Summary
Ein offener Gefäßfensteransatz mit fluoreszierenden Tracern bietet eine ausreichende Auflösung für die Messung des Cochlea-Blutflusses (CoBF). Die Methode erleichtert die Untersuchung struktureller und funktioneller Veränderungen von CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen.
Abstract
Die Schalltransduktion ist metabolisch anspruchsvoll, und die normale Funktion der Mikrovaskulatur in der Seitenwand ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des endocochleären Potenzials, des Ionentransports und des Flüssigkeitshaushalts. Es wird berichtet, dass verschiedene Formen von Hörstörungen eine abnormale Mikrozirkulation in der Cochlea beinhalten. Die Untersuchung, wie sich die Pathologie des Cochlea-Blutflusses (CoBF) auf die Hörfunktion auswirkt, ist aufgrund des Mangels an praktikablen Abfragemethoden und des schwierigen Zugangs zum Innenohr eine Herausforderung. Ein offenes Gefäßfenster in der lateralen Cochlea-Wand, kombiniert mit intravitaler Fluoreszenzmikroskopie, wurde zur Untersuchung von CoBF-Veränderungen in vivo verwendet, hauptsächlich jedoch bei Meerschweinchen und erst kürzlich in der Maus. Dieser Artikel und das zugehörige Video beschreiben die offene Gefäßfenstermethode zur Visualisierung des Blutflusses in der Maus-Cochlea. Zu den Details gehören 1) Herstellung der fluoreszenzmarkierten Blutzellsuspension von Mäusen; 2) Konstruktion eines offenen Gefäßfensters für die intravitale Mikroskopie in einer anästhesierten Maus und 3) Messung der Blutflussgeschwindigkeit und des Blutvolumens mittels einer Offline-Aufzeichnung der Bildgebung. Die Methode wird im Videoformat präsentiert, um zu zeigen, wie der Open-Window-Ansatz in der Maus verwendet werden kann, um strukturelle und funktionelle Veränderungen in der Cochlea-Mikrozirkulation unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.
Introduction
Die normale Funktion der Mikrozirkulation in der lateralen Cochlea-Wand (die den Großteil der Kapillaren im Spiralband und in der Stria vascularis umfasst) ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Hörfunktion1. Abnorme CoBF ist an der Pathophysiologie vieler Innenohrerkrankungen beteiligt, einschließlich lärmbedingtem Hörverlust, Ohrhydrops und Presbyakusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Die Visualisierung der intravitalen CoBF ermöglicht ein besseres Verständnis der Zusammenhänge zwischen Hörfunktion und cochlea-vaskulärer Pathologie.
Obwohl die Komplexität und Lage der Cochlea im Schläfenbein eine direkte Visualisierung und Messung von CoBF ausschließt, wurden verschiedene Methoden zur Beurteilung von CoBF entwickelt, darunter Laser-Doppler-Durchflussmessung (LDF)10,11,12, Magnetresonanztomographie (MRT)13, intravitale Fluoreszenzmikroskopie (FIVM)14, Fluoreszenzmikroskopie (FME)15, endoskopische Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI)16 und Ansätze, die auf der Injektion markierter Marker und radioaktiv markierter Mikrosphären in den Blutkreislauf basieren (optische Mikroangiographie, OMAG)17,18,19,20. Keine dieser Methoden hat jedoch eine absolute Echtzeitverfolgung von Änderungen in CoBF in vivo ermöglicht, mit Ausnahme von FIVM. FIVM, in Kombination mit einem Gefäßfenster in der lateralen Cochlea-Wand, ist ein Ansatz, der bei Meerschweinchen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen von verschiedenen Laboratorien verwendet und validiert wurde 14,21,22.
Eine FIVM-Methode wurde erfolgreich etabliert, um die strukturellen und funktionellen Veränderungen in der Cochlea-Mikrozirkulation in der Maus unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran als Kontrastmittel und einem Fluoreszenzfarbstoff zu untersuchen - entweder DiO (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat, grün) oder Dil (1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyaninperchlorat, rot) - zur Vormarkierung von Blutzellen, zur Visualisierung von Gefäßen und zur Verfolgung der Blutflussgeschwindigkeit. In der vorliegenden Studie wurde das Protokoll dieser Methode zur Bildgebung und Quantifizierung von Veränderungen der CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen (z. B. nach Lärmexposition) beschrieben. Diese Technik gibt dem Forscher die notwendigen Werkzeuge an die Hand, um die zugrunde liegenden Mechanismen von CoBF im Zusammenhang mit Hörstörungen und Pathologie in der Stria vascularis zu untersuchen, insbesondere wenn sie in Verbindung mit leicht verfügbaren transgenen Mausmodellen angewendet werden.
