Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

قياس تدفق الدم الغريلي في قوقعة الفئران باستخدام نافذة الأوعية المفتوحة والمجهر الفلوري داخل الحيوية

Published: September 21, 2021 doi: 10.3791/61857
Automatic Translation
1, 1, 1, , 1
1Oregon Hearing Research Center, Department of Otolaryngology/Head & Neck Surgery, Oregon Health & Science University

Summary

يوفر نهج نافذة الأوعية المفتوحة باستخدام مقتفيات الفلورسنت دقة كافية لقياس تدفق الدم في القوقعة الصناعية (CoBF). تسهل هذه الطريقة دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في CoBF في الفئران في ظل الظروف الطبيعية والمرضية.

Abstract

يتطلب نقل الصوت عملية التمثيل الغذائي ، والوظيفة الطبيعية للأوعية الدموية الدقيقة في الجدار الجانبي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على إمكانات القوقعة الداخلية ، ونقل الأيونات ، وتوازن السوائل. تم الإبلاغ عن أشكال مختلفة من اضطرابات السمع تنطوي على دوران الأوعية الدقيقة غير الطبيعي في القوقعة. يعد التحقيق في كيفية تأثير أمراض تدفق الدم القوقعي (CoBF) على وظيفة السمع أمرا صعبا بسبب عدم وجود طرق استجواب مجدية وصعوبة الوصول إلى الأذن الداخلية. تم استخدام نافذة وعاء مفتوحة في جدار القوقعة الصناعية الجانبي ، جنبا إلى جنب مع المجهر الفلوري داخل الحيوية ، لدراسة تغيرات CoBF في الجسم الحي ، ولكن في الغالب في خنزير غينيا ومؤخرا فقط في الفأر. تصف هذه الورقة والفيديو المرتبط بها طريقة نافذة الأوعية المفتوحة لتصور تدفق الدم في قوقعة الفأر. وتشمل التفاصيل 1) إعداد تعليق خلايا الدم المسمى بالفلورسنت من الفئران. 2) بناء نافذة وعاء مفتوحة للفحص المجهري داخل الحيوية في فأر مخدر ، و 3) قياس سرعة تدفق الدم وحجمه باستخدام تسجيل غير متصل بالإنترنت للتصوير. يتم تقديم الطريقة في شكل فيديو لإظهار كيفية استخدام نهج النافذة المفتوحة في الماوس للتحقيق في التغيرات الهيكلية والوظيفية في دوران الأوعية الدقيقة للقوقعة الصناعية في ظل الظروف العادية والمرضية.

Introduction

تعد الوظيفة الطبيعية لدوران الأوعية الدقيقة في جدار القوقعة الصناعية الجانبي (الذي يضم غالبية الشعيرات الدموية في الرباط الحلزوني والأوعية الدموية المخططة) مهمة للغاية للحفاظ على وظيفة السمع1. CoBF غير طبيعي متورط في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من اضطرابات الأذن الداخلية بما في ذلك فقدان السمع الناجم عن الضوضاء ، واستسقاء الأذن ، و presbycusis2،3،4،5،6،7،8،9. سيمكن تصور CoBF داخل الحيوية من فهم أفضل للروابط بين وظيفة السمع وأمراض الأوعية الدموية القوقعية.

على الرغم من أن تعقيد القوقعة وموقعها داخل العظم الصدغي يحول دون التصور المباشر وقياس CoBF ، فقد تم تطوير طرق مختلفة لتقييم CoBF بما في ذلك قياس تدفق الدوبلر بالليزر (LDF) 10،11،12 ، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 13 ، المجهر الفلوري داخل الحيوية (FIVM) 14 ، التنظير المجهري الفلوري (FME) 15 ، التصوير بالأشعة بالليزر بالمنظار (LSCI)16 ، والنهج القائمة على حقن العلامات الموسومة والميكروسفير الموسوم إشعاعيا في مجرى الدم (تصوير الأوعية الدقيقة الضوئية، OMAG)17،18،19،20. ومع ذلك ، لم تمكن أي من هذه الطرق من التتبع المطلق في الوقت الفعلي للتغيرات في CoBF في الجسم الحي ، باستثناء FIVM. FIVM ، بالاقتران مع نافذة وعاء في جدار القوقعة الصناعية الجانبي ، هو نهج تم استخدامه والتحقق من صحته في خنزير غينيا في ظل ظروف تجريبية مختلفة من قبل مختبرات مختلفة14،21،22.

