Summary
Automatiserad gång analys är ett genomförbart verktyg för att utvärdera funktionella återhämtning i gnagare modeller av perifera nerv skada och ryggmärg kontusion skada. Även om det kräver bara en inställning för att bedöma rörelseaktivitetsfunktionen i olika experimentella modeller, noggrann hård- och soft-ware justering och utbildning av djuren är mycket viktigt.
Abstract
Perifera och centrala nervskador studeras till största delen på gnagare, särskilt råttor, med tanke på att dessa djurmodeller är både kostnadseffektiva och en hel del jämförande data har publicerats i litteraturen. Detta inkluderar en mängd bedömningsmetoder för att studera funktionella återhämtning efter nerv skada och reparation. Förutom utvärdering av nervregenerering med hjälp av histologi, elektrofysiologi och andra in vivo och in vitro-bedömningstekniker, är funktionell återhämtning det viktigaste kriteriet för att bestämma graden av neural regenerering. Automatiserad gånganalys möjliggör registrering av en stor mängd gångrelaterade parametrar som Paw Print Area och Paw Swing Speed samt mått på inter-limb-koordination. Dessutom ger metoden digitala data av råttornas tassar efter neuronala skador och under nervregenerering, lägga till vår förståelse av hur perifera och centrala nervösa skador påverkar deras rörelseaktivitet beteende. Förutom den övervägande använda sciatic nervskada modell, andra modeller av perifer nerv skada såsom lårbensnerven kan studeras med hjälp av denna metod. Förutom skador i de perifera nervsystemen kan lesioner i centrala nervsystemet, t.ex. Giltig och reproducerbar databedömning är starkt beroende av noggrann justering av hård- och mjukvaruinställningarna före datainsamling. Dessutom är en ordentlig utbildning av försöksdjuren av avgörande betydelse. Detta arbete syftar till att illustrera användningen av datoriserade automatiserade gånganalys för att bedöma funktionella återhämtning i olika djurmodeller av perifer nerv skada samt ryggmärg kontusion skada. Det betonar också metodens begränsningar, t.ex., utvärdering av nerv regenerering hos råttor med sciatic nerv neurotmesis på grund av begränsad funktionella återhämtning. Därför är detta protokoll tänkt att hjälpa forskare som är intresserade av perifera och centrala nervösa skador för att bedöma funktionell återhämtning i gnagare modeller.
Introduction
Skador i det perifera och centrala nervsystemet studeras ofta hos gnagare, vilket resulterar i en stor mängd jämförande data angående nervskadans, reparationens eller nervskyddsföringen för att motverka ytterligare sekundära skador och regenerering1,2,3. Resultatet av experimentella behandlingsstrategier i gnagare modeller kan bedömas genom en mängd olika tekniker såsom histologi, immunohistokemi, elektrofysiologi, och avbildningstekniker såsom röntgen mikrotomografi (μCT) skanningar, men det viktigaste kriteriet för att fastställa framgången för en behandling är-som i mänskliga patienter-graden av funktionell återhämtning4,5. De första studierna som undersöker locomotor prestanda i gnagare går tillbaka till 1940-talet6,7,8. Råttor och möss var föremål för en stor mängd studier som undersöker deras rörelseaktivitet beteende i följande decennier9,10,11. Numera finns ett brett spektrum av bedömningstekniker för gnagare modeller av perifera och centrala nervskador finns, allt från gångspår analys med bläck och papper12,13,14 över fotled och gång kinematik15,16,17 till maskininlärning förbättrade metoder, som möjliggör en komplex uppskattning av gång, lem och ledbanor18,19.
Datoriserad Automatiserad gånganalys (AGA) används för att utvärdera rörelseorganisk funktion efter perifera och centrala nervösa skador och potentiell experimentell behandling av sådana skador. Enheten består huvudsakligen av en glasgångväg och en ljuskälla som lyser upp gnagarens tassavtryck i korrelation med det tryck som överskrids av dem. Dessa data datoriseras sedan för att beräkna ett brett utbud av statiska och dynamiska parametrar. Enligt Deumens kan dessa parametrar delas in ytterligare i kategorierna allmänna parametrar, smärtrelaterade parametrar samt samordningsrelaterade parametrar för gång20 (tabell 1). Genomförbarheten av AGA att upptäcka förändringar i gång beteende har bevisats i olika djurmodeller av perifer nervskada (PNI)21, såsom den sciatic nerv20, femorala nerv22, och median nerv23,24. Det används också rutinmässigt för att bedöma rörelsehindrande funktion hos råttor med centrala nervösa skador,t.ex. Metodens framsteg ligger i den stora mängden jämförbara data och dess möjlighet att registrera en uppsjö av parametrar relaterade till gång27. Detta dokument syftar till att ge forskare som är intresserade av djurmodeller av PNI och ryggmärgsskada (SCI) med en detaljerad och praktisk riktlinje för att bedöma rörelseaktivitetsfunktionen i sådana modeller.
| Kategori | Parametern | Beskrivning | |
| Allmänna parametrar för gång | Utskriftsområde (avståndsenhet) | Området för tafsavtrycket | |
| Utskriftslängd (distansenhet) | Längd på tassavtrycket | ||
| Stödbas (BoS) (avståndsenhet) | Avstånd mellan de två bak- eller framtassarna | ||
| Stride Längd (avstånd enhet) | Avstånd mellan två på varandra följande placeringar av en tass | ||
| Smärtrelaterade parametrar av gång | Swing Tid (s) | Svingfasens varaktighet | |
| Stand Time (s) | Hållningsfasens varaktighet | ||
| Genomsnittlig Paw Print Intensitet (godtycklig enhet) | Genomsnittlig iIntensity av tasstrycket under hållningsfasen | ||
| Koordinationsrelaterade parametrar av gång | Normala stegsekvensmönster (NSSP) | Specifika sekvenser av placeringar med tass under en stegcykel | |
| Fasdispersioner (%) | Tidsmässiga skillnader mellan stegcyklerna för två specifika tassar | ||
| Korrekthetsindex (RI) (%) | Kvantifiering av interlimb-koordination genom att dividera mängden felfria NSSP-gånger 4 med det totala antalet placeringar av tassar under en stegcykel | ||
Tabell 1: Parametrar för gångbedömbar med den automatiserade gånganalysen. De kategorier i vilka parametrarna klassificeras väljs enligt Deumens et al.20.
Protocol
Det experimentella protokollet för alla experiment godkändes i förväg av Animal Protocol Review Board i staden regeringen i Wien. Alla förfaranden genomfördes helt i enlighet med Helsingforsdeklarationen om djurens rättigheter och Vägvisaren för vård och användning av Institutey Animals vid National Institutes of Health.
1. Djurbostäder
- Hus hanråttor (Lewis eller Sprague Dawley) som väger 250–300 g under en 12 h ljus/mörk cykel med ad libitum tillgång till mat och vatten.
