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माउस कोक्लीआ में स्ट्रियल रक्त प्रवाह का मापन एक ओपन वेसल-विंडो और इंट्रावाइटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना

Published: September 21, 2021 doi: 10.3791/61857
Automatic Translation
1, 1, 1, , 1
1Oregon Hearing Research Center, Department of Otolaryngology/Head & Neck Surgery, Oregon Health & Science University

Summary

फ्लोरोसेंट ट्रेसर का उपयोग करके एक खुली पोत-खिड़की दृष्टिकोण कोक्लियर रक्त प्रवाह (सीओबीएफ) माप के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान करता है। विधि सामान्य और रोग स्थितियों के तहत माउस में सीओबीएफ में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करती है।

Abstract

ध्वनि का पारगमन चयापचय की मांग है, और पार्श्व दीवार में माइक्रोवास्कुलचर का सामान्य कार्य एंडोकोक्लियर क्षमता, आयन परिवहन और द्रव संतुलन बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। श्रवण विकारों के विभिन्न रूपों में कोक्लीआ में असामान्य माइक्रोसर्कुलेशन शामिल होने की सूचना है। कॉक्लियर रक्त प्रवाह (सीओबीएफ) विकृति सुनवाई समारोह को कैसे प्रभावित करती है, इसकी जांच व्यवहार्य पूछताछ विधियों की कमी और आंतरिक कान तक पहुंचने में कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण है। पार्श्व कॉक्लियर दीवार में एक खुली पोत-खिड़की, प्रतिदीप्ति इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त, विवो में सीओबीएफ परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए उपयोग की गई है, लेकिन ज्यादातर गिनी पिग में और हाल ही में माउस में। यह पेपर और संबंधित वीडियो माउस कोक्लीआ में रक्त प्रवाह की कल्पना करने के लिए खुले पोत-खिड़की विधि का वर्णन करते हैं। विवरण में 1) चूहों से फ्लोरोसेंट-लेबल रक्त कोशिका निलंबन की तैयारी शामिल है; 2) एक संवेदनाहारी माउस में इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के लिए एक खुली पोत-खिड़की का निर्माण, और 3) इमेजिंग की ऑफ़लाइन रिकॉर्डिंग का उपयोग करके रक्त प्रवाह वेग और मात्रा का माप। विधि को वीडियो प्रारूप में प्रस्तुत किया जाता है ताकि यह दिखाया जा सके कि सामान्य और रोग स्थितियों के तहत कॉक्लियर माइक्रोसर्कुलेशन में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों की जांच करने के लिए माउस में खुली खिड़की दृष्टिकोण का उपयोग कैसे किया जाए।

Introduction

पार्श्व कोक्लियर दीवार में माइक्रोसर्कुलेशन का सामान्य कार्य (सर्पिल स्नायुबंधन और स्ट्रिया संवहनी में अधिकांश केशिकाओं को शामिल करना) श्रवण समारोह1 को बनाए रखने के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। असामान्य सीओबीएफ शोर-प्रेरित सुनवाई हानि, कान हाइड्रोप्स और प्रेस्बिक्यूसिस 2,3,4,5,6,7,8,9 सहित कई आंतरिक कान विकारों के पैथोफिजियोलॉजी में फंसा हुआ है। इंट्रावाइटल सीओबीएफ का विज़ुअलाइज़ेशन श्रवण समारोह और कॉक्लियर संवहनी विकृति विज्ञान के बीच संबंधों की बेहतर समझ को सक्षम करेगा।

यद्यपि लौकिक हड्डी के भीतर कोक्लीआ की जटिलता और स्थान सीओबीएफ के प्रत्यक्ष दृश्य और माप को रोकता है, लेजर-डॉपलर फ्लोमेट्री (एलडीएफ) 10,11,12, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 13, प्रतिदीप्ति इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी (एफआईवीएम) 14, प्रतिदीप्ति माइक्रोएंडोस्कोपी (एफएमई) सहित सीओबीएफ के मूल्यांकन के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित किया गया है। , और रक्तप्रवाह में लेबल मार्करों और रेडियोधर्मी रूप से टैग किए गए माइक्रोस्फीयर के इंजेक्शन के आधार पर दृष्टिकोण (ऑप्टिकल माइक्रोएंजियोग्राफी, ओएमएजी) 17,18,19,20। हालांकि, इनमें से किसी भी विधि ने एफआईवीएम के अपवाद के साथ विवो में सीओबीएफ में परिवर्तनों की पूर्ण वास्तविक समय ट्रैकिंग को सक्षम नहीं किया है। एफआईवीएम, पार्श्व कॉक्लियर दीवार में एक पोत-खिड़की के साथ संयोजन में, एक दृष्टिकोण है जिसका उपयोग विभिन्न प्रयोगशालाओं14,21,22 द्वारा विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत गिनी पिग में किया गया है और मान्य किया गया है।

फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) -डेक्सट्रान का उपयोग करके माउस में कॉक्लियर माइक्रोसर्कुलेशन में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक एफआईवीएम विधि सफलतापूर्वक स्थापित की गई थी- एक विपरीत माध्यम और एक प्रतिदीप्ति डाई-या तो डीआईओ (3, 3'-डायोक्टाडेसिलोक्साकार्बोसायनिन परक्लोरेट, हरा) या दिल (1,1-डायोक्टाडेसिल -3,3,3,3)- वर्तमान अध्ययन में, इस पद्धति के प्रोटोकॉल को सामान्य और रोग स्थितियों (जैसे शोर जोखिम के बाद) के तहत माउस में सीओबीएफ में इमेजिंग और परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्णित किया गया है। यह तकनीक शोधकर्ता को स्ट्रिया संवहनी में श्रवण शिथिलता और विकृति विज्ञान से संबंधित सीओबीएफ के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए आवश्यक उपकरण देती है, खासकर जब आसानी से उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के साथ संयोजन के रूप में लागू किया जाता है।

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Protocol

नोट: यह एक गैर-उत्तरजीविता सर्जरी है। जानवरों के उपयोग से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी (आईएसीयूसी अनुमोदन संख्या: TR01_IP00000968) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. फ्लोरोसेंट-लेबल रक्त कोशिकाओं की तैयारी

  1. केटामाइन / ज़ाइलाज़िन संवेदनाहारी समाधान (5 एमएल / किग्रा, सामग्री की तालिका देखें) के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के साथ दाता चूहों (पुरुष सी 57 बीएल / 6 जे चूहों की आयु ~ 6 सप्ताह) को संवेदनाहारी करें।
    नोट: यह संज्ञाहरण प्रोटोकॉल बहुत विश्वसनीय है और प्रणालीगत रक्तचाप को बनाए रखता है।
  2. अपनी पीठ पर माउस रखो, त्वचा को खोलें और चिमटी और विदारक कैंची का उपयोग करके छाती गुहा का पर्दाफाश करें। डायाफ्राम को खोलें, क्लैंप कैंची का उपयोग करके उरोस्थि के आधार पर पकड़ें, रिबकेज के माध्यम से काटें और दिल को उजागर करने के लिए उठाएं। कार्डियक पंचर द्वारा हेपरिन (15 आईयू / एमएल रक्त) में 1 एमएल रक्त एकत्र करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। रक्त संग्रह के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु दें।
  3. प्लाज्मा निकालें, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 1 एमएल के साथ रक्त कोशिका गोली धो लें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 3000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र 3 एक्स।
  4. पीबीएस में 20 एमएम डीआईओ या दिल के 1 एमएल के साथ रक्त कोशिकाओं को लेबल करें, और कमरे के तापमान23,24 पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं।
  5. अपकेंद्रित्र और पीबीएस के 1 एमएल के साथ लेबल रक्त कोशिकाओं को धो लें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 3000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र 3 एक्स, और इंजेक्शन से पहले पीबीएस (अंतिम मात्रा ~ 1.3 एमएल) के ~ 0.9 एमएल के साथ 30% हेमटोक्रिट में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।