تم إنشاء طريقة FIVM بنجاح لدراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في دوران الأوعية الدقيقة القوقعة الصناعية في الفأر باستخدام فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC)-dextran كوسط تباين وصبغة فلورية - إما DiO (3 ، 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate ، الأخضر) أو Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate ، red) - لوضع العلامات المسبقة على خلايا الدم ، وتصور الأوعية ، وتتبع سرعة تدفق الدم. في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول هذه الطريقة للتصوير وتحديد التغيرات في CoBF في الفئران في ظل الظروف العادية والمرضية (مثل بعد التعرض للضوضاء). تمنح هذه التقنية الباحث الأدوات اللازمة للتحقيق في الآليات الأساسية ل CoBF المتعلقة بضعف السمع وعلم الأمراض في الأوعية الدموية stria ، خاصة عند تطبيقها بالاقتران مع نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتاحة بسهولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: هذه جراحة عدم البقاء على قيد الحياة. تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة أوريغون للصحة والعلوم (رقم موافقة IACUC: TR01_IP00000968).

1. إعداد خلايا الدم الفلورسنت المسمى

  1. تخدير الفئران المانحة (ذكور الفئران C57BL / 6J التي تبلغ أعمارها ~ 6 أسابيع) مع حقن داخل الصفاق (i.p) من محلول مخدر الكيتامين / xylazine (5 مل / كجم ، انظر جدول المواد).
    ملاحظة: بروتوكول التخدير هذا موثوق به للغاية ويحافظ على ضغط الدم النظامي.
  2. ضع الماوس على ظهره ، وافتح الجلد وكشف تجويف الصدر باستخدام ملاقط ومقص تشريح. قطع فتح الحجاب الحاجز ، والاستيلاء على قاعدة القص باستخدام مقص المشبك ، وقطع من خلال القفص الصدري ورفع لفضح القلب. جمع 1 مل من الدم في الهيبارين (15 وحدة دولية / مل من الدم) عن طريق ثقب القلب ، وأجهزة الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم بعد جمع الدم.
  3. قم بإزالة البلازما ، واغسل حبيبة خلايا الدم ب 1 مل من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) ، وأجهزة الطرد المركزي 3x عند 3000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بتسمية خلايا الدم ب 1 مل من 20 mM DiO أو Dil في PBS ، واحتضنها في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة23,24.
  5. جهاز طرد مركزي وغسل خلايا الدم المصنفة ب 1 مل من PBS ، وأجهزة الطرد المركزي 3x عند 3000 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 30٪ من الهيماتوكريت مع ~ 0.9 مل من PBS (الحجم النهائي ~ 1.3 مل) قبل الحقن.