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Protocol
HINWEIS: Dies ist eine Operation ohne Überleben. Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oregon Health & Science University überprüft und genehmigt (IACUC-Zulassungsnummer: TR01_IP00000968).
1. Vorbereitung der fluoreszenzmarkierten Blutzellen
- Betäuben Sie die Spendermäuse (männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von ~6 Wochen) mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von Ketamin / Xylazin-Anästhesielösung (5 ml / kg, siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Dieses Anästhesieprotokoll ist sehr zuverlässig und hält den systemischen Blutdruck aufrecht. - Legen Sie die Maus auf den Rücken, öffnen Sie die Haut und legen Sie die Brusthöhle mit einer Pinzette und einer Sezierschere frei. Schneiden Sie das Zwerchfell auf, greifen Sie mit einer Klemmschere an der Basis des Brustbeins, schneiden Sie durch den Brustkorb und heben Sie es an, um das Herz freizulegen. Sammeln Sie 1 ml Blut in Heparin (15 IE / ml Blut) durch Herzpunktion und zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 3 min bei 4 ° C. Euthanasieren Sie die Maus durch zervikale Dislokation nach der Blutentnahme.
- Entfernen Sie das Plasma, waschen Sie das Blutzellenpellet mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und zentrifugieren Sie 3x bei 3000 × g für 3 min bei 4 °C.
- Beschriften Sie die Blutzellen mit 1 ml 20 mM DiO oder Dil in PBS und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur23,24.
- Zentrifugieren und waschen Sie die markierten Blutzellen mit 1 ml PBS, zentrifugieren Sie 3x bei 3000 × g für 3 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 30% Hämatokrit mit ~0,9 ml PBS (Endvolumen ~ 1,3 ml) vor der Injektion.
2. Operation zur Schaffung eines offenen Fensters 25
- Bereiten Sie die sterilen chirurgischen Instrumente und die Bildgebungsplattform vor, und legen Sie ein Heizkissen unter den Vorhang (Abbildung 1A). Betäuben Sie die Mäuse (männliche C57BL / 6J-Mäuse im Alter von ~ 6 Wochen) wie in Schritt 1.1 beschrieben und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pfotenreflex und den allgemeinen Muskeltonus überwachen. Legen Sie das Tier auf das warme Heizkissen und halten Sie die Rektaltemperatur bei 37 °C.
- Legen Sie den Tierschwanz in das CODATM-Überwachungssystem zur Überwachung von Blutdruck und Herzschlag (siehe Materialtabelle). Zeichnen Sie den systolischen Blutdruck, den diastolischen Blutdruck und den mittleren Blutdruck (MBP) des Tieres im anästhesierten Zustand auf.
HINWEIS: Es ist kein Unterschied bei der tierischen MBP im anästhesierten und nicht anästhesierten Zustand zu sehen (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). Die Herzfrequenz des Tieres ist unter Narkose stabil, wenn auch niedriger (immer noch im normalen Bereich) als im nicht betäubten Zustand (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). Ein leicht erhöhter Herzschlag sollte bei Tieren in Fesselhaltung26 erwartet werden. - Öffnen Sie die linke Paukenbulle über einen lateralen und ventralen Zugang unter einem Stereomikroskop (siehe Materialtabelle), wobei das Trommelfell und die Gehörknöchelchen intakt bleiben21.
- Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres, wobei der Kopf immobilisiert und positioniert ist, um die Bewegung zu minimieren (Abbildung 1B). Entfernen Sie die linke Unterkieferdrüse und den hinteren Bauch des Digastriummuskels und kauterisieren.
HINWEIS: Unterkutan injizieren Sie Buprenorphin in 0,05 mg/kg, um die Schmerzen während der Operation zu reduzieren. - Lokalisieren und exponieren Sie die knöcherne Bulle, indem Sie den sternocleidomastoideus Muskel und den Gesichtsnerv identifizieren, die sich vor der Bulle erstrecken.
