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Mesure du débit sanguin strial dans la cochlée de souris à l’aide d’une fenêtre vasculaire ouverte et d’une microscopie à fluorescence intravitale

Published: September 21, 2021 doi: 10.3791/61857
Automatic Translation
1, 1, 1, , 1
1Oregon Hearing Research Center, Department of Otolaryngology/Head & Neck Surgery, Oregon Health & Science University

Summary

Une approche vaisseau-fenêtre ouverte utilisant des traceurs fluorescents fournit une résolution suffisante pour la mesure du débit sanguin cochléaire (CoBF). La méthode facilite l’étude des changements structurels et fonctionnels du CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques.

Abstract

La transduction du son est métaboliquement exigeante, et la fonction normale de la microvascularisation dans la paroi latérale est essentielle pour maintenir le potentiel endocochléaire, le transport des ions et l’équilibre des fluides. Différentes formes de troubles auditifs impliqueraient une microcirculation anormale dans la cochlée. L’étude de la façon dont la pathologie du flux sanguin cochléaire (CoBF) affecte la fonction auditive est difficile en raison du manque de méthodes d’interrogatoire réalisables et de la difficulté d’accès à l’oreille interne. Une fenêtre vasculaire ouverte dans la paroi cochléaire latérale, combinée à la microscopie intravitale à fluorescence, a été utilisée pour étudier les changements de CoBF in vivo, mais surtout chez le cobaye et récemment chez la souris. Cet article et la vidéo associée décrivent la méthode de fenêtre de vaisseau ouvert pour visualiser le flux sanguin dans la cochlée de souris. Les détails comprennent 1) la préparation de la suspension de cellules sanguines marquées par fluorescence provenant de souris; 2) construction d’une fenêtre vasculaire ouverte pour la microscopie intravitale chez une souris anesthésiée, et 3) mesure de la vitesse et du volume du flux sanguin à l’aide d’un enregistrement hors ligne de l’imagerie. La méthode est présentée sous forme vidéo pour montrer comment utiliser l’approche de la fenêtre ouverte chez la souris pour étudier les changements structurels et fonctionnels dans la microcirculation cochléaire dans des conditions normales et pathologiques.

Introduction

La fonction normale de la microcirculation dans la paroi cochléaire latérale (comprenant la majorité des capillaires du ligament spiralé et de la strie vasculaire) est d’une importance cruciale pour le maintien de la fonction auditive1. La CoBF anormale est impliquée dans la physiopathologie de nombreux troubles de l’oreille interne, y compris la perte auditive induite par le bruit, l’hydrops de l’oreille et la presbyacousie 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualisation du CoBF intravital permettra de mieux comprendre les liens entre la fonction auditive et la pathologie vasculaire cochléaire.

Bien que la complexité et l’emplacement de la cochlée dans l’os temporal empêchent la visualisation et la mesure directes du CoBF, diverses méthodes ont été développées pour l’évaluation du CoBF, notamment la débitmétrie laser-Doppler (LDF)10,11,12, l’imagerie par résonance magnétique (IRM)13, la microscopie intravitale à fluorescence (FIVM)14, la microendoscopie à fluorescence (FME)15, l’imagerie endoscopique par contraste de moucheture laser (LSCI)16 , et des approches basées sur l’injection de marqueurs marqués et de microsphères marquées radioactivement dans la circulation sanguine (microangiographie optique, OMAG)17,18,19,20. Cependant, aucune de ces méthodes n’a permis un suivi absolu en temps réel des changements dans le CoBF in vivo, à l’exception du FIVM. FIVM, en combinaison avec une fenêtre vasculaire dans la paroi cochléaire latérale, est une approche qui a été utilisée et validée chez le cobaye dans différentes conditions expérimentales par divers laboratoires14,21,22.

Une méthode FIVM a été établie avec succès pour étudier les changements structurels et fonctionnels de la microcirculation cochléaire chez la souris en utilisant l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran comme produit de contraste et un colorant de fluorescence - DiO (perchlorate de 3, 3′-dioctadécyloxacarbocyanine, vert) ou Dil (perchlorate de 1,1-dioctadécyl-3,3,3,3-tétraméthylindocarbocyanine, rouge) - pour prémarquer les cellules sanguines, visualiser les vaisseaux et suivre la vitesse du flux sanguin. Dans la présente étude, le protocole de cette méthode a été décrit pour l’imagerie et la quantification des changements dans le CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques (comme après une exposition au bruit). Cette technique donne au chercheur les outils nécessaires pour étudier les mécanismes sous-jacents du CoBF liés au dysfonctionnement auditif et à la pathologie de la strie vasculaire, en particulier lorsqu’il est appliqué en conjonction avec des modèles murins transgéniques facilement disponibles.