2. جراحة لإنشاء نافذة مفتوحة 25

  1. قم بإعداد الأدوات الجراحية المعقمة ومنصة التصوير ، ووضع وسادة تدفئة تحت الستارة (الشكل 1A). تخدير الفئران (ذكور الفئران C57BL/6J التي تبلغ أعمارها ~ 6 أسابيع) كما هو موضح في الخطوة 1.1 ، وتحقق من عمق التخدير عن طريق مراقبة منعكس المخلب وقوة العضلات العامة. ضع الحيوان على وسادة التدفئة الدافئة ، وحافظ على درجة حرارة المستقيم عند 37 درجة مئوية.
  2. ضع ذيل الحيوان في نظام مراقبة CODATM لمراقبة ضغط الدم وضربات القلب (انظر جدول المواد). سجل ضغط الدم الانقباضي للحيوان وضغط الدم الانبساطي ومتوسط ضغط الدم (MBP) في حالة التخدير.
    ملاحظة: لا يوجد فرق في MBP الحيواني في الحالة المخدرة وغير المخدرة (107 ± 11 مم زئبق مقابل 97 ± 7 مم زئبق). معدل ضربات قلب الحيوان مستقر تحت التخدير ، على الرغم من أنه أقل (لا يزال ضمن المعدل الطبيعي) مما هو عليه في حالة عدم التخدير (357 ± 12 bmp مقابل 709 ± 3 bmp). يجب توقع زيادة طفيفة في ضربات القلب في الحيوانات الموضوعة في قيود26.
  3. افتح الثور الطبلي الأيسر عبر نهج جانبي وبطني تحت مجهر ستيريو (انظر جدول المواد) ، تاركا الغشاء الطبلي والعظيمات سليمة21.
    1. قم بعمل شق على طول خط الوسط من عنق الحيوان مع شل حركة رأسه ووضعه لتقليل الحركة (الشكل 1B). إزالة الغدة تحت الفك السفلي الأيسر والبطن الخلفي للعضلة digastric والكي.
      ملاحظة: حقن البوبرينورفين تحت الجلد عند 0.05 ملغم/كغ لتقليل الألم أثناء الجراحة.
    2. حدد موقع الفقاعة العظمية وكشفها عن طريق تحديد العضلة القصية والعصب الوجهي الممتد أماميا نحو الفولا.
    3. افتح الفلا العظمية بإبرة 30 جم ، وقم بإزالة العظم المحيط بعناية باستخدام ملاقط جراحية لتوفير رؤية واضحة للقوقعة والشريان المستقر ، مع وجود هامشها الإنسي على حافة مكان النافذة المستديرة ، ويتجه أماميا متفوقا نحو النافذة البيضاوية (الشكل 1C ، D).
      ملاحظة: يتم إجراء بضع القصبة الهوائية للحفاظ على مجرى الهواء دون عائق ويجب أن يتم ذلك فقط عندما يكون الحيوان يعاني من مشكلة في الجهاز التنفسي أثناء الجراحة. بشكل عام ، فإن معظم الحيوانات تحت التخدير لديها تنفس سلس. ومع ذلك ، إذا تلقت الحيوانات بضع القصبة الهوائية أثناء الجراحة ، فلا ينبغي استخدام تدفق الدم المسجل لأي مقارنة.
  4. استخدم شفرة سكين صغيرة (مشرط #16 مطحون حسب الطلب) لكشط عظم الجدار الجانبي عند المنعطف العلوي الأوسط لقوقعة الفأر ، على بعد حوالي 1.25 مم من القمة حتى يتم تكسير بقعة رقيقة. قم بإزالة رقائق العظام باستخدام خطافات سلكية صغيرة (الشكل 1E).
  5. قم بتغطية نافذة السفينة بغطاء مقطوع للحفاظ على الظروف الفسيولوجية الطبيعية وتوفير رؤية بصرية لتسجيل صور الوعاء.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات بحذر. بالإضافة إلى مراقبة درجة حرارة الجسم ، يجب أيضا مراقبة العلامات الحيوية للحيوان ، بما في ذلك ضغط الدم وضربات القلب ، طوال الجراحة.

3. تصوير CoBF تحت FIVM

  1. قم بعمل شق ~ 1 سم على طول الوريد الصافن الأيمن لفضح الوعاء (الشكل 1F).
  2. غرس 100 ميكرولتر من محلول FITC-dextran (2000 kDa ، 40 mg / mL في PBS) و 100 μL من تعليق خلايا الدم (30٪ hematocrit) على التوالي في الحيوان من خلال الوريد الصافن (الشكل 1G) لتمكين تصور الأوعية الدموية وتتبع سرعة تدفق الدم.
  3. راقب تدفق الدم في الوقت الفعلي مباشرة على شاشة فيديو بعد 5 دقائق من الحقن. قم بتصوير الأوعية الدموية باستخدام مجهر فلوري مجهز بهدف مسافة العمل الطويلة (W.D. 30.5 مم ، 10x ، 0.26 فتحة رقمية) وغلاف مصباح يحتوي على مرشح إثارة متعدد النطاقات ومرشح انبعاثات متوافق (جدول المواد). سجل الفيديو باستخدام كاميرا جهاز رقمية عالية الدقة بالأبيض والأسود مقترنة بالشحن (جدول المواد) بمعدل 2 إطار / ثانية). احصل على أكثر من 350 صورة لكل فيديو لضمان التحليل الناجح لسرعة التدفق.
    ملاحظة: يمكن تصوير الأوعية الدموية لكل من الرباط الحلزوني والأوعية الدموية عن طريق ضبط التركيز البصري (فيديو تكميلي 1).