- Styr både rumstemperaturen (bibehållen vid 20–22 °C) och luftfuktighet (45%–65 %) för adekvat djurboende. För detta arbete, manliga Lewis (PNIs) och Sprague Dawley (SCI) råttor användes.
- Ge en ny, rengjord bur två gånger per vecka. Hus råtta i grupperna av två eller tre och nära upplysning deras social beteende och växelverkan. Låt råttorna en acklimatiseringsperiod på minst 1 vecka före varje kirurgisk ingrepp eller funktionstestning.
OBS: Råttor kräver minst 5 dagars daglig träning på gånganalysapparaten före operationen, så beräkna minst 2 veckor mellan ankomsten av råttorna till anläggningen och de schemalagda uppgifterna för experimentell kirurgi28.
2. Induktion av nervskada
OBS: Använd personlig skyddsutrustning som en operationsrock, handskar och en mask. I fall en steril operationsrock inte är tillgänglig, är en ren, tvättad labbrock också tillräcklig. Om det inte blir förorenat, behöver klänningen eller kappan inte ändras mellan djur utan mellan operationerna. Användning av sterila operationshandskar rekommenderas. I fall sådana handskar inte finns tillgängliga, kan undersökningshandskar också användas men bör tvättas före operationen med hjälp av kirurgiskt desinfektionsmedel. Handskar ska bytas mellan djur.
- På operationsdagen, försök att minimera någon mängd stress till djuren eftersom detta kan störa anestesi, t.ex.
- På operationsdagen, injicera 0,05 mg Buprenorfin/kg kroppsvikt i suspension med 100-200 μL 0,9% NaCl subkutant med hjälp av en 25 G-kanla 1 h före operationen för att ge pre- och interoperativ analgesi. Om inte anges annat, råttans flank är det föredragna stället för injektion.
- Bedöva råttorna genom att placera dem i en anestesi induktionskammare ansluten till en sevoflurane SPRIDARE och en aktiv krita behållare för att absorbera CO2. Anaesthetize råttan genom att översvämma anestesilådan med 4%–5% sevofluran-syreblandning i ca 5 min med hjälp av ett syreflöde på 1,5 L/min (initieringsfas). Anslut en pulsoximetriklämma till en av tassarna för att övervaka gnagarens syremättnad i blodet. Bibehålla tillståndet för narkos med 2,5%–4,5% sevofluran-syreblandning.
OBS: För experimentell kirurgi är narkos obligatorisk. Bekräfta generell anestesi genom att kontrollera bristen på svar på nypa stimulans av svansen eller tassarna. - När råttan har gått in i narkos, raka respektive areal som kommer att drivas på och desinficera området genom att svepa den omväxlande med alkohol och hud desinfektionsmedel. Den slutliga svepning bör utföras med hud desinfektionsmedel.
- Placera den på en justerbar värmedyna i det läge som krävs (supine för femorala nervmodellen, benägna för ischias och SCI-modellen). Sätt in en böjlig termometersond i råttans ändtarm för att övervaka djurets temperatur och bibehålla den vid omkring 37 °C under operation. Under anestesi, skydda råttans ögon från uttorkning med hjälp av ögonsalva
3. Kirurgisk induktion av nervskada
- När du utför kirurgiska ingrepp, följ strikt de sju principerna i Halsted29 enligt följande:
- Hantera alltid vävnaderna försiktigt när du arbetar med dem. Undvik att riva eller krossa vävnaderna.
OBS: Self-made30 eller kommersiellt tillgängliga upprullningssystem är till hjälp för att hålla muskler och kärl utanför operationsfältet. - Underhåll försiktigt hemostasen med hjälp av en elektrisk hemostat för att kauterisera fartyg eller ligaturer för att garantera noggrann hemostas.
- Alltid upprätthålla blodtillförseln till vävnaderna genom att dissekera dem noggrant och hantera dem försiktigt.
- Upprätthålla strikt asepsis genom att bära en mask, en klänning, och sterila handskar.
- Undvik spänningar på vävnaderna genom att applicera suturer som varken är för trånga eller för lösa.
- Minutiöst appose vävnaderna genom att föra sina respektive kanter tillsammans utan någon överlappande.
OBS: Detta är särskilt viktigt när det gäller epineurell eller perineurial neurorrhaphy. Utför alla mikrokirurgiska procedurer under 6x–16x förstoring med hjälp av ett driftmikroskop. Helst ger mikroskopet två par okulär för att möjliggöra observation av operationen av en assistent. - Undvik skapandet av döda utrymmen genom att noggrant suturera de olika vävnadsskikten.
- Hantera alltid vävnaderna försiktigt när du arbetar med dem. Undvik att riva eller krossa vävnaderna.
- Induktion av sciatic nerv neurotmesis av den högra hindlimb
- Exponera rätt sciatic nerv på midthigh nivå genom att utföra en 5 cm lång snitt på ryggsidan av bakbenen med en #10 skalpell blad ansluten till en #3 skalpell handtag och genom att dissekera den överliggande muskulatur och mjukvävnad. Placera ett upprullningsdon inuti såret för att hålla den dissekerade muskulaturen och huden borta från situsen. Exponera försiktigt nerven genom att ta bort den omgivande vävnaden med hjälp av böjda mikrokirurgiska saxar.
- Ta bort ett 8 mm långt nervsegment av ischiasnerven 1–2 mm proximalt till dess trifurkation med raka mikrokirurgiska saxar.
- Rotera nervsegmentet 180°, placera det mellan den transektoriska sciaticnervens proximala och disponibla stump och utför epineuriell neurorrhaphy på varje plats med två avbrutna 10–0 suturer och en mikrokirurgisk nålhållare.
- Induktion av femorala nerv neurotmesis på höger baklimb
- Utför ett längsgående 3–4 cm ljumske snitt med ett #10 skalpellblad som är anslutet till ett #3 skalpellhandtag för att exponera den högra femoral neurovaskulära bunten. Använd kirurgisk sax för trubbig dissektion tills bifurkationen av lårbensnerven exponeras. Placera ett upprullningsdon inuti såret för att hålla den dissekerade muskulaturen och huden borta från situsen.
- Transect de exponerade motoriska och sensoriska grenarna distala till bifurkation och punktskatt en 6 mm lång nerv segment av varje gren, respektive, med hjälp av raka mikrokirurgiska sax.
- Rotera båda nervsegmenten 180°, placera dem mellan den proximala och distala stumpen hos de transekterade femorala nervgrenarna och utför epineuriell neurorrhaphy på varje plats med två avbrutna 11–0 suturer och en mikrokirurgisk nålhållare.
OBS: Utför ett homotopiskt autologt nervtransplantat genom att ympa motortransplantatet till den ursprungliga motoriska grenen och det sensoriska transplantatet till den ursprungliga sensoriska grenen. Alternativt, utföra en heterotopic autolog nerv transplantat genom ympning motor graft till den ursprungliga sensoriska grenen och vice versa.