- Öffnen Sie die knöcherne Bulle mit einer 30-G-Nadel und entfernen Sie den umgebenden Knochen vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette, um eine klare Sicht auf die Cochlea und die Arteria stapedialis zu ermöglichen, deren medialer Rand über dem Rand der runden Fensternische liegt und anterior superior zum ovalen Fenster führt (Abbildung 1C, D).
HINWEIS: Die Tracheotomie wird durchgeführt, um die Atemwege ungehindert zu halten, und sollte nur durchgeführt werden, wenn das Tier während der Operation ein Atemproblem hat. Im Allgemeinen haben die meisten Tiere unter Narkose eine glatte Atmung. Wenn Tiere jedoch während der Operation eine Tracheotomie erhielten, sollte der aufgezeichnete Blutfluss nicht für einen Vergleich verwendet werden.
- Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres, wobei der Kopf immobilisiert und positioniert ist, um die Bewegung zu minimieren (Abbildung 1B). Entfernen Sie die linke Unterkieferdrüse und den hinteren Bauch des Digastriummuskels und kauterisieren.
- Verwenden Sie eine kleine Messerklinge (speziell gefrästes #16-Skalpell), um den seitlichen Wandknochen an der Apex-Mitteldrehung der Maus-Cochlea, etwa 1,25 mm von der Spitze entfernt, abzukratzen, bis eine dünne Stelle gerissen ist. Entfernen Sie die Knochenspäne mit kleinen Drahthaken (Abbildung 1E).
- Decken Sie das Gefäßfenster mit einem geschnittenen Deckglas ab, um normale physiologische Bedingungen zu erhalten, und bieten Sie eine optische Ansicht für die Aufnahme von Gefäßbildern.
HINWEIS: Alle Verfahren sind mit Vorsicht durchzuführen. Neben der Überwachung der Körpertemperatur sollten auch die Vitalfunktionen des Tieres, einschließlich Blutdruck und Herzschlag, während der gesamten Operation überwacht werden.
3. Bildgebung von CoBF unter FIVM
- Machen Sie einen ~1 cm langen Schnitt entlang der rechten Vena saphena, um das Gefäß freizulegen (Abbildung 1F).
- 100 μL der FITC-Dextran-Lösung (2000 kDa, 40 mg/ml in PBS) und 100 μL einer Blutzellsuspension (30% Hämatokrit) nacheinander durch die Stammvene in das Tier infundiert werden (Abbildung 1G), um die Visualisierung der Blutgefäße und die Verfolgung der Blutflussgeschwindigkeit zu ermöglichen.
- Beobachten Sie den Blutfluss in Echtzeit direkt auf einem Videomonitor 5 Minuten nach der Injektion. Abbildung der Blutgefäße mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand (B.D. 30,5 mm, 10x, 0,26 numerische Apertur) und einem Lampengehäuse mit einem Mehrband-Anregungsfilter und einem kompatiblen Emissionsfilter (Table of Materials) ausgestattet ist. Nehmen Sie das Video mit einer hochauflösenden digitalen Schwarzweißkamera (Table of Materials) mit 2 Bildern / s auf. Erfassen Sie mehr als 350 Bilder pro Video, um eine erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten.
HINWEIS: Blutgefäße sowohl des Spiralbandes als auch der Stria vascularis können durch Einstellen des optischen Fokus abgebildet werden (Supplemental Video 1).
4. Videoanalyse
- Messen Sie den Gefäßdurchmesser mit einer geeigneten Software (Table of Materials) und bestimmen Sie den Abstand zwischen zwei festen Punkten über das Gefäß in den aufgenommenen Bildern.
- Berechnen Sie die Blutflussgeschwindigkeit aus aufgenommenen Videobildern, indem Sie die Bewegung markierter Blutzellen in der räumlichen Entfernung zwischen Bildpositionenverfolgen 27.
- Öffnen Sie das Video des Blutflusses in der Software (Fidschi [ImageJ] wurde in diesem Protokoll verwendet) und stellen Sie die Skala der Bilder ein.
- Verfolgen Sie die ausgewählten DiO-gefärbten Blutzellen mit der Tracking-Funktion. Verwenden Sie die Entfernung, die sich die Zellen bewegt haben, und das Zeitintervall zwischen den Bildbildern im Video zur automatischen Berechnung der Strömungsgeschwindigkeit.
- Berechnen Sie den Volumenstrom (F) nach folgender Gleichung: F = V × A. (V: Geschwindigkeit; A: Querschnittsfläche des Schiffes).
5. Lärmbelastung
- Setzen Sie die Tiere in Maschendrahtkäfige. Setzen Sie sie Breitbandrauschen bei 120 dB Schalldruckpegel in einer Schallexpositionskabine für 3 h und für weitere 3 h am nächsten Tag aus.
HINWEIS: Dieses Lärmexpositionsregime, das routinemäßig in diesem Labor angewendet wird, führt zu einem dauerhaften Verlust der Cochlea-Empfindlichkeit28.
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Representative Results
Nach chirurgischer Exposition der Cochlea-Kapillaren in der Seitenwand (Abbildung 1) war eine intravitale hochauflösende fluoreszenzmikroskopische Beobachtung von Dil-markierten Blutzellen in FITC-Dextran-markierten Gefäßen durch ein offenes Gefäßfenster möglich. Abbildung 2A ist ein repräsentatives Bild, das unter FIVM aufgenommen wurde und die Kapillaren der Cochlea-Apex-Middle Turn Seitenwand der Maus zeigt. Die Lumina dieser Gefäße wird durch die Fluoreszenz von FITC-Dextran gemischt mit Plasma sichtbar gemacht. Auch einzeln markierte Blutzellen, die im Gefäßnetzwerk verteilt sind, sind in diesem Bild deutlich sichtbar. Zwei verschiedene Netzwerke - Kapillaren des Spiralbandes und Kapillaren der Striaa vascularis - unterscheiden sich durch ihre Lage (unter einem aufrechten Mikroskop verläuft die Striaa vascularis optisch unter dem Spiralband und enthält mehr Kapillarschleifen und kleinere Gefäße25). Beide können mit Anpassung des optischen Fokus auf den Blutfluss beurteilt werden. Wie in Abbildung 2B, C dargestellt, ist die Gefäßdichte des Spiralbandes spärlicher als die der Striaa vascularis.
Die vaskuläre Funktion im rauschexponierten Mausmodell wurde mit der vaskulären Funktion in der Kontrollgruppe verglichen. Die CoBF-Messung wurde 2 Wochen nach der Lärmexposition durchgeführt. Abbildung 3A,B sind repräsentative Bilder, die die Strömungsmuster in Kontroll- und lärmexponierten Gruppen zeigen. Ein gestörtes Muster des Blutflusses wurde in der lärmexponierten Gruppe beobachtet (Abbildung 3B). Zu den Anomalien gehörten ein reduzierter Gefäßdurchmesser (Abbildung 3C) und eine erhöhte Variation des Gefäßdurchmessers (Abbildung 3D). Wie in Abbildung 4A,B dargestellt, wurden die Blutflussgeschwindigkeiten in den Kontroll- und lärmexponierten Gruppen berechnet, indem die Routen der DiO-markierten Blutzellen verfolgt wurden (ergänzendes Video 2). Die Ergebnisse zeigen, dass Blutgeschwindigkeit und -volumen in der lärmexponierten Gruppe signifikant niedriger waren als in der Kontrollgruppe (Abbildung 4C, D). Diese Daten deuten darauf hin, dass laute Geräusche die Durchblutung erheblich beeinträchtigen und einen verminderten und gestörten Blutfluss verursachen.