2. एक खुली खिड़की बनाने के लिए सर्जरी 25

  1. बाँझ सर्जिकल उपकरणों और इमेजिंग मंच तैयार करें, और पर्दे (चित्रा 1 ए) के नीचे एक हीटिंग पैड रखें। चूहों (पुरुष सी 57 बीएल / 6 जे चूहों की आयु ~ 6 सप्ताह) जैसा कि चरण 1.1 में वर्णित है, और पंजा पलटा और सामान्य मांसपेशी टोन की निगरानी करके संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। गर्म हीटिंग पैड पर जानवर रखें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर मलाशय के तापमान को बनाए रखें।
  2. रक्तचाप और दिल की धड़कन की निगरानी के लिए सीओडीएटीएम मॉनिटर सिस्टम में जानवरों की पूंछ रखें (सामग्री की तालिका देखें)। संवेदनाहारी स्थिति में जानवर के सिस्टोलिक रक्तचाप, डायस्टोलिक रक्तचाप और औसत रक्तचाप (एमबीपी) को रिकॉर्ड करें।
    नोट: पशु एमबीपी में संवेदनाहारी और अन-एनेस्थेटाइज्ड अवस्था (107 ± 11 मिमीएचजी बनाम 97 ± 7 मिमीएचजी) में कोई अंतर नहीं देखा जाता है। पशु हृदय गति संवेदनाहारी के तहत स्थिर है, हालांकि गैर-संवेदनाहारी स्थिति (357 ± 12 बीएमपी बनाम 709 ± 3 बीएमपी) की तुलना में कम (अभी भी सामान्य सीमा के भीतर)। संयम26 में रखे गए जानवरों में थोड़ी वृद्धि हुई दिल की धड़कन की उम्मीद की जानी चाहिए।
  3. स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत पार्श्व और उदर दृष्टिकोण के माध्यम से बाएं टाइम्पैनिक बुला को खोलें ( सामग्री की तालिका देखें), टिम्पैनिक झिल्ली और ओसिकल्स को बरकराररखते हुए 21.
    1. आंदोलन (चित्रा 1 बी) को कम करने के लिए अपने सिर को स्थिर और तैनात करने के साथ जानवर की गर्दन की मध्य रेखा के साथ एक चीरा बनाएं। डिगैस्ट्रिक मांसपेशियों के बाएं सबमैंडिबुलर ग्रंथि और पीछे के पेट को हटा दें और कॉटराइज़ करें।
      नोट: सर्जरी के दौरान दर्द को कम करने के लिए चमड़े के नीचे 0.05 मिलीग्राम / किग्रा पर ब्यूप्रेनोर्फिन इंजेक्ट करें।
    2. बुल्ला की ओर पूर्वकाल का विस्तार करने वाली स्टर्नोक्लिडोमास्टोइड मांसपेशियों और चेहरे की तंत्रिका की पहचान करके बोनी बुला का पता लगाएं और उजागर करें।
    3. 30 जी सुई के साथ बोनी बुला खोलें, और कोक्लीआ और स्टेपेडियल धमनी का स्पष्ट दृश्य प्रदान करने के लिए सर्जिकल चिमटी के साथ आसपास की हड्डी को सावधानीपूर्वक हटा दें, इसके औसत दर्जे का मार्जिन गोल खिड़की आला के किनारे पर झूठ बोल रहा है, और अंडाकार खिड़की (चित्रा 1 सी, डी) की ओर पूर्वकाल-बेहतर है।
      नोट: ट्रेकियोटॉमी वायुमार्ग को निर्बाध रखने के लिए किया जाता है और केवल तभी किया जाना चाहिए जब जानवर को सर्जरी के दौरान श्वसन संबंधी समस्या हो। सामान्य तौर पर, संज्ञाहरण के तहत अधिकांश जानवरों में चिकनी श्वास होती है। हालांकि, अगर जानवरों को सर्जरी के दौरान ट्रेकियोटॉमी प्राप्त हुई, तो रिकॉर्ड किए गए रक्त प्रवाह का उपयोग किसी भी तुलना के लिए नहीं किया जाना चाहिए।
  4. माउस कोक्लीआ के शीर्ष-मध्य मोड़ पर पार्श्व दीवार की हड्डी को खुरचने के लिए एक छोटे चाकू ब्लेड (कस्टम-मिल्ड # 16 स्केलपेल) का उपयोग करें, शीर्ष से लगभग 1.25 मिमी जब तक कि एक पतली जगह टूट न जाए। छोटे तार हुक (चित्रा 1 ई) के साथ हड्डी चिप्स निकालें।
  5. सामान्य शारीरिक स्थितियों को संरक्षित करने और पोत छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए एक ऑप्टिकल दृश्य प्रदान करने के लिए एक कट कवरस्लिप के साथ पोत-खिड़की को कवर करें।
    नोट: सभी प्रक्रियाओं को सावधानी के साथ किया जाना है। शरीर के तापमान की निगरानी के अलावा, रक्तचाप और दिल की धड़कन सहित जानवर के महत्वपूर्ण संकेतों की भी सर्जरी के दौरान निगरानी की जानी चाहिए।

