Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית

Published: September 21, 2021 doi: 10.3791/61857
Automatic Translation
1, 1, 1, , 1
1Oregon Hearing Research Center, Department of Otolaryngology/Head & Neck Surgery, Oregon Health & Science University

Summary

גישה של חלון כלי דם פתוח באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים מספקת רזולוציה מספקת למדידת זרימת דם שבלולית (CoBF). השיטה מאפשרת לחקור שינויים מבניים ותפקודיים ב- CoBF בעכבר בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

Abstract

התמרת קול היא תובענית מבחינה מטבולית, והתפקוד התקין של המיקרו-ווסקולטורה בדופן הצידית הוא קריטי לשמירה על הפוטנציאל האנדו-שבלולי, הובלת יונים ומאזן נוזלים. דווח כי צורות שונות של הפרעות שמיעה מערבות מיקרו-סירקולציה לא תקינה בשבלול. חקירת האופן שבו פתולוגיה של זרימת הדם השבלולית (CoBF) משפיעה על תפקוד השמיעה היא מאתגרת בשל היעדר שיטות חקירה אפשריות והקושי בגישה לאוזן הפנימית. חלון כלי פתוח בדופן השבלול הצדדית, בשילוב עם מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית, שימש לחקר שינויי CoBF in vivo, אך בעיקר בחזירי ים ורק לאחרונה בעכבר. מאמר זה והסרטון הנלווה אליו מתארים את שיטת חלון כלי הדם הפתוח להמחשת זרימת הדם בשבלול העכבר. הפרטים כוללים 1) הכנת תרחיף תאי הדם המסומנים בפלואורסצנט מעכברים; 2) בניית חלון כלי פתוח למיקרוסקופיה תוך-חיונית בעכבר מורדם, ו-3) מדידת מהירות זרימת הדם ונפחו באמצעות הקלטה לא מקוונת של ההדמיה. השיטה מוצגת בפורמט וידאו כדי להראות כיצד להשתמש בגישת החלון הפתוח בעכבר כדי לחקור שינויים מבניים ותפקודיים במיקרו-סירקולציה של השבלול בתנאים רגילים ופתולוגיים.

Introduction

תפקוד תקין של המיקרו-סירקולציה בדופן השבלול הלטרלי (המהווה את רוב הנימים ברצועה הספירלית ובסטריה וסקולריס) חשוב ביותר לשמירה על תפקוד השמיעה1. CoBF לא תקין מעורב בפתופיזיולוגיה של הפרעות רבות באוזן הפנימית, כולל אובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש, הידרופס באוזן ופרסביקוזיס 2,3,4,5,6,7,8,9. הדמיה של CoBF תוך-חיוני תאפשר הבנה טובה יותר של הקשרים בין תפקוד השמיעה לפתולוגיה של כלי הדם בשבלול.

למרות שהמורכבות והמיקום של השבלול בתוך העצם הטמפורלית מונעים הדמיה ומדידה ישירה של CoBF, פותחו שיטות שונות להערכת CoBF, כולל זרימת לייזר-דופלר (LDF)10,11,12, הדמיית תהודה מגנטית (MRI)13, מיקרוסקופיה תוך-חיונית פלואורסצנטית (FIVM)14, מיקרואנדוסקופיה פלואורסצנטית (FME)15, הדמיית ניגודיות של כתמי לייזר אנדוסקופיים (LSCI)16 וגישות המבוססות על הזרקת סמנים מסומנים ומיקרוספרות מתויגות רדיואקטיבית לזרם הדם (מיקרואנגיוגרפיה אופטית, OMAG)17,18,19,20., עם זאת, אף אחת משיטות אלה לא אפשרה מעקב מוחלט בזמן אמת אחר שינויים ב- CoBF in vivo, למעט FIVM. FIVM, בשילוב עם חלון כלי בדופן השבלול הצדדית, היא גישה שנעשה בה שימוש ואומתה בחזירי ים בתנאי ניסוי שונים על ידי מעבדות שונות 14,21,22.