4. تحليل الفيديو

  1. قياس قطر السفينة باستخدام البرنامج المناسب (جدول المواد)، وتحديد المسافة بين نقطتين ثابتتين عبر السفينة في الصور التي تم الحصول عليها.
  2. احسب سرعة تدفق الدم من إطارات الفيديو الملتقطة عن طريق تتبع حركة خلايا الدم المصنفة في المسافة المكانية بين مواقع الصور27.
    1. افتح فيديو تدفق الدم في البرنامج (تم استخدام فيجي [ImageJ] في هذا البروتوكول) ، واضبط مقياس الصور.
    2. تتبع خلايا الدم الملطخة ب DiO المحددة باستخدام وظيفة التتبع. استخدم المسافة التي تحركت بها الخلايا والفاصل الزمني بين إطارات الصور في الفيديو للحساب التلقائي لسرعة التدفق.
  3. احسب التدفق الحجمي (F) وفقا للمعادلة التالية: F = V × A. (V: السرعة; ج: منطقة المقطع العرضي للسفينة).

5. التعرض للضوضاء

  1. ضع الحيوانات في أقفاص شبكية سلكية. قم بتعريضهم لضوضاء النطاق العريض عند مستوى ضغط صوت 120 ديسيبل في كشك التعرض للصوت لمدة 3 ساعات ولمدة 3 ساعات إضافية في اليوم التالي.
    ملاحظة: ينتج عن نظام التعرض للضوضاء هذا، المستخدم بشكل روتيني في هذا المختبر، فقدانا دائما لحساسية القوقعة الصناعية28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد التعرض الجراحي للشعيرات الدموية القوقعية في الجدار الجانبي (الشكل 1) ، كانت المراقبة المجهرية الفلورية عالية الدقة داخل الحيوية لخلايا الدم التي تحمل علامة ديل في الأوعية التي تحمل علامة FITC-dextran ممكنة من خلال نافذة وعاء مفتوحة. الشكل 2A هو صورة تمثيلية تم التقاطها تحت FIVM توضح الشعيرات الدموية للجدار الجانبي لقمة قوقعة الأذن الوسطى للفأر. يتم جعل لومينا هذه الأوعية مرئية من خلال تألق FITC-dextran الممزوج بالبلازما. خلايا الدم المصنفة بشكل فردي الموزعة في شبكة الأوعية الدموية مرئية بوضوح في هذه الصورة. تتميز شبكتان متميزتان - الشعيرات الدموية للرباط الحلزوني والشعيرات الدموية في الأوعية الدموية المخططة - بالموقع (تحت المجهر المستقيم ، يعمل المخطط الوعائي بصريا تحت الرباط الحلزوني ، ويحتوي على المزيد من الحلقات الشعرية والأوعية الأصغر25). يمكن تقييم كلاهما لتدفق الدم مع تعديل التركيز البصري. كما هو موضح في الشكل 2B ، C ، فإن كثافة الأوعية الدموية للرباط الحلزوني أقل من كثافة الأوعية الدموية stria.

تمت مقارنة وظيفة الأوعية الدموية في نموذج الماوس المعرض للضوضاء مع وظيفة الأوعية الدموية في المجموعة الضابطة. تم أخذ قياس CoBF بعد 2 أسابيع من التعرض للضوضاء. الشكل 3A و B عبارة عن صور تمثيلية توضح أنماط التدفق في المجموعات الضابطة والمجموعات المكشوفة للضوضاء. شوهد نمط مضطرب من تدفق الدم في المجموعة المعرضة للضوضاء (الشكل 3B). وشملت الحالات الشاذة انخفاض قطر الوعاء (الشكل 3 جيم) وزيادة التباين في قطر الوعاء (الشكل 3 دال). وكما هو موضح في الشكل 4A,B، تم حساب سرعات تدفق الدم في المجموعات الضابطة والمعرضة للضوضاء عن طريق تتبع مسارات خلايا الدم التي تحمل علامة DiO (الفيديو التكميلي 2). أظهرت النتائج أن سرعة الدم وحجمه في المجموعة المعرضة للضوضاء كانا أقل بكثير مما كانا عليه في المجموعة الضابطة (الشكل 4C ، D). تشير هذه البيانات إلى أن الصوت العالي يؤثر بشكل ملحوظ على الدورة الدموية ويسبب انخفاض واضطراب تدفق الدم.