3. एफआईवीएम के तहत सीओबीएफ की इमेजिंग

  1. पोत (चित्रा 1 एफ) को उजागर करने के लिए सही सैफेनस नस के साथ एक ~ 1 सेमी चीरा बनाएं।
  2. एफआईटीसी-डेक्सट्रान समाधान के 100 μL (पीबीएस में 2000 केडीए, 40 मिलीग्राम / एमएल) और रक्त कोशिका निलंबन (30% हेमटोक्रिट) के 100 μL को क्रमिक रूप से सैफेनस नस (चित्रा 1 जी) के माध्यम से जानवर में संक्रमित करें ताकि रक्त वाहिकाओं के दृश्य और रक्त प्रवाह वेग पर नज़र रखी जा सके।
  3. इंजेक्शन के 5 मिनट बाद एक वीडियो मॉनिटर पर सीधे वास्तविक समय में रक्त प्रवाह का निरीक्षण करें। एक लंबी काम दूरी (डब्ल्यूडी) उद्देश्य (डब्ल्यूडी 30.5 मिमी, 10x, 0.26 संख्यात्मक एपर्चर) और एक लैंप-हाउसिंग युक्त एक लंबी कामकाजी दूरी (डब्ल्यूडी) से लैस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रक्त वाहिकाओं की छवि बनाएं जिसमें कई बैंड उत्तेजना फिल्टर और संगत उत्सर्जन फिल्टर (सामग्री की तालिका)। एस पर एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिजिटल ब्लैक एंड व्हाइट चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके वीडियो रिकॉर्ड करें। प्रवाह वेग के सफल विश्लेषण को सुनिश्चित करने के लिए प्रति वीडियो 350 से अधिक छवियों का अधिग्रहण करें।
    नोट: सर्पिल स्नायुबंधन और स्ट्रिया संवहनी दोनों की रक्त वाहिकाओं को ऑप्टिकल फोकस (पूरक वीडियो 1) को समायोजित करके चित्रित किया जा सकता है।

4. वीडियो विश्लेषण

  1. उपयुक्त सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके पोत व्यास को मापें, और अधिग्रहित छवियों में पोत में दो निश्चित बिंदुओं के बीच की दूरी निर्धारित करें।
  2. छवि स्थानों के बीच स्थानिक दूरी में लेबल रक्त कोशिकाओं के आंदोलन का पता लगाकर कब्जा कर लिया वीडियो फ्रेम से रक्त प्रवाह वेगकी गणना 27.
    1. सॉफ्टवेयर में रक्त प्रवाह के वीडियो खोलें (फिजी [इमेजजे] का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया गया था), और छवियों के पैमाने को सेट करें।
    2. ट्रैकिंग फ़ंक्शन का उपयोग करके चयनित डीआईओ-दाग वाले रक्त कोशिकाओं को ट्रैक करें। दूरी कोशिकाओं ले जाया गया है और प्रवाह वेग की ऑटो गणना के लिए वीडियो में छवि फ्रेम के बीच समय के अंतराल का उपयोग करें।
  3. निम्नलिखित समीकरण के अनुसार वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह (एफ) की गणना करें: एफ = वी × ए( वी: वेग; ए: पोत का क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र)।

5. शोर एक्सपोजर

  1. जानवरों को तार जाल पिंजरों में रखें। उन्हें 3 घंटे के लिए एक ध्वनि एक्सपोजर बूथ में 120 डीबी ध्वनि दबाव स्तर पर ब्रॉडबैंड शोर के लिए उजागर करें और अगले दिन अतिरिक्त 3 घंटे के लिए।
    नोट: यह शोर जोखिम शासन, नियमित रूप से इस प्रयोगशाला में उपयोग किया जाता है, कोक्लियर संवेदनशीलता28 का स्थायी नुकसान पैदा करता है।

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Representative Results

पार्श्व दीवार (चित्रा 1) में कोक्लियर केशिकाओं के सर्जिकल एक्सपोजर के बाद, एफआईटीसी-डेक्सट्रान-लेबल वाले जहाजों में दिल-लेबल वाले रक्त कोशिकाओं के इंट्रावाइटल उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रतिदीप्ति सूक्ष्म अवलोकन एक खुली पोत-खिड़की के माध्यम से संभव था। चित्रा 2 ए एफआईवीएम के तहत ली गई एक प्रतिनिधि छवि है जो माउस कॉक्लियर एपेक्स-मिडिल टर्न लेटरल वॉल की केशिकाओं को दिखाती है। इन वाहिकाओं का ल्यूमिना प्लाज्मा के साथ मिश्रित एफआईटीसी-डेक्सट्रान के प्रतिदीप्ति द्वारा दिखाई देता है। संवहनी नेटवर्क में वितरित व्यक्तिगत रूप से लेबल की गई रक्त कोशिकाएं भी इस छवि में स्पष्ट रूप से दिखाई देती हैं। सर्पिल लिगामेंट के दो अलग-अलग नेटवर्क-केशिकाएं और स्ट्रिया संवहनी की केशिकाएं- स्थान से प्रतिष्ठित हैं (एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत, स्ट्रिया संवहनी सर्पिल स्नायुबंधन के नीचे ऑप्टिकल रूप से चलता है, और इसमें अधिक केशिका छोरों और छोटे जहाजों25 होते हैं)। ऑप्टिकल फोकस के समायोजन के साथ रक्त प्रवाह के लिए दोनों का मूल्यांकन किया जा सकता है। जैसा कि चित्रा 2 बी, सी में दिखाया गया है, सर्पिल स्नायुबंधन का पोत घनत्व स्ट्रिया संवहनी की तुलना में विरल है।

शोर-उजागर माउस मॉडल में संवहनी समारोह नियंत्रण समूह में संवहनी समारोह के साथ तुलना की गई थी। शोर जोखिम के 2 सप्ताह बाद सीओबीएफ माप लिया गया था। चित्रा 3 ए, बी नियंत्रण और शोर-उजागर समूहों में प्रवाह पैटर्न दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां हैं। रक्त प्रवाह का एक परेशान पैटर्न शोर उजागर समूह (चित्रा 3 बी) में देखा गया था। विसंगतियों में कम पोत व्यास (चित्रा 3 सी) और पोत व्यास (चित्रा 3 डी) में भिन्नता में वृद्धि शामिल है। जैसा कि चित्रा 4 ए, बी में सचित्र है, नियंत्रण और शोर-उजागर समूहों में रक्त प्रवाह वेग की गणना डीआईओ-लेबल रक्त कोशिकाओं (पूरक वीडियो 2) के मार्गों को ट्रैक करके की गई थी। परिणाम बताते हैं कि शोर-उजागर समूह में रक्त वेग और मात्रा नियंत्रण समूह (चित्रा 4 सी, डी) की तुलना में काफी कम थी। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि तेज आवाज विशेष रूप से रक्त परिसंचरण को प्रभावित करती है और रक्त प्रवाह को कम और परेशान करती है।