שיטת FIVM הוקמה בהצלחה לחקר השינויים המבניים והתפקודיים במיקרו-סירקולציה של שבלול בעכבר באמצעות פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן כאמצעי ניגוד וצבע פלואורסצנטי - או DiO (3, 3′-דיוקטדצילוקסאקרבוציאנין פרכלורט, ירוק) או דיל (1,1-דיוקטדציל-3,3,3,3,3-טטרה-מתילינדוקרבוציאנין פרכלורט, אדום) - לתיוג מוקדם של תאי דם, הדמיה של כלי דם ומעקב אחר מהירות זרימת הדם. במחקר הנוכחי תואר הפרוטוקול של שיטה זו להדמיה וכימות של שינויים ב-CoBF בעכבר בתנאים רגילים ופתולוגיים (כגון לאחר חשיפה לרעש). טכניקה זו מעניקה לחוקר את הכלים הדרושים כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של CoBF הקשורים לתפקוד לקוי של השמיעה ולפתולוגיה בסטריה וסקולריס, במיוחד כאשר היא מיושמת בשילוב עם מודלים זמינים של עכברים מהונדסים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדותי. כל ההליכים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (מספר אישור IACUC: TR01_IP00000968).

1. הכנת תאי הדם המסומנים בפלואורסצנט

  1. הרדמת העכברים התורמים (עכברי C57BL/6J זכרים בני ~6 שבועות) באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של תמיסת הרדמה קטמין/קסילזין (5 מ"ל/ק"ג, ראו טבלת חומרים).
    הערה: פרוטוקול הרדמה זה אמין מאוד ושומר על לחץ דם סיסטמי.
  2. הניחו את העכבר על גבו, פתחו את העור וחשפו את חלל החזה באמצעות פינצטה ומספריים לנתח. חותכים לפתוח את הסרעפת, לתפוס בבסיס עצם החזה באמצעות מספריים מהדק, לחתוך דרך הצלעות ולהרים כדי לחשוף את הלב. לאסוף 1 מ"ל של דם בהפרין (15 IU / mL דם) על ידי ניקור לב, צנטריפוגה ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (60 °F). להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם לאחר איסוף הדם.
  3. הסר את הפלזמה, לשטוף את גלולת תאי הדם עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), וצנטריפוגה 3x ב 3000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. תייג את תאי הדם עם 1 מ"ל של 20 mM DiO או Dil ב- PBS, ודגירה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר23,24.
  5. צנטריפוגה ולשטוף את תאי הדם המסומנים עם 1 מ"ל של PBS, צנטריפוגה 3x ב 3000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (60 °F), ו להשעות את גלולת התא ב 30% hematocrit עם ~ 0.9 מ"ל של PBS (נפח סופי ~ 1.3 מ"ל) לפני ההזרקה.

