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Biochemistry

पीसीआर म्यूटेनेसिस, क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, फास्ट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रोटोकॉल और वाइल्ड टाइप का क्रिस्टलीकरण और ट्रिप्टोफान सिंथेस के उत्परिवर्ती रूप

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61839
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Summary

यह लेख एक दिन में प्रोटीन परिसर को शुद्ध करने के लिए इस प्रोटोकॉल को एक तेजी से प्रणाली के रूप में इस प्रोटोकॉल की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए लगातार तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है। कवर किए गए तरीके साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस, एस्चेरिचिया कोलाईमें प्रोटीन अभिव्यक्ति, आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी, जेल फिल्ट्रेशन क्रोमेटोग्राफी और क्रिस्टलीकरण हैं।

Abstract

साल्मोनेला टाइफिमुरियम से ट्रिप्टोफान सिंथेस (टीएस) बिएंजाइम कॉम्प्लेक्स (α2β2 टीएस) के साथ संरचनात्मक अध्ययन इसके उत्प्रेरक तंत्र, एलोस्टेरिक व्यवहार और पीएलपी-आश्रित एंजाइमों में उत्पाद के लिए सब्सट्रेट के एंजाइमेटिक परिवर्तन के विवरण को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया गया है। इस काम में, अलग-थलग α और अलग-थलग β-सबयूनिट का उत्पादन करने के लिए एक उपन्यास अभिव्यक्ति प्रणाली ने2दिनों के भीतर अलग-थलग उपइकाओं से 2 β2सेंटटीएस परिसर में शुद्ध उपइकाओं की उच्च मात्रा और α की शुद्धि की अनुमति दी। शुद्धिकरण आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी द्वारा किया गया था जिसके बाद आत्मीयता टैग, अमोनियम सल्फेट वर्षा, और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) के दरार के बाद। एंजाइम β साइट पर प्रमुख अवशेषों की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए, पूर्व संरचनात्मक अध्ययनों में साइट-डायरेक्ट म्यूटेनेसिस का प्रदर्शन किया गया था। जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती α 2 β2सेंटटीएस परिसरों को शुद्ध करने के लिए एक और प्रोटोकॉल बनाया गया था। अमोनियम सल्फेट आंशिकता और एसईसी का उपयोग करके एक सरल, तेज और कुशल प्रोटोकॉल ने एक ही दिन मेंα 2β2सेंटटीएस परिसर के शुद्धिकरण की अनुमति दी। इस काम में वर्णित दोनों शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के काफी फायदे हैं जब पिछले प्रोटोकॉल की तुलना में खूंटी 8000 और शुक्राणु का उपयोग करके एक ही परिसर को शुद्ध करने के लिए शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के साथ2β2सेंटटीएस परिसर α को क्रिस्टलाइज करने के लिए। जंगली प्रकार और कुछ उत्परिवर्ती रूपों का क्रिस्टलीकरण थोड़ा अलग-अलग परिस्थितियों में होता है, जो खूंटी 8000 और शुक्राणु का उपयोग करके कुछ म्यूटेंट की शुद्धि को ख़राब करता है। एक्स-रे क्रिस्टलीय अध्ययन के लिए उपयुक्त क्रिस्टल तैयार करने के लिए क्रिस्टलीकरण, क्रिस्टल गुणवत्ता और क्रायोप्रोटेक्टेशन को अनुकूलित करने के लिए कई प्रयास किए गएथे। यहां प्रस्तुत तरीकों को आम तौर पर ट्रिप्टोफान सिंथास सबयूनिट और जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती α2β2सेंटटीएस परिसरों की शुद्धि के लिए लागू होना चाहिए।

Introduction

ट्रिप्टोफान सिंथेस (टीएस) बिएंजाइम कॉम्प्लेक्स (α2β2)एक एलोस्टेरिक एंजाइम है, जो बैक्टीरिया,पौधों और कवक1,2,3में अमीनो एसिड एल-ट्रिप्टोफान के बायोसिंथेसिस में अंतिम दो चरणों को उत्प्रेरित करता है। जीवाणु साल्मोनेला आंत्रप्रेन्योर सेवर टाइफिम्यूरियम (सेंट)मनुष्यों और अन्य जानवरों में गंभीर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमण का कारण बनता है। चूंकि मनुष्यों और उच्च जानवरों में टीएस (ईसी 4.2.1.20) नहीं है, इसलिए एस का अवरोध। टाइपिम्यूरियम α2β2 टीएस कॉम्प्लेक्स (α2β2सेंटटीएस) को क्रिप्टोस्पोरिडियोसिस और तपेदिक4,जननांग और नेत्र संक्रमण5के उपचार के लिए एक संभावित दवा लक्ष्य के रूप में खोजा गया है, और कृषि6में संभावित शाकयनासाइड उपयोग के लिए। α-सबयूनिट इंडोल-3-ग्लाइस्रोल-फॉस्फेट (आईजीपी) के एल्डोलिटिक क्लीवेज को ग्लाइसेरल्डिहाइड-3-फॉस्फेट (गैप) और इंडोल के गठन के माध्यम से, एक इंडोलेन ताटोमर और बाद में कार्बन-कार्बन बॉन्ड दरार को गैप और इंडोल3,6का उत्पादन करने के लिए उत्प्रेरित करता है। β उत्प्रेरक साइट में एक पायरिडॉक्सल 5'-फॉस्फेट (पीएलपी) कोफैक्टर अणु होता है जो शिफ बेस के माध्यम से β-Lys87 से बंधा होता है, जो एंजाइम β-सबयूनिट3,7पर प्रतिक्रियाओं के दौरान इलेक्ट्रॉन सिंक के रूप में कार्य करता है। β साइट एल-सेरीन साइड-चेन हाइड्रोक्सिल के प्रतिस्थापन को इंडोल द्वारा एल-ट्रिप्टोफान और पीएलपी-निर्भर प्रतिक्रिया में पानी के अणु देने के लिए उत्प्रेरित करती है । सेंट टीएस मल्टी एंजाइम कॉम्प्लेक्स2,3के भीतर सब्सट्रेट चैनलिंग और एलोस्टेरिक कम्युनिकेशन की जांच के लिए एक पुराना मॉडल के रूप में कार्य करता है। α और β-सबयूनिट्स ऑफ टीएस के बीच द्विदिशात्मक एलोस्टेरिक संचार उत्प्रेरक चरणों को सिंक्रोनाइज करने और एल-ट्रिप्टोफान संश्लेषण 3 केदौरानइंडोल रिलीज को रोकने के लिए आवश्यक है। इस प्रयास का विस्तार करने के लिए, हमने सेंटटीएस β-सबुनिट के उत्प्रेरक स्थल पर एंजाइम संरचना, तंत्र और कार्य के बीच संबंधों की आगे की खोजों में उपयोग किए जाने वाले एकल बिंदु उत्परिवर्तन द्वारा कई म्यूटेंट (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr, और β-Ser377Ala) तैयार किए हैं।

एडिथ डब्ल्यू मील के अनुसंधान समूह द्वारा α2β2सेंटटीएस के उत्प्रेरक तंत्र पर विस्तृत शोध शुरू किया गया था। देशी एस्चेरिचिया कोलाई α2β2 टीएस परिसर के साथ प्रारंभिक अध्ययनों ने अलग-थलग पड़े α-सबयूनिट8,9,अलग-थलग β-सबयूनिट10, 11और α 2 β2टीएस परिसर के पुनर्गठन के शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया है। शुद्धिकरण अमोनियम सल्फेट वर्षा, नमूना डायलिसिस, डीईई-सेपेडेक्स क्रोमेटोग्राफी, डायलिसिस, और डीईई-सेप्डेक्स कॉलम12पर एक दूसरा क्रोमेग्राफिक दौर द्वारा किया गया था। एक अन्य प्रोटोकॉल में, डीईई-सेपहेडेक्स कॉलम पर स्पष्ट सेल लिसेट लोड करके एक ही परिसर के शुद्धिकरण में सुधार किया गया था जिसके बाद सेफ्रोज 4बी कॉलम, अमोनियम सल्फेट वर्षा और डायलिसिस13पर क्रोमेग्राफिक कदम था। दोनों शुद्धिकरण प्रोटोकॉल 4-5 दिनों तक रहते हैं। एस्चेरिचिया कोलाई α2β2 टीएस कॉम्प्लेक्स क्रिस्टलाइज्ड लेकिन क्रिस्टल उस समय एक्स-रे विवर्तन के लिए उपयुक्त नहीं थे।

एक उपन्यास अध्ययन में, एस टाइपिम्यूरियम α 2 β2टीएस परिसर के पुनर्संयोजन और जंगली प्रकार के रूपों को शुद्ध और क्रिस्टलीकृत किया गया था14,15। 2 β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्सα रिकॉम्बिनेंट को पेबा-10 एक्सप्रेशन वेक्टर ले जाने वाले ई कोलाई स्ट्रेन CB149 में ओवरएक्सप्रेस किया गया था । प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण और एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह और α2β2सेंटटीएस परिसर के विश्लेषण की सूचना दी गई14। हालांकि, 2 α β2सेंटटीएस क्रिस्टल जैसी लंबी और पतली सुई संरचनात्मक अध्ययनों को बाधित करती है। बेहतर एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र करने के प्रयास में, एक और शुद्धिकरण प्रोटोकॉल को 2 β 2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स15α के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती रूपों को शुद्ध करने के लिए वर्णित किया गया था। शुद्धि एक प्रारंभिक वर्षा के साथ किया गया था शुक्राणु और खूंटी 8,000 का उपयोग कर स्पष्ट सेल lysate में और एक बड़े भारी वर्षा अपकेंद्रित्र द्वारा हटा दिया गया था। 2 α β2सेंटटीएस परिसर की उच्च मात्रा वाले सुपरनैंट अंश को 16-48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था जब तक कि पीले क्रिस्टल उपजी नहीं हो जातीं। क्रिस्टल को धोया गया था और विभिन्न बफ़र्स के खिलाफ बड़े पैमाने पर डायलाइज़ किया गया था। प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को बफर में फिर सेक्रिस्टाइज़ किया गया जिसमें अमोनियम सल्फेट और डायलिज्ड15थे । हालांकि, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण समाधान में प्रोटीन और तेज़ सांद्रता पर निर्भर करता है, समाधान में 2 α β2सेंटटीएस परिसर के अन्य उत्परिवर्ती रूपों के लिए शुद्धिकरण की निगरानी, भविष्यवाणी करना और पुन: पेश करना मुश्किल है। इस प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि यह किसी भी क्रोमेग्राफिक तरीकों का उपयोग नहीं करता है; हालांकि, नुकसान लंबे समय तक क्रिस्टलाइज, डायलाइज़ और रिक्रिस्टलाइज करने के लिए आवश्यक होते हैं, आमतौर पर 5-7 दिनों की आवश्यकता होती है। एक्स-रे डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन एकाग्रता, तापमान, पूर्वसिपिटेंट्स (खूंटी 4,000, 6,000, और 8,000) के संयोजन और भिन्नता का उपयोग करके 600 से अधिक क्रिस्टलीकरण स्थितियों का मूल्यांकन किया गया था, और एडिटिव्स (सीएसीएल2,एमएनएल2,जेएनसीएल2,शव, पुट्रेस, शुक्राणु, या शुक्राणु)15. क्रिस्टल एक बेहतर क्रिस्टलीय रूप था और 12% खूंटी 8,000 और 2 mm शुक्राणु युक्त स्थितियों में तेजी से वृद्धि हुई। क्रिस्टलीकरण 4, 30, या 42 डिग्री सेल्सियस के बजाय 25 डिग्री सेल्सियस पर अधिक अनुकूल था और 3 दिनों के भीतर अधिकतम आयामों तक बढ़ा15। उस समय (β 1996-1999) 16,17,18, 19,20, 21और कई अन्य संरचनाओं को आज तक प्रकाशित किया गया है। α

यहां, मुख्य उद्देश्य ट्रिप्टोफान सिंथेस को शुद्ध करने और प्रोटीन क्रिस्टलीकरण को अनुकूलित करने के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल पेश करना है। वर्तमान कार्य जंगली प्रकार अलग α-उपइकाइट (αसेंटटीएस), अलग-थलग β-सबयूनिट (βसेंटटीएस) को शुद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण सुधार दिखाता है, जो अलग-थलग उपइक इकाइयों से2β 2सेंटटीएस परिसर α पुनर्गठित किया गया है, और α2β2सेंटटीएस परिसर के जंगली प्रकार और उत्परिवर्तीरूपों का पुनर्गठन किया गया है । पिछले प्रोटोकॉल पर फायदे काफी हैं क्योंकि शुद्धिकरण समय काफी कम हो गया था और क्रिस्टलीकरण और क्रायोप्रोटेक्टेशन को अनुकूलित किया गया था। इस काम में इंजीनियर2β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स α के उत्परिवर्ती रूपों को जंगली प्रकार के रूप के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही स्थिति के पास क्रिस्टलीकृत किया गया है। हालांकि, निकट परमाणु संकल्प पर संरचना निर्धारण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के बड़े एकल क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए ठीक क्रिस्टलीकरण अनुकूलन आवश्यक था। आज तक, बैक्टीरिया, आर्किया और यूकेरियोट के लिए क्रमशः 101, 31 और 2 क्रिस्टल संरचनाओं का लेखा-जोखा, प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में जमा 134 ट्रिप्टोफान सिंथेस क्रिस्टल संरचनाएं हैं। अच्छी तरह से, 73 संरचनाएं एस एंटिका सेरोवर टाइफिमुरियम से संबंधित हैं और 2 β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स के α के 5 क्रिस्टलसंरचनाओंमें 1.50 एंगस्ट्रॉम से अधिक संकल्प सीमाएं हैं। आश्चर्य नहीं, 5 में से 4 हमारे अनुसंधान समूह में तैयार किए गए थे (पीडीबी IDs: 5CGQ पर 1.18 Å, 4HT3 पर 1.30 Å, 4HPJ पर 1.45 Å, 6DZ4 पर 1.45 Å संकल्प) । α 2 β2सेंटटीएस परिसर के उत्परिवर्ती रूप की परिष्कृत क्रिस्टलसंरचनाओंको एल-ट्रिप्टोफान संश्लेषण में शामिल आवश्यक अमीनो एसिड अवशेषों द्वारा निभाई गई तंत्र और भूमिकाओं में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने का अनुमान है।

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Protocol

1. α को शुद्ध करने के लिए फास्ट प्रोटोकॉल- और β-सबयूनिट और2β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स α पुनः संयोजन