Figure 1
चित्रा 1: माउस में आईवीएम इमेजिंग के लिए एक खुली पोत-खिड़की की तैयारी। (ए) सर्जरी के लिए उपकरणों और उपकरणों की तैयारी। (बी) बाएं बुल्ला को पार्श्व और उदर दृष्टिकोण के माध्यम से उजागर किया गया था। (सी) बुला को हटाने के बाद कोक्लीआ को उजागर किया गया था। (डी) (सी) में सर्कल से कोक्लीआ की आवर्धित छवि। (ई) कोक्लियर पार्श्व दीवार (बॉक्स) के शीर्ष-मध्य मोड़ पर एक खुली पोत खिड़की बनाई गई थी। (एफ और जी) "एफआईटीसी-डेक्सट्रान का अंतःशिरा जलसेक और सैफेनस नस के माध्यम से रक्त कोशिकाओं को लेबल किया गया"." संक्षिप्त नाम: ओडब्ल्यू = अंडाकार खिड़की; आरडब्ल्यू = गोल खिड़की; आईवीएम = इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी; एफआईटीसी = फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पार्श्व दीवार में कॉक्लियर केशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां ( ए ) एफआईटीसी-डेक्सट्रान (हरे) के साथ लेबल किए गए स्ट्रियल वाहिकाओं में दिल-लेबल रक्त कोशिकाएं (लाल, तीर)। (बी) एफआईटीसी-डेक्सट्रान (तीर, हरा) के साथ लेबल किए गए सर्पिल स्नायुबंधन वाहिकाओं में डीआईओ-लेबल रक्त कोशिकाएं (हरा)। ध्यान दें कि जहाज विरल हैं। (सी) एफआईटीसी-डेक्सट्रान (हरा) के साथ लेबल किए गए स्ट्रियल वाहिकाओं में डीआईओ-लेबल रक्त कोशिकाएं (हरा)। ध्यान दें कि बर्तन सघन हैं। स्केल बार: 50 μm और 100 μm संक्षिप्त नाम: दिल = 1,1-डायोक्टाडेसिल-3,3,3,3-टेट्रामेथिलिंडोकार्बोसायनिन परक्लोरेट; डीआईओ = 3, 3'-डायक्टेडसिलॉक्साकार्बोसायनिन परक्लोरेट; एफआईटीसी = फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: शोर जोखिम के दो सप्ताह बाद स्ट्रिया में पोत व्यास में परिवर्तन ( ए और बी ) एफआईटीसी-डेक्सट्रान (हरा) और नियंत्रण में डीआईओ (हरा) के साथ रक्त कोशिकाओं और उच्च रिज़ॉल्यूशन आईवीएम के साथ शोर-उजागर (एनई) समूहों के साथ जहाजों को लेबल करने के बाद रक्त परिसंचरण की प्रतिनिधि छवियां। (सी) नियंत्रण और एनई समूहों के लिए गणना की गई मीनवेसल व्यास। नियंत्रण समूह की तुलना में, शोर-उजागर समूह में पोत व्यास कम हो गया था। (एन = 18, टी (34) = 2.880, ** पी = 0.007, छात्र का टी-टेस्ट, मानक विचलन [एसडी]) ± मतलब है। (डी) नियंत्रण और एनई समूहों में पोत व्यास का विचरण। पोत व्यास नियंत्रण समूह की तुलना में एनई समूह में बहुत अधिक भिन्न था। (एन = 6, टी (10) = 6.630, **** पी < 0.0001, छात्र का टी-टेस्ट, एसडी ± मतलब)। स्केल बार: 100 μm. संक्षिप्त नाम: डीआईओ = 3, 3'-डायोक्टेडैसिलॉक्साकार्बोसायनिन परक्लोरेट; एफआईटीसी = फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट; आईवीएम = इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: शोर जोखिम के दो सप्ताह बाद स्ट्रिया में रक्त प्रवाह में परिवर्तन (ए और बी) प्रतिनिधि छवियां नियंत्रण और शोर-उजागर समूहों में रक्त प्रवाह वेग माप के लिए डीआईओ-लेबल रक्त कोशिकाओं (हरे) के ट्रैकिंग मार्गों (लाल, हरे और नीली रेखाओं) को दिखाती हैं। (सी और डी) नियंत्रण और शोर-उजागर समूहों के लिए क्रमशः रक्त प्रवाह वेग (μm/s) और वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर (μm3/s) की गणना की गई थी। शोर-उजागर समूह में रक्त प्रवाह दर और वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर नियंत्रण समूह की तुलना में कम थी (एन = 54,टी वेग (106) = 19.705, **** पीवेग < 0.0001; टीवॉल्यूम (106) = 15.342, **** पीवॉल्यूम < 0.0001, छात्र का टी-टेस्ट, मानक विचलन ± मतलब)। स्केल बार: 100 μm. संक्षिप्त नाम: डीआईओ = 3, 3'-डायोक्टेडसिलॉक्साकार्बोसायनिन परक्लोरेट 1; एफआईटीसी = फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट; एनई 2 डब्ल्यू = दो सप्ताह का शोर जोखिम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो 1: सर्पिल स्नायुबंधन और स्ट्रिया संवहनी दोनों की रक्त वाहिकाएं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। 