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Protocol

REMARQUE: Il s’agit d’une chirurgie de non-survie. Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Oregon Health & Science University (numéro d’approbation IACUC : TR01_IP00000968).

1. Préparation des cellules sanguines marquées par fluorescence

  1. Anesthésier les souris donneuses (souris mâles C57BL/6J âgées de ~6 semaines) avec une injection intrapéritonéale (i.p.) de solution anesthésique de kétamine/xylazine (5 mL/kg, voir le tableau des matières).
    REMARQUE: Ce protocole d’anesthésie est très fiable et maintient la pression artérielle systémique.
  2. Posez la souris sur le dos, ouvrez la peau et exposez la cavité thoracique à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux à disséquer. Coupez le diaphragme, saisissez la base du sternum à l’aide de ciseaux à pince, coupez à travers la cage thoracique et soulevez pour exposer le cœur. Prélever 1 mL de sang dans l’héparine (15 UI/mL de sang) par ponction cardiaque et centrifuger à 3 000 × g pendant 3 min à 4 °C. Euthanasier la souris par luxation cervicale après prélèvement sanguin.
  3. Retirer le plasma, laver la pastille de cellules sanguines avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et centrifuger 3x à 3000 × g pendant 3 min à 4 °C.
  4. Étiqueter les cellules sanguines avec 1 mL de 20 mM DiO ou Dil dans PBS, et incuber dans l’obscurité pendant 30 min à températureambiante 23,24.
  5. Centrifuger et laver les cellules sanguines marquées avec 1 mL de PBS, centrifuger 3x à 3000 × g pendant 3 min à 4 °C, et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 30% d’hématocrite avec ~0,9 mL de PBS (volume final ~1,3 mL) avant l’injection.

2. Chirurgie pour créer une fenêtre ouverte 25

  1. Préparez les instruments chirurgicaux stériles et la plateforme d’imagerie, et placez un coussin chauffant sous le champ (figure 1A). Anesthésiez les souris (souris mâles C57BL/6J âgées de ~6 semaines) comme décrit à l’étape 1.1, et vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant le réflexe de la patte et le tonus musculaire général. Placez l’animal sur le coussin chauffant chaud et maintenez la température rectale à 37 °C.
  2. Placez la queue de l’animal dans le système de surveillance CODATM pour surveiller la pression artérielle et le rythme cardiaque (voir le tableau des matériaux). Notez la pression artérielle systolique, la pression artérielle diastolique et la pression artérielle moyenne (MBP) de l’animal dans l’état anesthésié.
    REMARQUE : Aucune différence n’est observée chez les animaux à l’état anesthésié et non anesthésié (107 ± 11 mmHg contre 97 ± 7 mmHg). La fréquence cardiaque de l’animal est stable sous anesthésie, bien que plus faible (toujours dans la plage normale) que dans l’état non anesthésié (357 ± 12 bmp contre 709 ± 3 bmp). Il faut s’attendre à une légère augmentation du rythme cardiaque chez les animaux placés en contention26.
  3. Ouvrez la bulle tympanique gauche par une approche latérale et ventrale au stéréomicroscope (voir le tableau des matériaux), en laissant la membrane tympanique et les osselets intacts21.
    1. Faites une incision le long de la ligne médiane du cou de l’animal avec sa tête immobilisée et positionnée de manière à minimiser les mouvements (figure 1B). Retirez la glande sous-maxillaire gauche et le ventre postérieur du muscle digastrique et cautériser.
      REMARQUE: Injecter par voie sous-cutanée de la buprénorphine à 0,05 mg / kg pour réduire la douleur pendant la chirurgie.
    2. Localisez et exposez la bulle osseuse en identifiant le muscle sternocléidomastoïdien et le nerf facial s’étendant antérieurement vers la bulle.
    3. Ouvrez la bulle osseuse à l’aide d’une aiguille de 30 G et retirez délicatement l’os environnant à l’aide d’une pince chirurgicale pour offrir une vue dégagée de la cochlée et de l’artère stapédienne, avec sa marge médiale située sur le bord de la niche ronde de la fenêtre et se dirigeant antérieurement supérieur vers la fenêtre ovale (figure 1C, D).
      REMARQUE: La trachéotomie est effectuée pour garder les voies respiratoires dégagées et ne doit être effectuée que lorsque l’animal a un problème respiratoire pendant la chirurgie. En général, la plupart des animaux sous anesthésie ont une respiration douce. Cependant, si les animaux ont subi une trachéotomie pendant la chirurgie, le débit sanguin enregistré ne doit pas être utilisé pour toute comparaison.
  4. Utilisez une petite lame de couteau (scalpel #16 fraisé sur mesure) pour gratter l’os de la paroi latérale au sommet médian de la cochlée de souris, à environ 1,25 mm de l’apex jusqu’à ce qu’une fine tache soit fissurée. Retirez les éclats osseux à l’aide de petits crochets métalliques (figure 1E).
  5. Couvrir la fenêtre du récipient avec une lamelle de couverture coupée pour préserver les conditions physiologiques normales et fournir une vue optique pour l’enregistrement des images du navire.
    REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées avec prudence. En plus de surveiller la température corporelle, les signes vitaux de l’animal, y compris la pression artérielle et le rythme cardiaque, doivent également être surveillés tout au long de la chirurgie.