  1. पीईटीएसयूएमओ अभिव्यक्ति वेक्टर में डीएनए उप-समावेशन
    1. α को एन्कोडिंग करने वाले अनुवादी कपलिंग जीन (टीआरपीए और टीआरपीबी) प्राप्त करें - औरपेबा-10 अभिव्यक्ति वेक्टर22में क्लोन किए गए जीवाणु साल्मोनेला एंटिका सेरोवर टाइपहिमियम से ट्राइप्टोफान सिंथेस के β-सबयूनिट। डीएनए टेम्पलेट के रूप में पीईबीए-10 वेक्टर का उपयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, नीचे सूचीबद्ध प्राइमर का उपयोग साल्मोनेला एंटिका सेरोवर टाइफिमुरियम जीनोम से दोनों जीन को बढ़ाना करने के लिए किया जा सकता है। आणविक क्लोनिंग में वर्णित सभी आणविक जीव विज्ञान चरणों का पालन किया गया: एक प्रयोगशाला मैनुअल23।
    2. सेंटटीएस-एफडब्ल्यू-बाम और α α प्राइमर के साथ α-सबयूनिट(αएसटीटीएस) के पूर्ण लंबाई वाले पॉलीन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को व्यक्तिगत रूप से बढ़ाने के लिए पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) αउपयोग करें सेंटटीएस-रेव-इको और β-सबयूनिट (βसेंटटीएस) का फुल लेंथ सीक्वेंस β प्राइमर βएसटीटीएस-एफडब्ल्यू-बाम और βसेंटटीएस-रेव-हिंद के साथ । लगभग 55 डिग्री सेल्सियस के पिघलने के तापमान और 2 मिनट के पॉलीमरेज विस्तार समय का उपयोग करें।
      1. डीएनए दृश्यों को बढ़ाने के लिए उच्च निष्ठा डीएनए पॉलीमरेज (जैसे, फुसियन) और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करें। एक 50 माइक्रोन पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए नाभिक मुक्त पानी के 34 माइक्रोल जोड़ें, 5x रिएक्शन बफर का 10 माइक्रोन, 10 एमएम डीएनटीपीएस का 1 माइक्रोन, 10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर का 1 माइक्रोन, 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर का 1 माइक्रोन, टेम्पलेट डीएनए का 1 माइक्रोन (200 एनजी), डीएमओ का 1.5 माइक्रोन, फूसियन डीएनए पॉलिमर का 0.5 माइक्रोन।
      2. पीसीआर कार्यक्रम के लिए, एक गर्म शुरुआत (98 डिग्री सेल्सियस पर 180 सेकंड) का उपयोग करें और इसके बाद 30 प्रवर्धन चक्र (98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड और 72 डिग्री सेल्सियस पर 120 सेकंड), और अंतिम विस्तार (72 डिग्री सेल्सियस पर 300 सेकंड)।
        नोट: इटालिकिक्ड दृश्य क्रमशः बामएचआई, इकोआरआई, बामएचआई और हिंदIII प्रतिबंध साइटों के अनुरूप हैं। पीसीआर टुकड़ों की टर्मिनी के करीब एंजाइम क्लीवेज दक्षता को अतिरिक्त कुर्सियां (लोअरकेस सीक्वेंस) जोड़कर बढ़ाया गया था।
        αसेंटटीएस-FW-बाम: 5′-cgcGGATCCATGGAACCCTACGAAAAA-3'
        αसेंटटीएस-रेव-इको: 5'-ccgGAATTCTTATGCGGGGCTGGC-3 '
        βसेंटटीएस-एफडब्ल्यू-बाम: 5'-सीजीसीजीजीजीसीसीएटगाकाकैक-3'
        βसेंटटीएस-रेव-हिंद: 5′-सीसीसीसीटी एएजीटीटीटीसीसीसीसीसीटीसी-3'3'
    3. 6 वी/सेमी पर 1x TAE बफर (40 एमएम ट्रिस, 20 एमएम एसिटिक एसिड और 1 एमएम ईडीटीए) में 0.8% एगरेज जेल लोड करें, जेल ब्याज के डीएनए बैंड निकालें, और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सिलिका बीड किट का उपयोग करके पीसीआर टुकड़े को शुद्ध करें।
      1. उचित प्रतिबंध एंजाइमों और निर्माता द्वारा 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए अनुशंसित शर्तों के साथ प्रत्येक डीएनए टुकड़े के कम से कम 200 एनजी को पचाएं।
      2. स्थापित करने के लिए 50 माइक्रोन प्रतिबंध पाचन प्रतिक्रिया में नाभिक मुक्त पानी का 34 माइक्रोन, डीएनए का 10 माइक्रोन (200 एनजी), 10x रिएक्शन बफर का 5 माइक्रोन, प्रतिबंध एंजाइम 1 का 0.5 माइक्रोन और प्रतिबंध एंजाइम 2 का 0.5 माइक्रोन जोड़ें।
      3. पाचन उत्पाद को 6 वी/सेमी, जेल एक्सट्रैक्ट पर 1x TAE पर 0.8% एगर उठे जेल पर लोड करें, और एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके पचाने वाले टुकड़े को शुद्ध करें।
    4. सबक्लोन व्यक्तिगत रूप से ई. कोलाई अभिव्यक्ति संशोधित वेक्टर पीईटी सूमो में प्रत्येक टुकड़ा, पहले उचित एंजाइमों और जेल शुद्ध के साथ पचा।
      नोट: यह वेक्टर वाणिज्यिक पीईटी सूमो का एक संशोधित संस्करण है। इस वेक्टर को प्रतिबंध एंजाइम क्लोनिंग के लिए अनुकूलित किया गया है। pET28b वेक्टर(बामएचआई, इकोआरआई, सैकआई, सालआई, हिंदIII, नॉटआई, और एक्सएचओआई) की मल्टी क्लोनिंग साइट (एमसीएस) को पीईटी सूमो क्लोनिंग साइट में डाला गया था। इस वेक्टर में छोटे सर्वव्यापी-जैसे मोडिफायर प्रोटीन (सुमो) और कई क्लोनिंग साइटों के साथ फ्रेम में एन-टर्मिनल 6x-हिस्टिडीन टैग शामिल है।
    5. लिगेट संशोधित पीईटी सूमो के 100 एनजी और टी 4 डीएनए लिगामेंट के साथ पीसीआर टुकड़े के 50 एनजी 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए।
    6. निर्मित प्लाज्मिड को ई. कोलाई तनाव DH10B α कोशिकाओं की सक्षम कोशिकाओं मेंबदलना। एलबी एगर प्लेटों पर प्लेट सेल जिसमें 35 μg/mL kanamycin होता है। थाली को रात भर उलटा 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड करें।
    7. प्रत्येक परिवर्तन से एक ही कॉलोनी का चयन करें, अल्ट्रा-प्योर प्लाज्मिड डीएनए तैयार करें, और यह सत्यापित करने के लिए डीएनए अनुक्रमण करें कि αसेंटटीएस या βसेंटटीएस को एन-टर्मिनल His6-SUMO टैग के साथ फ्रेम में क्लोन किया गया था।
      नोट: सेल कल्चर के ग्लिसरोल स्टॉक तैयार करें (बाँझ ग्लाइसरोल के 16% अंतिम एकाग्रता में सेल निलंबन की बारी करें) और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक स्टोर करें।
    8. एक्सप्रेशन प्लाज्मिड सूमो-αसेंटटीएस या सूमो-βसेंटटीएस को व्यक्तिगत रूप से ई. कोलाई अभिव्यक्ति तनाव रोसेटा (DE3) pLysS की सक्षम कोशिकाओं में एक T7 प्रमोटर आधारित प्रणाली के साथ बदलना। लुरिया बर्टानी (एलबी) आगर प्लेटों पर रिकॉम्बिनेंट कोशिकाओं को प्लेट करें जिसमें 35 μg/mL kanamycin और क्लोराम्फेनिकोल होते हैं। थाली को रात भर उलटा 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड करें।
    9. सफल कॉलोनी गठन के बाद, एक ही कॉलोनी (बिना किसी उपग्रह उपनिवेशों के) चुनें और इसे दोनों एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी माध्यम के 5 एमएल में तितर-बितर करें। संस्कृति कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर २०० आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ रात भर ।
      नोट: सेल कल्चर के ग्लिसरोल स्टॉक तैयार करें, लॉन्ग-टर्म को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या फिर से संयोजन प्रोटीन एक्सप्रेशन के लिए तुरंत इस्तेमाल करें ।
  2. सूमो की अभिव्यक्ति-αएसटीटीएस और सूमो-βएसटीटीएस सबयूनिट
    1. ताजा ई. कोलाई तनाव रोसेटा (DE3) pLysS कोशिकाओं को शरण सूमो-αसेंटटीएस या सूमो-βसेंटटीएस का निर्माण या 35 μg/mL kanamycin और क्लोराफेनी युक्त पौंड की एक ५० एमएल संस्कृति में जमे हुए ग्लिसरोल स्टॉक के कुछ परिमार्जन । 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर मिलाते हुए रातोंरात कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    2. अगली सुबह, एलबी के एक ताजा और बाँझ 2x 1000 मिलीएल में रात भर सेल संस्कृति के 5 एमएल को टीका लगाते हैं जिसमें 2% ग्लाइस्रोल प्लस कानमाइसिन और क्लोरम्फेनिकोल (2.8 एल फर्नबाख फ्लास्क) होते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर मिलाते हुए सेल कल्चर बढ़ाएं।
      नोट: सुमो कीअभिव्यक्ति-αसेंटटीएस या सुमो-βसेंटटीएस एलबी शोरबा में प्रति लीटर 125-150 मिलीग्राम टैग प्रोटीन की पैदावार होती है । विशिष्ट मांगों को पूरा करने के लिए स्केलिंग प्रोटोकॉल पर विचार करें।
    3. जब ओडी600 0.4 एमएम की अंतिम एकाग्रता पर आइसोप्रोपिल β-डी-1 थिओग्लेक्टोपाइरानोसाइड (आईपीटीजी) के अलावा 0.6-0.8 तक पहुंचता है तो पुनः संयोजन प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें और इसके बाद 200 आरपीएम पर मिलाते हुए रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन होता है।
    4. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को फसल। सुपरनिटेंट को हटाएं और कोल्ड लाइसिस बफर 1 (50 एमएम ट्राइस-सीएल, पीएच 8.0, जिसमें 500 mm NaCl, 5% ग्लिसरोल, 10 एमएमएम 2-मर्केप्टोथेनॉल, और 40 एमएम इमिडाजोल-सीएल) के साथ सेल छर्रों को 60 मीटर की अंतिम मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया गया है।
      नोट: कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक संग्रहीत किया जा सकता है या प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है। कोशिकाओं को स्टोर करने के लिए, सेल निलंबन को 2 x 50 एमएल डिस्पोजेबल सेंट्रलाइज शंकु ट्यूबों में विभाजित करें और प्रोटीन शुद्धिकरण कदम तक सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. की शुद्धि α- और β-उपइकाइक्स ऑफ ट्रिप्टोफान सिंथेस
    नोट: सभी प्रक्रियाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाना है जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया हो। शुद्धिकरण समय को कम करने के लिए, प्रोटीन शुद्धिकरण से पहले या पुनः संयोजन प्रोटीन अभिव्यक्ति के दौरान बफर में निकेल-चार्ज आत्मीयता कॉलम और आकार अपवर्जन कॉलम को बराबर कर दिया।
    1. 1/2 "हॉर्न प्रोब (या एक समान उपकरण) के साथ एक डिजिटल सोनीफायर का उपयोग करके सोनीशन द्वारा सेल पेलेट को बाधित करें। 10 एस नाड़ी और 20 एस आराम का उपयोग कर या पूरा सेल व्यवधान तक बर्फ के पानी स्नान पर ८०% आयाम शुल्क चक्र पर 20 चक्र प्रदर्शन करते हैं ।
    2. सेंट्रलाइज सेल 30 मिनट के लिए 30,000 एक्स ग्राम पर lysate। सुपरनेट को एस्पिरेट करें, यह सुनिश्चित करना कि गोली ट्यूब से उखाड़ न फेंकती है। बर्फ पर 0.45 माइक्रोन फिल्टर इकाई के साथ सुपरनेट को फ़िल्टर करें और इसे 15 एमएल नी-एनटीए एगर उठे निकेल-चार्ज एफ़िनिटी कॉलम प्री-लिसिस बफर 1 में समानाखित के माध्यम से प्रवाहित करें।
      नोट: प्रत्येक नी-एनटीए agarose कॉलम या तोसूमो-αसेंटटीएस या सूमो-βसेंटटीएस recombinant प्रोटीन शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । शुद्धिकरण एक फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली से जुड़े 2x 5 एमएल नी-NITA कॉलम में किया जा सकता है। एक समय में एक प्रोटीन को शुद्ध करें।
    3. लाइसिस बफर 1 के 100 एमएल में नी-एनटीए एगर उठे कॉलम को धोएं।
    4. बफर ई 1 (25 एमएम ट्रिस-सीएल बफर, पीएच 7.8, जिसमें 200 एमएन एनएसीएल, 5% ग्लाइसरोल, और 400 एमएम इमिडाजोल-सीएल) के साथ 80 एमएल वन-स्टेप एल्यूशन के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: सुमो-प्रोटीज़ 300 एमएम इमिडाजोल तक सहन करता है और सेंट्रलाइज्ड फिल्टर उपकरणों की झिल्ली 100 एमएम इमिडाजोल तक सहन करती है। हम इमिडाजोल की उच्च मात्रा को हटाने और शुद्धिकरण समय को कम करने के लिए एक अमोनियम सल्फेट वर्षा करने की सलाह देते हैं, इसके बजाय प्रोटीन नमूना को पतला करते हैं और प्रोटीन एकाग्रता के साथ समय बर्बाद करते हैं।
    5. सुपरनिटेंट अंश की प्रारंभिक मात्रा का आकलन करें। धीरे-धीरे एक समय में अमोनियम सल्फेट की थोड़ी मात्रा जोड़ें, जब तक कि 25 डिग्री सेल्सियस पर 60% संतृप्ति (39.48 ग्राम/ 100 एमएल) न हो जाए। धीरे-धीरे 30 मिनट के लिए समाधान को हिलाएं और बुलबुले से बचें। 15 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    6. अधिष्ठाता अंश को ध्यान से छोड़ दें। नमूना बफर (20 mM Tris-Cl, पीएच 8.0, 300 mm NaCl और 5% ग्लिसरोल) के 20 मिलील में गोली अंश को फिर से खर्च करें।
    7. सूमो-प्रोटीज़ के साथ अपने-सूमो-टैग क्लीवेज के लिए, 1:1000 अनुपात में सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई से यूबल-विशिष्ट प्रोटीज 1 के पुनः संयोजन टुकड़े को जोड़ें और मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. एक एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी कॉलम के माध्यम से नमूना लोड करने से पहले प्रोटीन समुच्चय को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस में 10,000 x ग्राम पर पाचन उत्पाद को अपकेंद्रित्र करें।
    9. एक 15 एमएल नी-एनटीए agarose कॉलम पर 20 एमएल पुनः निलंबित नमूना गुजर His6-SUMO टैग के निशान निकालें, पहले lysis बफर 1 में संतुलन ।
    10. सेंट टीएस याβ एसटीटीएस αगैर-टैग वाले पास-थ्माध्यम से नमूना एकत्र करें।
    11. सेंट टीएस याβ एसटीटीएस के α गैर-टैग किएगए बचे हुए एकत्र करने के लिए बफर1 के 20 एमएल में एनआई-एनटीए कॉलम धोएं।
    12. प्रत्येक सबयूनिट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 एक्स ग्राम पर घूमते हुए 15 एमएल 10 केडीए कटऑफ सेंट्रलफ्यूगल फिल्टर यूनिट के साथ अलग से केंद्रित करें। कुल को हटाने के लिए केंद्रित प्रोटीन को एक ताजा 2.0 एमएल ट्यूब और माइक्रोसेंट्रफ्यूज (10,000 x ग्राम, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करें। प्रोटीन एकाग्रता24निर्धारित करें, 20-25 मिलीग्राम एमएल -1 पर1एमएल एलिकोट तैयार करें, लेबल, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: पूर्व शुद्ध प्रोटीन नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक संग्रहीत किया जा सकता है या आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम (एसईसी) पर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है।
    13. पूर्व सेकंड को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर प्रोटीन एलिकोट (20 मिलीग्राम) और माइक्रोसेंट्रफ्यूज लें।
    14. 0.5 एमएल मिन -1 की प्रवाह दर पर एक तेज प्रोटीन तरल क्रोमेटोग्राफी से जुड़े आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम (जैसे, हिप्रीप 16/60 सेफ्राक्रिलएस-200एचआर) पर लोड नमूना, पहले एसईसी बफर (10 एमएमएम ट्राइस-सीएल, पीएच 7.8, 100 mM NaCl, 5% ग्लाइसरोल, 0.1 m m pyridoxal फॉस्फेट)।
      नोट:सेंटटीएस या βसेंटटीएस सबयूनिट α अलग-थलग होने की उच्च मात्रा को शुद्ध करने और एसईसी राउंड की संख्या कम करने के लिए, 1.5 एमएल मिनट-1 की प्रवाह दर पर आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर20-25 मिलीग्राम एमएल एमएल-1पर 5 एमएल नमूना लोड करें।
    15. क्रमशः 12% या 15% सोडियम डोडेसिल सल्फेट-जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) का उपयोग करके पीक अंश में सेंटटीएसया βसेंटटीएस α की गुणवत्ता का आकलन करें, जो कूमासी शानदार नीले दाग25के साथ दाग है।
    16. ताजा 15 एमएल 10 केडीए कटऑफ सेंट्रलाइज्ड फिल्टर यूनिट्स के साथ प्रोटीन को सेंट्ट कर दें, प्रोटीन एकाग्रता24निर्धारित करें, 20-25 मिलीग्रामएमएल-1 पर 0.5एमएल एलिकोट्स तैयार करें, लेबल, लिक्विड नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. α और β-सबयूनिट से 2 β 2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स α का शुद्धिकरण
    नोट: एसईसी बफर (10 एमएम ट्रिस-सीएल, पीएच 7.8, 100 एमएमएम एनएसीएल, 5% ग्लिसरोल, 0.1 एमएम पायरिडॉक्सल फॉस्फेट) में आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम (सेफेडेक्स एस-200 एचआर या सुपरडेक्स 200 पीजी) को एक्क्विलिबेट करें।
    1. α और β-सबयूनिट से2β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स के जंगली प्रकार α शुद्ध करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट टीएस और βसेंटटीएस सबयूनिट के α के नमूने गल ध्यान केंद्रित करें ।
    2. एलिकोट्स (1.2 αसेंटटीएस: 1.0 βसेंटटीएस मोलर अनुपात) को मिलाएं और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए αStTS की अधिकता आवश्यक है कि अधिकांश βसेंटटीएस को2β2सेंटटीएस परिसर में α में शामिल किया जाएगा।
    3. माइक्रोसेंट्रफ्यूगेशन (10,000 x ग्राम, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा प्रोटीन समुच्चय को हटा दें।
    4. आकार अपवर्जन कॉलम पर स्पष्ट सुपरनेट लोड करें।
    5. क्रमशः 12% या 15% सोडियम डोडेसिल सल्फेट-जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) का उपयोग करके पीक अंश में सेंटटीएसया βसेंटटीएस α की गुणवत्ता का आकलन करें, जो कूमासी शानदार नीले दाग25के साथ दाग है।
    6. प्रोटीन एकाग्रता24निर्धारित करें, 15-20 मिलीग्राम एमएल-1पर 250-1000 माइक्रोन एलिकोट तैयार करें, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. 2 β2सेंटटीएस परिसर α के जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती रूप का शुद्धिकरण