2. ניתוח ליצירת חלון פתוח 25

  1. הכינו את כלי הניתוח הסטריליים ואת פלטפורמת ההדמיה, והניחו כרית חימום מתחת לווילון (איור 1A). הרדימו את העכברים (עכברי C57BL/6J זכרים בני ~6 שבועות) כמתואר בשלב 1.1, ובדקו את עומק ההרדמה על ידי מעקב אחר רפלקס כפות הרגליים וטונוס השרירים הכללי. מניחים את החיה על כרית החימום החמה, ושומרים על הטמפרטורה הרקטלית ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. הניחו את זנב החיה במערכת ניטור CODATM לניטור לחץ דם ודופק (ראו טבלת חומרים). רשום את לחץ הדם הסיסטולי של החיה, לחץ הדם הדיאסטולי ולחץ הדם הממוצע (MBP) במצב המרדים.
    הערה: לא נראה הבדל ב- MBP של בעלי חיים במצב מורדם ולא מורדם (107 ± 11 מ"מ כספית לעומת 97 ± 7 מ"מ כספית). קצב הלב של בעלי החיים יציב תחת הרדמה, אם כי נמוך יותר (עדיין בטווח התקין) מאשר במצב שאינו מורדם (357 ± 12 פעימות לדקה לעומת 709 ± 3 פעימות לדקה). יש לצפות לפעימות לב מוגברות מעט אצל בעלי חיים הממוקמים באיפוק26.
  3. פתח את הבולה הטימפנית השמאלית באמצעות גישה צידית וגחונית תחת מיקרוסקופ סטריאו (ראה טבלת החומרים), והשאר את הממברנה הטימפנית ואת המערכות ללא פגע21.
    1. בצעו חתך לאורך קו האמצע של צוואר החיה כשראשה משותק וממוקם כדי למזער את התנועה (איור 1B). הסר את הבלוטה התת-מנדיבולרית השמאלית ואת הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי ו cauterize.
      הערה: יש להזריק בופרנורפין באופן תת עורי במינון של 0.05 מ"ג/ק"ג כדי להפחית את הכאב במהלך הניתוח.
    2. אתר וחשוף את הבולה הגרמית על ידי זיהוי שריר הסטרנוקלידומסטואיד ועצב הפנים המשתרע קדמית לכיוון הבולה.
    3. פתח את הבולה הגרמית עם מחט של 30 G, והסר בזהירות את העצם המקיפה אותה באמצעות פינצטה כירורגית כדי לספק מבט ברור על עורק השבלול והעורק הסטפטיאלי, כאשר השוליים המדיאליים שלה מונחים על קצה גומחת החלון העגולה, וקורסים קדמיים-עליונים לכיוון החלון הסגלגל (איור 1C, D).
      הערה: טרכאוטומיה מבוצעת כדי לשמור על דרכי הנשימה ללא הפרעה ויש לעשות זאת רק כאשר לבעל החיים יש בעיה נשימתית במהלך ניתוח. באופן כללי, רוב בעלי החיים תחת הרדמה יש נשימה חלקה. עם זאת, אם בעלי חיים קיבלו טרכאוטומיה במהלך הניתוח, אין להשתמש בזרימת הדם המוקלטת לצורך השוואה כלשהי.
  4. השתמש בלהב סכין קטן (אזמל #16 טחון בהתאמה אישית) כדי לגרד את עצם הדופן הצדדית בסיבוב האמצעי-גבוה של שבלול העכבר, כ-1.25 מ"מ מהפסגה, עד שנקודה דקה נסדקה. הסירו את שבבי העצם בעזרת ווי תיל קטנים (איור 1E).
  5. כסה את חלון כלי השיט בכיסוי חתוך כדי שמירה על תנאים פיזיולוגיים תקינים וספק תצוגה אופטית להקלטת תמונות כלי השיט.
    הערה: יש לבצע את כל ההליכים בזהירות. בנוסף לניטור טמפרטורת הגוף, יש לעקוב אחר הסימנים החיוניים של החיה, כולל לחץ דם ודופק, לאורך כל הניתוח.

3. הדמיה של CoBF תחת FIVM

  1. בצע חתך של ~1 ס"מ לאורך הווריד הספנוס הימני כדי לחשוף את כלי הדם (איור 1F).
  2. החדירו 100 μL של תמיסת FITC-dextran (2000 kDa, 40 מ"ג/מ"ל ב-PBS) ו-100 μL של תרחיף תאי דם (30% המטוקריט) ברצף לתוך החיה דרך הווריד הספנוסי (איור 1G) כדי לאפשר הדמיה של כלי הדם ומעקב אחר מהירות זרימת הדם.
  3. שימו לב לזרימת הדם בזמן אמת ישירות על צג וידאו 5 דקות לאחר ההזרקה. דמיינו את כלי הדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה למרחק עבודה ארוך (W.D.) (W.D. 30.5 מ"מ, צמצם מספרי 10x, 0.26) ובית מנורה המכיל מסנן עירור מרובה פסים ומסנן פליטה תואם (Table of Materials). הקלט את הסרטון באמצעות מצלמת התקן דיגיטלית בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה (Table of Materials) במהירות של 2 פריימים לשנייה). רכוש יותר מ-350 תמונות לסרטון כדי להבטיח ניתוח מוצלח של מהירות הזרימה.
    הערה: ניתן לצלם את כלי הדם של הרצועה הספירלית ושל כלי הדם של סטריה על ידי התאמת המיקוד האופטי (וידאו משלים 1).

4. ניתוח וידאו

  1. מדוד את קוטר כלי השיט באמצעות תוכנה מתאימה (Table of Materials), וקבע את המרחק בין שתי נקודות קבועות על פני כלי השיט בתמונות שנרכשו.
  2. חשב את מהירות זרימת הדם ממסגרות וידאו שצולמו על-ידי מעקב אחר תנועת תאי הדם המסומנים במרחק המרחבי בין מיקומי תמונה27.
    1. פתח את הווידאו של זרימת הדם בתוכנה (פיג'י [ImageJ] שימש בפרוטוקול זה), וקבע את קנה המידה של התמונות.
    2. עקוב אחר תאי הדם המוכתמים ב- DiO שנבחרו באמצעות פונקציית המעקב. השתמש במרחק שהתאים עברו ובמרווח הזמן בין מסגרות תמונה בסרטון לצורך חישוב אוטומטי של מהירות הזרימה.
  3. חישוב הזרימה הנפחית (F) לפי המשוואה הבאה: F = V × A. (V: מהירות; A: שטח חתך של כלי השיט).

5. חשיפה לרעש

  1. מניחים את החיות בכלובי רשת תיל. חשוף אותם לרעש פס רחב ברמת לחץ קול של 120 dB בתא חשיפה לקול למשך 3 שעות ולמשך 3 שעות נוספות למחרת.
    הערה: משטר חשיפה לרעש זה, הנמצא בשימוש שגרתי במעבדה זו, גורם לאובדן קבוע של רגישות לשבלול28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר חשיפה כירורגית של נימי השבלול בדופן הצידית (איור 1), תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה של תאי דם המסומנים ב-Dil בכלי דם המסומנים ב-FITC-dextran הייתה אפשרית דרך חלון כלי פתוח. איור 2A הוא תמונה מייצגת שצולמה תחת FIVM שמראה את הנימים של השבלול העכבר-אמצע המפנה לרוחב. הלומינה של כלי אלה נראית לעין על ידי הפלואורסצנציה של FITC-dextran מעורבב עם פלזמה. תאי דם המסומנים בנפרד המופצים ברשת כלי הדם נראים בבירור גם בתמונה זו. שתי רשתות נפרדות - נימים של הרצועה הספירלית ונימים של הסטריה וסקולריס - נבדלות על ידי מיקום (תחת מיקרוסקופ זקוף, הסטריה וסקולריס פועלת אופטית מתחת לרצועה הספירלית, והיא מכילה יותר לולאות נימי וכלי דם קטנים יותר25). ניתן להעריך את שניהם לזרימת הדם עם התאמה של המיקוד האופטי. כפי שניתן לראות באיור 2B, C, צפיפות כלי הדם של הרצועה הספירלית דלילה יותר מזו של הסטריה וסקולריס.

תפקוד כלי הדם במודל העכבר החשוף לרעש הושווה לתפקוד כלי הדם בקבוצת הביקורת. מדידת CoBF נלקחה שבועיים לאחר החשיפה לרעש. איור 3A,B הן תמונות מייצגות המציגות את דפוסי הזרימה בקבוצות בקרה וקבוצות שנחשפו לרעש. דפוס מופרע של זרימת הדם נצפה בקבוצה שנחשפה לרעש (איור 3B). אנומליות כללו קוטר כלי דם מופחת (איור 3C) ושונות מוגברת בקוטר כלי הדם (איור 3D). כפי שמודגם באיור 4A,B, מהירויות זרימת הדם בקבוצות הביקורת והקבוצות שנחשפו לרעש חושבו על-ידי מעקב אחר המסלולים של תאי הדם המסומנים על-ידי DiO (וידאו משלים 2). התוצאות מראות שמהירות הדם ועוצמת הדם בקבוצה שנחשפה לרעש היו נמוכות משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת (איור 4C, D). נתונים אלה מצביעים על כך שקול חזק משפיע באופן משמעותי על זרימת הדם וגורם לירידה והפרעה בזרימת הדם.

