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Biology

Membrane lipidiche a doppio strato tethered per monitorare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro e membrane lipidiche

Published: December 8, 2020 doi: 10.3791/61851
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 1,2, 3, 2,4, 1,2,5
1School of Life Sciences, University of Technology Sydney, 2ARC Research Hub for Integrated Devices for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL), Faculty of Science, University of Technology Sydney, 3School of Mechanical and Manufacturing Engineering, The University of New South Wales, 4Surgical Diagnostics Pty Ltd., 5Institute for Biomedical Materials and Devices, University of Technology Sydney

Summary

Questo lavoro delinea un protocollo per ottenere un monitoraggio dinamico e non invasivo del trasferimento di calore dalle nanoparticelle d'oro irradiate al laser ai tBLM. Il sistema combina la spettroscopia di impedenza per la misurazione in tempo reale delle variazioni di conduttanza attraverso i tBBM, con un raggio laser focalizzato orizzontalmente che guida l'illuminazione delle nanoparticelle d'oro, per la produzione di calore.

Abstract

Qui riportiamo un protocollo per studiare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro irradiate (GNP) e membrane lipidiche a doppio strato mediante elettrochimica utilizzando membrane lipidiche a doppio strato (tBLM) assemblate su elettrodi d'oro. I GNP modificati irradiati, come i GNP coniugati con streptaviduina, sono incorporati in tBBM contenenti molecole bersaglio, come la biotina. Utilizzando questo approccio, i processi di trasferimento di calore tra GNP irradiati e membrana lipidica a doppio strato modello con entità di interesse sono mediati da un raggio laser focalizzato orizzontalmente. Il modello computazionale predittivo termico viene utilizzato per confermare i cambiamenti di conduttanza indotti elettrochimicamente nei tBBM. Nelle condizioni specifiche utilizzate, il rilevamento di impulsi di calore richiedeva l'attaccamento specifico delle nanoparticelle d'oro alla superficie della membrana, mentre le nanoparticelle d'oro non legate non riuscivano a suscitare una risposta misurabile. Questa tecnica funge da potente biosensore di rilevamento che può essere utilizzato direttamente per la progettazione e lo sviluppo di strategie per terapie termiche che consentono l'ottimizzazione dei parametri laser, della dimensione delle particelle, dei rivestimenti di particelle e della composizione.

Introduction

Le prestazioni ipertermiche dei nanomateriali d'oro irradiati offrono una nuova classe di trattamento minimamente invasivo, selettivo e mirato per infezioni e tumori1. L'impiego di nanoparticelle che possono essere riscaldate da un laser è stato utilizzato per distruggere selettivamente le cellule malate e fornire un mezzo per la somministrazione selettiva di farmaci2,3. Una conseguenza dei fenomeni di fototermolisi delle nanoparticelle plasmoniche riscaldate è il danno alle membrane cellulari. La membrana a doppio strato lipidico fluido è considerata un sito particolarmente vulnerabile per le cellule sottoposte a tali trattamenti perché la denaturazione delle proteine intrinseche di membrana e il danno alla membrana possono anche portare alla morte cellulare4, poiché molte proteine sono lì per mantenere il gradiente potenziale ionico attraverso le membrane cellulari. Mentre la capacità di determinare e monitorare il trasferimento di calore su scala nanometrica è di fondamentale interesse per lo studio e l'applicazione dei GNP irradiati1,5,6,7, la valutazione e la comprensione delle interazioni molecolari tra GNP e biomemerne, nonché le conseguenze dirette dei fenomeni di riscaldamento indotti dal laser dei GNP incorporati nei tessuti biologici, devono ancora essere pienamente chiariti8. Pertanto, una conoscenza approfondita del processo di ipertermia dei GNP irradiati rimane una sfida. Pertanto, lo sviluppo di un'interfaccia nanomateriale-elettrodo che imita l'ambiente naturale delle cellule potrebbe fornire un mezzo per intraprendere un'indagine approfondita delle caratteristiche di trasferimento di calore delle nanoparticelle d'oro irradiate all'interno dei sistemi biologici.

La complessità delle membrane cellulari native è una delle sfide significative nella comprensione delle interazioni dei GNP irradiati nelle cellule. Sono state sviluppate varie piattaforme di membrana artificiale per fornire versioni bio-mimetiche semplici dell'architettura e della funzionalità della membrana lipidica naturale, tra cui, ma non solo, membrane lipidiche nere9,membrane a doppio strato planare supportate10,membrane ibride a doppio strato11,membrane a doppio strato lipidico ammortizzate con polimeri12 e membrane lipidiche a doppio strato legate13. Ogni modello di membrana lipidica artificiale presenta vantaggi e limitazioni distinti rispetto all'imitazione delle membrane lipidiche naturali14.

Questo studio descrive l'impiego di elettrodi rivestiti di membrana lipidica come sensore per valutare le interazioni tra nanoparticelle d'oro e membrana lipidica, utilizzando il modello tBLM. Lo schema di rilevamento del biosensore basato su tBLM fornisce stabilità e sensibilità intrinseche13 in quanto le membrane legate possono autoriparazione, a differenza di altri sistemi (come le membrane formate da patch-clamp o liposomi) in cui solo una piccola quantità di danni alla membrana provoca il loro collasso15,16,17,18. Inoltre, poiché i tBBM sono di dimensioni mm2, l'impedenza di fondo è di ordini di grandezza inferiore rispetto alle tecniche di registrazione patch-clamp, che consente una registrazione dei cambiamenti nel flusso ionico della membrana basale dovuti alle interazioni delle nanoparticelle. Di conseguenza, il presente protocollo può contrastare i cambiamenti nella conduttanza della membrana da parte di GNP legati che sono eccitati da laser le cui potenze sono basse come 135 nW / μm2.

Il sistema qui presentato fornisce un metodo sensibile e riproducibile per determinare precisi parametri laser, dimensione delle particelle, rivestimenti di particelle e composizione necessari per progettare e sviluppare terapie termiche. Questo è fondamentale per il perfezionamento delle terapie fototermiche emergenti, oltre a offrire preziose informazioni per meccanismi dettagliati di trasferimento di calore all'interno dei sistemi biologici. Il protocollo presentato si basa sul lavoro precedentemente pubblicato19. Uno schema del protocollo è il seguente: la prima sezione definisce la formazione di tBLM; la seconda sezione delinea come costruire il setup e allineare la sorgente laser di eccitazione; la sezione finale illustra come estrarre informazioni dai dati della spettroscopia di impedenza elettrica.

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Protocol

1. Preparazione degli elettrodi tBLM

  1. Preparazione del primo rivestimento monostrato
    1. Immergere un vetrino per microscopio con elettrodi con schema in oro appena sputtered in una soluzione etanolica composta da un rapporto 3 mM 1:9 di molecole "distanziatore" benzil-disolfuro-tetra-etilenglicole-OH (il disolfuro di benzile comprendeva un quattro distanziatore di ossigeno-etilenglicole, terminato con un gruppo OH) e benzil-disolfuro (tetra-etilenglicole) n = 2 molecole "legate" di c20-fitanil. Questo crea il primo strato di rivestimento a cui può essere ancorato un doppio strato.
      NOTA: L'elettrodo d'oro è realizzato evaporando 100 nm, 99,9995% di oro (oro 5n5) su vetrini in policarbonato 25 mm x 75 mm personalizzati20.
    2. Incubare gli elettrodi con il primo strato a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
    3. Risciacquare gli elettrodi d'oro immergendoli in abbondanti quantità di etanolo puro oltre i 30 s.
    4. Utilizzare il vetrino dell'elettrodo d'oro con il primo monostrato direttamente per il passaggio successivo o conservare in un barattolo pieno di etanolo puro.
    5. NOTA: per garantire l'integrità del primo strato, ridurre al minimo qualsiasi contatto diretto con le parti dorate della diapositiva
  2. Assemblaggio della prima slitta rivestita monostrato
    1. Togliere con attenzione un vetrino per elettrodi d'oro complanare dal suo contenitore usando una pinzetta, assicurandosi di non entrare in contatto con le aree modellate in cui si formeranno i tBLM.
      NOTA: Fai attenzione a identificare il lato della diapositiva su cui viene depositato l'oro.
    2. Scorrimento a secco all'aria per 1 - 2 minuti per rimuovere eventuali residui di etanolo.
    3. Posizionare l'elettrodo d'oro su una superficie asciutta, assicurarsi che l'elettrodo d'oro sia orientato correttamente con la superficie d'oro a motivi geometrici rivolta verso l'alto.
    4. Staccare il coperchio dello strato adesivo trasparente da un laminato sottile e posizionarlo sopra i 6 canali per definire ogni pozzetti.
    5. Utilizzare un rullo di pressione per rilasciare l'aria tra la slitta e lo strato adesivo trasparente, come illustrato nella Figura 1A.
      NOTA: il tempo necessario per questo passaggio dovrà essere ottimizzato dal ricercatore. In questo protocollo, i tempi vanno da 2-3 min.
    6. Introdurre non appena possibile (entro 1-2 minuti) il secondo doppio strato lipidico al primo elettrodo rivestito monostrato assemblato per l'autoassemblaggio per evitare di danneggiare il primo strato.
  3. Preparazione del secondo doppio strato lipidico
    1. Aggiungere 6 μL di 3 mM lipidi di interesse al primo pozzo dei sei pozzi scorrevoli. Non lasciare che il bordo della punta della micropipetta tocchi la superficie dorata, che può danneggiare le sostanze chimiche tethered sull'elettrodo.
      NOTA: La miscela lipidica utilizzata in questo lavoro consisteva in 3 mM 70% zwitterionico C20 diphytanyl-ether-glycero-phosphatidylcholine (DPEPC) e 30% C20 diphytandiglyceride ether lipids (GDPE) mescolati con 3 mM colesterolo-PEG-Biotina in rapporto molare 50: 1.
    2. Introdurre 6 μL della miscela lipidica negli altri pozzeli con uno spazio di 10 s tra ogni aggiunta.
    3. Incubare ogni pozzetti per esattamente 2 minuti a temperatura ambiente prima di scambiare la miscela lipidica sugli elettrodi con un tampone come PBS. Distanziare i tempi per l'aggiunta e lo scambio tampone a 10 s di distanza in modo che ogni pozzo venga incubato con il lipide per esattamente 2 minuti ciascuno.
    4. Lavare altre 3 volte con 50 μL di tampone PBS (pH 7,0). Assicurarsi di lasciare 50 μL di tampone sopra gli elettrodi in ogni momento. Non lasciare asciugare gli elettrodi.
      NOTA: La sostituzione del solvente etanolo con la soluzione acquosa in questo modo (il metodo di scambiodel solvente) consente la rapida formazione di un singolo doppio strato lipidico ancorato all'elettrodo d'oro attraverso le sostanze chimiche tethered.
  4. Test della formazione di tBLM mediante misure di spettroscopia di impedenza elettrica (EIS)
    1. Inserire il vetrino dell'elettrodo preparato in uno spettrometro a impedenza CA (ad esempio, Tethapod). Assicurarsi che lo spettrometro sia collegato tramite una porta USB a un computer che esegue il software.
    2. Aprire il software, fare clic su Setup e aprire Hardware.
    3. Impostare le impostazioni hardware in modo che utilizzino l'eccitazione CA da picco a picco di 25 mV.
    4. Impostare frequenze comprese tra 0,1 e 10.000 Hz con due passaggi per decennio per misure di impedenza rapida premere ok.
    5. Fate clic sul menu Imposta (Setup) e aprite Modello (Model).
    6. Utilizzare un modello di circuito equivalente che descriva l'elettrodo d'oro di tethering come elemento di fase costante in serie con un resistore che descrive il buffer elettrolitico e una rete parallela resistore-condensatore per descrivere il doppio strato lipidico e premere OK.
    7. Premere il pulsante Start per avviare una misurazione in tempo reale della capacità della membrana (Cm)e della conduzione della membrana (Gm). I valori Cm dei tBBM tipici dovrebbero essere nell'intervallo da 12,5 nF a 15,5 nF per le sostanze chimiche tethered al 10%21,22.
    8. Dopo aver eseguito il protocollo e terminato l'esperimento, salvare i dati.
    9. Ripeti la misurazione con il prossimo pozzo.

2. Irradiazione laser

  1. Configurazione sperimentale
    NOTA: Il sistema su misura è impostato per ogni tBLM bene individualmente.
    1. Esegui esperimenti in una scatola a prova di luce per ridurre al minimo il laser in modo pericoloso.
    2. Utilizzare una tabella ottica per impostare l'esperimento per ridurre le vibrazioni indesiderate.
    3. Posizionare il lettore di impedenza, dove è collegata la slitta dorata, su uno stadio XYZ ed elevarlo in modo tale che si trovi nel percorso della sorgente laser.
    4. Utilizzare ingranaggi microscopici di messa a fuoco grossolana per controllare l'altezza della sorgente laser per ottenere la precisione appropriata.
    5. Mirare al percorso laser lungo l'asse longitudinale della slitta dell'elettrodo.
      ATTENZIONE: Indossare sempre occhiali di sicurezza laser adatti e mantenere buoni protocolli di sicurezza laser.
    6. Consentite al laser sintonizzato selezionato di stabilizzarsi prima di iniziare l'esperimento.
      NOTA: uno schema della configurazione sperimentale è illustrato nella Figura 2A.
  2. Allineamento di elettrodi laser e oro
    NOTA: prima di iniziare, valutare sempre la potenza erogata dal laser utilizzando un misuratore di potenza per assicurarsi che ai tBBM vengano erogati solo wattaggi molto bassi.
    1. Regolare il percorso del laser o l'angolo dell'elettrodo in modo tale che il laser passi attraverso il liquido che copre l'elettrodo ed è appena visibile, in modo uniforme, sulla superficie dorata.
    2. Regolare la posizione della luce del raggio laser per ogni esperimento alzando o abbassando la sorgente del raggio laser utilizzando la regolazione fine osservando i cambiamenti nella conduttanza della membrana.
    3. Bloccare la manopola per fissare la posizione del percorso laser quando non si osservano cambiamenti di conduttanza.
      NOTA: l'aumento dei valori di conduttanza della membrana verrà generato quando il laser interagisce con l'elettrodo d'oro sottostante. È quindi importante regolare il percorso laser in modo tale che tali interazioni non siano possibili.
  3. Preparazione del campione
    1. Preparare l'allineamento della luce del fascio laser (dove non vi è alcun cambiamento nella conduttanza della membrana), come mostrato in Figura 2, posizione 3.
    2. Aggiungi GNP di interesse (funzionalizzati o nudi) al buffer PBS in cui i tBLM sono immersi mentre il laser è spento.
    3. Mescolare delicatamente il tampone PBS che circonda i tBLM tre volte, facendo attenzione a non toccare l'elettrodo.
    4. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Accendere il laser per irradiare il campione, utilizzando la corretta posizione di luce del fascio laser allineato come si vede nella Figura 2,posizione 3.
    6. Utilizzare la combinazione appropriata di dimensioni, forma e concentrazione dei GNP con la lunghezza d'onda della luce laser.
      NOTA: il raggio laser di lunghezza d'onda impostata deve accoppiarsi alla corrispondente frequenza di risonanza plasmonica PNL.
    7. Registrare continuamente la corrente misurata (misurazioni in tempo reale).
    8. Eseguire i passaggi 2.2.1 - 2.3.7, omettendo l'aggiunta di PNL per gli esperimenti di controllo.

3. Analisi e presentazione dei dati statistici

  1. Esporta i dati in un foglio di calcolo.
  2. Estrarre il parametro di conduttanza della membrana rispetto al tempo.
  3. Utilizzare i dati registrati dopo aver impostato un raggio luminoso laser con la giusta posizione e prima dell'introduzione dei GNP.
  4. Normalizzare i dati dividendo la conduttanza della membrana misurata sulla conduttanza della membrana di base.
    NOTA: Questo conferma che i cambiamenti relativi nei valori di conduzione della membrana provocati dall'introduzione di GNP irradiati.
  5. Presentare i dati come grafici del tempo (asse x) rispetto alla conduzione di membrana normalizzata (asse y).

4. Prevedere la quantità di calore localizzato generato nei tBLM da nanoparticelle irradiate (modello predittivo termico)

  1. Risolvere il problema del trasferimento delle radiazioni secondo Dombrovsky23, al fine di calcolare la potenza di radiazione assorbita in soluzioni di nanoparticelle irradiate.
  2. Calcola la generazione di calore incorporando la fonte di calore dovuta alla radiazione assorbita nell'equazione dell'energia.
    NOTA: Per una spiegazione dettagliata dell'analisi numerica della generazione di calore nei tBLM da nanoparticelle irradiate e dall'interfaccia nanomateriale-elettrodo, fare riferimento a 19.

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Representative Results

Il substrato d'oro su cui è possibile creare tBBM è mostrato nella Figura 1. Uno schema dell'impostazione sperimentale è presentato nella Figura 2.

Gli elettrodi in oro complanare, come mostrato nella Figura 1A,sono costituiti da un substrato di base in policarbonato da 25 mm x 75 mm x 1 mm con matrici d'oro modellate. Uno strato adesivo trasparente definisce le sei singole camere di misura. L'elettrodo d'oro complanare consente l'esposizione diretta della luce laser alla membrana tBLMs. Ogni pozzetti dell'array di elettrodi contiene un elettrodo di lavoro a forma di cerchio (area: 0,707 cm2) e un controelettrodo a forma di semicerchio o un elettrodo complanare (area: ~ 0,725 cm2), che sono separati da uno spazio di ~ 2 mm. Lo strato adesivo trasparente isola il resto dell'oro depositato dall'elettrolita sfuso. Al contrario, il layout dorato sottostante collega gli elettrodi di lavoro alle aree di contatto esterne alle camere di misura per fornire il collegamento elettrico al lettore EIS senza la necessità di un elettrodo di riferimento.

Il percorso laser è allineato in modo tale da interagire con i tBBM e viene disperso attraverso il buffer liquido che lo circonda, ma non in modo tale da poter interagire con il substrato d'oro sottostante. Questo è facilmente determinante tramite sollevamento e abbassamento orizzontale del laser fino a quando non viene stabilita la posizione corretta. Questa posizione è proprio nel punto in cui non è possibile osservare cambiamenti nella conduttanza della membrana. Dato che i tBLM sono formati dall'attaccamento a uno strato di substrato di oro sfuso, sembra probabile che i cambiamenti nella conduttanza della membrana in posizione 1 e 2 nella Figura 2 siano il risultato del calore delle interazioni del laser con le nanostrutture all'interno dello strato d'oro sfuso sputtered. Pertanto, utilizzando la posizione accurata dell'allineamento orizzontale del fascio di luce, concentrandosi sull'eliminazione dell'interazione tra la luce laser e il substrato d'oro sfuso trovato sotto i tBLM.

Focalizzare la luce laser orizzontale direttamente verso l'elettrodo d'oro provoca un aumento della conduttanza della membrana, come presentato in Figura 2,posizione 1 e 2. La precisa posizione del laser ha rivelato una variazione trascurabile alle registrazioni della conduttanza della membrana durante entrambi i periodi di laser ON e laser OFF(Figura 2B,posizione 3). Il campione PNL è stato aggiunto dopo aver stabilito le registrazioni di base, come mostrato nella Figura 2,posizione 3. L'aggiunta di nanoparticelle d'oro da 30 nm coniugate con streptavicina a tBBM che contenevano colesterolo biotinilato ha mostrato una chiara differenza tra i periodi laser ON e OFF, nonché rispetto alla posizione 3, con distinti aumenti dell'ampiezza della conduttanza durante la fase ON del laser(Figura 2B,posizione 4).

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del modello di membrana lipidica a doppio strato legato (tBLM) su un substrato d'oro. (A) Vetrino per elettrodi in oro complanare con sei pozzetti, definiti in ultima analisi dall'aggiunta di un sottile strato adesivo trasparente. (B) Il modello tBLM comprende distanziatori (catene di glicole etilenico terminanti con un gruppo ossidrile) e molecole tese (gruppi di glicole etilenico terminanti con catena di fitanil idrofobico) legati alla superficie del substrato d'oro per formare il primo strato. Il secondo strato include i lipidi non legati. La figura modificata era basata su Cornell et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Illustrazione del set-up del saggio per l'allineamento e delle corrispondenti variazioni di conduttanza della membrana di misura tra i tBBM derivanti dall'illuminazione laser ( λ = 530 nm). (A) Schema rappresentativo delle diverse posizioni di allineamento laser orizzontale; dove Posizione 1: fascio di luce laser allineato con il substrato dorato (quando il laser è stato acceso è indicato in rosso); posizione 2 la luce laser orizzontale mescolata con membrana e substrato dorato; posizione 3 luce laser focalizzata nel fluido sfuso che circonda i tBBM; Posizione 4 fascio di luce laser focalizzato nel fluido che circonda i tBLM in presenza di GNP sferici a 30 nm coniugati con streptavidina. (B) Le registrazioni di conduttanza normalizzate nel tempo corrispondono alle diverse posizioni di allineamento. Le posizioni 1, 2 e 3 misurano la conduttanza dei tBBM in assenza di GNP, mentre la posizione 4 è una misura della conduttanza tBLM in presenza di GNP sferici a 30 nm coniugati con streptaviduina. I valori di conduzione della membrana sono stati normalizzati al valore iniziale della conduzione della membrana alla formazione di tBBM. I risultati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive l'uso del modello tBLM con un substrato di elettrodo complanare in combinazione con un allineamento laser orizzontale impostato che consente la registrazione dell'impedenza elettrica in tempo reale in risposta all'irradiazione laser di nanoparticelle d'oro. Il metodo di registrazione EIS qui presentato costruisce un elenco minimo di esperimenti necessari per fornire la registrazione dei cambiamenti di corrente ionica attraverso la membrana, che corrisponde al calore generato dall'interazione accoppiata di laser e nanoparticelle d'oro. C'è un passo fondamentale in questo protocollo, che è l'allineamento attento e preciso del percorso laser verso il tampone che circonda la membrana lipidica a doppio strato.

L'uso del modello tBLM offre proprietà di tenuta elettrica distinte che imitano le caratteristiche delle membrane lipidiche naturali24. I tBBM forniscono anche una regione acquosa del serbatoio ionico tra il substrato d'oro e la membrana successivamente formata, dove le molecole tethered e la molecola distanziatrice avevano uno spessore di 11 Å25e lo spessore della membrana lipidica a doppio strato era di circa 6,5 nm19. Questo può offrire spazio per incorporare proteine di membrana, canali ionici o altre specifiche molecole funzionalizzate13,22. La selezione del 70% di lipidi DPEPC e 30% di GDPE fornisce una tenuta ottimale della membrana lipidica a doppio strato per esaminare le caratteristiche elettriche dei tBLM utilizzando il sistema EIS24. Allo stesso modo, l'introduzione del colesterolo all'interno delle membrane lipidiche a doppio strato imita da vicino le membrane modello biomimetiche native. Le parti di colesterolo migliorano la stabilità della membrana lipidica a doppio strato, oltre a ridurre al minimo la permeabilità della membrana agli ioni fornendo un elevato imballaggio del doppio strato fosfolipidico26,27. La combinazione di tBLM con il sistema EIS fornisce una misurazione indiretta del trasferimento di calore tra GNP irradiati e membrane lipidiche a doppio strato. Inoltre, l'uso di elettrodi d'oro complanari in questo protocollo consente le misurazioni EIS in tempo reale senza alcuna interferenza da parte di elettrodi di riferimento o di controelemento.

L'oro nella scala delle nanoparticelle ha caratteristiche fisiche e ottiche diverse rispetto agli aggregati d'oro più grandi. Le dimensioni e la forma delle nanoparticelle accedono alla loro bio-distribuzione, durata di circolazione e assorbimento cellulare, dove le nanoparticelle di dimensioni intermedie (20-60 nm) mostrano il massimo assorbimento cellulare e offrono un elevato rapporto superficie/volume, consentendo la successiva funzionalizzazione28,29. La dimensione del PNL di 30 nm implementata in questo studio rappresentava dimensioni intermedie dei GNP, mentre la selezione della lunghezza d'onda del laser era in base al picco di assorbimento dei GNP per produrre l'eccitazione più efficiente, che di conseguenza porta al riscaldamento. L'illuminazione laser delle superfici dorate tBLM eleva i picchi di conduzione della membrana nella fase ON laser. Questo si propone di essere il risultato di nanostrutture superficiali d'oro sfuse che interagiscono con il laser, che maschererebbero i fenomeni di produzione di calore a seguito dell'aggiunta dei GNP30. Per ovviare a questo, l'approccio sviluppato qui INP è illuminato utilizzando l'allineamento laser orizzontale attraverso l'interfaccia lipidico-tampone, come illustrato nella Figura 2,posizione 3 e 4.

I protocolli qui descritti possono essere modificati facilmente alterando la composizione lipidica della membrana per imitare vari tipi di cellule naturali o alterando le dimensioni e la forma dei GNP introdotti come le nanourichine d'oro da 100 nm con la corrispondente luce del raggio laser19. Questo può quindi essere utilizzato per determinare l'impatto delle radiazioni indotte da GNP localizzate su specifici tipi di cellule.

In sintesi, questo protocollo funge da robusto biosensore di rilevamento per studiare le interazioni dei GNP irradiati in situ con entità di membrana lipidica a doppio strato modello di interesse per rispondere a domande sui fenomeni di trasferimento di calore. Ciò contribuirà a sviluppare terapie fototermiche più efficienti, oltre a fornire preziose informazioni per meccanismi dettagliati di trasferimento di calore all'interno dei sistemi biologici. Questo approccio può essere utilizzato come strumento per la previsione del livello di distruzione della membrana cellulare che può essere sperimentato da queste nanoparticelle riscaldate.

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Disclosures

Gli autori dichiarano i seguenti interessi finanziari / relazioni personali, che possono essere considerati come potenziali interessi concorrenti: Il Prof Bruce Cornell è Direttore - Scienza e Tecnologia presso Surgical Diagnostics SDx tethered membranes Pty. Ltd.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council (ARC) Discovery Program (DP150101065) e dall'ARC Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles Cytodiagnostics AC-30-04-05 This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles Sigma-Aldrich 753629 This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) NANOCS PG2-BNCS-10k Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S1 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl  SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Tethered molecules
532 nm green laser continuous light OBIS LS/OBIS CORE LS, China ND-1000 The power of this laser was ~135 mW 
tethaPod EIS reader SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-R1 A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-BG Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-A1 Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-T10 Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% 
tethaQuick software SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-B1 Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
 99.9% Pure ethanol Sigma-Aldrich  34963 Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 pH 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Numero 166 Membrane lipidiche a doppio strato legato (tBBM) Biosensore Nanoparticelle d'oro Laser Trasferimento di calore Dinamica delle membrane
Membrane lipidiche a doppio strato tethered per monitorare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro e membrane lipidiche
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Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X., Yeoh, G. H., Cranfield, C. G., Timchenko, V., Cornell, B. A., Valenzuela, S. M. Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (166), e61851, doi:10.3791/61851 (2020).

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