3. Imagerie du CoBF sous FIVM

  1. Faites une incision de ~1 cm le long de la veine saphène droite pour exposer le vaisseau (Figure 1F).
  2. Injecter successivement dans l’animal 100 μL de la solution FITC-dextran (2000 kDa, 40 mg/mL dans PBS) et 100 μL d’une suspension de cellules sanguines (hématocrite à 30 %) dans l’animal par la veine saphène (Figure 1G) pour permettre la visualisation des vaisseaux sanguins et le suivi de la vitesse du flux sanguin.
  3. Observez le flux sanguin en temps réel directement sur un moniteur vidéo 5 min après l’injection. Imagez les vaisseaux sanguins à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif à longue distance de travail (L.D. 30,5 mm, 10x, ouverture numérique 0,26) et d’un boîtier de lampe contenant un filtre d’excitation à bandes multiples et un filtre d’émission compatible (Tableau des matériaux). Enregistrez la vidéo à l’aide d’une caméra numérique haute résolution noir et blanc à couplage de charge (Table of Materials) à 2 images/s). Obtenez plus de 350 images par vidéo pour assurer une analyse réussie de la vitesse d’écoulement.
    REMARQUE: Les vaisseaux sanguins du ligament spiralé et de la strie vasculaire peuvent être imagés en ajustant le foyer optique (vidéo supplémentaire 1).

4. Analyse vidéo

  1. Mesurez le diamètre du récipient à l’aide d’un logiciel approprié (Tableau des matériaux) et déterminez la distance entre deux points fixes à travers le récipient dans les images acquises.
  2. Calculez la vitesse du flux sanguin à partir d’images vidéo capturées en traçant le mouvement des cellules sanguines marquées dans la distance spatiale entre les emplacements des images27.
    1. Ouvrez la vidéo du flux sanguin dans le logiciel (Fiji [ImageJ] a été utilisé dans ce protocole) et définissez l’échelle des images.
    2. Suivez les cellules sanguines colorées DiO sélectionnées à l’aide de la fonction de suivi. Utilisez la distance parcourue par les cellules et l’intervalle de temps entre les images de la vidéo pour calculer automatiquement la vitesse d’écoulement.
  3. Calculer le débit volumétrique (F) selon l’équation suivante : F = V × A. (V : vitesse ; A : section transversale du navire).

5. Exposition au bruit

  1. Placez les animaux dans des cages en treillis métallique. Exposez-les à un bruit à large bande à un niveau de pression acoustique de 120 dB dans une cabine d’exposition acoustique pendant 3 h et pendant 3 heures supplémentaires le lendemain.
    NOTE: Ce régime d’exposition au bruit, couramment utilisé dans ce laboratoire, produit une perte permanente de sensibilité cochléaire28.

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Representative Results

Après exposition chirurgicale des capillaires cochléaires de la paroi latérale (Figure 1), l’observation microscopique par fluorescence intravitale à haute résolution de cellules sanguines marquées par Dil dans des vaisseaux marqués FITC-dexton a été possible à travers une fenêtre vasculaire ouverte. La figure 2A est une image représentative prise sous FIVM qui montre les capillaires de la paroi latérale apex cochléaire de la souris. La lumina de ces vaisseaux est rendue visible par la fluorescence du FITC-dextrane mélangé au plasma. Les cellules sanguines marquées individuellement distribuées dans le réseau vasculaire sont également clairement visibles sur cette image. Deux réseaux distincts - les capillaires du ligament spiralé et les capillaires de la strie vasculaire - se distinguent par leur emplacement (sous un microscope vertical, le strie vasculaire court optiquement sous le ligament spiralé, et il contient plus de boucles capillaires et des vaisseaux plus petits25). Les deux peuvent être évalués pour le flux sanguin avec ajustement du foyer optique. Comme le montre la figure 2B, C, la densité vasculaire du ligament spiralé est plus clairsemée que celle de la strie vasculaire.

La fonction vasculaire dans le modèle murin exposé au bruit a été comparée à la fonction vasculaire dans le groupe témoin. La mesure du CoBF a été prise 2 semaines après l’exposition au bruit. Les figures 3A, B sont des images représentatives montrant les schémas d’écoulement dans les groupes témoins et exposés au bruit. Une perturbation du flux sanguin a été observée dans le groupe exposé au bruit (figure 3B). Les anomalies comprenaient une réduction du diamètre du récipient (figure 3C) et une variation accrue du diamètre du récipient (figure 3D). Comme l’illustre la figure 4A, B, les vitesses du flux sanguin dans les groupes témoins et exposés au bruit ont été calculées en suivant les voies des cellules sanguines marquées par la DiO (vidéo supplémentaire 2). Les résultats montrent que la vitesse et le volume sanguins dans le groupe exposé au bruit étaient significativement inférieurs à ceux du groupe témoin (Figure 4C, D). Ces données indiquent que les sons forts affectent notamment la circulation sanguine et provoquent une réduction et une perturbation du flux sanguin.

Figure 1
Figure 1 : Préparation d’une fenêtre vasculaire ouverte pour l’imagerie par MIV chez la souris. (A) Préparation des instruments et des outils pour la chirurgie. (B) La bulle gauche a été exposée par une approche latérale et ventrale. (C) La cochlée a été exposée après avoir enlevé la bulle. (D) Image agrandie de la cochlée, à partir du cercle en (C). (E) Une fenêtre ouverte du vaisseau a été créée au sommet du milieu de la paroi latérale cochléaire (boîte). (F et G) Perfusion intraveineuse de FITC-dextran et de cellules sanguines marquées dans la veine saphène. Abréviations : OW = fenêtre ovale; RW = fenêtre ronde; MIV = microscopie intravitale; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Images représentatives des capillaires cochléaires dans la paroi latérale. (A) Cellules sanguines marquées par Dil (rouge, flèche) dans les vaisseaux strial marqués avec FITC-dextran (vert). (B) Cellules sanguines marquées DiO (vert) dans des vaisseaux ligamentaires en spirale marqués avec FITC-dextran (flèches, vert). Notez que les navires sont clairsemés. (C) Cellules sanguines marquées au DiO (vert) dans les vaisseaux industriels marqués avec FITC-dextran (vert). Notez que les vaisseaux sont plus denses. Barres d’échelle: 50 μm et 100 μm. Abréviations: Dil = perchlorate de 1,1-dioctadécyl-3,3,3,3-tétraméthylindocarbocyanine; DiO = perchlorate de 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Changement du diamètre du vaisseau dans la strie deux semaines après l’exposition au bruit. (A et B) Images représentatives de la circulation sanguine après marquage des vaisseaux avec FITC-dextran (vert) et des cellules sanguines avec DiO (vert) dans les groupes témoins et exposés au bruit (NE) avec MIV haute résolution. (C) Diamètre moyen du récipient calculé pour le groupe témoin et le groupe NE. Par rapport au groupe témoin, le diamètre du navire a été réduit dans le groupe exposé au bruit. (n = 18, t (34) = 2,880, **p = 0,007, test t de Student, moyenne ± écart-type [ET]). (D) Variance du diamètre du navire dans les groupes témoin et NE. Le diamètre du récipient variait beaucoup plus dans le groupe NE que dans le groupe témoin. (n = 6, t (10) = 6,630, ****p < 0,0001, test t de Student, moyenne ± écart-type). Barres d’échelle : 100 μm. Abréviations : DiO = perchlorate de 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; MIV = microscopie intravitale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Changements du débit sanguin dans la strie deux semaines après l’exposition au bruit. (A et B) Des images représentatives montrent les voies de suivi (lignes rouges, vertes et bleues) des cellules sanguines marquées par le DiO (vert) pour la mesure de la vitesse du flux sanguin dans les groupes témoins et exposés au bruit. (C et D) La vitesse du flux sanguin (μm/s) et le débit volumétrique (μm3/s) ont été calculés respectivement pour les groupes témoins et exposés au bruit. Le débit sanguin et le débit volumétrique dans le groupe exposé au bruit étaient inférieurs à ceux du groupe témoin (n = 54,t vitesse (106) = 19,705, vitesse ****p < 0,0001; t volume (106) = 15,342, ****pvolume < 0,0001, test t de Student, moyenne ± écart-type). Barres d’échelle : 100 μm. Abréviations : DiO = 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine perchlorate1; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; NE 2W = exposition au bruit pendant deux semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Vaisseaux sanguins du ligament spiralé et de la strie vasculaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo. 