  1. सेंटटीएस β उत्परिवर्ती तैयार करने के लिए साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस
    1. β-चेनटीएस पॉलीन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में विशिष्ट बिंदु-उत्परिवर्तन पेश करने के लिए पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया के दो चरणों केदौरान डीएनए टेम्पलेट के रूप में पीईबीए-10 अभिव्यक्ति वेक्टर 22 का निर्माण करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग साल्मोनेला टाइपिमुरियम ट्राइप्टोफान सिंथेसे से α या β-सबयूनिट में एक बिंदु उत्परिवर्तन पेश करने के लिए किया जा सकता है। अतिरिक्त के लिए, वांछनीय उत्परिवर्तन युक्त नए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर को उचित रूप से डिजाइन किया जाना चाहिए। इस काम में, Q114A, βK167T, βS377A βम्यूटेशन सूचीबद्ध हैं।
    2. न्यूक्लियोटाइड प्राइमर टीएस-एफडब्ल्यू-NcoI/Q114A-Rev, टीएस-एफडब्ल्यू-NcoI/K167T-Rev, और टीएस-FW-NcoI/S377A-Rev के जोड़े का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन क्रमशः टुकड़े A1, B1, और C1 उत्पन्न करने के लिए ।
      नोट: ओलिगोन्यूक्लियोटाइड टीएस-एनएसओआई-एफडब्ल्यू और टीएस-सैसी-रेव, क्रमशः, पीबीए-10 वेक्टर में क्लोन किए गए αο सेंटटीएस पॉलीन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के ऊपर और डाउनस्ट्रीम एनील्स।
      1. डीएनए दृश्यों को बढ़ाने के लिए उच्च निष्ठा डीएनए पॉलीमरेज (जैसे, फुसियन) और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करें। 50 माइक्रोन पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, नाभिक मुक्त पानी के 34 माइक्रोन जोड़ें, 5x रिएक्शन बफर का 10 माइक्रोन, 10 एमएम डीएनटीपीएस का 1 माइक्रोन, 10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर का 1 माइक्रोन, 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर का 1 माइक्रोन, टेम्पलेट डीएनए का 1 माइक्रोन (200 एनजी), डीएमएसओ का 1.5 माइक्रोन, डीएनए पॉलीमरेज का 0.5 माइक्रोन।
      2. पीसीआर कार्यक्रम के लिए, एक गर्म शुरुआत (98 डिग्री सेल्सियस पर 180 सेकंड) का उपयोग करें, इसके बाद 30 प्रवर्धन चक्र (98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड और 72 डिग्री सेल्सियस पर 120 सेकंड), और अंतिम विस्तार (72 डिग्री सेल्सियस पर 300 सेकंड)।
        नोट: सभी आणविक जीव विज्ञान कदम के रूप में आणविक क्लोनिंग में वर्णित पीछा किया गया: एक प्रयोगशाला मैनुअल23। जबकि एक लोअरकेस अनुक्रम एक प्रतिबंध साइट से मेल खाता है, एक बोल्ड और इटालिक अनुक्रम उत्परिवर्तन से मेल खाता है।
        टीएस-FW-NcoI: 5'-CAA TTT सीएसी एसीए GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC जीसीसी जीटीजी सीजीसी एसीसी जीजीसी जीसीसी जीजीटी टीटीसी-3 '
        K167T-Rev: 5'-सीटीसी जीटीटी एसीए जीजीसी एटीसी टीजीटी टैग सीजीटी एजीसी जीजीए जीसीसी-3 '
        S377A-Rev: 5'-C TTT एटीसी टीसीसी जीसीसी जीसीसी एजीसी गैग एटी जीसी सीएसी सीएजी-3 '
    3. क्रमशः टुकड़े A2, B2, और C2 उत्पन्न करने के लिए न्यूक्लियोटाइड प्राइमर टीएस-रेव-SacI/Q114A-एफएफ, टीएस-रेव-SacI/K167T-FF, और टीएस-रेव-SacI/S377A-FF के जोड़े का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करें ।
      टीएस-रेव-सैसी (5'-TTA टीजीसी जीसीजीजी जीसीजीसी जीजीसी टीटीटीटी कैट जीजीसी टीजीए जी-3'
      Q114A-एफएफ 5'-GAA एसीसी जीजीसी जीसीसी जीजीटी जीसी जीसीजी सीएसी जीजीसी जीटीसी जीसीसी टीसीटी जी-3 '
      K167T-एफएफ 5'-GGC टीसीसी जीसीटी एसीजी सीटीए एसीए गैट जीसीसी टीजीटी एएसी गैग-3 '
      S377A-एफएफ 5'-CTG GTG GTC AAT सीटीसीजीजीसी सीजीसी जीजीए गेट एएए जी-3 '
    4. आंशिक टुकड़ों को व्यक्तिगत रूप से बढ़ाने के लिए पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया का उपयोग करें। 55 डिग्री सेल्सियस के पिघलने के तापमान और 2 मिनट के पॉलीमरेज विस्तार समय का उपयोग करें।
    5. पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दूसरे दौर को करने के लिए, पीसीआर उत्पाद को 1x TAE पर 0.8% एगरेज जेल पर 6 वी/सेमी और जेल निकालने और ब्याज के टुकड़ों को शुद्ध करने के लिए लोड करें।
      1. टुकड़े A1/A2, B1/B2, और C1/C2 अलग से सममोलीय मात्रा में मिलाएं, 96 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिश्रण को गर्म करें, और 25 डिग्री सेल्सियस पर एनील करें । निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार उच्च-निष्ठा पॉलीमरेज और डिऑक्सीरिबोक्यूक्लियोटाइड के साथ रिकॉम्बिनेंट किस्में का विस्तार करें।
    6. पूर्ण लंबाई उत्परिवर्ती डीएनए टुकड़ा की एक उच्च प्रतिलिपि संख्या उत्पन्न करने के लिए, एक दूसरी पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए ओलिगो प्राइमर टीएस-एफडब्ल्यू-NcoI और टीएस-रेव-SacI जोड़ें ।
    7. 6 वी/सेमी पर 1x TAE बफर में 0.8% agarose पर लोड पीसीआर उत्पाद, जेल ब्याज के डीएनए बैंड निकालने, पीसीआर टुकड़ा शुद्ध जेल, और उचित बफर और निर्माता द्वारा सिफारिश की शर्तों के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए उचित प्रतिबंध पाचन के साथ आगे बढ़ना।
      1. उचित प्रतिबंध एंजाइमों और निर्माता द्वारा 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए अनुशंसित शर्तों के साथ प्रत्येक डीएनए टुकड़े के कम से कम 200 एनजी को पचाएं। स्थापित करने के लिए 50 माइक्रोन प्रतिबंध पाचन प्रतिक्रिया में नाभिक मुक्त पानी का 34 माइक्रोन, डीएनए का 10 माइक्रोन (200 एनजी), 10x रिएक्शन बफर का 5 माइक्रोन, प्रतिबंध एंजाइम 1 का 0.5 माइक्रोन और प्रतिबंध एंजाइम 2 का 0.5 माइक्रोन जोड़ें। 6 वी/सेमी पर 1x TAE बफर में 0.8% agarose पर पाचन उत्पाद लोड और पचा पीसीआर टुकड़ा शुद्ध।
    8. पीईबीए-10 के 200 एनजी को निर्माता की सिफारिश के बाद प्रतिबंध एंजाइमों एनसीओआई और सैकआई के साथ निर्मित करें। 6 V/सेमी पर 1x TAE बफर में 0.8% agarose जेल पर पाचन उत्पाद लोड, वेक्टर के लिए बैंड संवाददाता आबकारी, और जेल पचा वेक्टर शुद्ध।
    9. लिगेट 100 एनजी वेक्टर के साथ 50 एनजी पीसीआर टुकड़ा, पहले पचा और शुद्ध, T4 डीएनए ligase के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए। निर्मित प्लाज्मिड को सक्षम कोशिकाओं ई. कोलाई तनाव DH10B कोशिकाओं में बदलना। एलबी एगर प्लेटों पर प्लेट सेल जिसमें ५० μg/mL एम्पीसिलिनहोता है । थाली को रात भर उलटा 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड करें।
    10. प्रत्येक सेल परिवर्तन से एक ही कॉलोनी (किसी भी उपग्रह उपनिवेशों के बिना) चुनें और इसे एम्पीसिलिन युक्त एलबी माध्यम के 5 एमएल में तितर-बितर करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर मिलाते हुए रातोंरात कोशिकाओं को बढ़ाएं। प्रत्येक इंजीनियर निर्माण से अल्ट्रा-प्योर प्लाज्मिड डीएनए के 10 माइक्रोन तैयार करें। सेल कल्चर के ग्लिसरोल स्टॉक तैयार करें (बाँझ ग्लाइस्रोल के 16% अंतिम एकाग्रता में सेल निलंबन की बारी करें) और -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि की दुकान करें।
    11. α और β-सबइकाइंस ऑफ ट्राइप्टोफान सिंथेस की पूर्ण लंबाई अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए डीएनए अनुक्रम का प्रदर्शन करें। प्रत्येक व्यक्ति एकल उत्परिवर्तन की पुष्टि करें और अवांछनीय यादृच्छिक उत्परिवर्तन युक्त किसी भी प्लाज्मिड निर्माण को त्यागें। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर नीचे सूचीबद्ध हैं।
      टीएस-1एफ: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      टीएस-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      टीएस-2एफ: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      टीएस-3एफ: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      टीएस-4एफ: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      टीएस-5एफ: 5'-CGTTGCATCATCATCATCATTG-3'
      नोट: ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर्स टीएस-1एफ, टीएस-1आर, टीएस-2एफ, और टीएस-3एफ एनील β-सबयूनिट (जेनबैंक परिग्रहण कोड: CP051286.1) के पॉलीन्यूक्लियोटाइड सीक्वेंस पर। α-सबयूनिट (जेनबैंक परिग्रहण कोड: CP053865.1) के पॉलीन्यूक्लियोटाइड सीक्वेंस पर प्राइमर टीएस-4एफ और टीएस-5एफ एनील।