Figure 1
איור 1: הכנת חלון כלי פתוח להדמיית IVM בעכבר . (א) הכנת מכשירים וכלים לניתוח. (B) הבולה השמאלית נחשפה בגישה צידית וגחונית. (C) השבלול נחשף לאחר הסרת הבולה. (D) תמונה מוגדלת של השבלול, מהעיגול ב-(C). (E) חלון כלי פתוח נוצר בקצה האמצע של דופן השבלול הצדדית (תיבה). (ו ' ו-ז') עירוי תוך ורידי של FITC-dextran ותאי דם מסומנים דרך הווריד הספני. קיצורים: OW = חלון סגלגל; RW = חלון עגול; IVM = מיקרוסקופיה תוך-חיונית; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות של נימי שבלול בדופן הצדדית. (A) תאי דם המסומנים בדיל (אדום, חץ) בכלי דם פרוזדוריים המסומנים ב-FITC-דקסטרן (ירוק). (B) תאי דם המסומנים ב-DiO (בירוק) בכלי רצועה ספירליים המסומנים ב-FITC-dextran (חצים, ירוק). שימו לב שהכלים דלילים. (C) תאי דם המסומנים ב-DiO (ירוק) בכלי דם פרוזדוריים המסומנים ב-FITC-dextran (ירוק). שימו לב שהכלים צפופים יותר. סרגלי קנה מידה: 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר. קיצורים: דיל = 1,1-דיוקטדציל-3,3,3,3-טטרה-מתילינדוקרבוציאנין פרכלורט; DiO = 3, 3′-דיוקטדצילוקסאקרבוציאנין פרכלורט; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: שינוי בקוטר כלי הדם בסטריה שבועיים לאחר חשיפה לרעש. (A ו-B) תמונות מייצגות של זרימת הדם לאחר סימון כלי הדם עם FITC-dextran (ירוק) ותאי דם עם DiO (ירוק) בקבוצות בקרה וחשופות לרעש (NE) עם IVM ברזולוציה גבוהה. (C) קוטר ה-Meanvessel המחושב עבור קבוצות בקרה ו-NE. בהשוואה לקבוצת הביקורת, קוטר כלי השיט הופחת בקבוצת החשיפה לרעש. (n = 18, t (34) = 2.880, **p = 0.007, מבחן t של סטודנט, ממוצע ± סטיית תקן [SD]). (D) שונות בקוטר כלי השיט בקבוצות בקרה ו-NE. קוטר כלי השיט השתנה הרבה יותר בקבוצת NE מאשר בקבוצת הביקורת. (n = 6, t (10) = 6.630, ****p < 0.0001, מבחן t של סטודנט, ממוצע ± SD). סרגלי קנה מידה: 100 מיקרומטר. קיצורים: DiO = 3, 3′-דיוקטדצילוקסאקרבוציאנין פרכלורט; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט; IVM = מיקרוסקופיה תוך-ויטלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: שינויים בזרימת הדם בסטריה שבועיים לאחר חשיפה לרעש. (A ו-B) תמונות מייצגות מציגות את נתיבי המעקב (קווים אדומים, ירוקים וכחולים) של תאי דם המסומנים ב-DiO (ירוק) למדידת מהירות זרימת הדם בקבוצות בקרה ובקבוצות שנחשפו לרעש. (ג ו-ד) מהירות זרימת הדם (μm/s) וקצב הזרימה הנפחית (μm3/s) חושבו בהתאמה עבור קבוצות בקרה וחשיפה לרעש. קצב זרימת הדם וקצב הזרימה הנפחית בקבוצה שנחשפה לרעש היו נמוכים יותר מאשר בקבוצת הביקורת (n = 54,t מהירות (106) = 19.705, ****pמהירות < 0.0001; נפח t (106) = 15.342, ****pנפח < 0.0001, מבחן t של סטודנט, ממוצע ± סטיית תקן). סרגלי קנה מידה: 100 מיקרומטר. קיצורים: DiO = 3, 3′-דיוקטדצילוקסאקרבוציאנין פרכלורט1; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט; NE 2W = חשיפה לרעש של שבועיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרטון משלים 1: כלי הדם של הרצועה הספירלית ושל stria vascularis. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה. 

סרטון משלים 2: מעקב אחר נתיבי תאי הדם המסומנים ב- DiOלחישוב מהירויות זרימת הדם בחיית בקרה. קיצורים: DiO = 3, 3′-דיוקטדצילוקסאקרבוציאנין פרכלורט. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מדגים כיצד ניתן לדמיין נימים בדופן הצידית של השבלול (ובסטריה וסקולריס) של מודל עכבר באמצעות תיוג פלואורופור בהכנה של חלון כלי פתוח תחת מערכת FIVM. מודל העכבר נמצא בשימוש נרחב ומועדף כמודל יונקים לחקר בריאות האדם ומחלותיו. הפרוטוקול המתואר כאן הוא גישה אפשרית להדמיה וחקירה של CoBF בדופן הצידית של העכבר (במיוחד בסטריה וסקולריס) באמצעות חלון כלי פתוח תחת מערכת FIVM השיטה מספקת רזולוציה מספקת לקביעת מהירות זרימת הדם ונפחו באמצעות תאי דם המסומנים בפלואורסצנציה כעוקבים (כפי שמוצג באיור 3 ובאיור 4 ). גישה זו יכולה לשמש למספר יישומים שונים, כגון הערכת חדירות כלי הדם ובדיקת התכווצות פריציטים, ומעקב אחר נדידת תאי מח עצםבמחזור 25. ניתן לעקוב אחר שינויים חריפים ב- CoBF בתגובה לטראומה, זיהום, רעש, גופים זרים, תרופות אוטוטוקסיות או חומרים אחרים המשפיעים על הדופן הצידית בזמן אמת25,29.
 
בעשורים האחרונים הוקמו מספר שיטות לא פולשניות יחסית להערכת CoBF מבלי להסיר את דופן השבלול הגרמי, כולל LDF, MRI, OMAG, LSCI אנדוסקופי, FME אנדוסקופי , והזרקת מיקרוספרות לפלסמה בדם. עם זאת, אף אחת מהגישות הללו אינה יכולה לשמש להערכת קצב הזרימה המוחלט בכלי שיט בודדים. לדוגמה, FME אנדוסקופי לא פולשני יכול לשמש רק כדי לדמות אזורים מוגבלים ליד החלון העגול, אך לא זרימת דם בסטריה וסקולריס.  עם זאת, לזרימת הדם בסטריה וסקולריס יש תפקידים מכריעים בשמירה על EP, הובלת יונים ומאזן נוזלים אנדולימפטי, כולם חיוניים לרגישות שמיעה (Zhang et al., 2021). OMAG שימושי גם להדמיה של זרימת הדם בשבלול השלם, עם זאת, הרזולוציה גרועה מדי להדמיית נימים בודדים בכלי הדם של עכבר מודל19.

חלון כלי פתוח, בשילוב עם FIVM, מאפשר הדמיה בזמן אמת של זרימת הדם בדופן הצידית של השבלול ומדידת קוטר כלי הדם ומהירות זרימת הדם באזורים שתועדו. למערכת IVM מספר יתרונות על פני שיטות אחרות. לדוגמה, ניתן למקם את החיה בנוחות ולתפעל אותה לפי הצורך. קיימת גמישות להתאים את הניגודיות של הפלזמה ותאי הדם המסומנים בפלואורסצנציה כדי לייעל את ההדמיה של ארכיטקטורת כלי הדם ולהדגיש מבנים רלוונטיים. ניתן גם לבחור את המשקלים המולקולריים השונים של עוקבים מצומדים של FITC כדי לייעל את ההערכה של חדירות כלי הדם. e הבחירה אם להשתמש ב- Dil (lex = 550 nm; lem = 564 nm) או Dio (lex = 484 nm; lem = 501 nm) כדי לסמן את תאי הדם, בניגוד ל- FITC-dextran המשמש לסימון הפלזמה, נקבעת על ידי מטרות הניסוי. באופן כללי, דיל מספק ניגודיות טובה יותר להדמיה של לומן כלי הדם ותאי הדם הבודדים, בעוד ש- Dio מועדף כאשר הדמיה בו זמנית משמשת להדמיה של תאי דם ולומן באותו ערוץ רכישה. יתרה מכך, המעקב מתבצע בצורה הטובה ביותר עם מספר קטן של תאים מסומנים מכיוון שפלואורסצנציה של תאי דם תסווה את פלואורסצנטיות לומן כלי הדם אם כל תאי הדם בכלי הדם מסומנים21. בנוסף, יש לנקוט משנה זהירות כדי להגביל את כמות התמיסה הניתנת לדם, כדי למזער את הדילול ואת השינויים בזרימת הדם הקשורים לצמיגות בשבלול30.

באופן כללי, שיטה זו חזקה וניתן להשתמש בה לחקר שינויים מבניים ותפקודיים ב-CoBF בתנאים רגילים ופתולוגיים כגון דלקת, רעש והזדקנות. חשוב לציין, ניתן לשמור על EP קבוע ותקין במהלך הניתוח, מה שמעיד על כך שההליך אינו מזיק לתפקוד השבלול כאשר הוא מבוצע בזהירות מספקת25. עם זאת, הקמה מוצלחת של חלון כלי הדם הפתוח דורשת רמה גבוהה של מיומנות כירורגית. לדוגמה, יש לנקוט משנה זהירות בהסרת העצם של דופן השבלול לרוחב כדי למנוע אובדן של נוזל פרילימפטי ופגיעה זעירה בשכבה החיצונית של הרצועה הספירלית של השבלול. אלה עלולים להשפיע לרעה על הומאוסטזיס שבלול ולפגוע בהדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi), וקרן המחקר הרפואי מאוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (OHSU) (X.Shi).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Hospira NDC 0409-1966-02 0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma Aldrich 468495 20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate Sigma Aldrich D4292 20 µM
CODA Monitor system Kent scientific CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip Fisher Scientific 12-542A
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fiji/ImageJ NIH Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa) Sigma Aldrich FD2000s 40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV Mylan NDC 67457-374-12 5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL) Henry Schein NDC 11695-0702-1 0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective Mitutoyo 378-823-5 Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera Hamamatsu Model: C4742-80-12AG
PBS Gibco 2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) Lloyd LPFL04821 0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope Olympus Model: SZ61, fluorescent microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
  2. Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
  3. Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
  4. Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
  5. Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
  6. Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
  7. Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
  8. Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
  9. Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , Thieme Medical Publishers. 242-250 (2012).
  10. Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
  11. Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
  12. Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
  13. Le Floc'h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
  14. Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
  15. Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
  16. Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
  17. Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
  18. Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
  19. Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
  20. Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
  21. Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
  22. Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
  23. Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
  24. Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
  25. Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
  26. Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
  27. Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
  28. Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
  29. Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
  30. Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).

Tags

רפואה גיליון 175 עכבר זרימת דם שבלול מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית תאי דם מסומנים פלואורסצנטיים חלון כלי פתוח מהירות זרימת דם נפח דם
מדידת זרימת הדם בפרוזדורים בשבלול עכברים תוך שימוש בחלון כלי פתוח ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hou, Z., Zhang, Y., Neng, L., Zhang, … More

Hou, Z., Zhang, Y., Neng, L., Zhang, J., Shi, X. Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (175), e61857, doi:10.3791/61857 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter