Summary
Automatiseret gangart analyse er et muligt værktøj til at evaluere funktionelle opsving i gnaver modeller af perifere nerveskade og rygmarvskontusion skade. Selv om det kun kræver én opsætning at vurdere bevægelsesfunktion i forskellige eksperimentelle modeller, er omhyggelig justering og træning af dyrene meget vigtigt.
Abstract
Perifere og centrale nerveskader er for det meste undersøgt hos gnavere, især rotter, da disse dyremodeller er både omkostningseffektive og en masse sammenlignende data er blevet offentliggjort i litteraturen. Dette omfatter en lang række vurderingsmetoder til undersøgelse af funktionel helbredelse efter nerveskade og reparation. Udover evaluering af nerve regenerering ved hjælp af histologi, elektrofysiologi, og andre in vivo og in vitro vurdering teknikker, funktionelgenopretning er det vigtigste kriterium for at bestemme graden af neurale regenerering. Automatiseret gangart analyse giver mulighed for registrering af en enorm mængde af gangart-relaterede parametre såsom Paw Print Area og Paw Swing Speed samt mål for inter-lemmer koordinering. Derudover, metoden giver digitale data om rotternes poter efter neuronal skade og under nerve regenerering, hvilket bidrager til vores forståelse af, hvordan perifere og centrale nervøse skader påvirker deres bevægelsesadfærd. Udover den overvejende anvendte iskiasnerven skade model, andre modeller af perifere nerveskade såsom lårbensnerven kan studeres ved hjælp af denne metode. Ud over skader i det perifere nervesystem, læsioner i centralnervesystemet, f.eks rygmarvskontusion kan evalueres. Gyldig og reproducerbar datavurdering er stærkt afhængig af omhyggelig justering af de hårde og softwareindstillinger forud for dataindsamling. Desuden er korrekt uddannelse af forsøgsdyr af afgørende betydning. Dette arbejde har til formål at illustrere brugen af edb automatiseret gangart analyse til at vurdere funktionelle opsving i forskellige dyremodeller af perifere nerveskade samt rygmarvskontusion skade. Det understreger også metodens begrænsninger, fx evaluering af nerve regenerering hos rotter med iskiasnerven neurotmesis på grund af begrænset funktionel opsving. Derfor, denne protokol menes at hjælpe forskere interesseret i perifere og centralnerveskader til at vurdere funktionelle opsving i gnaver modeller.
Introduction
Skader i det perifere og centrale nervesystem er ofte undersøgt i gnavere, hvilket resulterer i en stor mængde af sammenlignelige data om løbet af nerveskader, reparation, eller neuroprotection at modvirke yderligere sekundære skader og regenerering1,2,3. Resultatet af eksperimentelle behandlingsstrategier i gnavere modeller kan vurderes ved en række teknikker såsom histologi, immunhistrokemi, elektrofysiologi, og billeddannelse teknikker såsom X-ray mikrotomografi (μCT) scanninger, men det vigtigste kriterium for at bestemme succes en behandling er-ligesom hos menneskelige patienter-graden af funktionel opsving4,5. De første undersøgelser af bevægelsesfremmende resultater hos gnavere går tilbage til 1940'erne6,7,8. Rotter og mus var genstand for en stor mængde undersøgelser undersøge deres bevægelsesadfærd i de følgende årtier9,10,11. I dag findes der en bred vifte af vurderingsteknikker for gnavermodeller af perifere og centrale nerveskader, lige fra analyse af vandrespor med blæk og papir12,13,14 over ankel- og gangteknikkinematik15,16,17 til machine-learning forbedrede metoder, som giver mulighed for kompleks estimering af gangart, lemmer og fælles baner18,19.
Edb Automated Gait Analysis (AGA) bruges til at evaluere bevægelsesfunktion efter perifere og centrale nervøse skader og potentielle eksperimentelle behandling af sådanne skader. Enheden består hovedsageligt af en glasgangbro og en lyskilde, der oplyser gnaverens pote prints i sammenhæng med trykket overskrides af dem. Disse data er derefter edb til at beregne en bred vifte af statiske og dynamiske parametre. Ifølge Deumens kan disse parametre yderligere opdeles i kategorierne generelle parametre, smerterelaterede parametre samt koordineringsrelaterede parametre for gangart20 (tabel 1). Gennemførligheden af AGA at opdage ændringer i gangart adfærd er blevet bevist i forskellige dyremodeller af perifere nerveskade (PNI)21, såsom iskiasnerven20,lårbensnerven22, og median nerve23,24. Det er også rutinemæssigt anvendes til at vurdere bevægelsesfunktion hos rotter med centralnerveskader, f.eks slagtilfælde25 eller rygmarvskontusion26. Metodens fremskridt ligger i den store mængde sammenlignelige data og dens mulighed for at registrere et væld af parametre relateret til gangart27. Dette papir har til formål at give forskere interesseret i dyremodeller af PNI og rygmarvsskader (SCI) med en detaljeret og hands-on retningslinje til at vurdere bevægelsesfunktion i sådanne modeller.
| Kategori | Parameter | Beskrivelse | |
| Generelle parametre for gangart | Udskriftsområde (afstandsenhed) | Område af pote print | |
| Udskriftslængde (afstandsenhed) | Længden af pote print | ||
| Base of Support (BoS) (afstandsenhed) | Afstand mellem de to bag- eller forpoter | ||
| Skridtlængde (afstandsenhed) | Afstand mellem to på hinanden følgende placeringer af en pote | ||
| Smerterelaterede parametre for gangart | Svingtid (er) | Swingfasens varighed | |
| Stand time (er) | Varighed af holdningsfasen | ||
| Gennemsnitlig paw printintensitet (vilkårlig enhed) | Gennemsnitlig iIntensitet af pote print under holdning fase | ||
| Koordineringsrelaterede parametre for gangart | Normale trinsekvensmønstre (NSSP) | Specifikke sekvenser af poteplaceringer under en trincyklus | |
| Fase dispersioner (%) | Tidsmæssige forskelle mellem trincyklusserne for to specifikke poter | ||
| Regularity Index (RI) (%) | Kvantificering af interlimb koordination ved at dividere mængden af fejlfri NSSP gange 4 med det samlede antal pote placering i løbet af et trin cyklus | ||
Tabel 1: Parametre for gangart, der kan vurderes med den automatiserede ganganalyse. De kategorier , som parametrene klassificeres i , vælges i henhold til Deumens et al.20.
Protocol
Forsøgsprotokollen for alle forsøg blev på forhånd godkendt af Animal Protocol Review Board of the City Government of Vienna. Alle procedurer blev gennemført i fuld overensstemmelse med Helsinki-erklæringen om dyrerettigheder og vejledningen om pleje og anvendelse af laboratoriedyr fra de nationale sundhedsinstitutter.
1. Dyrehuse
- House mandlige rotter (Lewis eller Sprague Dawley) vejer 250-300 g under en 12 h lys / mørk cyklus med ad libitum adgang til mad og vand.