    12. ई. कोलाई अभिव्यक्ति तनाव CB149 की सक्षम कोशिकाओं को बदलने के लिए प्रत्येक प्लाज्मिड निर्माण (pEBA-10-β Q114A, pEBA-10-β K167T, और pEBA-10-β S377A) के२००एनजी का उपयोग करें । सफल कॉलोनी गठन के बाद, एक ही कॉलोनी चुनें और 50 μg/mL एम्पीसिलिन युक्त एलबी माध्यम के 5 एमएल में कोशिकाओं को विकसित करें। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल इनक्यूबेटर में संस्कृति। सेल कल्चर के ग्लिसरोल स्टॉक तैयार करें, लॉन्ग-टर्म को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या फिर से संयोजन प्रोटीन एक्सप्रेशन के लिए तुरंत इस्तेमाल करें।
      नोट: साल्मोनेला टाइफिमुरियम ट्राइप्टोफान सिंथेस से α या β-सबयूनिट में एक ही बिंदु उत्परिवर्तन एंजाइम समारोह या ई. कोलाई स्ट्रेन CB149 में एल-ट्रिप्टोफान के कम संश्लेषण को ख़राब कर सकता है। कृपया या तो ई. कोलाई तनाव BL21 (DE) pLys-S या रोसेटा (DE3) pLys-S का उपयोग करने पर विचार करें यदि कोई अभिव्यक्ति या 2 α β 2 सेंट टीएस परिसर में2β2सेंटटीएस परिसर के पुनर्संयोजन की कम मात्रा एक SDS-पृष्ठ जेल में पाया जाता है ।
  2. ई. कोलाई में 2 β2सेंटटीएस परिसर α के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती रूप की अभिव्यक्ति
    1. ई. कोलाई अभिव्यक्ति 50 μg/ 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर मिलाते हुए रातोंरात कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    2. 2% ग्लाइस्रोल प्लस एम्पिसिलिन (2.8 एल फर्नबाख फ्लास्क) वाले एलबी के ताजा और बाँझ 2x 1000 एमएल में रातोंरात सेल संस्कृति का 5 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर मिलाते हुए सेल कल्चर बढ़ाएं।
    3. जब ओडी600 0.4 एमएम की अंतिम एकाग्रता पर आईपीटीजी के अलावा 0.6-0.8 तक पहुंचता है तो रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें और इसके बाद रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन 200 आरपीएम पर मिलाते हुए।
    4. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में 4,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को फसल। सुपरनॉट निकालें और 50 mL बफर के अंतिम वॉल्यूम के लिए कोल्ड लाइसिस बफर 2 (50 एमएम ट्रिस-सीएल, पीएच 7.80, जिसमें 100 mm NaCl, 5 m m dithiothreitol, 1 m M EDTA, और 1 m M PMSF) के साथ सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
      नोट: कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक संग्रहीत किया जा सकता है या प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है। कोशिकाओं को स्टोर करने के लिए, सेल निलंबन को 2 x 50 एमएल डिस्पोजेबल सेंट्रलाइज शंकु ट्यूबों में विभाजित करें और प्रोटीन शुद्धिकरण कदम तक सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एलबी शोरबा में 2 β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स α के उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के रूप की अभिव्यक्ति प्रति लीटर 125-150 मिलीग्राम प्रोटीन की पैदावार करती है। विशिष्ट मांगों को पूरा करने के लिए स्केलिंग प्रोटोकॉल पर विचार करें।
  3. 2 α β2सेंटटीएस परिसर के जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती रूप का शुद्धिकरण
    नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उद्देश्य गैर-टैग किए गए पुनः संयोजन जंगली प्रकार या पुनर्संयोजन के उत्परिवर्ती रूप को शुद्ध करना α2β2St1 दिन के भीतर टीएस परिसर, कौशल सेट और प्रयासों पर निर्भर करता है। शुद्धिकरण समय को कम करने के लिए, बफर पूर्व प्रोटीन शुद्धिकरण/अभिव्यक्ति में आकार बहिष्कार कॉलम को बराबर करें । जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती α की शुद्धि2β2Stटीएस परिसर एक दो चरण शुद्धि द्वारा किया जाता है जिसमें अमोनियम सल्फेट आंशिकता और एक आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी शामिल है। यह प्रोटोकॉल एलबी माध्यम के 1 एल से 60-100 मिलीग्राम शुद्ध परिसर की पैदावार करता है।
    1. 1/2 "हॉर्न प्रोब (या एक समान उपकरण) के साथ एक डिजिटल सोनीफायर का उपयोग करके सोनीशन द्वारा सेल पेलेट को बाधित करें। 10 एस नाड़ी और 20 एस आराम का उपयोग कर या पूरा सेल व्यवधान तक बर्फ के पानी स्नान पर ८०% आयाम शुल्क चक्र पर 20 चक्र प्रदर्शन करते हैं ।
    2. सेंट्रलाइज सेल 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 30,000 एक्स ग्राम पर lysate। सुपरनेट को एस्पिरेट करें, यह सुनिश्चित करना कि गोली ट्यूब से उखाड़ न फेंकती है। कमरे के तापमान पर 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ स्पष्ट सुपरनेट अंश को फ़िल्टर करें।
    3. स्पष्ट किए गए सुपरनिटेंट अंश की प्रारंभिक मात्रा का आकलन करें। धीरे-धीरे एक समय में अमोनियम सल्फेट की छोटी मात्रा जोड़ें, जब तक कि 20% संतृप्ति (11.51 ग्राम / 100 एमएल) न हो जाए। 25 डिग्री सेल्सियस पर अमोनियम सल्फेट आंशिकता बाहर ले जाएं। धीरे-धीरे 10 मिनट के लिए समाधान को हिलाएं और बुलबुले से बचें।
    4. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 30,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। 20% सुपरनिटेंट अंश को एक साफ फ्लास्क में स्थानांतरित करें। नमूना बफर 2 (50 mM Tris-Cl, पीएच 7.80, जिसमें 100 mm NaCl, 1 m EDTA, और 2 m m dithiothreitol) के 20 मिलीलन में 20% गोली अंश धीरे से पुनः बढ़ाएं और एसडी-पेज जेल चलाने के लिए एक नमूना तैयार करें। 20% गोली अंश त्यागें।
    5. 20% सुपरनिटेंट अंश की प्रारंभिक मात्रा का आकलन करें। 30% संतृप्ति तक पहुंच गया है (5.94 ग्राम / 100 एमएल) तक अमोनियम सल्फेट जोड़ें, समाधान हलचल, बुलबुले से बचा जाता है, और पहले की तरह अपकेंद्रित्र। 30% सुपरनिटेंट अंश को एक साफ फ्लास्क में स्थानांतरित करें। धीरे से नमूना बफर 2 के 20 मिलील में 30% गोली अंश resuspend और SDS-पेज जेल चलाने के लिए एक नमूना तैयार करते हैं । 30% गोली अंश त्यागें।
    6. 30% सुपरनिटेंट अंश की प्रारंभिक मात्रा का आकलन करें। 40% संतृप्ति पर अमोनियम सल्फेट जोड़ें (6.14 ग्राम / 100 एमएल) तक पहुंच जाता है, समाधान को हिलाएं, बुलबुले से बचें, और पहले की तरह अपकेंद्रित्र करें। 40% सुपरनिटेंट अंश को एक साफ फ्लास्क में स्थानांतरित करें। धीरे से नमूना बफर 2 के 10 मिलील में 40% गोली अंश को फिर से खर्च करें और एसडीएस-पेज जेल चलाने के लिए एक नमूना तैयार करें। 40% सुपरनिटेंट अंश को त्यागें।
      नोट: 12% एसडीएस-पेज जेल25 में 30% और 40% सुपरनैंट और पैलेट के अंशों के नमूनों का उपयोग करके α,सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स की गुणवत्ता का आकलन करें। यदि आप यह सत्यापित करते हैं कि कोई अन्य उत्परिवर्तीसेंटटीएस परिसर 40% सुपरनैंट अंश में है, तो अमोनियम सल्फेट (13.0 ग्राम / 100 एमएल) के 60% संतृप्ति के साथ आगे बढ़ें। पूर्व-शुद्ध α2β 2 सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स के पूर्व-शुद्ध प्रोटीन एलिकोट्स को-80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक संग्रहीत किया जा सकता है या आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम (एसईसी) पर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है।
    7. माइक्रोसेन्ट्राइज प्रोटीन का नमूना 10,000 x ग्राम,20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस और एक HiPrep 16/60 Sephacryl एस-200 एचआर कॉलम पर एक सुपरनैटेंट अंश लोड ०.५ डिग्रीन्यूनतम-1की प्रवाह दर पर एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमेटोग्राफी से जुड़े, पहले एसईसी बफर में समान रूप से (10 mM Tris-Cl, पीएच ७.८, 100 एमएमएल एनएसीएल, 5% ग्लाइसरोल, 0.1 m pyridoxal फॉस्फेट) ।
      नोट: बड़ी मात्रा में जटिल को शुद्ध करने के लिए, 1.5 एमएल न्यूनतम-1 की प्रवाह दर पर एक HiLoad 26/600 सुपरडेक्स 200 पीजी कॉलम पर 20-25 मिलीग्राम एमएल-1पर 5 एमएल नमूना लोड करें।
    8. 12% एसडीएस-पेज जेल पर एसईसी कॉलम से अमोनियम सल्फेट आंशिकता और पीक अंशों के साथ एकत्र किए गए नमूनों का आकलन करें जो कूमासी शानदार नीले दाग25के साथ दाग है।
    9. जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती α2β2सेंटटीएस परिसर को 15 एमएल 100 केडीए कटऑफ सेंट्रलीफ्यूगल फिल्टर यूनिट के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 एक्स ग्राम पर कताई करके केंद्रित करें। कुल को हटाने के लिए केंद्रित प्रोटीन को एक ताजा 2.0 एमएल ट्यूब और माइक्रोसेंट्रफ्यूज (10,000 x ग्राम, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करें।
    10. प्रोटीन एकाग्रता24निर्धारित करें, 20-25 मिलीग्राम एमएल-1पर 0.5 एमएल एलिकेट्स तैयार करें, लेबल, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. जंगली प्रकार और 2सेंटटीएस परिसर α2के उत्परिवर्ती रूप β लिए अनुकूलित क्रिस्टलीकरण