Figure 1
الشكل 1: إعداد نافذة وعاء مفتوحة لتصوير IVM في الفأر . (أ) إعداد الأدوات والأدوات اللازمة للجراحة. (ب) تم الكشف عن الثور الأيسر عن طريق نهج جانبي وبطني. (ج) تعرضت القوقعة بعد إزالة البولا. (د) صورة مكبرة للقوقعة، من الدائرة في (C). (ه) تم إنشاء نافذة وعاء مفتوحة عند المنعطف العلوي الأوسط للجدار الجانبي للقوقعة الصناعية (الصندوق). (F و G) التسريب الوريدي ل FITC-dextran وخلايا الدم المصنفة من خلال الوريد الصافن. الاختصارات: OW = نافذة بيضاوية ؛ RW = نافذة مستديرة; IVM = المجهر داخل الحيوية. FITC = الفلوريسين إيزوثيوسيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور تمثيلية للشعيرات الدموية القوقعية في الجدار الجانبي. (أ) خلايا الدم الموسومة بعلامة ديل (حمراء ، سهم) في الأوعية الرعوية الموسومة ب FITC-dextran (أخضر). (ب) خلايا الدم الموسومة ب DiO (خضراء) في أوعية الأربطة الحلزونية الموسومة ب FITC-dextran (الأسهم ، الأخضر). لاحظ أن الأوعية متفرقة. (ج) خلايا الدم الموسومة ب DiO (الخضراء) في الأوعية الأذينية الموسومة ب FITC-dextran (الأخضر). لاحظ أن الأوعية أكثر كثافة. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر. الاختصارات: ديل = 1،1-ديوكتاديسيل-3،3،3،3-رباعي ميثيل إندوكرابوسيانين بيركلورات; DiO = 3, 3′-ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانين بيركلورات; FITC = الفلوريسين إيزوثيوسيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التغير في قطر الوعاء في ستريا بعد أسبوعين من التعرض للضوضاء. (A و B) صور تمثيلية للدورة الدموية بعد وضع العلامات على الأوعية باستخدام FITC-dextran (أخضر) وخلايا الدم مع DiO (أخضر) في مجموعات التحكم والتعرض للضوضاء (NE) مع IVM عالي الدقة. (ج) متوسط قطر السفينة المحسوب للمجموعات الضابطة ومجموعات NE. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، تم تقليل قطر السفينة في المجموعة المعرضة للضوضاء. (n = 18 ، t (34) = 2.880 ، ** p = 0.007 ، اختبار t للطالب ، متوسط الانحراف المعياري ±[SD]). (د) تباين قطر السفينة في المجموعات الضابطة والمجموعات NE. اختلف قطر الوعاء في مجموعة NE أكثر بكثير من المجموعة الضابطة. (n = 6 ، t (10) = 6.630 ، **** p < 0.0001 ، اختبار t للطالب ، متوسط ± SD). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. الاختصارات: DiO = 3 ، 3 ′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate; FITC = الفلوريسين إيزوثيوسيانات. IVM = المجهر داخل الحيوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تغيرات تدفق الدم في المخطط بعد أسبوعين من التعرض للضوضاء. (A و B) تظهر الصور التمثيلية مسارات التتبع (الخطوط الحمراء والخضراء والزرقاء) لخلايا الدم التي تحمل علامة DiO (الخضراء) لقياس سرعة تدفق الدم في المجموعات الضابطة والمجموعات المعرضة للضوضاء. (جيم ودال) تم حساب سرعة تدفق الدم (μm / s) ومعدل التدفق الحجمي (μm3 / s) على التوالي للمجموعات الضابطة والمعرضة للضوضاء. كان معدل تدفق الدم ومعدل التدفق الحجمي في المجموعة المعرضة للضوضاء أقل مما كان عليه في المجموعة الضابطة (n = 54,t السرعة (106) = 19.705 ، **** pالسرعة < 0.0001; t volume (106) = 15.342, ****pvolume < 0.0001, Student's t-test, mean ± standard deviation). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. الاختصارات: DiO = 3 ، 3 ′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate1 ؛ FITC = الفلوريسين إيزوثيوسيانات. NE 2W = التعرض للضوضاء لمدة أسبوعين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي 1: الأوعية الدموية لكل من الرباط الحلزوني والأوعية الدموية المخططة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو. 