पूरक वीडियो 2: एक नियंत्रण जानवर में रक्त प्रवाह वेग की गणना के लिए डीआईओ-लेबल रक्त कोशिकाओं के मार्गों पर नज़र रखना। संक्षिप्त नाम: डीआईओ = 3, 3'-डायक्टैडेसिलॉक्साकार्बोसायनिन परक्लोरेट। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह पेपर दर्शाता है कि माउस मॉडल की कॉक्लियर पार्श्व दीवार (और स्ट्रिया संवहनी में) में केशिकाओं को एफआईवीएम प्रणाली के तहत एक खुले पोत-खिड़की की तैयारी में फ्लोरोफोर लेबलिंग के साथ कैसे देखा जा सकता है। माउस मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और मानव स्वास्थ्य और बीमारी की जांच के लिए एक स्तनधारी मॉडल के रूप में पसंद किया जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एफआईवीएम प्रणाली के तहत एक खुली पोत-खिड़की का उपयोग करके माउस पार्श्व दीवार (विशेष रूप से स्ट्रिया संवहनी में) में सीओबीएफ की इमेजिंग और जांच के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण है विधि एक अनुरेखक के रूप में प्रतिदीप्ति-लेबल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करके रक्त प्रवाह वेग और मात्रा निर्धारित करने के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान करती है (जैसा कि चित्रा 3 और चित्रा 4 में दिखाया गया है) ). इस दृष्टिकोण का उपयोग कई अलग-अलग अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे संवहनी पारगम्यता का मूल्यांकन और पेरिसाइट सिकुड़न की परीक्षा, और परिसंचारी अस्थि मज्जा सेल माइग्रेशन25 पर नज़र रखना। आघात, संक्रमण, शोर, विदेशी निकायों, ओटोटॉक्सिक दवाओं, या पार्श्व दीवार को प्रभावित करने वाले अन्य एजेंटों के जवाब में सीओबीएफ में तीव्र परिवर्तन भी वास्तविक समय25,29 में निगरानी की जा सकती है।
 
पिछले दशकों में एलडीएफ, एमआरआई, ओएमएजी, एंडोस्कोपिक एलएससीआई, एंडोस्कोपिक एफएमई और रक्त प्लाज्मा में माइक्रोस्फीयर के इंजेक्शन सहित कोक्लियर बोनी दीवार को हटाए बिना सीओबीएफ का आकलन करने के लिए कई अपेक्षाकृत गैर-इनवेसिव तरीकों की स्थापना की गई थी। हालांकि, इनमें से किसी भी दृष्टिकोण का उपयोग व्यक्तिगत जहाजों में पूर्ण प्रवाह दर का मूल्यांकन करने के लिए नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, गैर-इनवेसिव एंडोस्कोपिक एफएमई का उपयोग केवल गोल खिड़की के पास सीमित क्षेत्रों की छवि के लिए किया जा सकता है, लेकिन स्ट्रिया संवहनी में रक्त प्रवाह नहीं।  हालांकि, स्ट्रिया संवहनी में रक्त परिसंचरण की ईपी, आयन परिवहन और एंडोलिम्फेटिक द्रव संतुलन को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका है, जो सुनवाई संवेदनशीलता (झांग एट अल। ओएमएजी बरकरार कोक्लीआ में रक्त प्रवाह के दृश्य के लिए भी उपयोगी है, हालांकि, माउस मॉडल19 के स्ट्रिया संवहनी में व्यक्तिगत केशिकाओं की इमेजिंग के लिए संकल्प बहुत खराब है।

एक खुली पोत-खिड़की, एक एफआईवीएम के साथ संयोजन के रूप में, कॉक्लियर पार्श्व दीवार में रक्त प्रवाह के वास्तविक समय के दृश्य और रिकॉर्ड किए गए क्षेत्रों में संवहनी व्यास और रक्त प्रवाह वेग के माप को सक्षम बनाती है। आईवीएम प्रणाली के अन्य तरीकों पर कई फायदे हैं। उदाहरण के लिए, जानवर को आवश्यकतानुसार आसानी से तैनात और हेरफेर किया जा सकता है। संवहनी वास्तुकला के दृश्य को अनुकूलित करने और प्रासंगिक संरचनाओं को उजागर करने के लिए प्रतिदीप्ति-लेबल प्लाज्मा और रक्त कोशिकाओं के विपरीत समायोजित करने के लिए लचीलापन है। संवहनी पारगम्यता के मूल्यांकन को अनुकूलित करने के लिए एफआईटीसी-संयुग्मित ट्रेसर के विभिन्न आणविक भार का भी चयन किया जा सकता है। ई प्लाज्मा को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एफआईटीसी-डेक्सट्रान के विपरीत रक्त कोशिकाओं को लेबल करने के लिए दिल (लेक्स = 550 एनएम; लेम = 564 एनएम) या डियो (लेक्स = 484 एनएम; लेम = 501 एनएम) का उपयोग करने का विकल्प प्रयोग लक्ष्यों द्वारा निर्धारित किया जाता है। सामान्य तौर पर, दिल पोत लुमेन और व्यक्तिगत रक्त कोशिकाओं के दृश्य के लिए बेहतर विपरीत प्रदान करता है, जबकि डियो को प्राथमिकता दी जाती है जब एक ही अधिग्रहण चैनल में रक्त कोशिकाओं और लुमेन के दृश्य के लिए एक साथ इमेजिंग का उपयोग किया जाता है। क्या अधिक है, ट्रैकिंग लेबल वाली कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के साथ सबसे अच्छी तरह से पूरा किया जाता है क्योंकि रक्त कोशिका प्रतिदीप्ति पोत लुमेन प्रतिदीप्ति को मुखौटा करेगी यदि पोत में सभी रक्त कोशिकाओं को21 लेबल किया जाता है। इसके अलावा, रक्त को प्रशासित समाधान की मात्रा को सीमित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, ताकि कोक्लीआ30 में कमजोर पड़ने और चिपचिपाहट से संबंधित रक्त प्रवाह परिवर्तन को कम किया जा सके।

कुल मिलाकर, यह विधि मजबूत है और इसका उपयोग सूजन, शोर और उम्र बढ़ने जैसी सामान्य और रोग स्थितियों के तहत सीओबीएफ में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों की जांच के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि सर्जरी के दौरान एक निरंतर और सामान्य ईपी बनाए रखा जा सकता है, यह दर्शाता है कि प्रक्रिया सावधानीपूर्वक पर्याप्त प्रदर्शन करने पर कोक्लियर फ़ंक्शन के लिए हानिरहित है25. हालांकि, खुले पोत-खिड़की की सफल स्थापना के लिए उच्च स्तर के सर्जिकल कौशल की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, कोक्लियर सर्पिल लिगामेंट की बाहरी परत पर पेरिलिम्फेटिक तरल पदार्थ और सूक्ष्म चोट के नुकसान को रोकने के लिए कोक्लियर पार्श्व दीवार की हड्डी को हटाने में देखभाल की जानी चाहिए। ये कोक्लियर होमियोस्टेसिस पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकते हैं और इमेजिंग से समझौता कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह शोध एनआईएच / एनआईडीसीडी आर 21 डीसी 016157 (एक्स.शी), एनआईएच / एनआईडीसीडी आर 01 डीसी 015781 (एक्स.शी), एनआईएच / एनआईडीसीडी आर 01-डीसी 010844 (एक्स.शी), और ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी (ओएचएसयू) (एक्स.शि) से मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Hospira NDC 0409-1966-02 0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma Aldrich 468495 20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate Sigma Aldrich D4292 20 µM
CODA Monitor system Kent scientific CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip Fisher Scientific 12-542A
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fiji/ImageJ NIH Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa) Sigma Aldrich FD2000s 40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV Mylan NDC 67457-374-12 5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL) Henry Schein NDC 11695-0702-1 0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective Mitutoyo 378-823-5 Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera Hamamatsu Model: C4742-80-12AG
PBS Gibco 2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) Lloyd LPFL04821 0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope Olympus Model: SZ61, fluorescent microscope

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References

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दवा अंक 175 माउस कॉक्लियर रक्त प्रवाह इंट्रावाइटल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट लेबल रक्त कोशिकाओं खुली पोत-खिड़की रक्त प्रवाह वेग रक्त की मात्रा
माउस कोक्लीआ में स्ट्रियल रक्त प्रवाह का मापन एक ओपन वेसल-विंडो और इंट्रावाइटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना
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Hou, Z., Zhang, Y., Neng, L., Zhang, J., Shi, X. Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (175), e61857, doi:10.3791/61857 (2021).

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