- Induktion av bröst ryggmärg kontusion skada
- Utför en hud snitt över bröst ryggraden med en #10 skalpell blad ansluten till en #3 skalpell handtag följt av två muskel snitt parallellt med de spinous processer för att underlätta muskel upprullning. Placera ett upprullningsdon inuti såret för att hålla den dissekerade muskulaturen och huden borta från situsen.
- Identifiera den 11: e bröstkotan (Th) och exponera lamina av kotbågen genom att ta bort överliggande vävnad samt den spinous processen med hjälp av en rongeur.
- Utför en laminektomi med hjälp av en mikroborr och en lämplig grad för att borra ett litet hål i lamina, något större än spetsen på slagkroninen. För att förhindra skador på ryggmärgen, bara tunna ut lamina samtidigt öppna och utvidga hålet med hjälp av en rongeur. Om periosteum fortfarande är intakt, ta försiktigt bort den med hjälp av en vass spetsig sond utan att skada dura mater.
- Efter att säkerställa ett tillräckligt stort hål görs utan att destabilisera lamina, håll djurets ryggrad på plats genom att spänna fast den rostrally och caudally till Th11 med slaggarestabiliserande tympning. Med hjälp av handhjulen fram och på sidan, placera stålstången 3–5 mm ovanför laminektomihålet. Slutligen, utsätta alla djur för en inverkan med en definierad kraft på 150 kilodyne att framkalla en mild till måttlig grad av ryggmärgskontusion skada4.
- Utför sårförslutning i anatomiska lager med hjälp av polyglactin 4–0 eller 5–0 avbrutna suturer och en kirurgisk nålhållare. Rengör såret noggrant genom att försiktigt torka av det med en gasvävsdyna som blötts i steril 0,9% NaCl.
- Efter operationen, tillbaka djuren till deras hem bur och skydda dem från ljus och ljud exponering. Övervaka djurens beteende noga fram till postoperativ dag (DPO) 7 och försäkra tillräckligt med mat och vattenintag. Om det behövs, ge ytterligare vätska genom subkutana injektioner (t.ex. 10 ml NaCl 0,9%).
- Tillhandahålla postoperativ analgesi i minst 2 dagar med hjälp av, t.ex. opioider (0,05 mg/kg kroppsvikt Buprenorfin subkutant (s.c.)) och/eller antipyretics (4 mg/kg kroppsvikt Carprofen s.c.). Om det krävs, och när det gäller SCI-modellen, också ge postoperativ antibiotikabehandling (7,5 mg/kg kroppsvikt Enrofloxacin per os (p.o.)).
- Vid ryggmärgsskada tömr råttans blåsa manuellt tills spontan urinering kommer tillbaka.
4. Återhämtning från kirurgiska ingrepp före gånganalys
OBS: Råttor med sciatic nervskada visar tendensen att gnaga på sina baktassar på grund av debut av smärtsam neuropati efter nervskada. Denna form av automutilation kan resultera i autoamputation av tår eller delar av respektive baktass. Föredrar Lewis råttor över andra råtta stammar i fall när du använder den sciatic nervskada modell, som denna råtta stam visar en mindre tendens för automutilation31. Råttor med sciatic nervskada visar också tendensen att utveckla contractures av den drivna delen, vilket kan resultera i deras uteslutning från studien på grund av störningar i datainsamling. Sådana biverkningar inträffar mycket mindre vanligt hos råttor med lårbensskada.
- Inspektera opererade djur dagligen efter operation med särskild uppmärksamhet på status för sina lemmar och tassar, respektive.
OBS: Hos råttor med SCI, på höjden av Th11, penis eller rektal framfall kan uppstå på grund av försämring av djurens naturliga förmåga att urinera och uträtta sina uträttning. Dessa händelser definieras vanligen som mänskliga effektmått i studien och innebär omedelbar uteslutning av det drabbade djuret från studien. - Fortsätt postoperativ analgesi tills råttor upphör att visa några smärtrelaterade symtom.
- Vid ihållande smärta, administrera gabapentin (30–120 mg/kg kroppsvikt) p.o. för att behandla neuropatisk smärta.
5. Förberedelser före utförande automatiserad gånganalys
OBS: Gånganalyssystemets metodik bygger på att djuren registreras underifrån samtidigt som de korsar en glasskiva, som belyses av en grön LED-lampa. När djurens tassar kontaktar golvet, belyses och spelas in området i tassavtrycket av en höghastighetsvideokamera. Dessa data skickas sedan via en Ethernet-kabel till en dator som kör programvaran för gånganalys. Medan enskilda fotavtryck kan klassificeras manuellt av experimentören, den senaste programversionen har också automatisk fotavtryck klassificering.
- Utför alla testprocedurer i mörker och i avsaknad av störande ljud. Eftersom råttor har möjlighet att uppfatta överljudsfrekvenser, också kontrollera att inga källor avger sådana ljud.
OBS: Utför gånganalys antingen varje vecka eller varannan vecka, men inte testa råttor alltför ofta som särskilt Lewis råttor tenderar att förlora intresset för att delta i förfarandet över tiden när de utsätts för en viss övning alltför ofta. Det är dock skyldig att träna råttor dagligen i 5 dagar före operationen för att acklimatisera dem till testmiljön och förfarandet. - Under träningspass och på testdagen förbereder du beteendetestrummet genom att stänga av alla ljuskällor, vilket annars skulle kunna störa den automatiserade gånganalysenhetens kamera. Placera datorskärmen som är nödvändig för dataanskaffningen bort från kameran för att förhindra att dess ljus stör kameran.
- Kontrollera att enheten är installerad i stabil position och på ett sätt som förhindrar varje form av vibrationer, eftersom detta allvarligt kommer att störa förfarandet för datainsamling.
- Ta med råttorna till beteendetestrummet och acklimatisera dem i sin egen hemmabur i minst 30 min före testet.
OBS: Närhelst djuren hanterar, använd personlig skyddsutrustning som en operationsrock eller labbrock, handskar, och en mask.
6. Utföra automatiserad gånganalys
- Utbildningstillfällen
OBS: Under träningen kommer djuren att genomgå en inlärningskurva, så det rekommenderas att justera träningsschemat gradvis. Använd matbelöningar (t.ex. 1–2 stycken frukostflingor) för att belöna djuren efter ett lyckat slutförande av varje träningspass.- På den första dagen av träning, försiktigt lyfta djuret genom att hålla den under bagageutrymmet och försiktigt bära den till gångvägen ingången.
- Placera djuret i entréområdet och låt det utforska öppningen av korridoren utan några störningar från den person som utför testförfarandet.
OBS: Skrik inte, vissla, blås på eller peta djuret i ett försök att motivera det att korsa gångvägen. Allt sådant beteende kommer att allvarligt betona djuret och ytterligare komplicera förfarandet för datainhämtning. - Vänta tills djuret frivilligt korsar gångvägen för att nå sin hembur. Ibland, särskilt i otränade djur, detta kan ta upp till flera minuter. Den första träningsdagen är djuret varken förväntas eller krävs för att göra oavbrutna körningar med enhetlig gånghastighet. I stället bör det acklimatisera sig med testaapparaturen och tillvägagångssättet.
- På den andra dagen av utbildning, vänja djur att komma in i gångvägen utan att tveka och, också att återvända till sitt hem bur utan att tveka. Vissa djur kommer förmodligen redan har lärt sig att korsa gångvägen utan avbrott, men detta krävs fortfarande inte i slutet av den andra dagen.
- På den tredje dagen av träning, se till att djuren lär sig att korsa gångvägen utan att tveka, sniffa, eller på annat sätt explorativa rörelser. Se till att de går med jämn hastighet.
- På den fjärde och femte dagen av utbildningen, upprepa den tidigare övningen för att konsolidera testförfarandet.
OBS: I fall ett djur inte skaffar sig den nödvändiga skickligheten för att korsa gångvägen ordentligt i slutet av 5-dagars träningsperioden, lägg till 2 ytterligare dagar av träning (t.ex. helgen). Också, överväga utför upp till 3 träningspass om dagen, åtskilda av minst 2 h vila mellan individuell session. I 95 % av fallen kommer djuret att ha förvärvat den erfarenhet som krävs för utbildning i slutet av denna förlängda utbildningsperiod. I det sällsynta fallet ett djur har fortfarande inte förvärvat denna färdighet efter 7 dagars träning, rekommenderas att skjuta upp den planerade experimentella kirurgi session i minst 1 vecka och att upprepa ovan nämnda utbildning regim.
7. Dataförvärv
OBS: Gånganalyssystemet visualiserar varje tassutskrift medan djuret går och analyserar automatiskt olika gångparametrar som Paw Print Area, Paw Print Intensity, Paw Swing Time och Paw Swing Speed (Tabell 1). När gånganalyssystemet registrerar alla data baserat på intensiteten som genereras av djurens tassavtryck, se till att kamerainställningarna justeras enligt råttornas vikt och storlek. Dessutom, se till att gångvägen är torr och ren före datainspelning för att förhindra påverkan på datainsamling.
- Innan du förvärvar några data, rengör gångvägen med hjälp av kommersiell glasrengöringsmedel och en squeegee. Spraya glasplattan flera gånger och torka sedan den med squeegee för att avlägsna eventuella partiklar från dess yta. Rengör också undersidan. Se till att ta bort eventuell vätska från ändarna av gångvägen eftersom djuren annars kunde trampa på den, vilket skulle påverka de registrerade uppgifterna.
- Upprepa rengöringsproceduren närhelst det är nödvändigt, t.ex. Detta är tänkt att förhindra att djuret från att distraheras av deras conspecifics doft.
- Före den allra första datainhämtningen justerar du de kamerainställningar som passar djurens vikt. Bekräfta detta genom att sätta det lättaste och tyngsta djuret på gångvägen och välj en kamerainställning som möjliggör god datakvalitet i båda fallen. Justera Kameraförsträckningen, rött takljus, grönt gångvägsljus och git (Green Intensity Threshold) för att säkerställa optimal avkänning av tassutskrift.
OBS: Ändra inte de valda inställningarna efter att dataanskaffning har påbörjats eftersom detta kommer att hindra jämförbarheten av de förvärvade uppgifterna. Som ett undantag kan GIT ändras under dataklassificering, men detta måste göras för alla försök enhetligt. - Definiera och kalibrera gångvägen med hjälp av det medföljande kalibreringsarketet.
- Välj en registrerad kamera som anges i fliken Setup.
- Klicka på knappen Öppna förvärv som finns i fliken Förvärva.
- Ta en ögonblicksbild av den tomma, rensade gångvägen, som kommer att användas som referens under hela följande datainsamlingsprocedur.
- Observera statusen ändras från Väntar på ögonblicksbild till Klar för förvärv.
- Klicka på knappen Starta förvärv och lägg märke till statusändringen från Klar för förvärv till Väntar på körning till start.
- Placera en råtta på gångvägen och följ djurets rörelse på datorskärmen. Observera statusändringen från Väntar på körning till Start till inspelningskörning.
OBS: Programvaran kommer automatiskt klassificera kör den anser kompatibel enligt förinställda köra egenskaper med en grön symbol, medan icke-kompatibla körningar kommer att märkas med en röd symbol. Programvaran stoppar automatiskt datainsamling när tre kompatibla körningar registrerades, men datainhämtning kan fortsättas genom att klicka på knappen Starta förvärv igen.
8. Dataklassificering
OBS: Se tabell 1 för en lista över AGA-utfallsparametrar. Minst tre överensstämmande körningar behövs där djuret måste korsa gångvägen stadigt utan att tveka27. Dessutom ska löphastigheter matcha inom samma kategorier som definieras i litteraturen30.
- Klicka på knappen Klassificera i fliken Experimentell Explorer av respektive försök som ska klassificeras.
- Spela den förvärvade körningen med normal hastighet för att få ett intryck om data överensstämmer med de krav som anges innan.
- I vänstra övre hörnet, klicka på Auto Classify knappen för automatisk klassificering av tass utskrifter av programvaran.
OBS: Även om programvaran har en hög takt av korrekt tass klassificering, misslyckas det ibland att tilldela en tass till utskrifter eller tilldelar fel tass. Dubbelkolla därför alltid de autoklassificerade tassavtrycken efteråt. - För korrekt beräkning av normala stegsekvensmönster (NSSP) måste du kontrollera att klassificerande algoritmen inte förväxlas med icke synliga tassutskriv, vilket leder till bristfälliga NSSP (Bild 1A). Därför endast inkludera tassavtrycken som är detekterbara medan den kontralaterala tassen också är synlig för NSSP-beräkningar,t.ex.
Figur 1: Exemplariska AGA-uppgifter, vilket visar behovet av manuell dubbelkontroll av korrekt dataklassificering. I fall en upptäckt placering av en främre tass efterträds av den upptäckta placeringen av en annan främre tass (A) den AGA programvara kan förväxla detta med en okoordinerad gångmönster eftersom inga hind tassar har upptäckts. Därför rekommenderas att alltid dubbelkolla och välja en inledande tassavtryck, som detekteras när även den kontralaterala tassen syns (B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
9. Beräkna statistik
OBS: För att justera kördata för viktökningsrelaterade förändringar över tiden rekommenderas starkt att beräkna ett förhållande mellan den experimentella tassen med en icke-experimentell (t.ex. kontroll) tass. Dessutom beräkna förhållandet till preoperative värden av denna tass-till-tas jämförelse för övervägande av individuella skillnader i tass användning.
- Klicka på knappen Visa kör statistik för att få en omfattande översikt över körstatistiken.
- Välj Arkiv och Exportera om du antingen vill exportera kör statistik eller teststatistik till ett kalkylblad programvara.
Representative Results
12 råttor genomgick experimentell perifer nervoperation. Sciatic nerv samband (Figur 2A) utfördes i 7 råttor, medan femorala nerv neurotmesis (Figur 2B) var inducerad i 5 råttor. I alla djur, var nerv defekt rekonstrueras med hjälp av en autolog nerv moderplantor. Ryggmärgskontusionskada (Figur 2C) på nivå Th11 inducerades hos 6 råttor, vilket gav totalt 18 råttor.
Figur 2: Avgörande platser efter nervrekonstruktion. Nervrekonstruktion med autograft i sciaticnerven (A) och lårbensnerven (B) samt efter ryggmärgskontusionskada (C). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Alla djur återhämtade sig väl från kirurgi och inga fall av självstympning inträffade. Ett djur av sciatic nerv skada gruppen utvecklat starka contractures av den högra hind tass under loppet av den postoperativa observationsperioden och måste uteslutas från ytterligare dataanalys.
Sciatic nerv neurotmesis
Eftersom sciatic nerv ger muskulös och sensorisk innervation till majoriteten av hindlimb, dess samband resulterar i en allvarlig försämring av locomotor funktion. Efter skada använder råttor tafsens häl för endast viktstöd (figur 3B–E) och extremiteten flyttas i en svepande cirkumductory rörelse. Därför blir de lokomotoriska förändringar som bedöms via AGA uppenbara med hjälp av en betydligt reducerad Print Area (Figur 4A) och avsevärt ökade Swing Time (Figur 4B). Båda parametrarna ändrades fortfarande avsevärt i jämförelse med mätningar före OP som vid slutet av observationsperioden. Anmärkningsvärt, ett djur utvecklat starka contractures av höger hind tass börjar på postoperativa vecka (WPO) 10. Detta resulterade i en ökning av Print Area av höger baktass till mer än 150% i jämförelse med vänster tass vid WPO12 (Figur 5). Eftersom detta var en extremum i jämförelse med alla andra djur som bedömdes i denna studie, uteslöt vi detta djur från dataanalys när det gäller Utskriftsområde.
Bild 3: Representativa tassutskrivningar före och efter kritisk storleksresektion av höger sciatic nerv och autograftreparation. Notera den kraftiga minskningen i Print Area efter nervskada (B) jämfört med preoperatively (A). Trots en liten ökning i Print Area under loppet av observationsperioden (C–E) tass utskrifter av den högra bakbenen förblev särskilt ändras från baslinjen inspelningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Kursen av funktionella återhämtning efter kritisk storlek samband och autograft reparation av den sciatic nerv. Print Area Ratio (A) och Swing Time Ratio (B) ändrades statistiskt sett avsevärt från Pre-OP-värden omedelbart efter sciatic nerv samband. Medan Print Area förblev betydligt minskat jämfört med baslinjen fram till WPO10, ökades Swing Time fortfarande avsevärt till Pre-OP-värden vid WPO12. *: p < 0,05 jämfört med Pre-OP, **: p < 0,01 jämfört med Pre-OP. Felstaplar indikerar medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Boxplot av loppet av Print Area efter sciatic nervskada. Notera extremumen (röd ellips) på WPO12, som förklaras av faktumet att ett djur framkallade starka contractures av den högra hindtassstarten från WPO10. Djuret uteslöts därför från den statistiska analys som visades i figur 4. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Femorala nerv neurotmesis
Femorala nerv samband resulterar i denervation av quadriceps muskeln ilåret 33,34. I konsekvens, knäförlängning är nedsatt, vilket resulterar i hyperflexion av fotleden med på varandra följande lyft av tassens häl. Därför minskas respektive tass's Print Area (Figur 6B), starkt efter operationen. Print Area av vänster hind tass ökas på grund av en kompenserande växling av vikt till vänster. Detta bör hållas i åtanke, eftersom detta fenomen direkt påverkar det beräknade förhållandet mellan den "experimentella" och "kontroll" tass. Start från WPO4 reinnervation av quadricepsen vid regenererande femorala nerven blytak till omsvängning av dessa ändringar resultera i ökande Tasstryck område av den högra hindtassen (Figurera 7A). Som quadriceps muskeln i låret spelar också en roll i svingfasen av respektive tass, Swing Time (Figur 7B) är kraftigt långvarig hos råttor med lårbensnervskada. Speglar återlämnande av Print Area, Swing Time minskar som regenererande lårbensnerven når quadriceps muskeln i låret. Vid WPO10, båda parametrarna för gång återvände till baslinjen, signalering full funktionell återhämtning.
Bild 6: Representativa tassavtryck. Representativa tass utskrifter före (A) och följande (B–E) rätt lårbensnerv samband och autograft reparation. Skriv ut Område av RH minskade starkt på WPO2 (B), stund en förhöjning in Skriva ut Område av den lämnade hindtassen (LH) tack vare ökande väger laddar blev synligt. RH Print Area började öka med början från WPO6 (C) åtföljd av en minskning av Print Area of LH. Vid WPO8 (D) och WPO10 (E) Print Area of RH återhämtade sig tillbaka nära preoperative nivåer. (Anpassad med tillstånd från Heinzel et al.22, licensierad enligt CC BY 4.0.) Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Kursen av funktionell återhämtning efter 7-mm samband och autograft reparation av lårbensnerven. Kursen av Print Area Ratio (A) och Swing Time Ratio (B) visade en stark förändring omedelbart efter lårbensnerven samband, men värden återhämtat sig tillbaka till preoperative värden vid WPO8. #: p < 0.05. Felstänger indikerar medelvärde ± SEM. (Anpassad med tillstånd från Heinzel et al.22, licensierad enligt CC BY 4.0.) Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Ryggmärgskontusion
Gånganalys visade markant förändrade tassavtryck efter bröst ryggmärgskontusionskada (Figur 8), mest anmärkningsvärda en desinfektion i Print Area och en markant intern rotation av baktassarna vid WPO2 (Figur 8B). Anmärkningsvärt, tass rotation genomförs också som en bedömningsbar funktion i BBB, understryker tillämpligheten av datoriserade gånganalys för att utvärdera förändringar av gång som ursprungligen utvärderades med Open Field testning. Angående de enskilda gångparametrarnas förtur resulterade ryggmärgskontusionen påTh 11-nivån en minskning av Utskriftsområdet Ratio (Bild 9A) och ökning av Swing Time Ratio (Bild 9B). Båda parametrarna trendade mot utgångsnivåerna under observationsperiodens fortsatta gång, men det fanns inga statistiskt signifikanta förändringar observerbara. Även den samordningsrelaterade parametern Regularity Index (Figur 9C) minskade vid WPO2, men graden varierade kraftigt mellan djur. Det trendade också mot preoperativa värden fram till WPO16. Bas för stöd av baktassarna (Figur 9D), en allmän parameter av gång enligt Deumens, visade en markant ökning, som var statistiskt signifikant från WPO10 till WPO14. Den trendade mot baslinjenivåerna vid WPO16 och ändrades vid denna tidpunkt inte längre nämnkraftigt från pre-OP-värdet.
Bild 8: Representativa tassavtryck av de två baktassarna. Paw skriver ut preoperatively (A) och efter bröst ryggmärg kontusion skada (B–F). Notera minskningen i utskriftsområdet med början från WPO2 (B) åtföljd av en anmärkningsvärd intern rotation av tassarna. Under loppet av observationsperioden (C–F) är en ökning av Print Area observerbar samt clearance av den interna rotationen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 9: Ryggmärgskontusion på Th 11-nivån. Ryggmärgskontusion vid Th 11 resulterade i observerbara ombyggnader av Print Area Ratio (A) och Swing Time (B) och Regularitetsindexet (C), men dessa förändringar var inte statistiskt signifikanta. Efter skada visade Basen för stöd av hind tassarna en markant ökning jämfört med baslinjen, vad som var statistiskt signifikant vid WPO10 fram till WPO14. *: p < 0,05 jämfört med Pre-OP. Felstaplar indikerar medelvärde ± SEM. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Felsökningsdetaljer. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Bedömning av funktionell återhämtning i djurmodeller av PNI och SCI är fortfarande utmanande på grund av den stora variationen av utvärderingsmetoder, var och en med individuella fördelar och nackdelar. Endast få metoder har testats och validerats i flera modeller av perifera och centrala nervösa skador, även om lovande nya tekniker som kombinerar rörelsespårning och maskininlärning kan potentiellt driva neurobehavioral forskning till nästa nivå av funktionell testning. Vi är övertygade om att banbrytande metoder som i stort sett gäller för en mängd olika djur- och skademodeller snart kommer att dyka upp. Mot bakgrund av dessa överväganden, en av fördelarna med AGA är möjligheten att utvärdera funktionell återhämtning i flera modeller av nervskada med hjälp av endast en enhet. Sedan början av 2000-talet detta tillvägagångssätt har använts i experimentella modeller av PNI såsom den sciatic37, peroneal38, och lårbens nerv skadamodell 22 samt efter rot avulsion av både ländryggen39 och den brachialis plexus40. Olika centrala nervösa skador inklusive ryggmärgskontusion skada har också studerats med metoden41,42. Med detta papper, presenterade vi ett utförligt protokoll om hur man inducera tre vanligen studerade nerv skador samt hur man utvärdera funktionella återhämtning efteråt. Enligt vår mening, en praktisk riktlinje för forskare som är intresserade av området experimentell nervskada, reparation och förnyelse om hur man kan göra optimal användning av metodens fördelaktiga funktioner skulle vara till stor hjälp.
Flera författare har tagit upp potentialen hos AGA att utvärdera funktionell återhämtning hos gnagare, belyser metodens fördel att samtidigt bedöma gång parametrar relaterade till motor och sensorisk reinnervation27,28. Dessutom möjliggör jämförelse av data från en experimentell tass, t.ex., rekonstruerad nervskada till en oopererad tass som visades i båda de presenterade modellerna införandet av en intra-animal positiv kontroll. Omvänt, en opererad tass utan kirurgisk rekonstruktion eller ytterligare behandling skulle kunna fungera som en intra-animal negativ kontroll. Det visades också att det är möjligt att kombinera AGA med maskininlärningsansatser43. Trots metodens fördelar har den också flera begränsningar och nackdelar, såsom de tidskrävande utbildningsinsatserna, som är obligatoriska för att vänja djuret vidförvärvsförfarandet 28,44. En annan begränsning av AGA är den största storleken på de djur som är berättigade till testning på grund av apparatens begränsade dimensioner. Därför är användningen av AGA för närvarande begränsad till djur av storleken på gnagare och illrar45. Dessutom, nyligen framväxande neurobehavioral bedömning metoder inom området för rörelsespårning kan maskininlärning kan överträffa AGA i både omfattande samt möjliga tillämpningar18,19,46. Mest anmärkningsvärt, men i enlighet med andra utvärderingsmetoder, verkar det som funktionell återhämtning som bedöms av AGA är starkt begränsad-om ens förekommer-i modeller av ischiasnerven neurotmesis47,48. Å andra sidan, AGA möjliggör omfattande utvärdering av loppet av funktionella återhämtning efter femorala nerv neurotmesis som framgår av våra data. Med detta arbete, vi visat att Paw Print Area är en representativ gång parametern assessable via AGA, vilket är exemplariskt för loppet av funktionella återhämtning i de två nämnda perifera nerv skada modeller presenteras av oss. Medan funktionella återhämtning annons integrum var observerbara efter autograft reparation av femorala nerv, var AGA parametrar fortfarande väsentligt förändrats från baslinjen i slutet av observationsperioden efter autograft reparation av sciatic nerv. Det är anmärkningsvärt i detta sammanhang att lem kontrakturer är ett vanligt fenomen hos råttor med ischiasnerven skada och försiktighet är nödvändigt att inte blanda ihop dessa tecken på muskulär obalans och förlamning med förfarandet funktionella återhämtning32. Detta å ena sidan understryker AGA metodens oförmåga att upptäcka betydande funktionella återhämtning efter neurotmesis skada i denna modell. Å andra sidan väcker det frågan om det är möjligt att utvärdera ischias nervskada modell av råttan, som fortfarande är den mest använda experimentella nerv reparation modell, med hjälp av gånganalys i allmänhet i fall nervskada är allvarligare än axonotmesis48. Felsökningsuppgifter tillhandahålls i Tilläggsfil 1.
Vi lämnade också exemplariska uppgifter om användning av metoden för att utvärdera rörelseaktivitetsfunktionen hos råttor med ryggmärgsskada, vilket är möjligt utan några nödvändiga ändringar av hårdvaran setup eller förvärv förfarande. Samma princip gäller för andra gnagare modeller av centrala nervös skada (CNI)26,49,50 och rot avulsion skada. I motsats till isolerade PNIs, skador i ryggmärgen är mycket mer komplexa i sina patofysiologiska konsekvenser, som en mängd mycket viktiga strukturer är skadade, som involverar efferent vägar såsom corticospinal och rubrospinal skrifter och afferenta vägar såsom dorsala kolumner och spinothalamic skrifter35. Utmaningen att på ett adekvat sätt bedöma dessa patologiska förändringar återspeglas i den omfattande armamentarium av beteendemässiga tester, såsom Basso, Beattie, och Bresnahan (BBB) poäng36. Den gång parametern Base of Support har rapporterats öka efter centrala nervösa skador, troligen att redogöra för en resulterande instable gång. Base of Support ändrades avsevärt från baslinjen från WPO10 till WPO14 i vår modell, stödja vår presumtion att denna parameter tillåter bedömning av loppet av funktionella återvinning av AGA efter bröst ryggmärg kontusion skada.
Vi är övertygade om att AGA är ett genomförbart verktyg för att utvärdera funktionell återhämtning hos gnagare med skador i nervsystemet. Ändå, Vi råder att återspegla de observerade förändringarna av gång noggrant och grundligt i varje respektive experimentella setup. Ändringar i gång parametrar, t.ex., en ökning av Print Area efter en omedelbar postoperativ decirktion eller en minskning av Swing Time förfarande en omedelbar postoperativ höjning av denna parameter, under loppet av observationsperioden inte oundvikligen avser funktionella återhämtning. Istället dessa förändringar kan också relateras till en eventuell funktionell anpassning för att upprätthålla en oansenlig gång, med tanke på att råttor är ett byte arter och försöka undvika att visa smärta eller funktionshinder till potentiella rovdjur51. Det är, därför, rekommenderas att använda automatiserad gånganalys som ett kompletterande verktyg för att relatera förändringar av gång till andra resultat åtgärder av perifer nerv skada och regenerering21. Som tidigare nämnts anser vi också att det bör återspeglas noggrant om gnagare med ischias nerv neurotmesis bör undersökas med hjälp av AGA som vår konstaterandet starkt anger att funktionella återhämtning är starkt begränsad i detta fall.
Som framgår av vårt arbete är AGAs främsta tillgång möjligheten att studera både motorisk och sensorisk reinnervation i en mängd experimentella PNI-modeller samt CNI samtidigt som den bara kräver en uppställning. Därför är metoden, enligt vår mening, ett mycket värdefullt verktyg för omfattande neurobehavioral testning. En av AGA: s tillgångar, som är möjligheten att studera motoriska och sensoriska reinnervation i olika djurmodeller av PNI och CNI samtidigt som det kräver endast en setup, är enligt vår mening metodens främsta fördel i jämförelse med andra utvärderingsmetoder för att studera funktionell återhämtning, såsom gång spår analys52, Von Frey testning53, eller gång kinematik16. Potentialen att samtidigt utvärdera förändringar av gång som gör antingen korrelerar med resultat av elektrofysiologiska undersökningar av reinnervated muskel22 eller utvärderingsmetoder för sensorisk funktion54 är lovande när det gäller framtida tillämpningar av metoden. Vi rekommenderar därför att du använder AGA för att undersöka funktionell återhämtning i gnagare modeller av forelimb PNI, såsom ulnar, radiella eller median nerv, eller experimentell nerv överföring modeller55, som förblir ostuderade med denna metod ännu.
Vi ger härmed ett utförligt protokoll om hur man använder automatiserad gånganalys för att studera funktionell återhämtning i tre gnagare modeller av nervskada. Medan metoden kräver noggrant övervägande av olika viktiga aspekter såsom adekvat utbildning och noggrann hård- och programvarukalibrering, är det ett genomförbart och värdefullt kompletterande verktyg för att utvärdera nervregenerering i gnagare modeller av centrala och perifera nervskada.
Disclosures
Författarna förklarar att detta arbete stöddes av Noldus Inc. genom täckning av open access publicering avgift. Ingen av författarna fick någon personlig lön eller någon form av ekonomisk dricks. Författarna har inga andra konkurrerande intressen att deklarera.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Karin Brenner för hennes passionerade omsorg om djuren. Författarna vill också tacka Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner och Susanne Drechsler för deras hjälp under de experimentella operationerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | B. Braun Austria | 3570410 | Vehicle for drug delivery |
| 1 ml syringe | B. Braun Austria | 9161708V | Injecting device |
| 10 ml syringe | B. Braun Austria | 4606728 V | Injecting device |
| 1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin | Gebro Pharma | N/A | Alcoholic skin disinfection |
| 23-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657667 | Canula for s.c. injection |
| 26-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657683 | Canula for s.c. injection |
| 5 ml syringe | B. Braun Austria | 4606710 V | Injecting device |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma | B9275 | Analgetic agent |
| Burrs for Micro Drill | F.S.T | 19007-29 | Drilling of a hole inside the lamina |
| Caprofen | Zoetis Austria | N/A | Analgetic agent |
| Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of animal gait |
| Cauterizer Kit | F.S.T | 18010-00 | Cauterization of vessels during surgery |
| Enrofloxacin | Bayer Austria | N/A | Antibiotic |
| Ethilon (10-0) | ETHICON | 2810G | Suture material for neurrorhaphy |
| Ethilon (11-0) | ETHICON | EH7465G | Suture material for neurrorhaphy |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | 4302436 | Eye protection during anesthesia |
| Friedman-Pearson Rongeurs | F.S.T | 16221-14 | Surgical instrument |
| Gabapentin | Wedgewood Pharmacy | N/A | Analgetic agent |
| Goldstein retractor | F.S.T | 17003-03 | Retraction of tissues during surgery |
| Hair trimmer | Aescular | N/A | Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery |
| Heating Pad for rodents | ALA Scientific Instruments | N/A | Regulation of body temperature |
| Impactor | Precision Systems and Instrumentation | N/A | Induction of spinal cord contusion |
Lewis rat ( ) |
Janvier | N/A | Experimental animal |
| Magnetic Fixator Retraction System | F.S.T | 18200-50 | Retraction of tissues during surgery |
| Metzenbaum Baby Scissors | F.S.T | 14019-13 | Surgical instrument |
| Micro Drill | Word Precision Instruments | 503599 | Instrument for bone drilling |
| Micro Needle holder | F.S.T | 12076-12 | Surgical instrument |
| Micro-scissors (curved) | F.S.T | 15023-10 | Surgical instrument |
| Micro-scissors (straight) | F.S.T | 15007-08 | Surgical instrument |
| Mirror Finish Forceps | F.S.T | 11251-23 | Surgical instrument |
| Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
| Operating microscope | Leica | M651 MSD | Magnification of the operative site |
| Povidone Iod | B. Braun Melsungen | N/A | Non-alcoholic skin disinfectant |
| Pulse Oximeter | STARR Life Sciences | N/A | Surveillance of heart rate and oxygen saturation |
| Rodent thermometer | BIOSEB | BIO-TK8851 | Surveillance of body temperature |
| Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
| Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%) | Baxter | HDG9117A | Anesthetic |
| Spatula & Probe | F.S.T | 10090-13 | Surgical instrument |
| Sprague Dawley rat () |
Janvier | N/A | Experimental animal |
| Sterila gauze 5x5cm | EVAC MEDICAL | E010.03.00215 | Sterile gauze compress |
| Tissue Forceps | F.S.T | 11021-12 | Surgical instrument |
| Vicryl (4-0) | ETHICON | V3040H | Suture material for subcutaneous sutures |
| Vicryl (5-0) | ETHICON | V303H | Suture material for subcutaneous sutures |
| Vicryl cutting needle (4-0) | ETHICON | V392ZH | Suture material for skin sutures |
| Vicryl cutting needle (5-0) | ETHICON | V391H | Suture material for skin sutures |
References
- Mohanty, C. B., Bhat, D. I., Devi, B. I. Use of animal models in peripheral nerve surgery and research. Neurology India. 9, Supplement 100-105 (2019).
- Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regeneration Research. 15 (3), 491-502 (2020).
- Verma, R., Virdi, J. K., Singh, N., Jaggi, A. S. Animals models of spinal cord contusion injury. The Korean Journal of Pain. 32 (1), 12-21 (2019).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. The European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
- Sperry, R. W. The functional results of muscle transposition in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 73 (3), 379-404 (1940).
- Sperry, R. W. The effect of crossing nerves to antagonistic muscles in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 75 (1), 1-19 (1941).
- Sperry, R. W. Transplantation of motor nerves and muscles in the forelimb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 76 (2), 283-321 (1942).
- Zimmerman, E. A., Chambers, W. W., Liu, C. N. An experimental study of the anatomical organization of the Cortico-Bulbar System in the Albino Rat. The Journal of Comparative Neurology. 123, 301-323 (1964).
- Cohen, A. H., Gans, C. Muscle activity in rat locomotion: movement analysis and electromyography of the flexors and extensors of the elbow. Journal of Morphology. 146 (2), 177-196 (1975).
- Barnett, S. A. The Rat: A Study in Behaviour. , Aldine Publishing Company. (1963).
- Hare, G. M., et al. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Annals of Plastic Surgery. 30 (2), 147-153 (1993).
- Hare, G. M., et al. Walking track analysis: a long-term assessment of peripheral nerve recovery. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (2), 251-258 (1992).
- Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioral evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journa of Neuroscience Methods. 46 (3), 203-208 (1993).
- Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research. 26 (2), 186-194 (2004).
- Varejao, A. S., et al. Functional assessment of peripheral nerve recovery in the rat: gait kinematics. Microsurgery. 21 (8), 383-388 (2001).
- Varejao, A. S., et al. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve. 27 (6), 706-714 (2003).
- Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
- Deumens, R., Jaken, R. J., Marcus, M. A., Joosten, E. A. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
- Heinzel, J., et al. Use of the CatWalk gait analysis system to assess functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury - a systematic review. Journal of Neuroscience Methods. 345, 108889 (2020).
- Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. , 01580 (2020).
- Chen, S. H., et al. Changes in GABA and GABA(B) receptor expressions are involved in neuropathy in the rat cuneate nucleus following median nerve transection. Synapse. 66 (6), 561-572 (2012).
- Chen, S. H., et al. Decreases of glycine receptor expression induced by median nerve injury in the rat cuneate nucleus contribute to NPY release and c-Fos expression. Life Sciences. 90 (7-8), 278-288 (2012).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Sandner, B., et al. Systemic epothilone D improves hindlimb function after spinal cord contusion injury in rats. Experimental Neurology. 306, 250-259 (2018).
- Kappos, E. A., et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment of functional nerve recovery in small animal models. Brain and Behavior. 7 (7), 00723 (2017).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
- Webster, G. V. Halstedian principles in the practice of plastic and reconstructive surgery. Stanford Medical Bulletin. 13 (3), 315-316 (1955).
- Bozkurt, A., et al. A flexible, sterile, and cost-effective retractor system for microsurgery. Microsurgery. 31 (8), 668-670 (2011).
- Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
- Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
- Jackson, C. M. Anatomy of the rat. Transactions of the American Philosophical Society, Philadelphia, New Series, Volume XXVII, 1935. The Anatomical Record. 65 (1), By Eunice Chace Greene. With Foreword by Henry H Donaldson 127-129 (1936).
- Pena, M. C., Baron, J. Femoral nerve and rectus femoris muscle of the rat: a study in anatomy, histology, and histoenzymes. Annals of Plastic Surgery. 20 (6), 527-532 (1988).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models and Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
- Godinho, M. J., et al. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One. 8 (8), 69987 (2013).
- Pajenda, G., et al. Spatiotemporally limited BDNF and GDNF overexpression rescues motoneurons destined to die and induces elongative axon growth. Experimental Neurology. 261, 367-376 (2014).
- Matsuura, Y., et al. The effect of anti-NGF receptor (p75 Neurotrophin Receptor) antibodies on nociceptive behavior and activation of spinal microglia in the rat brachial plexus avulsion model. Spine (Phila Pa 1976). 38 (6), 332-338 (2013).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Koopmans, G. C., et al. The assessment of locomotor function in spinal cord injured rats: the importance of objective analysis of coordination. Journal of Neurotrauma. 22 (2), 214-225 (2005).
- Frohlich, H., Claes, K., De Wolf, C., Van Damme, X., Michel, A. A machine learning approach to automated gait analysis for the Noldus Catwalk system. IEEE Transaction on Bio-medical Engineering. 65 (5), 1133-1139 (2018).
- Batka, R. J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record (Hoboken, N. J). 297 (10), 1839-1864 (2014).
- Wood, T., et al. A ferret model of encephalopathy of prematurity. Developmental Neuroscience. 40 (5-6), 475-489 (2018).
- Abbas, W., Masip Rodo, D. Computer methods for automatic locomotion and gesture tracking in mice and small animals for neuroscience applications: a survey. Sensors. 19 (15), Basel, Switzerland. (2019).
- Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
- Haastert-Talini, K. Modern Concepts of Peripheral Nerve Repair. Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. , Springer International Publishing. 127-138 (2017).
- Lu, L., et al. Growth differentiation factor 11 promotes neurovascular recovery after stroke in mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Caballero-Garrido, E., Pena-Philippides, J. C., Galochkina, Z., Erhardt, E., Roitbak, T. Characterization of long-term gait deficits in mouse dMCAO, using the CatWalk system. Behavioral Brain Research. 331, 282-296 (2017).
- Graham, D. M., Hampshire, V. Methods for measuring pain in laboratory animals. Lab Animal. 45 (3), 99-101 (2016).
- Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the sciatic functional index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
- Stossel, M., et al. Comparative evaluation of chitosan nerve guides with regular or increased bendability for acute and delayed peripheral nerve repair: a comprehensive comparison with autologous nerve grafts and muscle-in-vein grafts. Anatomical Record (Hoboken). 301 (10), 1697-1713 (2018).
- Vrinten, D. H., Hamers, F. F. CatWalk' automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
- Aman, M., Sporer, M., Bergmeister, K., Aszmann, O. Animal models for selective nerve transfers of the upper extremity. Handchirurgie Mikrochirurgie Plastische Chirurgie. 51 (4), 319-326 (2019).