فيديو تكميلي 2: تتبع مسارات خلايا الدم التي تحمل علامة DiOلحساب سرعات تدفق الدم في التحكم. الاختصارات: DiO = 3 ، 3 ′-ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانين بيركلورات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه الورقة كيف يمكن تصور الشعيرات الدموية في الجدار الجانبي للقوقعة الصناعية (وفي ستريا والأوعية الدموية) لنموذج الفأر مع وضع العلامات الفلوروفورية في إعداد نافذة وعاء مفتوح تحت نظام FIVM. يستخدم نموذج الماوس على نطاق واسع ويفضل كنموذج للثدييات للتحقيق في صحة الإنسان ومرضه. البروتوكول الموصوف هنا هو نهج عملي لتصوير وفحص CoBF في الجدار الجانبي للفأر (خاصة في الأوعية الدموية المخططة) باستخدام نافذة وعاء مفتوحة تحت نظام FIVM توفر الطريقة دقة كافية لتحديد سرعة تدفق الدم وحجمه باستخدام خلايا الدم الموسومة بالتألق كمقتفي (كما هو موضح في الشكل 3 والشكل 4 ). يمكن استخدام هذا النهج للعديد من التطبيقات المختلفة ، مثل تقييم نفاذية الأوعية الدموية وفحص انقباض pericyte ، وتتبع هجرة خلايا نخاع العظم المتداولة25. يمكن أيضا مراقبة التغيرات الحادة في CoBF استجابة للصدمة أو العدوى أو الضوضاء أو الأجسام الغريبة أو الأدوية السامة للأذن أو غيرها من العوامل التي تؤثر على الجدار الجانبي في الوقت الفعلي25,29.
 
في العقود الماضية ، تم إنشاء العديد من الطرق غير الغازية نسبيا لتقييم CoBF دون إزالة الجدار العظمي للقوقعة الصناعية ، بما في ذلك LDF و MRI و OMAG و LSI بالمنظار و FME بالمنظار وحقن الميكروسفير في بلازما الدم. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام أي من هذه الأساليب لتقييم معدل التدفق المطلق في السفن الفردية. على سبيل المثال، لا يمكن استخدام FME بالمنظار غير الغازي إلا لتصوير مناطق محدودة بالقرب من النافذة المستديرة ولكن ليس لتدفق الدم في الأوعية الدموية المخططة.  ومع ذلك ، فإن الدورة الدموية في الأوعية الدموية المخططة لها أدوار حاسمة في الحفاظ على EP ، ونقل الأيونات ، وتوازن السائل اللمفاوي الداخلي ، وكلها ضرورية لحساسية السمع (Zhang et al.، 2021). OMAG مفيد أيضا لتصور تدفق الدم في القوقعة السليمة ، ومع ذلك ، فإن الدقة ضعيفة للغاية لتصوير الشعيرات الدموية الفردية في الأوعية الدموية stria لنموذج الماوس19.

تتيح نافذة الأوعية المفتوحة ، بالاقتران مع FIVM ، التصور في الوقت الفعلي لتدفق الدم في الجدار الجانبي للقوقعة الصناعية وقياس قطر الأوعية الدموية وسرعة تدفق الدم في المناطق المسجلة. يتمتع نظام IVM بالعديد من المزايا مقارنة بالطرق الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن وضع الحيوان بشكل ملائم والتلاعب به حسب الحاجة. هناك مرونة لضبط تباين البلازما وخلايا الدم ذات العلامات الفلورية لتحسين تصور بنية الأوعية الدموية وتسليط الضوء على الهياكل ذات الصلة. يمكن أيضا اختيار الأوزان الجزيئية المختلفة لأجهزة التتبع المترافقة مع FITC لتحسين تقييم نفاذية الأوعية الدموية. (ه) اختيار ما إذا كان ينبغي استخدام Dil (lex = 550 nm؛ lem = 564 nm) أو Dio (lex = 484 nm؛ lem = 501 nm) لتسمية خلايا الدم، على عكس FITC-dextran المستخدم لتسمية البلازما، يتم تحديده من خلال أهداف التجربة. بشكل عام ، يوفر Dil تباينا أفضل لتصور تجويف الأوعية الدموية وخلايا الدم الفردية ، في حين يفضل Dio عند استخدام التصوير المتزامن لتصور خلايا الدم والتجويف في نفس قناة الاكتساب. ما هو أكثر من ذلك ، من الأفضل إنجاز التتبع مع عدد صغير من الخلايا المصنفة لأن تألق خلايا الدم سوف يخفي تألق تجويف الوعاء إذا تم تصنيف جميع خلايا الدم في الوعاءعلى أنها 21. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر للحد من كمية المحلول الذي يتم إعطاؤه للدم ، لتقليل تغيرات تدفق الدم المرتبطة بالتخفيف واللزوجة في القوقعة30.

بشكل عام ، هذه الطريقة قوية ويمكن استخدامها للتحقيق في التغيرات الهيكلية والوظيفية في CoBF في ظل الظروف الطبيعية والمرضية مثل الالتهاب والضوضاء والشيخوخة. الأهم من ذلك ، يمكن الحفاظ على EP ثابت وطبيعي أثناء الجراحة ، مما يشير إلى أن الإجراء غير ضار بوظيفة القوقعة الصناعية عند إجرائه بعناية كافية25. ومع ذلك ، فإن الإنشاء الناجح لنافذة السفينة المفتوحة يتطلب درجة عالية من المهارة الجراحية. على سبيل المثال، يجب توخي الحذر في إزالة عظم الجدار الجانبي للقوقعة الصناعية لمنع فقدان السائل حول اللمفاوي والإصابة الدقيقة للطبقة الخارجية من الرباط الحلزوني القوقعي. هذه يمكن أن تؤثر سلبا على توازن القوقعة الصناعية وتعرض التصوير للخطر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من قبل NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi) ، NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi) ، NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) ، ومؤسسة البحوث الطبية من جامعة أوريغون للصحة والعلوم (OHSU) (X.Shi).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Hospira NDC 0409-1966-02 0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma Aldrich 468495 20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate Sigma Aldrich D4292 20 µM
CODA Monitor system Kent scientific CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip Fisher Scientific 12-542A
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fiji/ImageJ NIH Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa) Sigma Aldrich FD2000s 40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV Mylan NDC 67457-374-12 5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL) Henry Schein NDC 11695-0702-1 0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective Mitutoyo 378-823-5 Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera Hamamatsu Model: C4742-80-12AG
PBS Gibco 2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) Lloyd LPFL04821 0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope Olympus Model: SZ61, fluorescent microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
  2. Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
  3. Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
  4. Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
  5. Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
  6. Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
  7. Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
  8. Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
  9. Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , Thieme Medical Publishers. 242-250 (2012).
  10. Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
  11. Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
  12. Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
  13. Le Floc'h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
  14. Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
  15. Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
  16. Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
  17. Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
  18. Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
  19. Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
  20. Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
  21. Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
  22. Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
  23. Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
  24. Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
  25. Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
  26. Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
  27. Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
  28. Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
  29. Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
  30. Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).

Tags

الطب، العدد 175، الماوس، تدفق الدم القوقعة، المجهر الفلوري داخل الحيوية، خلايا الدم الفلورية الموسومة، نافذة الأوعية المفتوحة، سرعة تدفق الدم، حجم الدم
قياس تدفق الدم الغريلي في قوقعة الفئران باستخدام نافذة الأوعية المفتوحة والمجهر الفلوري داخل الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hou, Z., Zhang, Y., Neng, L., Zhang, … More

Hou, Z., Zhang, Y., Neng, L., Zhang, J., Shi, X. Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (175), e61857, doi:10.3791/61857 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter