Summary
自动步态分析是评估周围神经损伤和脊髓挫伤啮齿动物模型功能恢复的可行工具。虽然它只需要一个设置来评估各种实验模型中的运动功能，但细致的软件调整和动物训练是非常重要的。
Abstract
外周和中枢神经损伤主要研究在啮齿动物，特别是大鼠身上，因为这些动物模型既具有成本效益，而且文献中已经发表了大量比较数据。这包括多种评估方法，用于研究神经损伤和修复后的功能恢复。除了通过组织学、电生理学和其他体内和体外评估技术评估神经再生外，功能恢复是确定神经再生程度最重要的标准。自动步态分析允许记录大量与步态相关的参数，如爪打印区域和爪子摆动速度，以及肢体间协调的测量。此外，该方法还提供神经损伤后和神经再生期间大鼠爪子的数字数据，进一步了解外周和中枢神经损伤如何影响它们的运动行为。除了主要使用的坐骨神经损伤模型外，还可以通过这种方法研究外周神经损伤模型，如股骨神经。除了周围神经系统的伤害外，还可以评估中枢神经系统的病变，例如脊髓挫伤。有效和可重复的数据评估在很大程度上取决于在数据采集之前对硬和软件设置进行细致的调整。此外，对实验动物进行适当的训练也至关重要。这项工作旨在说明使用计算机自动化步态分析来评估周围神经损伤和脊髓挫伤的不同动物模型的功能恢复。它还强调了该方法的局限性，例如，由于功能恢复受限，对坐骨神经瘤大鼠的神经再生进行评估。因此，该协议被认为有助于对周围和中枢神经损伤感兴趣的研究人员评估啮齿动物模型中的功能恢复。
Introduction
周围和中枢神经系统的损伤经常在啮齿动物中研究，导致大量有关神经损伤、修复或神经保护过程的比较数据，以抵消进一步的继发损伤和再生1、2、3。啮齿动物模型中实验治疗策略的结果可以通过组织学、免疫组织化学、电生理学和成像技术（如X射线显微断层扫描）等多种技术进行评估，但确定治疗成功与否最重要的标准是——就像人类患者一样——功能恢复的程度4，5。调查啮齿动物运动性能的第一项研究可追溯到20世纪40年代6、7、8。老鼠和老鼠要接受大量的研究，调查它们在9、10、11的几十年中运动的行为。目前，对周围神经和中枢神经损伤的啮齿动物模型存在广泛的评估技术，从用墨水和纸张12、13、14对脚踝和步态运动学15、16、17到机器学习增强方法的行走轨迹分析，允许对步态、肢体和关节轨迹18、19的复杂估计。
计算机化自动步态分析 （AGA） 用于评估周围和中枢神经损伤以及此类损伤的潜在实验治疗后运动功能。该装置主要由玻璃走道和光源组成，该光源可照亮啮齿动物的爪印，与啮齿动物所施加的压力相关。然后，将这些数据计算机化，以计算大量静态和动态参数。根据Deumens的说法，这些参数可以进一步细分为一般参数、疼痛相关参数以及步态20的协调相关参数（表1）。AGA检测步态行为变化的可行性已在各种动物模型的周围神经损伤（PNI）21中得到证实，如坐骨神经20，股骨神经22，中位神经23，24。它也经常用于评估中枢神经损伤大鼠的机运动功能，例如中风25或脊髓挫伤26。该方法的进步在于大量的可比数据，以及记录与步态27相关的大量参数的可能性。本文旨在为对PNI和脊髓损伤（SCI）动物模型感兴趣的研究人员提供详细的实践指南，以评估这些模型中的运动功能。
| 类别 | 参数 | 描述 | |
| 步态的一般参数 | 打印面积（距离单位） | 爪印区域 | |
| 打印长度（距离单位） | 爪印的长度 | ||
| 支撑基（BoS）（距离单位） | 两个后爪或前爪之间的距离 | ||
| 步长（距离单位） | 爪子连续放置两个位置之间的距离 | ||
| 与步态疼痛相关的参数 | 摆动时间 | 摆动阶段的持续时间 | |
| 站立时间 | 姿态阶段的持续时间 | ||
| 平均爪打印强度（任意单位） | 平均在姿势阶段爪印的 iintity | ||
| 与协调有关的步态参数 | 法线步序模式 （NSSP） | 在步进周期中，爪子放置的特定序列 | |
| 相位分散（%） | 两个特定爪子的步进周期之间的时间差异 | ||
| 规律指数 （RI） （%） | 通过将完美无瑕的 NSSP 倍数 4 除以一步周期内爪子放置的总数来量化间位协调 | ||
表1：可通过自动步态分析评估的步态参数。 参数分类的类别根据Deumens等人20进行选择。
Protocol
维也纳市政府动物议定书审查委员会事先批准了所有实验的实验议定书。所有程序都完全按照《赫尔辛基动物权利宣言》和国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南执行。
1. 动物住房
- 房子雄性大鼠（刘易斯或斯普拉格道利）体重250-300克下12小时光/暗循环与广告利比图姆获得食物和水。
- 控制室温（维持在20~22°C）和湿度（45%~65%）足够的动物住房。对于这项工作，男性刘易斯（PNIS）和斯普拉格道利（SCI）大鼠被使用。
- 每周提供两次新的清洁笼。将大鼠组成两组或三组，密切监测它们的社会行为和互动。允许大鼠在任何外科手术或功能测试前至少1周的适应期。
注：大鼠在手术前需要至少5天的步态分析设备每日训练，因此从大鼠抵达该设施到实验手术的预定数据28之间计算至少2周。
2. 神经损伤的诱导
注：佩戴个人防护装备，如手术服、手套和口罩。如果无菌手术服不可用，清洁、清洗过的实验室外衣也就足够了。除非受到污染，否则不需要在动物之间更换礼服或外衣，而是需要在手术之间更换。建议使用无菌手术手套。如果此类手套不可用，也可以使用检查手套，但应在手术前使用手术消毒剂清洗。手套应在动物之间更换。
- 在手术当天，尽量减少对动物的任何压力，因为这可能会干扰麻醉，例如，动物将需要更高剂量的麻醉剂。
- 在手术当天，注射0.05毫克布丙诺啡/千克体重在悬浮液中，100-200μL 0.9% NaCl皮下使用手术前 25 G canula 1 小时提供预和互操作的镇痛。如果没有其他指示，大鼠的侧翼是注射的首选部位。
- 麻醉大鼠，将大鼠放在麻醉感应室中，与一个合成氟兰蒸发器和一个活性粉笔容器相连，以吸收CO2。麻醉大鼠通过淹没麻醉盒与4%-5%的sevofluran-氧气混合物约5分钟使用1.5升/分钟的氧气流量（启动阶段）。将脉搏血氧仪夹连接到其中一只爪子，以监测啮齿动物的血氧饱和度。使用 2.5%~4.5% 的 sevofluran-氧气混合物保持全身麻醉状态。
注：对于实验手术，全身麻醉是强制性的。通过检查对尾巴或爪子的挤压刺激缺乏反应来确认全身麻醉。 - 当大鼠进入全身麻醉后，剃掉将动手术的各口，用酒精和皮肤消毒剂交替轻扫区域，对该区域进行消毒。最后的刷卡应使用皮肤消毒剂进行。
- 将它放在可调节加热垫上，位于所需位置（股骨神经模型的 supine，易用于坐骨神经和 SCI 模型）。在大鼠的直肠中插入一个灵活的温度计探针，以监测动物的温度，并在手术期间将其保持在37°C左右。麻醉期间，使用眼药膏保护大鼠的眼睛免受干燥
3. 神经损伤的手术诱导
- 在进行外科手术时，严格遵守Halsted29的七项原则 ，如下所示：
- 处理组织时，请始终轻轻处理。避免撕裂或压碎组织。
注：自制的30 或市售缩回器系统有助于将肌肉和血管远离操作场。 - 小心地维护用电动海莫塔特烧灼血管或连字的海莫西，以保证细心的海西。
- 始终保持血液供应的组织，仔细解剖和精心处理他们。
- 戴口罩、长袍和无菌手套，保持严格的防毒。
- 通过涂抹不太紧或不太松的缝合线，避免组织上的张力。
- 将组织的边缘结合在一起，无需任何重叠，从而精心地应用组织。
注：这在肾上腺素或环心神经病的情况下尤其重要。使用操作显微镜在 6x~16x 放大率下执行所有显微手术程序。理想情况下，显微镜提供两对眼部，以便由助手观察手术。 - 通过仔细监测不同的组织层，避免产生死空间。
- 处理组织时，请始终轻轻处理。避免撕裂或压碎组织。
- 右后肢坐骨神经神经瘤的诱导
- 通过用#10手术刀刀片连接到#3手术刀手柄，解剖过度的肌肉和软组织，在后肢的后肢上执行一个5厘米长的切口，暴露右坐骨神经。将缩回器放在伤口内，使解剖的肌肉和皮肤远离原位。使用弯曲的显微手术剪刀去除周围的组织，轻轻暴露神经。
- 用直显微手术剪刀去除坐骨神经1~2毫米近部8毫米长的神经段。
- 旋转神经段180°，将神经段放在横坐神经的近角和近头树桩之间，并在每个位点用两个中断的10+0缝合线和一个显微手术针架进行活生生神经病。
- 右后肢股骨神经瘤的诱导
- 执行一个纵向3~4厘米腹股沟切口，用#10刀刀片连接到#3手术刀手柄，以暴露正确的股骨神经血管束。使用手术剪刀进行钝解剖，直到股骨神经的分叉暴露。将缩回器放在伤口内，使解剖的肌肉和皮肤远离原位。
- 使用直显微手术剪刀将暴露的马达和感觉分支分离到分叉，并分别切除每个分支的 6 mm 长神经段。
- 旋转两个神经段 180°，将它们放在跨切骨股神经分支的近位和近处树桩之间，并在每个位点进行活生生神经病，用两个中断的 11+0 缝合线和一个显微手术针架。
注：通过将运动移植到原始运动分支和感觉移植到原始感觉分支上，执行同位自体神经移植。或者，通过将运动移植移植到原始的感觉分支（反之亦然）来执行异位自体神经移植。
- 胸脊髓挫伤的诱导
- 在胸椎柱上执行皮肤切口，用#10手术刀刀片连接到#3手术刀手柄，然后是两个平行于旋转过程的肌肉切口，以方便肌肉缩回。将缩回器放在伤口内，使解剖的肌肉和皮肤远离原位。
- 识别第 11th 胸椎 （Th）， 并暴露椎骨的层， 通过去除覆盖组织， 以及旋转过程使用荣器。
- 使用微钻和适当的毛刺进行拉明切除术，将小孔钻入层中，比撞击器的尖端稍大。为了防止对脊髓的损伤，在打开和扩大孔时，只用神经来稀释膜。如果周一仍然完好无损，请使用锋利的尖探针小心地将其拆下，而不会损坏杜拉母体。
- 在确保在不破坏层膜稳定的情况下制造一个足够大的孔后，用冲击器的稳定钳将动物的脊柱用玫瑰色和卡道夹住到Th11上，从而将动物的脊柱固定到位。使用前部和侧面的手轮，将钢棒放在拉明切除术孔上方 3~5 mm。最后，让所有动物受到150千迪耳的界定力的影响，以诱发轻度至中度脊髓挫伤4。
- 使用聚氨酯 4+0 或 5+0 中断缝合和手术针架在解剖层中执行伤口闭合。用浸泡在无菌 0.9% NaCl 中的纱布垫轻轻擦拭伤口，彻底清洁伤口。
- 手术后，将动物回到家中的笼子里，保护它们免受光线和声音的照射。密切监测动物的行为，直到术后日（DPO）7，并确保足够的食物和水摄入量。如果需要，通过皮下注射（例如，10毫升NaCl 0.9%）提供额外的液体。
- 通过阿片类药物（0.05毫克/千克体重丁丙诺啡皮（s.c.））和/或抗热药（4毫克/千克体重卡普罗芬.c.））提供术后镇痛至少2天。如果需要，在SCI模型中，还提供术后抗生素治疗（每os7.5毫克/千克体重Enrofloxacin（p.o.）。
- 在脊髓损伤的情况下，手动清空大鼠的膀胱，直到自发排尿返回。
4. 在步态分析之前从手术干预中恢复
注：坐骨神经损伤的老鼠由于神经损伤后出现痛苦的神经病变，有啃后爪的倾向。这种形式的自动利用可能导致脚趾或相应后爪的一部分自动被分割。使用坐骨神经损伤模型时，首选刘易斯大鼠，而不是其他大鼠菌株，因为这种大鼠菌株显示出较小的自残倾向31。坐骨神经损伤的老鼠也表现出手术肢体收缩的倾向，这可能导致它们因干扰数据采集而被排除在研究之外。这种不良事件在股骨损伤的大鼠中发生得要不常见。
- 手术后每天检查手术动物，特别注意它们的四肢和爪子的状态。
注：在有SCI的大鼠中，在Th11的高峰期，由于动物的排尿和排便能力受损，可能发生性压住或直肠脱垂。这些事件通常被定义为研究的人类终点，意味着立即将受影响的动物排除在研究之外。 - 继续术后镇痛，直到大鼠停止显示任何疼痛相关症状。
- 在持续疼痛的情况下，服用加巴彭汀（30~120毫克/千克体重）以治疗神经病变疼痛。
5. 执行自动步态分析前的准备
注：步态分析系统的方法基于在穿过玻璃板时从下面记录动物，玻璃板由绿色 LED 灯照亮。当动物的爪子接触地板时，爪印区域通过高速摄像机进行照明和记录。然后，通过以太网电缆将这些数据发送到运行步态分析软件的计算机。虽然实验者可以手动对单个足迹进行分类，但最新的软件版本还具有自动足迹分类功能。
- 在无干扰噪音的情况下，在黑暗中执行所有测试程序。由于大鼠能够感知超音速频率，也验证没有来源发出这种声音。
注意：每周或每隔一周进行步态分析，但不要太频繁地测试大鼠，因为刘易斯大鼠在过度接触某项运动时，往往会对参与手术失去兴趣。然而，在手术前每天训练大鼠5天，以使它们适应测试环境和程序。 - 在培训课程和测试日，通过关闭所有光源来准备行为测试室，否则可能会干扰自动步态分析设备的摄像头。将数据采集远离摄像机所需的计算机屏幕放置，以防止其光线干扰摄像机。
- 确保设备安装在稳定位置，并防止任何形式的振动，因为这将严重干扰数据采集程序。
- 将大鼠带到行为测试室，并在测试前将老鼠放在自己的家庭笼子里至少30分钟。
注意：每当处理动物时，请穿戴个人防护装备，如手术服或实验室外套、手套和口罩。
6. 执行自动步态分析
- 训练
注：在训练期间，动物将经历学习曲线，因此建议逐步调整训练计划。使用食物奖励（例如，1~2片早餐麦片）在成功完成每一个培训课程后奖励动物。- 在训练的第一天，轻轻地抬起动物，把它放在它的树干下面，轻轻地把它抬到走道入口。
- 将动物放在入口区域，让它探索走廊的开口，而不受执行测试程序的人的任何干扰。
注：不要尖叫、吹口哨、吹口或戳动物，以激励它穿过人行道。所有这些行为都会严重地给动物造成压力，并使数据采集程序进一步复杂化。 - 等到动物自愿穿过走道到达家笼。有时，特别是在未经训练的动物，这可能需要几分钟。在第一个训练日，动物既不期望也不要求以统一的步行速度进行不间断的跑步。相反，它应该适应自己的测试设备和程序。
- 训练的第二天，习惯动物毫不犹豫地进入走道，也毫不犹豫地回到自己的笼子里。一些动物可能已经学会了不间断地穿过人行道，但在第二天结束时，这仍然不需要。
- 在训练的第三天，确保动物学会毫不犹豫地穿过走道，嗅探，或以其他方式探索动作。确保他们以统一的速度行走。
- 在第四天和第五天的训练中，重复以前的练习以巩固测试程序。
注：如果动物在5天训练期结束时没有获得正确穿越走道的必要技能，请额外增加2天的训练（例如周末）。此外，请考虑每天进行最多 3 次培训课程，在个别课程之间至少休息 2 小时。在95%的情况下，动物将在延长训练期结束时获得所需的训练经验。在极少数情况下，动物在训练7天后仍未获得这一技能，建议将计划好的实验手术时间至少推迟1周，并重复上述训练制度。
7. 数据采集
注：步态分析系统在动物行走时可视化每个爪印，并自动分析各种步态参数，如爪印面积、爪印强度、爪摆动时间和爪子摆动速度（表1）。由于步态分析系统根据动物的爪印产生的强度记录所有数据，请确保根据大鼠的体重和大小调整相机设置。此外，在数据记录之前，请确保走道干燥干净，以防止对数据采集产生任何影响。
- 在获取任何数据之前，使用商业玻璃清洁剂和挤压器清洁走道。喷洒玻璃板几次，然后用挤压器擦拭，以去除其表面的任何颗粒。此外，清洁下面的。确保从走道的末端取出任何液体，否则动物可能会踩到它，这将影响记录的数据。
- 必要时重复清洁程序，例如，在记录不同笼子的老鼠数据之前，对走道的污染进行。这被认为是为了防止动物被他们特定的气味分心。
- 在第一次数据采集之前，调整适合动物重量的摄像机设置。通过将最轻、最重的动物放在走道上来确认这一点，并选择一种相机设置，在两种情况下都可实现良好的数据质量。调整摄像机增益、红色天花板灯、绿色走道灯和绿色强度阈值 （GIT），以确保最佳的爪印检测。
注意：在开始数据采集后，不要更改所选设置，因为这将妨碍采集数据的可比性。作为例外，可以在数据分类期间更改 GIT，但必须统一完成所有试验。 - 使用提供的校准表定义和校准走道。
- 选择"设置"选项卡中列出的 已注册 摄像机。
- 单击" 已打开获取 "按钮，该按钮位于"获取 " 选项卡中。
- 拍摄空的清洁走道的快照，该走道将在整个数据采集过程中用作参考。
- 请注意状态从"等待快照"更改为"准备获取"。
- 单击"开始 获取" 按钮，并注意状态从" 准备获取" 更改为 "等待运行"开始。
- 将老鼠放在走道上，在电脑屏幕上跟随动物的运动。请注意状态从"等待运行"更改为"录制运行"。
注：软件将自动根据预设的运行特性（带绿色符号）对运行进行分类，而不符合要求的运行将用红色符号标记。当记录三个兼容的运行时，软件会自动停止数据采集，但可以通过再次单击"开始获取 "按钮来 继续数据采集。
8. 数据分类
注：有关 AGA 结果参数的列表，请参阅表 1。 至少需要三次合规的跑步，动物必须毫不犹豫地平稳地穿过人行道。此外，运行速度应与文献30中定义的相同类别匹配。
- 单击要 分类 的各 试验的实验的 "实验资源管理器"选项卡中的"分类"按钮。
- 以正常速度播放获取的运行，以了解数据是否符合之前列出的要求。
- 在左上角，单击"自动 分类" 按钮，由软件自动分类爪印。
注：虽然该软件具有高速率的正确爪子分类，它有时不能分配爪子打印或分配错误的爪子。因此，以后始终仔细检查自动分类的爪印。 - 要正确计算正常步进序列模式 （NSSP），请确保分类算法不会被不可见的爪印混淆，从而导致有缺陷的 NSSP（图 1A）。因此，仅包括可检测的爪印，而反面爪在 NSSP 计算中也可见，例如左前爪 （LF） 和右后爪 （RH） （图 1B）。
图1：示范性 AGA 数据，说明需要手动仔细检查正确的数据分类。如果检测到前爪的位置被检测到后，另一个前爪 （A） 的位置被检测到，AGA 软件可能会混淆这与不协调的行走模式，因为尚未检测到后爪。因此，建议始终仔细检查并选择初始爪印，当反面爪也可见时检测到该爪印 （B）。 请单击此处查看此图的较大版本。
9. 计算统计数据
注：为了调整运行数据，以适合随时间增加的体重增加相关变化，强烈建议使用非实验爪（例如控制）爪子计算实验爪的比例。此外，计算此爪子与爪子比较的术前值的比率，以考虑爪子使用中的个体差异。
- 单击" 查看运行统计信息 "按钮可全面了解运行统计信息。
- 选择"文件"和"导出"以将运行统计信息或试用统计信息导出到电子表格软件中。
Representative Results
12只大鼠接受了实验性外周神经手术。在7只大鼠中进行了坐骨神经切除手术（图2A），股骨神经性切除（图2B）在5只大鼠中诱导。在所有动物中，神经缺陷都是通过自体神经移植重建的。脊髓挫伤（图2C）在TH11 水平在6只大鼠中诱发，导致总共18只大鼠。
图2：神经重建后操作点。神经重建与自graft在坐骨神经 （A） 和股骨神经 （B） 以及脊髓挫伤损伤 （C）. . 请单击此处查看此图的较大版本。
所有动物都从手术中恢复得很好，没有发生过自残病例。坐骨神经损伤组的一只动物在术后观察过程中右后爪出现强收缩，不得不被排除在进一步的数据分析之外。
坐骨神经神经性
由于坐骨神经为大多数后肢提供肌肉和感觉内向，其切除会导致运动功能的严重损伤。受伤后，大鼠仅使用爪子的脚跟支撑重量（图3B+E），肢体在一次全面的周周运动中移动。因此，通过 AGA 评估的运动变化通过显著减少的打印区域（图4A）和显著增加的摆动时间（图 4B）变得明显。与观测期末的 OP 前测量相比，这两个参数仍然发生了显著变化。值得注意的是，一种动物从术后周（WPO）10开始，就发展出右后爪的强收缩。与WPO12的左爪相比，右后爪的打印面积增加了150%以上（图5）。由于与本研究中评估的所有其他动物相比，这是极值，因此我们将这种动物排除在打印区数据分析之外。
图 3：右坐骨神经和自动切除修复的关键尺寸切除之前和之后具有代表性的爪印。注意神经损伤（B）与术前（A）相比，神经损伤后打印面积的显著减少。尽管在观察期间（C+E）的打印面积略有增加，但右后肢的爪印与基线记录保持显著变化。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：坐骨神经关键尺寸切除和自动切除修复后的功能恢复过程。打印面积比 （A） 和摆动时间比 （B） 在坐骨神经切除后立即与 OP 前值发生统计变化。虽然打印区域与基线相比在 WPO10 之前仍然显著减少，但摆动时间仍显著增加到 WPO12 的 OP 前值。*： p < 0.05 与 OP 前相比， *： p < 0.01 与 OP 前相比。错误栏表示均± （SEM） 的标准误差。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：坐骨神经损伤后打印区域过程框图。请注意WPO12的极值（红色椭圆），这可以通过一种动物从WPO10开始发展右后爪的强收缩来解释。因此，该动物被排除在图4所示的统计 分析之外。 请单击此处查看此图的较大版本。
股骨神经性
女性神经切除导致大腿四头肌肌肉脱神经33，34。结果，膝盖延长受损，导致脚踝关节过度弯曲，爪子脚跟连续抬起。因此，手术后，各爪的打印面积（图6B）会大幅减少。由于重量向左的补偿性转移，左后爪的打印面积增加。这一点应牢记在心，因为这种现象直接影响到"实验"和"控制"爪子之间的计算比率。从WPO4开始，由再生股骨神经重新神经化导致这些变化的逆转，导致右后爪的爪打印面积增加（图7A）。由于大腿的四头肌在各爪子的摆动阶段也起着一定的作用，摇摆时间（图7B）在股骨神经损伤的老鼠中大大延长。镜像打印区域的回归，摆动时间减少，因为再生股骨神经到达大腿的四头肌肌肉。在 WPO10，步态的两个参数返回到基线，表示完全功能恢复。
图6：代表性爪印。代表性爪印之前 （A） 和以下 （B+E） 右股骨神经切除和自动抓伤修复.在WPO2（B）下，RH的打印面积显著下降，而左后爪（LH）的打印面积由于重量负载增加而增加。RH 打印面积从 WPO6 （C） 开始增加，同时 LH 打印面积也减少。在WPO8 （D） 和WPO10 （E） 的RH打印区域恢复到接近术前水平。（经海因策尔等人许可改编，根据CC BY 4.0 获得许可。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：股骨神经7毫米切除和自动切除后的功能恢复过程。打印面积比率 （ A ）和摆动时间比率 （B） 的过程揭示了股骨神经切除后立即发生的强烈变化，但值恢复到 WPO8 的术前值。#： p < 0.05.错误栏表示± SEM. （经 Heinzel 等人许可改编，根据 CC BY 4.0 许可）。 请单击此处查看此图的较大版本。
脊髓挫伤
盖特分析显示，胸脊髓挫伤后爪印明显改变（图8），最值得注意的是打印面积的锐化和WPO2后爪的显著内部旋转（图8B）。值得注意的是，爪子旋转也是作为BBB的一个可评估功能实现的，突出了计算机步态分析对评估最初通过开放场测试评估的步态变化的适用性。关于单个步态参数的历程，第 11 级的脊髓挫伤导致打印面积比（图 9A）和摆动时间比增量（图 9B）的减少。在观测期间的进一步过程中，这两个参数都趋向于基线水平，但没有统计学上显著的变化。与协调相关的参数规律指数（图9C）在WPO2也有所下降，但动物之间的程度差异很大。它还趋向于术前值，直到WPO16。后爪支撑基数（图9D）是Deumens的步态的一般参数，从WPO10到WPO14，其统计学意义显著。它趋向于 WPO16 的基线水平，并且在此时间点不再与 OP 前值发生显著变化。
图 8：两个后爪的代表性爪印。掌纹术前 （A） 和后胸脊髓挫伤 （B+F）.请注意，从 WPO2 （ B ） 开始的打印面积减少，同时爪子内部旋转明显。在观察期间 （C+F） 中，打印区域的增量是可观察到的，以及内部旋转的间隙。 请单击此处查看此图的较大版本。
图9：Th 11级的脊髓挫伤。脊髓挫伤在Th 11导致打印面积比率（A）和摆动时间（B）和规律指数（C）的可观察到的变化，但这些变化在统计学上并不显著。受伤后，后爪支撑基数与基线相比显著增加，在 WPO10 直到 WPO14 之前具有统计学意义。*： p < 0.05 与操作前相比。错误栏表示± SEM。请单击此处查看此图的较大版本。
补充文件 1：故障排除详细信息。请点击这里下载此文件。
Discussion
由于评估方法种类繁多，各有优缺点，因此对PNI和SCI动物模型的功能恢复的评估仍然具有挑战性。在外周和中枢神经损伤的多种模型中，只有很少的方法得到测试和验证，尽管将运动跟踪和机器学习相结合的有前途的新技术可能会将神经行为研究推向更高水平的功能测试。我们相信，广泛适用于各种动物和伤害模型的尖端方法将很快出现。鉴于这些考虑，AGA的优点之一是只需使用一种设备就评估多个神经损伤模型的功能恢复。自21世纪早期开始，这种方法一直用于PNI的实验模型，如坐骨神经37、佩罗内38、股骨神经损伤模型22以及腰椎39和胸椎40的根部外伤。各种中枢神经损伤，包括脊髓挫伤，也已研究的方法41，42。本文提出了如何诱发三种常用神经损伤以及评估其后功能恢复的详细方案。我们认为，为对实验神经损伤、修复和再生领域感兴趣的研究人员提供实践指南，指导如何最有效地利用该方法的优势特性，将大有作为。
几位作者讨论了AGA评估啮齿动物功能恢复的潜力，强调了该方法同时评估与运动和感觉再分析相关的步态参数的优势27，28。此外，比较实验爪子的数据，例如，重建神经损伤的未操作的爪子，如所示的两个模型显示允许包括动物内部的阳性控制。相反，没有手术重建或额外治疗的手术爪可以作为动物内部的阴性控制。研究还表明，有可能将 AGA 与机器学习方法43 相结合。尽管该方法的优点，它也有一些限制和缺点，如耗时的训练努力，这是强制性的，使动物适应收购程序28，44。AGA 的另一个限制是，由于仪器尺寸有限，有资格进行测试的动物的最大尺寸。因此，AGA的使用目前仅限于动物大小的啮齿动物和雪铁龙45。此外，最近出现的神经行为评估方法在运动跟踪领域能够机器学习可能超过GA在全面性以及可能的应用18，19，46。最值得注意的是，但根据其他评估方法，AGA评估的功能恢复似乎非常有限——即使发生的话——在坐骨神经神经瘤模型47，48。另一方面，AGA 允许全面评估股骨神经紧张后的功能恢复过程，如我们的数据所示。通过这项工作，我们证明了 Paw Print 区域是一个通过 AGA 评估的代表性步态参数，在我们提供的两种上述外周神经损伤模型中，它是功能恢复过程的典范。虽然功能恢复广告在股骨神经自动重力修复后可观察到，但AGA参数在坐骨神经自动重力修复后，在观察期结束时仍与基线相比有显著变化。值得注意的是，肢体收缩是坐骨神经损伤大鼠的常见现象，有必要谨慎，不要混淆这些肌肉不平衡和瘫痪的迹象与进行中的功能恢复32。这一方面突出了 AGA 方法在此模型中神经损伤后无法检测到显著功能恢复。另一方面，通过步态分析，评价大鼠坐骨神经损伤模型是否可行提出了问题，即神经损伤比阿未克症48更严重的神经损伤。大鼠仍然是最常用的实验神经修复模型。疑难解答详细信息在补充文件 1 中提供。
我们还提供了关于使用该方法来评估脊髓损伤大鼠运动功能的示范性数据，无需对硬件设置或采集程序进行任何必要的更改即可。同样的原则也适用于其他啮齿动物模型的中枢神经损伤（CNI）26，49，50和根外伤。与孤立的PNIS相比，脊髓损伤的病理生理后果要复杂得多，因为许多非常重要的结构被损坏，涉及发泡通路，如皮质球菌和红宝石，以及诸如背柱和脊柱35等的发泡途径。充分评估这些病理变化的挑战反映在行为测试的综合军备中，如巴索、贝蒂和布雷斯纳汉（BBB）得分36。据报道，在中枢神经损伤后，步态参数基础增加，这很可能导致了步态不稳定。在我们的模型中，支持基础从WPO10到WPO14的基线发生了显著变化，这支持支持基础的假设支持支持基础允许 AGA 在胸脊髓挫伤后评估功能恢复过程。
我们相信，AGA是一个可行的工具，以评估在神经系统受伤的啮齿动物的功能恢复。然而，我们建议在每个实验设置中仔细和彻底地反映观察到的步态变化。步态参数的改变，例如，在术后立即减少的十近月数后，打印面积增加，或在观察期间立即提高该参数的术后高度，则打印面积增加，并不不可避免地与功能恢复有关。相反，这些变化也可以与可能的功能适应有关，以保持一个不显眼的步态，因为老鼠是一个猎物物种，并试图避免显示疼痛或残疾的潜在掠食者51。因此，建议使用自动步态分析作为补充工具，将步态变化与周围神经损伤和再生的其他结果测量方法联系起来。如前所述，我们还认为，如果应该通过 AGA 对患有坐骨神经瘤的啮齿动物进行调查，应该仔细反映，因为我们的发现有力地表明，在这种情况下，功能恢复受到严重限制。
如我们的工作所示，AGA 的主要资产是能够研究多种实验性 PNI 模型和 CNI 中的电机和感官再分析，同时只需要一个设置。因此，我们认为，该方法是全面神经行为测试的一个极有价值的工具。AGA的资产之一，即研究运动和感官再呼吸在PNI和CNI的各种动物模型，而只需要一个设置，是我们认为该方法的主要优势相比，其他评估方法研究功能恢复，如步行轨道分析52，冯弗雷测试53，或步态运动学16。同时评估步态变化的潜力，这些变化与再紧张肌肉22 的电生理学调查结果或感觉功能54 的评价方法有关，在该方法的未来应用方面是有希望的。因此，我们建议使用 AGA 来研究前肢 PNI 的啮齿动物模型的功能恢复，如乌尔纳、径向神经或中位神经，或实验神经转移模型55，这些模型尚未对此方法进行研究。
我们特此提供了如何使用自动步态分析来研究三种神经损伤啮齿动物模型的功能恢复的详细协议。虽然该方法需要仔细考虑各种关键方面，如充分训练和细致的硬和软件校准，它是一个可行和有价值的补充工具，以评估神经再生的啮齿动物模型的中枢和外周神经损伤。
Disclosures
作者声明，这一作品得到了Noldus Inc.的支持，并报道了公开访问出版费。提交人都没有获得任何个人工资或任何经济酬金。作者没有其他相互竞争的利益可以申报。
Acknowledgments
作者要感谢卡琳·布伦纳对动物的热情照顾。作者还要感谢克劳迪娅·凯布尔、詹姆斯·弗格森、加布里埃尔·莱因费勒和苏珊·德瑞斯勒在实验手术中提供的援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | B. Braun Austria | 3570410 | Vehicle for drug delivery |
| 1 ml syringe | B. Braun Austria | 9161708V | Injecting device |
| 10 ml syringe | B. Braun Austria | 4606728 V | Injecting device |
| 1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin | Gebro Pharma | N/A | Alcoholic skin disinfection |
| 23-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657667 | Canula for s.c. injection |
| 26-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657683 | Canula for s.c. injection |
| 5 ml syringe | B. Braun Austria | 4606710 V | Injecting device |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma | B9275 | Analgetic agent |
| Burrs for Micro Drill | F.S.T | 19007-29 | Drilling of a hole inside the lamina |
| Caprofen | Zoetis Austria | N/A | Analgetic agent |
| Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of animal gait |
| Cauterizer Kit | F.S.T | 18010-00 | Cauterization of vessels during surgery |
| Enrofloxacin | Bayer Austria | N/A | Antibiotic |
| Ethilon (10-0) | ETHICON | 2810G | Suture material for neurrorhaphy |
| Ethilon (11-0) | ETHICON | EH7465G | Suture material for neurrorhaphy |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | 4302436 | Eye protection during anesthesia |
| Friedman-Pearson Rongeurs | F.S.T | 16221-14 | Surgical instrument |
| Gabapentin | Wedgewood Pharmacy | N/A | Analgetic agent |
| Goldstein retractor | F.S.T | 17003-03 | Retraction of tissues during surgery |
| Hair trimmer | Aescular | N/A | Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery |
| Heating Pad for rodents | ALA Scientific Instruments | N/A | Regulation of body temperature |
| Impactor | Precision Systems and Instrumentation | N/A | Induction of spinal cord contusion |
Lewis rat ( ) |
Janvier | N/A | Experimental animal |
| Magnetic Fixator Retraction System | F.S.T | 18200-50 | Retraction of tissues during surgery |
| Metzenbaum Baby Scissors | F.S.T | 14019-13 | Surgical instrument |
| Micro Drill | Word Precision Instruments | 503599 | Instrument for bone drilling |
| Micro Needle holder | F.S.T | 12076-12 | Surgical instrument |
| Micro-scissors (curved) | F.S.T | 15023-10 | Surgical instrument |
| Micro-scissors (straight) | F.S.T | 15007-08 | Surgical instrument |
| Mirror Finish Forceps | F.S.T | 11251-23 | Surgical instrument |
| Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
| Operating microscope | Leica | M651 MSD | Magnification of the operative site |
| Povidone Iod | B. Braun Melsungen | N/A | Non-alcoholic skin disinfectant |
| Pulse Oximeter | STARR Life Sciences | N/A | Surveillance of heart rate and oxygen saturation |
| Rodent thermometer | BIOSEB | BIO-TK8851 | Surveillance of body temperature |
| Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
| Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%) | Baxter | HDG9117A | Anesthetic |
| Spatula & Probe | F.S.T | 10090-13 | Surgical instrument |
| Sprague Dawley rat () |
Janvier | N/A | Experimental animal |
| Sterila gauze 5x5cm | EVAC MEDICAL | E010.03.00215 | Sterile gauze compress |
| Tissue Forceps | F.S.T | 11021-12 | Surgical instrument |
| Vicryl (4-0) | ETHICON | V3040H | Suture material for subcutaneous sutures |
| Vicryl (5-0) | ETHICON | V303H | Suture material for subcutaneous sutures |
| Vicryl cutting needle (4-0) | ETHICON | V392ZH | Suture material for skin sutures |
| Vicryl cutting needle (5-0) | ETHICON | V391H | Suture material for skin sutures |
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