Abbildung 1: Vorbereitung eines offenen Gefäßfensters für die IVM-Bildgebung in der Maus . (A) Vorbereitung von Instrumenten und Werkzeugen für die Operation. (B) Die linke Bulle wurde über einen lateralen und ventralen Zugang freigelegt. (C) Die Cochlea wurde nach dem Entfernen der Bulle freigelegt. (D) Vergrößertes Bild der Cochlea aus dem Kreis in (C). (E) An der Scheitel-Mitteldrehung der Cochlea-Seitenwand (Box) wurde ein offenes Gefäßfenster geschaffen. (F und G) Intravenöse Infusion von FITC-Dextran und markierten Blutzellen durch die Vena saphena. Abkürzungen: OW = ovales Fenster; RW = rundes Fenster; IVM = intravitale Mikroskopie; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Aufnahmen von Cochlea-Kapillaren in der Seitenwand . (A) Dil-markierte Blutzellen (rot, Pfeil) in strischen Gefäßen, die mit FITC-Dextran (grün) markiert sind. (B) DiO-markierte Blutzellen (grün) in Spiralbandgefäßen, die mit FITC-Dextran markiert sind (Pfeile, grün). Beachten Sie, dass die Schiffe spärlich sind. (C) DiO-markierte Blutzellen (grün) in strischen Gefäßen, die mit FITC-Dextran (grün) markiert sind. Beachten Sie, dass die Gefäße dichter sind. Maßstabsbalken: 50 μm und 100 μm. Abkürzungen: Dil = 1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyaninperchlorat; DiO = 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Veränderung des Gefäßdurchmessers in der Stria zwei Wochen nach Lärmexposition. (A und B) Repräsentative Bilder der Blutzirkulation nach Markierung von Gefäßen mit FITC-Dextran (grün) und Blutzellen mit DiO (grün) in Kontroll- und lärmexponierten (NE) Gruppen mit hochauflösender IVM. (C) Mittlerer Gefäßdurchmesser, berechnet für Kontroll- und NE-Gruppen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war der Gefäßdurchmesser in der lärmexponierten Gruppe reduziert. (n = 18, t (34) = 2,880, **p = 0,007, Student's t-Test, Mittelwert ± Standardabweichung [SD]). (D) Varianz des Behälterdurchmessers in Kontroll- und NE-Gruppen. Der Gefäßdurchmesser variierte in der NE-Gruppe viel stärker als in der Kontrollgruppe. (n = 6, t (10) = 6,630, ****p < 0,0001, Student's t-Test, Mittelwert ± SD). Maßstabsbalken: 100 μm. Abkürzungen: DiO = 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; IVM = intravitale Mikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Blutflussveränderungen in der Stria zwei Wochen nach Lärmbelastung. (A und B) Repräsentative Bilder zeigen die Tracking-Routen (rote, grüne und blaue Linien) von DiO-markierten Blutzellen (grün) zur Messung der Blutflussgeschwindigkeit in Kontroll- und lärmexponierten Gruppen. (C und D) Die Blutflussgeschwindigkeit (μm/s) und der Volumenstrom (μm3/s) wurden jeweils für Kontroll- und lärmexponierte Gruppen berechnet. Blutflussrate und Volumenstrom waren in der lärmexponierten Gruppe niedriger als in der Kontrollgruppe (n = 54,t Geschwindigkeit (106) = 19,705, ****pGeschwindigkeit < 0,0001; t-Volumen (106) = 15,342, ****p-Volumen < 0,0001, Student-t-Test, Mittelwert ± Standardabweichung). Maßstabsbalken: 100 μm. Abkürzungen: DiO = 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat1; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; NE 2W = zweiwöchige Lärmbelastung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzendes Video 1: Blutgefäße sowohl des Spiralbandes als auch der Stria vascularis. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 2: Verfolgung der Routen von DiO-markierten Blutzellenzur Berechnung der Blutflussgeschwindigkeiten in einem Kontrolltier. Abkürzungen: DiO = 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Diese Arbeit zeigt, wie Kapillaren in der Cochlea-Seitenwand (und in der Stria vascularis) eines Mausmodells mit Fluorophormarkierung in einer offenen Gefäßfensterpräparation unter einem FIVM-System sichtbar gemacht werden können. Das Mausmodell ist weit verbreitet und wird als Säugetiermodell zur Untersuchung der menschlichen Gesundheit und Krankheit bevorzugt. Das hier beschriebene Protokoll ist ein praktikabler Ansatz zur Bildgebung und Untersuchung von CoBF in der Mausseitenwand (insbesondere in der Striaa vascularis) unter Verwendung eines offenen Gefäßfensters unter FIVM-System Die Methode bietet eine ausreichende Auflösung zur Bestimmung der Blutflussgeschwindigkeit und des Blutvolumens unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Blutzellen als Tracer (wie in Abbildung 3 und Abbildung 4 gezeigt). ). Dieser Ansatz kann für verschiedene Anwendungen verwendet werden, wie z.B. die Beurteilung der vaskulären Permeabilität und die Untersuchung der Perizytenkontraktilität sowie die Verfolgung der zirkulierenden Knochenmarkzellmigration25. Akute Veränderungen des CoBF als Reaktion auf Trauma, Infektion, Lärm, Fremdkörper, ototoxische Medikamente oder andere Agenzien, die die Seitenwand beeinflussen, können ebenfalls in Echtzeit überwacht werden25,29.
In den vergangenen Jahrzehnten wurden mehrere relativ nicht-invasive Methoden zur Beurteilung von CoBF ohne Entfernung der Cochlea-Knochenwand etabliert, darunter LDF, MRT, OMAG, endoskopische LSCI, endoskopische FME und die Injektion von Mikrosphären in das Blutplasma. Keiner dieser Ansätze kann jedoch zur Bewertung der absoluten Durchflussrate in einzelnen Behältern verwendet werden. Zum Beispiel kann nicht-invasive endoskopische FME nur verwendet werden, um begrenzte Regionen in der Nähe des runden Fensters abzubilden, nicht aber den Blutfluss in der Stria vascularis. Die Blutzirkulation in der Stria vascularis spielt jedoch eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des EP, des Ionentransports und des endolymphatischen Flüssigkeitsgleichgewichts, die für die Hörempfindlichkeit unerlässlich sind (Zhang et al., 2021). OMAG ist auch nützlich für die Visualisierung des Blutflusses in der intakten Cochlea, jedoch ist die Auflösung zu schlecht, um einzelne Kapillaren in der Stria vascularis eines Mausmodells19 abzubilden.
Ein offenes Gefäßfenster in Verbindung mit einer FIVM ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung des Blutflusses in der Cochlea-Seitenwand und die Messung des Gefäßdurchmessers und der Blutflussgeschwindigkeit in den aufgezeichneten Regionen. Das IVM-System hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden. Zum Beispiel kann das Tier bequem positioniert und nach Bedarf manipuliert werden. Es besteht die Flexibilität, den Kontrast des fluoreszenzmarkierten Plasmas und der Blutzellen anzupassen, um die Visualisierung der vaskulären Architektur zu optimieren und relevante Strukturen hervorzuheben. Die unterschiedlichen Molekulargewichte von FITC-konjugierten Tracern können ebenfalls ausgewählt werden, um die Bewertung der vaskulären Permeabilität zu optimieren. e Die Wahl, ob Dil (lex = 550 nm; lem = 564 nm) oder Dio (lex = 484 nm; lem = 501 nm) zur Markierung der Blutzellen verwendet wird, im Gegensatz zu dem FITC-Dextran, das zur Markierung des Plasmas verwendet wird, wird durch die Versuchsziele bestimmt. Im Allgemeinen bietet Dil einen besseren Kontrast für die Visualisierung des Gefäßlumens und einzelner Blutzellen, während Dio bevorzugt wird, wenn simultane Bildgebung zur Visualisierung von Blutzellen und Lumen im selben Erfassungskanal verwendet wird. Darüber hinaus wird das Tracking am besten mit einer kleinen Anzahl markierter Zellen durchgeführt, da die Fluoreszenz der Blutzellen die Lumenfluoreszenz des Gefäßes maskiert, wenn alle Blutzellen im Gefäß mit21 markiert sind. Darüber hinaus sollte darauf geachtet werden, die Menge der dem Blut verabreichten Lösung zu begrenzen, um Verdünnungs- und viskositätsbedingte Durchblutungsänderungen in der Cochleazu minimieren 30.
Insgesamt ist diese Methode robust und kann zur Untersuchung struktureller und funktioneller Veränderungen von CoBF unter normalen und pathologischen Bedingungen wie Entzündungen, Lärm und Alterung verwendet werden. Wichtig ist, dass während der Operation eine konstante und normale EP aufrechterhalten werden kann, was darauf hinweist, dass das Verfahren für die Cochlea-Funktion harmlos ist, wenn es sorgfältig genug durchgeführt wird25. Die erfolgreiche Etablierung des offenen Gefäßfensters erfordert jedoch ein hohes Maß an chirurgischem Geschick. Zum Beispiel muss bei der Entfernung des Knochens der Cochlea-Seitenwand vorsichtig vorgegangen werden, um den Verlust von perilymphatischer Flüssigkeit und eine Mikroverletzung der äußeren Schicht des Cochlea-Spiralbandes zu verhindern. Diese könnten die Cochlea-Homöostase beeinträchtigen und die Bildgebung beeinträchtigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) und Medical Research Foundation der Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
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