- Kontroller både rumtemperatur (holdes ved 20-22 °C) og fugtighed (45%-65 %) for passende dyrehus. Til dette arbejde blev der anvendt mandlige Lewis (PNIs) og Sprague Dawley (SCI) rotter.
- Giv en ny, renset bur to gange om ugen. House rotter i grupper af to eller tre og nøje overvåge deres sociale adfærd og interaktion. Lad rotterne en akklimatiseringsperiode på mindst 1 uge før kirurgisk indgreb eller funktionstest.
BEMÆRK: Rotter kræver mindst 5 dages daglig træning på ganganalyseapparatet før operationen, så beregn mindst 2 uger mellem rotternes ankomst på anlægget og de planlagte data for eksperimentel kirurgi28.
2. Induktion af nerveskade
BEMÆRK: Bær personlige værnemidler såsom en kirurgisk kjole, handsker og en maske. Hvis en steril kirurgisk kjole ikke er tilgængelig, en ren, hvidvasket laboratoriekittel er også tilstrækkelig. Medmindre det bliver forurenet, kjole eller pels behøver ikke at blive ændret mellem dyr, men mellem kirurgi sessioner. Det anbefales at anvende sterile kirurgiske handsker. Hvis sådanne handsker ikke er tilgængelige, kan der også anvendes undersøgelseshandsker, men skal vaskes før operation ved hjælp af kirurgisk desinfektionsmiddel. Handskerne bør skiftes mellem dyr.
- På dagen for operationen, forsøge at minimere enhver mængde stress til dyrene, da dette kan forstyrre anæstesi, f.eks dyr vil kræve højere doser af anæstesi.
- På operationsdagen injiceres 0,05 mg Buprenorphin/kg kropsvægt i suspension med 100-200 μL 0,9% NaCl subkutant ved hjælp af en 25 G canula 1 h før operationen for at give præ- og interoperativ analgesi. Hvis andet ikke er angivet, er rottens flanke det foretrukne injektionssted.
- Bedøve rotterne ved at placere dem i en anæstesi induktion kammer forbundet til en sevofluran vaporizer og en aktiv kridt beholder til at absorbere CO2. Bedøve rotten ved at oversvømme anæstesi boksen med 4%-5% sevofluran-oxygen blanding i ca 5 min ved hjælp af en iltstrøm på 1,5 L / min (indledning fase). Tilslut en puls oximetri klip til en af poterne til at overvåge gnaver blod iltmætning. Opretholde tilstanden af generel anæstesi med 2,5%-4,5% sevofluran-oxygen blanding.
BEMÆRK: Ved eksperimentel kirurgi er generel anæstesi obligatorisk. Bekræft generel anæstesi ved at kontrollere den manglende reaktion på knivspids stimulus af halen eller poter. - Når rotten er kommet ind i almen anæstesi, skal du barbere det areal, der skal anvendes på, og desinficere området ved at stryge det skiftevis med alkohol og huddesinfektionsmiddel. Den endelige aflæsning skal udføres med huddesinfektionsmiddel.
- Placer den på en justerbar varmepude i den ønskede position (liggende til lårbensnerven model, tilbøjelige til iskias og SCI model). Indsæt en fleksibel termometersonde i rottens endetarm for at overvåge dyrets temperatur og holde det ved omkring 37 °C under operationen. Under anæstesi skal du beskytte rottens øjne mod udyring ved hjælp af øjens salve
3. Kirurgisk induktion af nerveskade
- Når du udfører kirurgiske procedurer, holde sig strengt til de syv principper i Halsted29 som følger:
- Håndter altid vævsvævet forsigtigt, når du arbejder med dem. Undgå at rive eller knuse vævene.
BEMÆRK: Self-made30 eller kommercielt tilgængelige retractor systemer er nyttige til at holde muskler og fartøjer ud af driftsområdet. - Vedligehold omhyggeligt hæmostase ved hjælp af en elektrisk hæmostat til at ætse fartøjer eller ligaturer for at sikre omhyggelig hæmostase.
- Altid opretholde blodforsyningen til væv ved at dissekere dem omhyggeligt og håndtere dem fint.
- Opretholde streng asepsis ved at bære en maske, en kjole, og sterile handsker.
- Undgå spændinger på vævene ved at anvende suturer, som hverken er for stramme eller for løse.
- Omhyggeligt appose væv ved at bringe deres respektive kanter sammen uden overlapning.
BEMÆRK: Dette er især vigtigt i tilfælde af epineurial eller perineurial neurorrhaphy. Udfør alle mikrokirurgiske procedurer under 6x-16x forstørrelse ved hjælp af et driftsmikroskop. Ideelt set mikroskop giver to par okularer at give mulighed for observation af operationen af en assistent. - Undgå oprettelse af døde rum ved omhyggeligt at suturere de forskellige vævslag.
- Håndter altid vævsvævet forsigtigt, når du arbejder med dem. Undgå at rive eller knuse vævene.
- Induktion af iskiasnerven neurotmesis af højre hindlimb
- Eksponere højre iskiasnerven på midthigh niveau ved at udføre en 5 cm lang snit på den dorsale side af baglemmen med en #10 skalpel klinge forbundet til en #3 skalpel håndtag og ved at dissekere den overliggende muskulatur og blødt væv. Placer en retractor inde i såret for at holde den dissekerede muskulatur og hud ud af situs. Forsigtigt udsætte nerven ved at fjerne det omgivende væv ved hjælp af buede mikrokirurgiske saks.
- Fjern en 8 mm lang nerve segment af iskiasnerven 1-2 mm proksimalt til sin trifurcation med lige mikrokirurgiske saks.
- Drej nervesegmentet 180°, placer det mellem den proksimale og distale stub af den transsiterede iskiasnerven og udfør epineurial neurorrhaphy på hvert sted med to afbrudte 10-0 suturer og en mikrokirurgisk nåleholder.
- Induktion af femorale nerve neurotmesis på højre hindlimb
- Udfør en langsgående 3-4 cm lyske snit med en #10 skalpel klinge forbundet til en #3 skalpel håndtag for at afsløre den rigtige femorale neurovaskulære bundt. Brug kirurgisk saks til stump dissektion, indtil bifurcation af lårbensnerven er udsat. Placer en retractor inde i såret for at holde den dissekerede muskulatur og hud ud af situs.
- Transect de udsatte motoriske og sensoriske grene distale til bifurcation og punktafgifter en 6 mm lang nerve segment af hver gren, henholdsvis ved hjælp af lige mikrokirurgiske saks.
- Roter begge nervesegmenter 180°, placer dem mellem den proksimale og distale stub af de transsiterede lårbensnervegrene og udfør epineurial neurorrhaphy på hvert sted med to afbrudte 11-0 suturer og en mikrokirurgisk nåleholder.
BEMÆRK: Udfør et homotopisk autologt nervetransplantat ved at pode motortransplantatet til den oprindelige motorgren og det sensoriske transplantat til den oprindelige sensoriske gren. Alternativt kan du udføre en heterotopisk autolog nervetransplantation ved at pode motortransplantatet til den oprindelige sensoriske gren og omvendt.
- Induktion af thorax rygmarvskontusion skade
- Udfør et hudsnit på tværs af brysthvirvelsøjlen med en #10 skalpelblad forbundet til en #3 skalpel håndtag efterfulgt af to muskel indsnit parallelt med spinøse processer for at lette muskel tilbagetrækning. Placer en retractor inde i såret for at holde den dissekerede muskulatur og hud ud af situs.
- Identificer den 11. brysthvirvel (Th) og eksponere ryghvirvlens lamina ved at fjerne overliggende væv samt den spinøse proces ved hjælp af en rongeur.
- Udfør en laminectomy ved hjælp af en mikro boremaskine og en passende grat til at bore et lille hul i lamina, lidt større end spidsen af slagberen. For at forhindre skader på rygmarven, kun tynde ud lamina mens åbning og udvide hullet ved hjælp af en rongeur. Hvis periosteum stadig er intakt, skal du forsigtigt fjerne det ved hjælp af en skarp spids sonde uden at beskadige dura mater.
- Efter at have sørget for et stort nok hul er lavet uden at destabilisere lamina, holde dyrets rygsøjle på plads ved at fastspænde det rostrally og caudally til Th11 med slaghuggerens stabiliserende kraftbeslag. Ved hjælp af håndhjulene foran og siden skal stålstangen placeres 3-5 mm over laminectomy-hullet. Endelig udsættes alle dyr for en påvirkning med en defineret kraft på 150 kilodyne for at fremkalde en mild til moderat grad af rygmarvskontusionskade4.
- Udfør sårlukning i anatomiske lag ved hjælp af polyglactin 4-0 eller 5-0 afbrudt suturer og en kirurgisk nålholder. Rengør såret grundigt ved forsigtigt at tørre det med en gazepude dyppet i steril 0,9% NaCl.
- Efter operationen, returnere dyrene til deres hjem bur og beskytte dem mod lys og lyd eksponering. Overvåg dyrenes adfærd nøje indtil postoperativ dag (DPO) 7 og sikre tilstrækkelig mad og vandindtag. Hvis det er nødvendigt, skal der tilvejebringes yderligere væske ved subkutane injektioner (f.eks. 10 ml NaCl 0,9 %).
- Der tilby.c des postoperativ analgesi i mindst 2 dage ved hjælp af.c f.eks. Hvis det er nødvendigt, og i tilfælde af SCI-modellen, også give postoperativ antibiotikabehandling (7,5 mg/kg kropsvægt Enrofloxacin per os (p.o.)).
- I tilfælde af rygmarvsskade skal rottens blære tømmes manuelt, indtil den spontane vandladning vender tilbage.
4. Inddrivelse fra kirurgiske indgreb før ganganalyse
BEMÆRK: Rotter med iskiasnerven skade viser tendensen til at gnave på deres bagpoter på grund af udbrud af smertefuld neuropati efter nerveskade. Denne form for automutilation kan resultere i autoamputation af tæer eller dele af den respektive bagpote. Foretrækker Lewis rotter frem for andre rotte stammer i tilfælde, når du bruger iskiasnerven skade model, da denne rotte stamme viser en mindre tendens til automutilation31. Rotter med iskiasnerven skade viser også tendensen til at udvikle kontrakturer af den opererede lemmer, hvilket kan resultere i deres udelukkelse fra undersøgelsen på grund af interferens med dataindsamling. Sådanne bivirkninger forekommer langt mindre udbredt hos rotter med femorale skader.
- Efterse opererede dyr dagligt efter operationen med særlig vægt på status for deres lemmer og poter, henholdsvis.
BEMÆRK: Hos rotter med SCI kan penis eller rektal prolaps ved højden af Th11 forekomme på grund af svækkelsen af dyrenes naturlige evne til at tisse og afføringe. Disse hændelser defineres almindeligvis som undersøgelsens menneskelige endepunkter og indebærer øjeblikkelig udelukkelse af det berørte dyr fra undersøgelsen. - Fortsæt postoperativ analgesi, indtil rotterne ophører med at vise smerterelaterede symptomer.
- I tilfælde af vedvarende smerter, administrere gabapentin (30-120 mg/kg kropsvægt) o. til behandling af neuropatiske smerter.
5. Forberedelse forud for udførelse af automatiseret ganganalyse
BEMÆRK: Ganganalysesystemets metode er baseret på registrering af dyrene nedefra, mens de krydser en glasplade, som er oplyst af et grønt LED-lys. Når dyrenes poter kommer i kontakt med gulvet, lyser poteaftrykkets område og optages af et højhastighedsvideokamera. Disse data sendes derefter via et Ethernet-kabel til en computer, der kører gangartanalysesoftwaren. Mens individuelle fodspor kan klassificeres manuelt af eksperimentatoren, den nyeste softwareversion indeholder også automatisk fodaftryk klassificering.
- Udfør alle testprocedurer i mørke og i mangel af forstyrrende lyde. Da rotter er i stand til at opfatte supersoniske frekvenser, også kontrollere, at ingen kilder udsender sådanne lyde.
BEMÆRK: Udfør ganganalyse enten ugentligt eller hver anden uge, men ikke teste rotter for ofte, da især Lewis rotter har tendens til at miste interessen for at deltage i proceduren over tid, når de er udsat for en bestemt øvelse for ofte. Det er dog forpligtet til at træne rotter dagligt i 5 dage før operationen for at akklimatisere dem til testmiljøet og proceduren. - Under træningspas og på testdagen skal du forberede testrummet ved at slukke for alle lyskilder, som ellers kunne forstyrre den automatiserede ganganalyseenheds kamera. Placer den computerskærm, der er nødvendig for dataindsamling, væk fra kameraet for at forhindre, at lyset forstyrrer kameraet.
- Sørg for, at enheden er installeret i en stabil position og på en måde, der forhindrer enhver form for vibrationer, da dette i alvorlig grad vil forstyrre dataindsamlingsproceduren.
- Bring rotterne til adfærdsmæssige testrum og akklimatisere dem i deres eget hjem bur i mindst 30 min før testen.
BEMÆRK: Når du håndterer dyrene, skal du bære personlige værnemidler såsom en kirurgisk kjole eller laboratoriekittel, handsker og en maske.
6. Udførelse af automatiseret ganganalyse
- Træningssessioner
BEMÆRK: Under træningen gennemgår dyrene en indlæringskurve, så det anbefales at justere træningsplanen gradvist. Brug mad belønninger (f.eks 1-2 stykker morgenmadsprodukter) for at belønne dyrene efter en vellykket afslutning af hver træningssession.- På den første træningsdag løftes dyret forsigtigt ved at holde det under bagagerummet og forsigtigt bære det til gangbroindgangen.
- Angr. dyret i indgangsområdet og lad det udforske åbningen af korridoren uden indblanding fra den person, der udfører testproceduren.
BEMÆRK: Må ikke skrige, fløjte, blæse på eller stikke dyret i et forsøg på at motivere det til at krydse gangbro. Alle sådanne adfærd vil alvorligt understrege dyret og yderligere komplicere dataindsamlingen procedure. - Vent, indtil dyret frivilligt krydser gangbroen for at nå sit hjem bur. Nogle gange, især i utrænede dyr, kan dette tage op til flere minutter. På den første træningsdag forventes eller kræves dyret hverken for at lave uafbrudte løb med ensartet ganghastighed. I stedet bør det akklimatisere sig med testapparat og procedure.
- På den anden træningsdag kan du vænne dyrene til at komme ind på gangbroen uden tøven og også vende tilbage til deres hjembur uden tøven. Nogle dyr vil sandsynligvis allerede har lært at krydse gangbroen uden afbrydelser, men det er stadig ikke påkrævet i slutningen af den anden dag.
- På den tredje træningsdag skal du sikre, at dyrene lærer at krydse gangbroen uden tøven, sniffing eller på anden måde udforskende bevægelser. Sørg for, at de går med ensartet hastighed.
- På den fjerde og femte træningsdag gentages den foregående øvelse for at konsolidere testproceduren.
BEMÆRK: Hvis et dyr ikke opnår den nødvendige færdighed til at krydse gangbroen korrekt ved udgangen af 5-dages træningsperioden, skal der tilføjes yderligere 2 dages træning (f.eks. weekenden). Også overveje at udføre op til 3 træningssessioner om dagen, adskilt af mindst 2 timers hvile mellem individuelle session. I 95 % af tilfældene vil dyret have fået den nødvendige uddannelseserfaring ved udgangen af denne forlængede uddannelsesperiode. I de sjældne tilfælde et dyr har stadig ikke erhvervet denne færdighed efter 7 dages træning, anbefales det at udskyde den planlagte eksperimentelle kirurgi session i mindst 1 uge og at gentage ovennævnte uddannelse regime.
7. Erhvervelse af data
BEMÆRK: Gangart analysesystemet visualiserer hver pote print, mens dyret går og automatisk analyserer forskellige gangart parametre såsom Paw Print Area, Paw Print Intensitet, Paw Swing Time, og Paw Swing Speed (Tabel 1). Da ganganalysesystemet registrerer alle data baseret på intensiteten genereret af dyrenes poteudskrifter, skal du sørge for, at kameraindstillingerne justeres i henhold til rotternes vægt og størrelse. Derudover skal du sørge for, at gangbroen er tør og ren før dataregistrering for at forhindre enhver indflydelse på dataindsamlingen.
- Før erhvervelse af data, rense gangbro ved hjælp af kommercielle glas renere og en squeegee. Spray glaspladen flere gange og tør den derefter af med squeegee for at fjerne eventuelle partikler fra dens overflade. Også, rense nedenunder. Sørg for at fjerne væske fra enderne af gangbroen, da dyrene ellers kunne træde på den, hvilket ville påvirke de registrerede data.
- Rengør rengøringsproceduren, når det er nødvendigt, f.eks. Dette menes at forhindre dyret i at blive distraheret af deres conspecifics 'duft.
- Forud for den allerførste dataindsamling justeres kameraindstillingerne, der passer til dyrenes vægt. Bekræft dette ved at sætte det letteste og tungeste dyr på gangbroen og vælge en kameraindstilling, der muliggør god datakvalitet i begge tilfælde. Juster kameraforøgende, rødt loftslys, grønt gangvejslys og grøn intensitetstærskel (GIT) for at sikre optimal registrering af poteprint.
BEMÆRK: Du må ikke ændre de valgte indstillinger, når dataindsamlingen er begyndt, da dette vil hindre sammenligneligheden af de erhvervede data. Som en undtagelse kan GIT ændres under dataklassificering, men dette skal gøres for alle forsøg ensartet. - Definer og kalibrer gangbroen ved hjælp af det medfølgende kalibreringsark.
- Vælg et registreret kamera, der er angivet under fanen Opsætning.
- Klik på knappen Åbn anskaffelse, som kan findes under fanen Hent.
- Tag et øjebliksbillede af den tomme, rensede gangbro, som vil blive brugt som reference i hele følgende dataindsamlingsprocedure.
- Bemærk, at status ændres fra Venter på snapshot til Klar til anskaffelse.
- Klik på knappen Start anskaffelse, og læg mærke til statusændringen fra Klar til anskaffelse til Venter på kør til start.
- Placer en rotte på gangbroen og følg dyrets bevægelse på computerskærmen. Bemærk statusændringen fra Venter på kørsel til Start til Optagelse Kør.
BEMÆRK: Softwaren klassificerer automatisk kørsler, som den anser for at være i overensstemmelse med forudindstillede kørselsegenskaber med et grønt symbol, mens ikke-overensstemmende kørsler vil blive markeret med et rødt symbol. Softwaren stopper automatisk dataindsamling, når tre kompatible kørsler blev registreret, men dataindsamling kan fortsættes ved at klikke på knappen Start anskaffelse igen.
8. Dataklassificering
BEMÆRK: Se tabel 1 for en liste over AGA-resultatparametre. Der er behov for mindst tre overensstemmende kørsler, hvor dyret skal krydse gangbroen støt uden tøven27. Desuden skal kørehastigheder svare til inden for de samme kategorier som defineret ilitteraturen 30.
- Klik på knappen Klassificere i fanen Eksperimentel Explorer for de respektive forsøg, der skal klassificeres.
- Spil den erhvervede køre med normal hastighed for at få et indtryk, om dataene er i overensstemmelse med de krav, der er anført før.
- I venstre øverste hjørne skal du klikke på autoklassificeringsknappen for automatisk klassificering af poteudskrifter af softwaren.
BEMÆRK: Selv om softwaren har en høj sats af korrekte pote klassificering, det nogle gange undlader at tildele en pote til udskrifter eller tildeler den forkerte pote. Derfor skal du altid dobbelttjekke de auto-klassificerede pote udskrifter bagefter. - For korrekt beregning af Normal Step Sequence Patterns (NSSP), skal du sørge for, at klassificeringen algoritme ikke er forvirret af ikke-synlige pote udskrifter, hvilket fører til fejlbehæftede NSSP (Figur 1A). Derfor omfatter kun pote udskrifter, der kan påvises, mens den kontralaterale pote er også synlig for NSSP beregninger, fx den venstre forreste pote (LF) og højre bagpote (RH) (Figur 1B).
Figur 1: Eksemplariske AGA-data, der viser behovet for manuel dobbeltkontrol af korrekt dataklassificering. I tilfælde af en opdaget placering af en front pote er efterfulgt af den fundne placering af en anden front pote (A) AGA software kan forveksle dette med en ukoordineret gå mønster, da ingen bagpoter er blevet opdaget. Derfor anbefales det altid at dobbelttjekke og vælge en indledende pote print, som detekteres, når den kontralaterale pote er også synlig (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
9. Beregning af statistikker
BEMÆRK: For at justere køredata for vægtøgningsrelaterede ændringer over tid anbefales det kraftigt at beregne et forhold mellem den eksperimentelle pote med en ikke-eksperimentel (f.eks. kontrol) pote. Derudover beregne forholdet til præoperative værdier af denne pote-til-pote sammenligning til overvejelse af individuelle forskelle i pote brug.
- Klik på knappen Vis kørselsstatistik for at få et omfattende overblik over kørselsstatistikken.
- Vælg Filer og eksportér for enten at eksportere kørselsstatistik eller prøvestatistik til et regnearkssoftware.
Representative Results
12 rotter gennemgik eksperimentel perifer nervekirurgi. Iskiasnerven resektion (Figur 2A) blev udført i 7 rotter, mens femorale nerve neurotmesis (Figur 2B) blev induceret i 5 rotter. Hos alle dyr blev nervedefekten rekonstrueret ved hjælp af et autologt nervetransplantat. Rygmarvskontusionskade (Figur 2C) på niveau11.
Figur 2: Operative steder efter nerverekonstruktion. Nerverekonstruktion med autografter i iskiasnerven (A) og lårbensnerven(B) samt efter rygmarvskontusionskade (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Alle dyr kom sig godt efter operationen, og der opstod ingen tilfælde af selvlemlæstelse. Et dyr i iskiasnerven skade gruppe udviklet stærke kontrakturer af højre bagpote i løbet af den postoperative observation periode og måtte udelukkes fra yderligere dataanalyse.
Iskiasnerurneurtmes
Da iskiasnerven giver muskuløs og sensorisk innervation til størstedelen af hindlimb, dens resektion resulterer i en alvorlig svækkelse af bevægeapparatet funktion. Efter skade, rotter bruge hælen af poten kun for vægtstøtte (Figur 3B-E) og lemmerne er flyttet i en fejende circumductory bevægelse. Derfor bliver bevægelsesændringer, der vurderes via AGA, tydelige ved hjælp af et betydeligt reduceret udskriftsområde (Figur 4A) og væsentligt øget svingtid (Figur 4B). Begge parametre blev stadig ændret betydeligt i forhold til pre-OP-målingerne ved observationsperiodens afslutning. Bemærkelsesværdigt, et dyr udviklet stærke kontrakturer af højre bagpote starter ved postoperativ uge (WPO) 10. Dette resulterede i en stigning i udskriftsområdet af højre bagpote til mere end 150% i forhold til den venstre pote på WPO12 (Figur 5). Da dette var et efterfølgende ende i forhold til alle andre dyr, der blev vurderet i denne undersøgelse, udelukkede vi dette dyr fra dataanalyse med hensyn til printområde.
Figur 3: Repræsentativ pote udskrifter før og efter kritisk størrelse resektion af højre iskiasnerven og autograft reparation. Bemærk det kraftige fald i udskriftsområdet efter nerveskade (B) sammenlignet med præoperativt (A). På trods af en lille stigning i Print Area i løbet af observationsperioden (C-E) pote udskrifter af højre bagben forblev især ændret fra baseline optagelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Forløbet af funktionel opsving efter kritisk størrelse resektion og autograft reparation af iskiasnerven. Print Area Ratio (A) og Swing Time Ratio (B) blev statistisk ændret betydeligt fra Pre-OP værdier umiddelbart efter iskiasnerven resektion. Mens Print Area forblev betydeligt reduceret i forhold til baseline indtil WPO10, swing tid var stadig betydeligt øget til Pre-OP værdier på WPO12. *: p < 0,05 sammenlignet med Pre-OP, **: p < 0,01 sammenlignet med Pre-OP. Fejllinjer angiver ± standardfejl i middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Boxplot af løbet af Print Area efter iskiasnerven skade. Bemærk ekstremiteten (rød ellipse) på WPO12, hvilket forklares ved, at et dyr udviklede stærke kontrakturer af højre bagpote startende fra WPO10. Dyret blev derfor udelukket fra den statistiske analyse i figur 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Femoral nerve neurotmesis
Femoral nerve resektion resulterer i denervation af quadriceps musklen i låret33,34. Som følge heraf er knæforlængelse nedsat, hvilket resulterer i hyperflexion af ankelleddet med på hinanden følgende løft af potens hæl. Derfor er den respektive pote's Print Area (Figur 6B), stærkt reduceret efter operationen. Print Area af venstre bagpote øges på grund af en kompenserende forskydning af vægt til venstre. Dette bør holdes for øje, da dette fænomen direkte påvirker det beregnede forhold mellem den "eksperimentelle" og "kontrol" pote. Startende fra WPO4 reinnervation af quadriceps ved regenererende femorale nerve fører til vending af disse ændringer resulterer i øget Paw Print Area af højre bagpote (Figur 7A). Da quadriceps musklen i låret også spiller en rolle i svingfasen af den respektive pote, swing tid (figur 7B) er stærkt forlænget i rotter med femoral nerveskade. Spejling af tilbagelevering af Print Area, Swing Time falder som den regenererende femorale nerve når quadriceps musklen i låret. Ved WPO10 vendte begge parametre for gangart tilbage til baseline, hvilket signalerer fuld funktionel genopretning.
Figur 6: Repræsentativ poteudskrifter. Repræsentativ pote prints før (A) og følgende(B-E)højre lårbensnerven resektion og autograft reparation. Print Area of RH faldt kraftigt ved WPO2 (B), mens en stigning i udskriftsområdet af venstre bagpote (LH) på grund af øget vægtbelastning blev synlig. RH Print Area begyndte at stige fra WPO6 (C) ledsaget af et fald i print area af LH. På WPO8 (D) og WPO10 (E) Print Area af RH inddrives tilbage tæt på præoperative niveauer. (Tilpasset med tilladelse fra Heinzel et al.22, licenseret under CC BY 4.0.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Forløbet af funktionelt opsving efter 7-mm resektion og autograft reparation af lårbensnerven. Forløbet af Print Area Ratio (A) og Swing Time Ratio (B) afslørede en stærk ændring umiddelbart efter femorale nerveresektion, men værdier inddrives tilbage til præoperative værdier på WPO8. #: p < 0,05. Fejllinjer angiver ± SEM. (Tilpasset med tilladelse fra Heinzel et al.22, licenseret under CC BY 4.0.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Rygmarvskontusion
Gait analyse afslørede markant ændret pote prints efter thorax spinal cord contusion skade (Figur 8), mest bemærkelsesværdige en reduktion i Print Area og en markant intern rotation af bagpoter på WPO2 (Figur 8B). Bemærkelsesværdigt, pote rotation er også gennemført som en assessable træk i BBB, understreger anvendeligheden af edb gangart analyse for at evaluere ændringer af gangart, som oprindeligt blev evalueret med Open Field test. Med hensyn til forløbet af de enkelte gangart parametre, rygmarvskontusion på Th11 niveau resulterede i et fald i print area ratio (Figur 9A) og stigning i Swing Time Ratio (Figur 9B). Begge parametre ne var baseret i retning af baselineniveauer i observationsperiodens videre løb, men der var ingen statistisk signifikante ændringer, der kunne observeres. Den koordineringsrelaterede parameter Regularity Index (Figur 9C) faldt også ved WPO2, men graden varierede meget mellem dyr. Det har også tendens mod præoperative værdier indtil WPO16. Base of Support af bagpoterne (Figur 9D), en generel parameter for gangart ifølge Deumens, viste en markant stigning, som var statistisk signifikant fra WPO10 indtil WPO14. Det trendede mod baseline niveauer på WPO16 og blev ikke længere væsentligt ændret fra Pre-OP værdi på dette tidspunkt.
Figur 8: Repræsentativ pote aftryk af de to bagpoter. Paw udskriver preoperatively (A) og efter thorax rygmarvskontusion skade (B-F). Bemærk reduktionen i print område startende fra WPO2 (B) ledsaget af en bemærkelsesværdig intern rotation af poterne. I løbet af observationsperioden (C-F) kan der observeres en forøgelse af udskriftsområdet samt afstanden til den interne rotation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Rygmarvskontusion på 11. Rygmarvskontusion ved th 11 resulterede i observerbare ændringer af Print Area Ratio (A) og Swing Time (B) og Regularity Index (C), men disse ændringer var ikke statistisk signifikant. Efter skade, Base of Support af bagpoterne viste en markant stigning i forhold til baseline, hvad der var statistisk signifikant på WPO10 indtil WPO14. *: p < 0,05 i forhold til Pre-OP. Fejllinjer angiver ± SEM. Klik her for at få vist en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Oplysninger om fejlfinding. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Vurderingen af funktionel nyttiggørelse i dyremodeller af PNI og SCI er fortsat udfordrende på grund af de mange forskellige evalueringsmetoder, hver med individuelle fordele og ulemper. Kun få tilgange er blevet testet og valideret i flere modeller af perifere og centrale nervøse skader, selv om lovende nye teknikker, der kombinerer motion tracking og machine learning potentielt kunne drive neurobehavioral forskning til det næste niveau af funktionelle test. Vi er overbevist om, at avancerede metoder, der i vid udstrækning kan anvendes på en lang række dyre- og skadesmodeller, snart vil dukke op. I lyset af disse overvejelser, en af fordelene ved AGA er muligheden for at evaluere funktionelle opsving i flere modeller af nerveskade ved hjælp af kun én enhed. Siden begyndelsen af 2000'erne denne fremgangsmåde har været anvendt i eksperimentelle modeller af PNI såsom iskias37, peroneal38, og femoralnerverskade model22 samt efter rod avulsion af både lændebenet39 og brachial plexus40. Forskellige centralnerveskader, herunder rygmarvskontusionsskader, er også blevet undersøgt med metoden41,42. Med dette papir, præsenterede vi en detaljeret protokol om, hvordan man fremkalder tre almindeligt studerede nerveskader samt hvordan man kan evaluere funktionelle opsving bagefter. Efter vores mening, en hands-on-retningslinje for forskere interesseret i området for eksperimentelle nerveskade, reparation, og regenerering om, hvordan man kan gøre optimal brug af metodens fordelagtige funktioner ville være til stor hjælp.
Flere forfattere har behandlet potentialet i AGA til at evaluere funktionelle opsving i gnavere, fremhæver metodens fordel til samtidig at vurdere gangart parametre relateret til motoriske og sensoriske reinnervation27,28. Derudover giver sammenligning af data fra en eksperimentel pote, fx rekonstrueret nerveskade til en ikke-operativ pote, som det blev vist i begge de præsenterede modeller, mulighed for at inkludere en intradyret positiv kontrol. Omvendt, en opereret pote uden kirurgisk rekonstruktion eller yderligere behandling kan tjene som en intra-dyr negativ kontrol. Det blev også påvist, at det er muligt at kombinere AGA med machine learning tilgange43. På trods af metodens fordele har den også flere begrænsninger og ulemper, såsom den tidskrævende uddannelsesindsats, som er obligatorisk for at vænne dyret til anskaffelsesproceduren28,44. En anden begrænsning af AGA er den maksimale størrelse af de dyr, der kan testes på grund af apparatets begrænsede dimensioner. Anvendelsen af AGA er derfor i øjeblikket begrænset til dyr på størrelse med gnavere og fritter45. Derudover kan nyligt fremspirende neurobehavioral vurdering tilgange inden for motion tracking i stand til machine-learning overgår AGA i både comprehensiveness samt mulige applikationer18,19,46. Mest bemærkelsesværdige, men i overensstemmelse med andre evalueringsmetoder, ser det ud til, at funktionelle opsving som vurderet af AGA er stærkt begrænset, hvis selv forekommende-i modeller af iskiasnerven neurotmesis47,48. På den anden side, AGA giver mulighed for omfattende evaluering af løbet af funktionelle opsving efter femorale nerve neurotmesis som vist ved vores data. Med dette arbejde, viste vi, at Paw Print Area er en repræsentativ gangart parameter vurderes via AGA, som er eksemplarisk for løbet af funktionelle opsving i de to førnævnte perifere nerveskade modeller præsenteret af os. Mens funktionelle opsving ad integrum var observerbare efter autograft reparation af lårbensnerven, AGA parametre blev stadig væsentligt ændret fra baseline i slutningen af observationsperioden efter autograft reparation af iskiasnerven. Det er bemærkelsesværdigt i denne sammenhæng, at lemmer kontrakturer er et almindeligt fænomen hos rotter med iskiasnerven skade og forsigtighed er nødvendig for ikke at forveksle disse tegn på muskuløs ubalance og lammelse med proceduren funktionelle opsving32. Dette på den ene side understreger AGA-metodens manglende evne til at opdage signifikant funktionel genopretning efter neurotmesis skade i denne model. På den anden side, Det rejser spørgsmålet om, hvorvidt det er muligt at vurdere iskiasnerven skade model af rotten, som stadig er den mest almindeligt anvendte eksperimentelle nerve reparation model, ved hjælp af gangart analyse i almindelighed i tilfælde af nerveskade er mere alvorlig end axonotmesis48. Oplysninger om fejlfinding findes i supplerende fil 1.
Vi har også givet eksemplariske data om brugen af metoden til at evaluere bevægelsesfunktion hos rotter med rygmarvsskade, hvilket er muligt uden de nødvendige ændringer af hardwareopsætningen eller anskaffelsesproceduren. Det samme princip gælder for andre gnavere modeller af centralnerveskade (CNI)26,49,50 og root avulsion skade. I modsætning til isolerede PNIs, skader på rygmarven er langt mere komplekse i deres patofysiologiske konsekvenser, som en lang række meget vigtige strukturer er beskadiget, involverer efferent veje såsom kortikospinal og rubrospinal skrifter og afferent veje såsom dorsale kolonner og spinotalamic skrifter35. Udfordringen med at foretage en tilstrækkelig vurdering af disse patologiske ændringer afspejles i den omfattende armamentarium af adfærdsmæssige tests, såsom Basso, Beattie og Bresnahan (BBB) score36. Gangparameteren Base of Support er blevet rapporteret til at stige efter centralnervede skader, sandsynligvis for at tage højde for en resulterende instable gangart. Base of Support blev væsentligt ændret fra baseline fra WPO10 til WPO14 i vores model, støtte vores formodning om, at denne parameter giver mulighed for vurdering af løbet af funktionelle opsving af AGA efter thorax spinal cord contusion skade.
Vi er overbeviste om, at AGA er et muligt redskab til at evaluere funktionel genopretning hos gnavere med skader på nervesystemet. Ikke desto mindre anbefaler vi at afspejle de observerede ændringer af gangart omhyggeligt og grundigt i hver respektive eksperimentelle setup. Ændringer i gangeparametre, fx en stigning i udskriftsområdet efter en øjeblikkelig postoperativ nedgang eller et fald i Svingtid, der fortsætter en umiddelbar postoperativ forhøjelse af denne parameter, i løbet af observationsperioden, vedrører ikke nødvendigvis funktionel genopretning. I stedet disse ændringer kan også være relateret til en mulig funktionel tilpasning til at opretholde en diskret gangart, da rotter er et bytte arter og forsøge at undgå at vise smerte eller handicap til potentielle rovdyr51. Det anbefales derfor at bruge automatiseret ganganalyse som et supplerende redskab til at relatere ændringer af gangart til andre resultat mål for perifere nerveskader og regenerering21. Som tidligere nævnt mener vi også, at det bør nøje afspejles, hvis gnavere med iskiasnerven neurotmesis bør undersøges ved hjælp af AGA som vores konstatering tyder stærkt på, at funktionel genopretning er stærkt begrænset i dette tilfælde.
Som det fremgår af vores arbejde, AGA vigtigste aktiv er muligheden for at studere både motoriske og sensoriske reinnervation i en lang række eksperimentelle PNI modeller samt CNI samtidig kun kræver én opsætning. Derfor er metoden efter vores mening et meget værdifuldt værktøj til omfattende neurobehavioral test. En af AGA's aktiver, som er muligheden for at studere motoriske og sensoriske reinnervation i forskellige dyremodeller af PNI og CNI, mens der kun kræver én opsætning, er efter vores mening metodens største fordel i forhold til andre evalueringsmetoder til at studere funktionel opsving, såsom walking track analyse52, Von Frey test53, eller gangart kinematik16. Potentialet til samtidig at evaluere ændringer af gangart, som enten korrelerer med resultaterne af elektrofysiologiske undersøgelser af reinnerverede muskel22 eller evalueringsmetoder for sensorisk funktion54 er lovende med hensyn til fremtidige anvendelser af metoden. Vi anbefaler derfor at bruge AGA til at undersøge funktionel opsving i gnavere modeller af forelimb PNI, såsom ulnar, radial, eller median nerve, eller eksperimentelle nerveoverførsel modeller55, som forbliver uudstået med denne metode endnu.
Vi giver hermed en detaljeret protokol om, hvordan man bruger automatiseret gangart analyse til at studere funktionel helbredelse i tre gnaver modeller af nerveskade. Mens metoden kræver nøje overvejelse af forskellige centrale aspekter såsom passende uddannelse og omhyggelig hard- og software kalibrering, er det et muligt og værdifuldt supplerende værktøj til at evaluere nerve regenerering i gnavere modeller af centrale og perifere nerveskade.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at dette arbejde blev støttet af Noldus Inc. af dækningen af open access publikation gebyr. Ingen af forfatterne modtog nogen personlig løn eller nogen form for finansiel drikkepenge. Forfatterne har ingen andre konkurrerende interesser at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Karin Brenner for hendes lidenskabelige pasning af dyrene. Forfatterne vil også gerne takke Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner og Susanne Drechsler for deres hjælp under de eksperimentelle operationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | B. Braun Austria | 3570410 | Vehicle for drug delivery |
| 1 ml syringe | B. Braun Austria | 9161708V | Injecting device |
| 10 ml syringe | B. Braun Austria | 4606728 V | Injecting device |
| 1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin | Gebro Pharma | N/A | Alcoholic skin disinfection |
| 23-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657667 | Canula for s.c. injection |
| 26-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657683 | Canula for s.c. injection |
| 5 ml syringe | B. Braun Austria | 4606710 V | Injecting device |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma | B9275 | Analgetic agent |
| Burrs for Micro Drill | F.S.T | 19007-29 | Drilling of a hole inside the lamina |
| Caprofen | Zoetis Austria | N/A | Analgetic agent |
| Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of animal gait |
| Cauterizer Kit | F.S.T | 18010-00 | Cauterization of vessels during surgery |
| Enrofloxacin | Bayer Austria | N/A | Antibiotic |
| Ethilon (10-0) | ETHICON | 2810G | Suture material for neurrorhaphy |
| Ethilon (11-0) | ETHICON | EH7465G | Suture material for neurrorhaphy |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | 4302436 | Eye protection during anesthesia |
| Friedman-Pearson Rongeurs | F.S.T | 16221-14 | Surgical instrument |
| Gabapentin | Wedgewood Pharmacy | N/A | Analgetic agent |
| Goldstein retractor | F.S.T | 17003-03 | Retraction of tissues during surgery |
| Hair trimmer | Aescular | N/A | Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery |
| Heating Pad for rodents | ALA Scientific Instruments | N/A | Regulation of body temperature |
| Impactor | Precision Systems and Instrumentation | N/A | Induction of spinal cord contusion |
Lewis rat ( ) |
Janvier | N/A | Experimental animal |
| Magnetic Fixator Retraction System | F.S.T | 18200-50 | Retraction of tissues during surgery |
| Metzenbaum Baby Scissors | F.S.T | 14019-13 | Surgical instrument |
| Micro Drill | Word Precision Instruments | 503599 | Instrument for bone drilling |
| Micro Needle holder | F.S.T | 12076-12 | Surgical instrument |
| Micro-scissors (curved) | F.S.T | 15023-10 | Surgical instrument |
| Micro-scissors (straight) | F.S.T | 15007-08 | Surgical instrument |
| Mirror Finish Forceps | F.S.T | 11251-23 | Surgical instrument |
| Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
| Operating microscope | Leica | M651 MSD | Magnification of the operative site |
| Povidone Iod | B. Braun Melsungen | N/A | Non-alcoholic skin disinfectant |
| Pulse Oximeter | STARR Life Sciences | N/A | Surveillance of heart rate and oxygen saturation |
| Rodent thermometer | BIOSEB | BIO-TK8851 | Surveillance of body temperature |
| Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
| Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%) | Baxter | HDG9117A | Anesthetic |
| Spatula & Probe | F.S.T | 10090-13 | Surgical instrument |
| Sprague Dawley rat () |
Janvier | N/A | Experimental animal |
| Sterila gauze 5x5cm | EVAC MEDICAL | E010.03.00215 | Sterile gauze compress |
| Tissue Forceps | F.S.T | 11021-12 | Surgical instrument |
| Vicryl (4-0) | ETHICON | V3040H | Suture material for subcutaneous sutures |
| Vicryl (5-0) | ETHICON | V303H | Suture material for subcutaneous sutures |
| Vicryl cutting needle (4-0) | ETHICON | V392ZH | Suture material for skin sutures |
| Vicryl cutting needle (5-0) | ETHICON | V391H | Suture material for skin sutures |
References
- Mohanty, C. B., Bhat, D. I., Devi, B. I. Use of animal models in peripheral nerve surgery and research. Neurology India. 9, Supplement 100-105 (2019).
- Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regeneration Research. 15 (3), 491-502 (2020).
- Verma, R., Virdi, J. K., Singh, N., Jaggi, A. S. Animals models of spinal cord contusion injury. The Korean Journal of Pain. 32 (1), 12-21 (2019).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. The European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
- Sperry, R. W. The functional results of muscle transposition in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 73 (3), 379-404 (1940).
- Sperry, R. W. The effect of crossing nerves to antagonistic muscles in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 75 (1), 1-19 (1941).
- Sperry, R. W. Transplantation of motor nerves and muscles in the forelimb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 76 (2), 283-321 (1942).
- Zimmerman, E. A., Chambers, W. W., Liu, C. N. An experimental study of the anatomical organization of the Cortico-Bulbar System in the Albino Rat. The Journal of Comparative Neurology. 123, 301-323 (1964).
- Cohen, A. H., Gans, C. Muscle activity in rat locomotion: movement analysis and electromyography of the flexors and extensors of the elbow. Journal of Morphology. 146 (2), 177-196 (1975).
- Barnett, S. A. The Rat: A Study in Behaviour. , Aldine Publishing Company. (1963).
- Hare, G. M., et al. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Annals of Plastic Surgery. 30 (2), 147-153 (1993).
- Hare, G. M., et al. Walking track analysis: a long-term assessment of peripheral nerve recovery. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (2), 251-258 (1992).
- Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioral evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journa of Neuroscience Methods. 46 (3), 203-208 (1993).
- Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research. 26 (2), 186-194 (2004).
- Varejao, A. S., et al. Functional assessment of peripheral nerve recovery in the rat: gait kinematics. Microsurgery. 21 (8), 383-388 (2001).
- Varejao, A. S., et al. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve. 27 (6), 706-714 (2003).
- Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
- Deumens, R., Jaken, R. J., Marcus, M. A., Joosten, E. A. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
- Heinzel, J., et al. Use of the CatWalk gait analysis system to assess functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury - a systematic review. Journal of Neuroscience Methods. 345, 108889 (2020).
- Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. , 01580 (2020).
- Chen, S. H., et al. Changes in GABA and GABA(B) receptor expressions are involved in neuropathy in the rat cuneate nucleus following median nerve transection. Synapse. 66 (6), 561-572 (2012).
- Chen, S. H., et al. Decreases of glycine receptor expression induced by median nerve injury in the rat cuneate nucleus contribute to NPY release and c-Fos expression. Life Sciences. 90 (7-8), 278-288 (2012).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Sandner, B., et al. Systemic epothilone D improves hindlimb function after spinal cord contusion injury in rats. Experimental Neurology. 306, 250-259 (2018).
- Kappos, E. A., et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment of functional nerve recovery in small animal models. Brain and Behavior. 7 (7), 00723 (2017).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
- Webster, G. V. Halstedian principles in the practice of plastic and reconstructive surgery. Stanford Medical Bulletin. 13 (3), 315-316 (1955).
- Bozkurt, A., et al. A flexible, sterile, and cost-effective retractor system for microsurgery. Microsurgery. 31 (8), 668-670 (2011).
- Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
- Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
- Jackson, C. M. Anatomy of the rat. Transactions of the American Philosophical Society, Philadelphia, New Series, Volume XXVII, 1935. The Anatomical Record. 65 (1), By Eunice Chace Greene. With Foreword by Henry H Donaldson 127-129 (1936).
- Pena, M. C., Baron, J. Femoral nerve and rectus femoris muscle of the rat: a study in anatomy, histology, and histoenzymes. Annals of Plastic Surgery. 20 (6), 527-532 (1988).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models and Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
- Godinho, M. J., et al. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One. 8 (8), 69987 (2013).
- Pajenda, G., et al. Spatiotemporally limited BDNF and GDNF overexpression rescues motoneurons destined to die and induces elongative axon growth. Experimental Neurology. 261, 367-376 (2014).
- Matsuura, Y., et al. The effect of anti-NGF receptor (p75 Neurotrophin Receptor) antibodies on nociceptive behavior and activation of spinal microglia in the rat brachial plexus avulsion model. Spine (Phila Pa 1976). 38 (6), 332-338 (2013).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Koopmans, G. C., et al. The assessment of locomotor function in spinal cord injured rats: the importance of objective analysis of coordination. Journal of Neurotrauma. 22 (2), 214-225 (2005).
- Frohlich, H., Claes, K., De Wolf, C., Van Damme, X., Michel, A. A machine learning approach to automated gait analysis for the Noldus Catwalk system. IEEE Transaction on Bio-medical Engineering. 65 (5), 1133-1139 (2018).
- Batka, R. J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record (Hoboken, N. J). 297 (10), 1839-1864 (2014).
- Wood, T., et al. A ferret model of encephalopathy of prematurity. Developmental Neuroscience. 40 (5-6), 475-489 (2018).
- Abbas, W., Masip Rodo, D. Computer methods for automatic locomotion and gesture tracking in mice and small animals for neuroscience applications: a survey. Sensors. 19 (15), Basel, Switzerland. (2019).
- Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
- Haastert-Talini, K. Modern Concepts of Peripheral Nerve Repair. Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. , Springer International Publishing. 127-138 (2017).
- Lu, L., et al. Growth differentiation factor 11 promotes neurovascular recovery after stroke in mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Caballero-Garrido, E., Pena-Philippides, J. C., Galochkina, Z., Erhardt, E., Roitbak, T. Characterization of long-term gait deficits in mouse dMCAO, using the CatWalk system. Behavioral Brain Research. 331, 282-296 (2017).
- Graham, D. M., Hampshire, V. Methods for measuring pain in laboratory animals. Lab Animal. 45 (3), 99-101 (2016).
- Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the sciatic functional index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
- Stossel, M., et al. Comparative evaluation of chitosan nerve guides with regular or increased bendability for acute and delayed peripheral nerve repair: a comprehensive comparison with autologous nerve grafts and muscle-in-vein grafts. Anatomical Record (Hoboken). 301 (10), 1697-1713 (2018).
- Vrinten, D. H., Hamers, F. F. CatWalk' automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
- Aman, M., Sporer, M., Bergmeister, K., Aszmann, O. Animal models for selective nerve transfers of the upper extremity. Handchirurgie Mikrochirurgie Plastische Chirurgie. 51 (4), 319-326 (2019).