नोट:α 2β 2सेंटटीएस परिसर के लिए प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण की स्थिति पहले 12% खूंटी ८,००० और 2 m शुक्राणु22युक्त स्थितियों में सूचित किया गया था ।

  1. क्रिस्टलीकरण से पहले स्टॉक समाधान तैयार करें जो बेहतर क्रिस्टलीकरण पुन: उत्पन्न क्षमता प्राप्त करने के लिए देता है। टीएस के साथ संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए, bienzyme परिसर के धातु समन्वय स्थल पर ना+ या सीएस+ आयन के साथ प्रोटीन क्रिस्टलाइज करें।
    1. पानी में 200 एमएम स्पर्मिन का 5 एमएल स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और 500 माइक्रोन एलिकोट्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. 30 प्रतिशत (डब्ल्यू/वी) खूंटी 8000 का 50 एमएल स्टॉक घोल पानी में तैयार करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल डिस्पोजेबल सेंट्रलाइज शंकु फ्लास्क में 25 एमएल एलिकोट्स रखें।
    3. पानी में 1 एम सीसीएल का 25 एमएल स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. पानी में 1 एम एनएसीएल का 25 एमएल स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और 25 डिग्री सेल्सियस रखें।
    5. पीएच 7.6, 7.8, और 8.0 पर बफर समाधान प्राप्त करने के लिए CSOH या NaOH के साथ 1 एम बाइसिन और टाइट्रे के 3x 50 एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें। 25 एमएल एलिकोट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. आइस बाथ पर2β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स (20-25 मिलीग्राम एमएल-1)के α का नमूना गल ।
  3. प्रोटीन समुच्चय को हटाने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज नमूना।
  4. एक साफ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्वीकृत सुपरनेट अंश को स्थानांतरित करें।
  5. अनुमानित प्रोटीन एकाग्रता24 और पतला प्रोटीन एलिकोट्स (15 मिलीग्राम एमएल-1 में 50 मिलीग्राम एमएल-सीएसओएच या -नाओएच, पीएच 7.8 जिसमें 50 एमएम सीएससीएल या एनएसीएल होते हैं। प्रोटीन का नमूना 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. 3x 24-अच्छी तरह से बैठे ड्रॉप प्लेटों के लिए 500 μL जलाशय समाधान बाँझ 1.5 मिलीएल लेबल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में तैयार करें। जलाशय समाधान में 50 m M bicine-CsOH या -NaOH, 50 mM CsCl या NaCl, और खूंटी 8000 शामिल हैं। प्लेट कॉलम पर खूंटी 8000 (6-11%) की एकाग्रता और प्लेट पंक्तियों पर शुक्राणु (2-8 mM) की एकाग्रता भिन्न होती है। प्रत्येक सेट के लिए बफर पीएच (पीएच 7.6, 7.8 और 8.0) बदलें।
  7. ट्यूबों और भंवर को कम से कम 10 सेकंड की सख्ती से कैप करें। बुलबुले को हटाने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइजट्यूब। प्रत्येक लेबल जलाशय में 500 माइक्रोन बफर समाधान वितरित करें।
  8. पी-10 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें और प्रत्येक बैठे बूंद के अनुसार 15 मिलीग्राम एमएल-1 पर प्रोटीन समाधान के 5 माइक्रोन वितरित करें। बुलबुले से बचें। प्रोटीन ड्रॉप करने के लिए प्रत्येक संवाददाता जलाशय समाधान के 5 माइक्रोन जोड़ें । मिश्रण के दौरान बुलबुले से बचें और मिश्रण को समरूप बनाने के लिए ऊपर और नीचे पाइपेट न करें।
  9. प्लेट को पारदर्शी चिपकने वाले टेप से टेप करें और प्लेट को 25 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। क्रिस्टल 2-5 दिनों में दिखाई देते हैं और दो सप्ताह के भीतर अपने पूर्ण आयामों तक बढ़ते हैं।

4. एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह और 2 β2सेंटटीएस जटिल संरचना समाधान α

नोट: एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह से पहले, प्रत्येक क्रिस्टल के लिए क्रायोप्रोटेक्टिव समाधान पहले से तैयार करें। समाधान (10, 20, और 30% v/v) और विशिष्ट लिगांड (एस) में डी इमेथाइल सल्फोक्साइड की बढ़ती सांद्रता वाले 3 एलिकोट्स तैयार करने के लिए विशिष्ट जलाशय समाधान का उपयोग करें। डिमेथिल सल्फॉक्साइड ग्लाइसेरोल, एथिलीन ग्लाइकोल और खूंटी 200-300 की तुलना में बेहतर क्रायोप्रोप्रोटेक्टेंट पाया गया ।

  1. स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के नीचे क्रायोलोप का उपयोग करके एक बड़े एकल क्रिस्टल को काटें।
  2. प्रत्येक क्रायोप्रोप्रोटेक्वेंटी समाधान का पिपेट 2 माइक्रोन जिसमें वर्षा समाधान के साथ-साथ डीइमेथाइल सल्फोक्साइड और लिगांड (एस) की उच्च सांद्रता एक नई कवर स्लाइड पर होती है।
  3. क्रमिक रूप से, प्रत्येक बूंद में सीरिस्टल सोख लें और क्रिस्टल को क्रायोप्रोटेक्टिव समाधान में 30 एस के लिए बराबर कर दें।
  4. -173 डिग्री सेल्सियस (100 K) पर गैसीय नाइट्रोजन धारा का उपयोग करके क्रायोप्रोटेक्टेड क्रिस्टल को फ्लैश-कूलिंग करें या पक में दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में विसर्जित करें।
    नोट: तरल नाइट्रोजन के साथ एक फोम देवर भरें, एक क्रिस्टल पक को पूर्व-ठंडा करें, क्रायोजेनिक स्टोरेज देवर में क्रिस्टल स्टोर करें, और सूखे शिपर का उपयोग करके सिंक्रोट्रॉन को क्रिस्टल शिप करें।
  5. -173 डिग्री सेल्सियस पर एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के साथ आगेबढ़ें। 0.5-4.0 एस एक्सपोजर समय और 0.5 डिग्री दोलनों का उपयोग करके एक्स-रे विवर्तन डेटा रिकॉर्ड करें। क्रिस्टल 180-360 ° घुमाएं।
  6. उपयुक्त अंतरिक्ष समूह में प्रतिबिंब फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए iMosflm27 के साथ एक्स-रे विवर्तन छवियों को संसाधित करें। आम तौर पर,α 2β2सेंटटीएस क्रिस्टल अंतरिक्ष समूह सी सी 121 (C2) से संबंधित हैं।
  7. सीसीपी 4 पैकेज29में लागू स्कैला28के साथ प्रतिबिंबों की कई टिप्पणियों को एक साथ स्केल करें ।
  8. मोलरेप30 और एक उपयुक्त खोज मॉडल का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन द्वारा2β2सेंटटीएस परिसर α उच्च-रिज़ॉल्यूशन की संरचना को हल करें। एक सफल संरचना समाधान के बादकूट 31 में मॉडल और इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र का निरीक्षण करें।
    नोट: प्रोटीन डेटा बैंक में विभिन्न लिगांड (एस) के साथ जमा कई टीएस क्रिस्टल संरचनाएं हैं। एक बेहतर आणविक प्रतिस्थापन चरण के लिए और नए क्रिस्टल संरचना को फिट करने के समय में कमी आई है, ब्याज की लिगांड (एस) युक्त सर्वोत्तम खोज मॉडल का उपयोग करें। सीसीपी 429,30 या फेनिक्स31 में क्रिस्टल संरचना शोधन के साथ आगे बढ़ें ।
  9. कूट 32का उपयोग करके मॉडल में मैन्युअल समायोजन करें , इसके बाद रिफले29,33 या फेनिक्स.रिफाइन31,34के साथ स्वचालित रूप से परिष्करण करें । कूट32 और स्वचालित शोधन में मॉडल निर्माण के पुनरावर्तक दौर चलाकर अंतिम मॉडल का निर्माण और शोधन करें।
  10. प्रोटीन डेटा बैंक वेब साइट में समन्वय और संरचना कारकों के साथ आगे बढ़ें।

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Representative Results

α की शुद्धि - और β-ट्रिप्टोफान सिंथास की उपइकास
साल्मोनेला टाइफूरियम ट्राइप्टोफान सिंथेस के α-सबयूनिट(αStटीएस) और β-सबयूनिट (βसेंटटीएस) को संशोधित पीईटी सुमो वेक्टर में उप-कालिक किया गया था। चित्रा 1A दो मजबूत His6-SUMO-αसेंटटीएस (लेन αON) और His6-SUMO-βसेंटटीएस (लेन αON) संलयन प्रोटीन के अनुरूप बैंड के प्रतिनिधि SDS-पृष्ठ परिणाम से पता चलता है । इस कार्य में वर्णित शुद्धिकरण प्रोटोकॉल ने 2 दिनों के भीतर व्यक्तिगत रूप से दोनों उपइकाओं के शुद्धिकरण की अनुमति दी। पहले दिन नी-एनटीए आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी, अमोनियम सल्फेट वर्षा द्वारा प्रत्येक प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था उसके बाद अपने-SUMO टैग दरार, उसके-SUMO टैग निशान को हटाने, और प्रोटीन एकाग्रता । चित्रा 1B और 1C शो प्रतिनिधि SDS-α-सबयूनिट और β-सबयूनिट शुद्धिकरण के पृष्ठ परिणाम, क्रमशः । दूसरे दिन α से α-सबयूनिट, β-सबयूनिट और α2 β 2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स और β-सबयूनिट को साइज अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर लोड किया गया। चित्रा 1D एस-200 एचआर आकार अपवर्जन कॉलम पर αStटीएस, βसेंटटीएस, और α2β2सेंटटीएस परिसरों की एक विशिष्ट एल्यूशन प्रोफ़ाइल दिखाता है। चित्रा 1E एकत्र शिखर अंशों के एक प्रतिनिधि SDS-पेज परिणाम से पता चलता है । शुद्धतम चोटी के अंशों को पूल किया गया था, केंद्रित किया गया था, और प्रोटीन क्रिस्टलीकरण अध्ययन β लिए2βसेंटटीएस परिसर के α का उपयोग किया गया था।

जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती α2β2सेंटटीएस परिसर काशुद्धिकरण
इस काम में 2 β2एस टाइफिमुरियम ट्राइप्टोफन सिंथास कॉम्प्लेक्स α के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती रूप को शुद्ध करने के लिए एक और तेजी से और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। चित्रा 2 पीईबीए-10 के निर्माण का प्रतिनिधित्व दिखाता है जिसमें α के लिए जंगली प्रकार के अनुवादी कपलिंग जीन (टीआरपीए और टीआरपीबी) एन्कोडिंग और β-सबयूनिट22शामिल हैं । 2 α β2सेंटटीएस परिसर के उत्परिवर्ती रूपों को उत्पन्न करने के लिए दो-स्टेप पीसीआर म्यूटेनेसिस प्रोटोकॉल को चित्र 3में दर्शाया गया है।

pEBA10 में उत्परिवर्ती α2β2सेंटटीएस परिसर के कोडिंग क्षेत्रों डीएनए अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की गई थी और ई कोलाई तनाव CB149 कोशिकाओं को बदलने के लिए इस्तेमाल किया26। 2 β2सेंटटीएस परिसर α के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती रूप को अतिव्यक्त किया गया था और 1-2 दिनों के भीतर पुनर्संयोजन प्रोटीन को सफलतापूर्वक शुद्ध किया गया था। कमरे के तापमान पर अमोनियम सल्फेट अंश आसानी से विषम अभिव्यक्ति प्रणाली से संदूषक प्रोटीन के अधिकांश हटा दिया(चित्रा 4A,लेन 20P, 30P और 40S)। एक हाईप्रिप16/60सेफक्राइल एस-200 एचआर आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर α 2 β2सेंटटीएस (143.06 केडीए) परिसर के सापेक्ष एल्यूशन स्थिति के साथ एक प्रतिनिधि एल्यूशन प्रोफाइल चित्रा 4Bमें दिखाया गया है। बहिष्कृत शिखर अंशों की शुद्धता SDS-पेज पूलिंग(चित्रा 4C)से पहले विश्लेषण किया गया था ।

जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती α2β2ट्रिप्टोफान सिंथेस जटिल क्रिस्टलीकरण का अनुकूलन
जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती α2β2सेंटTScomplex के Aliquots 15 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 पर 24 अच्छी तरह से बैठे ड्रॉप प्लेटों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया गया । आमतौर पर, 5 माइक्रोन प्रोटीन समाधान और जलाशय समाधान की बराबर मात्रा से मिलकर बूंदों को जलाशय समाधान(चित्र 5)के 500 माइक्रोन के खिलाफ बराबर किया गया था। शुक्राणुओं को जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती α2β 2सेंटटीएस परिसर22को क्रिस्टलाइज करने की आवश्यकता होती है। जबकि जंगली प्रकार को क्रिस्टलाइज करने के लिए शुक्राणुओं की अंतिम एकाग्रता 2 mM है, इस काम में उत्परिवर्ती परिसर को क्रिस्टलाइज करने के लिए शुक्राणुओं की एकाग्रता थोड़ी अधिक (4-8 mM) दिखाई दी।

एक ठीक क्रिस्टलीकरण अनुकूलन के माध्यम से बड़े एकल क्रिस्टल प्राप्त किए गए थे, जो खूंटी 8000 (6-11%) और बाइसिन बफर पीएच को अलग-अलग करते थे। विभिन्न मॉर्फोलोजी के साथ क्रिस्टल 2-5 दिनों में दिखाई दिए और क्रिस्टल दो सप्ताह(चित्र 6)के भीतर पूर्ण आकार में बढ़ गए। एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह से पहले, क्रिस्टल को क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान (जलाशय बफर जिसमें 30% डिमेथाइल सल्फोक्साइड होता है) में भिगोया गया था। अनुकूलित प्रक्रिया के परिणामस्वरूप परमाणु संकल्प के पास एक्स-रे विवर्तन मापन के लिए उपयुक्त गुणवत्ता क्रिस्टल होते हैं।

एक्स-रे विवर्तन डेटा विश्लेषण
2 β2सेंटटीएस परिसर α जंगली प्रकार की एक क्रिस्टल संरचना इस लेख में वर्णित तरीकों के साथ तैयार की गई थी और एक्स-रे विवर्तन डेटा निकट परमाणु संकल्प पर एकत्र किया गया था। क्रिस्टल को क्रायोप्रोटेक्टिव सॉल्यूशन में भिगोया गया था जिसमें F9 अवरोधक (2-{[4-(Trifluoromethoxy)Phenyl]Sulfonyl}Amino) एथिल डिहाइड्रोजन फॉस्फेट) और एल-ट्रिप्टोफान शामिल थे ।

0.5 डिग्री की वेतन वृद्धि में क्रिस्टल 360 डिग्री घुमाकर उन्नत प्रकाश स्रोत (बर्कले-सीए) पर एसआईबीवाईएलएस सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन 12.3.1 पर एक पूर्ण एक्स-रे विवर्तन डेटा सेट एकत्र किया गया था। एक्स-रे विवर्तन तीव्रता को संसाधित किया गया था, और डेटा-संग्रह के आंकड़ों को तालिका 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। सममितता विश्लेषण इंगित करता है कि क्रिस्टल मोनोक्लिनिक स्पेस ग्रुप C2 से संबंधित था। यूनिट-सेल पैरामीटर एक = 182.55, बी = 59.30, सी = 67.37Å, α = 90.00, β = 94.82, γ = 90.00 डिग्री हैं। मैथ्यू गुणांक (वीएम = 2.57 Å3 Da-1)का गणना मूल्य क्रिस्टल की असममित इकाई में एक टीएस विषम अणु (αο StTS) की उपस्थिति का सुझाव देता है जिसमें 52.08%35,36की सॉल्वेंट सामग्री होती है। विवर्तन गुणवत्ता में सुधार और विकिरण क्षय को कम करने के लिए सभी एक्स-रे डेटा कम तापमान (100 K) पर एकत्र किए गए थे। परिसर में2β2सेंटटीएस क्रिस्टल संरचना α को आणविक प्रतिस्थापन विधि द्वारा हल किया गया था, जिसमें धातु समन्वय साइट (पीडीबी आईडी कोड: 4HT3) पर α साइट और सीज़ियम आयन पर अवरोधक F9 के साथ परिसर में जंगली प्रकार αο StTS मॉडल का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन विधि द्वारा हल किया गया था। अंतिम समन्वय फ़ाइल और संरचना कारकों को परिग्रहण कोड 5CGQ(चित्रा 7A)के साथ पीडीबी में जमा किया गया था। 2 β2सेंट टीएस परिसर में एंजाइम α साइट(चित्रा 7B),धातु समन्वय साइट(चित्रा 7C),कोफैक्टर पाइरिडॉक्सल पर सीजियम आयन पर अवरोधक F9 के साथ 2 β2सेंटटीएस परिसर के α की क्रिस्टल संरचना 5'-फॉस्फेट को एक प्रकार से बंधुआ किया गया है, जो 1.18 एंगस्ट्रॉम रिज़ॉल्यूशन पर एंजाइम β-साइट(चित्रा 7E)में उत्पाद एल-ट्रिप्टोफान है। मॉडल 5CGQ 2 β2सेंटटीएस क्रिस्टल संरचना α सबसे अधिक संकल्प है जो पीडीबी में आज तक जमा किया गया है।

Figure 1
चित्र 1: α और β-उपइकाओं का शुद्धिकरण और 2 β2सेंटटीएस परिसरα। (क) रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन एक्सप्रेशन । 30 डिग्री सेल्सियस (α/0 पूर्व आईपीटीजी इंडक्शन) पर आईपीटीजी इंडक्शन के बाद सूमो-αसेंटटीएस (αON) और सूमो-βएसटीटीएस (αON) के रातोंरात अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के 12% एसडीएस-पेज जेल। (बी, सी) नी-एनटीए आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी के बाद अमोनियम सल्फेट वर्षा (६०% संतृप्ति), (एस) स्पष्ट कच्चे तेल निकालने (FT1) नी-एनटीए कॉलम नमूना (डब्ल्यू) कॉलम धोने का नमूना (ई) eluate नमूना (60S) और (60P) के माध्यम से गुजरती है उच्च गति अपकेंद्रित्र के बाद अंश, क्रमशः (डी) सूमो-प्रोटीज पाचन उत्पाद (FT2) नी-एनटीए कॉलमसेंटटीएस या βसेंटटीएस सबयूनिट α टैग-कम वाले नमूने से गुजरता है। (D)αसेंटटीएस सबयूनिट (२८.६७ केडीए), βसेंटटीएस सबयूनिट (४२.८६ केडीए) और α2β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स (१४३.०६ केडीए) के साथ एक हाईप्रीप 16/60 सेफक्रिल एस-२०० साइज एचआर वर्जन क्रोमेट कॉलम । प्रत्येक रन अलग से किया गया था । (ई)प्रत्येक व्यक्ति क्रोमेटोग्राफी से बहिष्कृत चोटी अंशों के एसडीएस-पेज जैल। जबकि 15% एसडीएस-पेज जैल 2 β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स और αसेंटटीएससबयूनिट α विश्लेषण करने के लिए तैयार किया गया था, एक 12% SDS-पेज जेलसेंटटीएस सबयूनिट β का विश्लेषण करने के लिए तैयार किया गया था । केडीए में लेन मेगावाट, आणविक वजन मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: निर्माण पीईबीए-10 का प्रतिनिधित्व। (A)जंगली प्रकार का प्रतिनिधित्व ट्रांसलेशनली कपलिंग जीन (टीआरपीए और ट्रापबी) αको एन्कोडिंग करते हैं - और जीवाणु साल्मोनेला एंटिका सेरोवर टाइफुरियम (यांग, अहमद एट अल 1 99 6) से ट्राइप्टोफान सिंथेस के β-उपइकाइट्स। (ख)वेक्टर में एक एम्पीसिलिन प्रतिरोध (amp) जीन, एक प्रतिकृति मूल (ओरी), एक lacIक्यू जीन आईपीटीजी प्रेरक की अनुपस्थिति में एक लाख प्रमोटर को बेहतर तरह से बंद करने के लिए, और LacI दमित प्रमोटर शामिलहैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: दो कदम पीसीआर म्यूटागेनिसिस प्रोटोकॉल का समग्र प्रतिनिधित्व। पीईबीए-10 वेक्टर का इस्तेमाल डीएनए टेम्पलेट के तौर पर किया गया था । पीसीआर का पहला दौर प्राइमर टीएस-एफडब्ल्यू-एनकोई और म्यूट-रेव (म्यूटेशन युक्त रिवर्स प्राइमर) के साथ तैयार किया गया था ताकि दूसरा टुकड़ा उत्पन्न करने के लिए पहला टुकड़ा और प्राइमर टीएस-रेव-सैसी और म्यूटेशन युक्त फॉरवर्ड प्राइमर उत्पन्न किया जा सके। टुकड़े जेल शुद्ध और समान रूप से संयुक्त, गर्मी विकृत, और annealed थे । रीकॉम्बिनेंट किस्में पॉलीमेरेज और डिऑक्सीरिबोक्यूक्लियोटाइड्स के साथ विस्तारित की गई थीं। पीसीआर का दूसरा राउंड प्राइमर्स टीएस-एफडब्ल्यू-नाकेई और टीएस-रेव-सैसी के साथ तैयार किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: जंगली प्रकार का शुद्धिकरण और 2 β2सेंटटीएस परिसरα केउत्परिवर्तीरूप। (ए)अमोनियम सल्फेट वर्षा के साथ एकत्र नमूनों के 12% एसडीएस-पेज जेल कमरे के तापमान पर 20, 30, ४० और ५०% अमोनियम सल्फेट संतृप्ति का उपयोग कर: (सीई) क्रूड निकालने (एस) और (पी) उच्च गति अपकेंद्रित्र के बाद अलौकिक और तेज़ अंश । (ख)α2β2सेंटटीएस (१४३.०६ केडीए) कॉम्प्लेक्स का एल्यूशन प्रोफाइल जिसमें हाईप्रेप 16/60 सेफहैक्रिल एस-२०० एचआर साइज अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम है । (ग)12% एसडीएस-पेज जेल की तस्वीर बहिष्कृत चोटी के अंशों की। लेन मेगावाट, केडीए में आणविक वजन मार्कर (सटीक प्लस प्रोटीन अन दाग मानक, जैव रेड) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: जंगली प्रकार के लिए क्रिस्टलीकरण अनुकूलन और 2 β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्सα केउत्परिवर्तीरूप। क्रिस्टल 50 m M Bicine-CsOH बफर में उगाए गए थे जिसमें 50 mm CsCl2होता है। एक्स-रे प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी द्वारा संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए पॉलीथीन ग्लाइकोल 8000 (6-11%) और शुक्राणु (2-8 mM) की एकाग्रता एक बड़े क्रिस्टल रूपों को प्राप्त करने के लिए भिन्न थी। (A)बाइसिन-सीएसओएच, पीएच 7.6। (ख)बाइसिन-सीएसओएच, पीएच 7.8। (ग)बाइसिन-सीएसओएच, पीएच 8.0। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: जंगली प्रकार के क्रिस्टल का फोटोमाइक्रोग्राफ और 2 β2सेंट टीएस कॉम्प्लेक्सα उत्परिवर्तीरूप। क्रिस्टल आकृति विज्ञान में भिन्न होते हैं, लेकिन वे अंतरिक्ष समूह C2 से संबंधित हैं। क्रिस्टल दो सप्ताह के बाद अंतिम परिस्थितियों में अपने पूर्ण आयामों के लिए वृद्धि हुई । आकार में लगभग 0.20 x 0.15 x 0.10 मिमी के क्रिस्टल। (ए-डी) जंगली प्रकार के रूप (कॉलम ए), उत्परिवर्ती रूप α2β 2 q114A (कॉलम बी), α 2 β2 β2 οK167T (कॉलम सी), और α2β2ss377A (कॉलम डी) के धातु समन्वय स्थल पर सीज़ियम आयन के साथ परिसर में पीएलपी होलो-क्रिस्टल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: क्रिस्टल संरचना का समग्र दृश्य और क्रिस्टल संरचना शोधन के बाद प्राप्त इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्रों का सत्यापन। (A)एंजाइम α साइट (पीलेरंग), धातु समन्वय साइट (नीले रंग), कोफैक्टर पाइरिडॉक्स पर अवरोधक F9 के साथ 2 β2सेंटटीएस परिसर α जंगली प्रकार की क्रिस्टल संरचना 5'-फॉस्फेट सहसंयोजक 1.18 एंगस्ट्रॉम रिज़ॉल्यूशन पर एंजाइम β-साइट (सियान रंगीन) में 1.18 87 (हरे रंग) से बंधुआ। जहां α सबयूनिट हल्के नीले रंग में रंगा होता है, वहीं β सबयूनिट को सामन में रंग दिया जाता है। (बी-ई) इलेक्ट्रॉन घनत्व के नक्शे(बी.m)अवरोधक F9(C)सी) सीज़ियम आयन(D)पायरिडॉक्सल-5′-फॉस्फेट, और(ई)एल-ट्रिप्टोफान के आसपास 1.0 आर.4.s स्तर पर समोच्च। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डेटा संग्रह और प्रसंस्करण
एक्स-रे स्रोत/ एएलएस बीमलाइन 12.3.1
तरंगदैर्ध्य (Å) 10,000
संकल्प (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
प्रतिबिंब की कुल संख्या 2151280 (252941)
कुल संख्या अद्वितीय प्रतिबिंब 231646 (32187)
इंडेक्सिंग, स्केलिंग और विलय के लिए अंतरिक्ष समूह सी 1 2 1
सेल आयाम
ए, बी, सी (Å) 182.55, 59.30, 67.37
α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
मोज़ेकिटी 0.61
मैथ्यू वॉल्यूम वीएम (Å3 Da-1) 2.57
आरमेस (%) 8.6 (93.0)
<मी/σ (I) > 14.7 (3.0)
CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
पूर्णता (%) 98.6 (94.2)
बहुलता 9.3 (7.9)
परिष्करण के आंकड़े
Rwork/Rfree (%) 14.04 / 16.05
आरएमएसडी बॉन्ड लंबाई (Å) 0.0120
आरएमएसडी बॉन्ड एंगल (°) 14,059
रामचंद्रन इष्ट 515 (96.44%)
रामचंद्रन की अनुमति 16 (3.00%)
रामचंद्रन की अनुमति नहीं 3 (0.56%)

तालिका 1: डेटा संग्रह और प्रसंस्करण। कोष्ठक में मान बाहरी खोल के लिए हैं।

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Discussion

हमने संरचना-कार्य संबंध अध्ययनों α के लिए 2 β2α β2 β2β2 β म्यूटेंट फॉर्म αको सफलतापूर्वक इंजीनियर किया है। प्रारंभ में, हमने पिछले शुद्धिकरण प्रोटोकॉल22का उपयोग करके म्यूटेंट को शुद्ध करने की कोशिश की है, जिसके लिए2α β2सेंटटीएस जटिल क्रिस्टलीकरण की आवश्यकता होती है, जो खूंटी 8000 और शुद्धि के दौरान शुक्राणु के साथ। हालांकि क्रिस्टलीकरण दर उत्परिवर्ती रूप और समाधान में परिसर की एकाग्रता पर निर्भर करती है, जब क्रिस्टल एक बड़े समाधान की मात्रा में दिखाई देते हैं तो भविष्यवाणी करना मुश्किल होता है। क्रिस्टलीकरण या तो लंबी अवधि (48-96 एच) के बाद प्राप्त किया जा सकता है या आवश्यक होने के नाते क्रिस्टलीकरण दीक्षा15के बाद खूंटी 8000 की अतिरिक्त मात्रा में जोड़ दिया जा रहा है।

दुर्भाग्य से, इस कार्य में प्रस्तुतα 2β 2सेंटटीएस परिसर के उत्परिवर्ती रूपों को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सफलतापूर्वक शुद्ध नहीं किया गया क्योंकि वे प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरणों केदौरानक्रिस्टलाइज करने में विफल रहे, क्रिस्टलीय अध्ययन को ख़राब कर रहे थे। इसलिए, हमने एक सरल और कुशल शुद्धिकरण प्रोटोकॉल बनाया है जिसमें अमोनियम सल्फेट आंशिकता और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी शामिल है, जो जंगली प्रकार की उच्च पैदावार देता है और2β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स α का उत्परिवर्ती रूप देता है । यह प्रोटोकॉल तेज (1-2 दिन) और पिछले प्रोटोकॉल (5-7 दिन)15,22की तुलना में पुन: उत्पन्न होता है, क्योंकि शुद्धिकरण के साथ कोई क्रिस्टलीकरण आवश्यकताएं और प्रोटोकॉल समस्या निवारण नहीं होता है। इसके अलावा, हमने α-सबयूनिट, β-सबयूनिट और2β2सेंटटीएस कॉम्प्लेक्स α पुनर्गठन की उच्च मात्रा को अलग करने के लिए नए अभिव्यक्ति निर्माण और प्रोटोकॉल बनाए हैं।

भविष्य के आवेदन में कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उप-इकाइयों का पुनर्संयोजन शामिल है। उत्परिवर्ती α2β 2q114A, α2β 2 0K167T, और α2β2 sS377A जटिल शुक्राणुओं की उच्च सांद्रता वाली स्थितियों में सघन (4-8 mM) जब जंगली प्रकार के रूप (2 mM) के साथ तुलना में । इसलिए, यह तेज़ और बफर पीएच की एकाग्रता को अलग करके प्रोटीन क्रिस्टल की गुणवत्ता में सुधार करने पर समय बिताना सार्थक है। एकल बड़े क्रिस्टल रूपों बेतरतीब ढंग से बाइसिन बफर समाधान (पीएच 7.6-8.0) में वृद्धि हुई जिसमें 6-11% खूंटी 8,000 होता है। इस काम में वर्णित तरीकों का उपयोग जंगली प्रकार की क्रिस्टल संरचनाओं और α2β2 परिसर के क्रिस्टल संरचनाओं को तैयार करने के लिए किया जाएगा, जिसमें α के भीतर विभिन्न लिगामेंट्स और β-सक्रिय साइटें, ट्राइप्टोफान के लिए इंडोल और सेरीन के रूपांतरण में शामिल विभिन्न मध्यवर्ती और संक्रमण राज्यों की नकल करते हैं। इन म्यूटेंट की क्रिस्टल संरचनाओं को एल-ट्रिप्टोफान संश्लेषण में प्रमुख अवशेषों द्वारा निभाई गई तंत्र और भूमिकाओं में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने का अनुमान है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा की है ।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिका के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (GM097569) ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL 10 kDa filter MilliporeSigma UFC901024 centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter MilliporeSigma UFC910024 centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials Corning CLS430489 Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-141 microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate Hampton Research HR3-158 24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100 Chemical
50 mL centrifuge conical tubes Thermo Scientific 12-565-270 centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic Fisher Scientific 13-636-AB15 pH meter
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 Agarose gel
ammonium sulfate Fisher Scientific A702-500 Chemical
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5 Antibiotic
Bacterial incubator Fisher Scientific S35836 incubator.
BamHI New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
bicine Fisher Scientific BP2646100 Chemical
Branson 450 Digital Sonifier Brason B450 Cell disruptor
Cesium chloride Fisher Scientific BP210-100 Chemical
Cesium hydroxide Acros Organics AC213601000 Chemical
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 Antibiotic
dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D1391 Chemical
dithiothreitol Fisher Scientific BP172-5 Chemical
DNA Polymerase Thermo Scientific F530S HF polymerase
dNTP Set Invitrogen 10-297-018 dNTPs set
EcoRI New England Biolabs R0101S Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chemical
Excella E25R Orbital Shaker Eppendorf New Brunswick M1353-0004 Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus GE Healthcare 8149-30-0004 FPLC
Gel Extraction Kit Invitrogen K210012 DNA purification kit
Glycerol Fisher Scientific G33-500 Chemical
HindIII New England Biolabs R0104S Restriction enzyme
His-Trap columns GE Healthcare GE17-5255-01 5 mL Histrap column
imidazole Fisher Scientific O3196-500 Chemical
IPTG Thermo Fisher Scientific R0392 Inducer
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Antibiotic
Kelvinator Series-100 Kelvinator discontinued Ultra low freezer
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Liquid broth
Luria Bertani agar Fisher Scientific BP1425-2 Solid broth
NaCl Fisher Scientific S271-500 Chemical
NcoI New England Biolabs R0193S Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads Thermo Fisher Scientific R90115 Ni-NTA agarose beads
PEG 8000 Fisher Scientific BP233-100 Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific 44-865-0 Chemical
pyridoxal phosphate Acros Organics AC228170010 Chemical
S-200 HR Cytiva 45-000-196 Size exclusion column
SacI New England Biolabs R0156S Restriction enzyme
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge Sorvall 8327-30-1004 Floor cetrifuge
Spermine Acros Organics AC132750010 Chemical
Superdex 200 prep grade Cytiva 45-002-491 Size exclusion column
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S DNA liagse
Tris Fisher Scientific BP152-500 Chemical
Ubl-specific protease 1 Thermo Scientific 12588018 SUMO Protease

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References

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