Vidéo supplémentaire 2 : Suivi des voies des cellules sanguines marquées par la DiOpour le calcul des vitesses de circulation sanguine chez un animal témoin. Abréviations : DiO = 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine perchlorate. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Cet article démontre comment les capillaires dans la paroi latérale cochléaire (et dans la strie vasculaire) d’un modèle murin peuvent être visualisés avec le marquage fluorophore dans une préparation vaisseau-fenêtre ouverte sous un système FIVM. Le modèle murin est largement utilisé et préféré comme modèle de mammifère pour étudier la santé et les maladies humaines. Le protocole décrit ici est une approche réalisable pour l’imagerie et l’étude du CoBF dans la paroi latérale de la souris (en particulier dans la strie vasculaire) en utilisant une fenêtre vasculaire ouverte sous le système FIVM La méthode fournit une résolution suffisante pour déterminer la vitesse et le volume du flux sanguin en utilisant des cellules sanguines marquées par fluorescence comme traceur (comme illustré à la figure 3 et à la figure 4). ). Cette approche peut être utilisée pour plusieurs applications différentes, telles que l’évaluation de la perméabilité vasculaire et l’examen de la contractilité péricytaire, et le suivi de la migration des cellules circulantes de la moelle osseuse25. Les changements aigus du CoBF en réponse à un traumatisme, une infection, un bruit, des corps étrangers, des médicaments ototoxiques ou d’autres agents affectant la paroi latérale peuvent également être surveillés en temps réel25,29.
 
Au cours des dernières décennies, plusieurs méthodes relativement non invasives ont été établies pour évaluer le CoBF sans enlever la paroi osseuse cochléaire, y compris la LDF, L’IRM, OMAG, le LSCI endoscopique, l’EMF endoscopique et l’injection de microsphères dans le plasma sanguin. Cependant, aucune de ces approches ne peut être utilisée pour évaluer le débit absolu dans les récipients individuels. Par exemple, la FME endoscopique non invasive ne peut être utilisée que pour imager des régions limitées près de la fenêtre ronde, mais pas le flux sanguin dans la strie vasculaire.  Cependant, la circulation sanguine dans la strie vasculaire joue un rôle crucial dans le maintien de l’EP, du transport ionique et de l’équilibre du liquide endolymphatique, tous essentiels à la sensibilité auditive (Zhang et al., 2021). OMAG est également utile pour la visualisation du flux sanguin dans la cochlée intacte, cependant, la résolution est trop faible pour l’imagerie des capillaires individuels dans la strie vasculaire d’un modèle murin19.

Une fenêtre vasculaire ouverte, associée à un FIVM, permet de visualiser en temps réel le flux sanguin dans la paroi latérale cochléaire et de mesurer le diamètre vasculaire et la vitesse du flux sanguin dans les régions enregistrées. Le système IVM présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes. Par exemple, l’animal peut être facilement positionné et manipulé au besoin. Il existe une flexibilité pour ajuster le contraste du plasma et des cellules sanguines marqués par fluorescence afin d’optimiser la visualisation de l’architecture vasculaire et de mettre en évidence les structures pertinentes. Les différents poids moléculaires des traceurs conjugués FITC peuvent également être sélectionnés pour optimiser l’évaluation de la perméabilité vasculaire. e Le choix d’utiliser Dil (lex = 550 nm; lem = 564 nm) ou Dio (lex = 484 nm; lem = 501 nm) pour marquer les cellules sanguines, contrairement au FITC-dextran utilisé pour marquer le plasma, est déterminé par les objectifs de l’expérience. En général, Dil offre un meilleur contraste pour la visualisation de la lumière des vaisseaux et des cellules sanguines individuelles, tandis que Dio est préféré lorsque l’imagerie simultanée est utilisée pour la visualisation des cellules sanguines et de la lumière dans le même canal d’acquisition. De plus, le suivi est mieux accompli avec un petit nombre de cellules marquées puisque la fluorescence des cellules sanguines masquera la fluorescence de la lumière du vaisseau si toutes les cellules sanguines du vaisseau sont marquées21. En outre, il faut veiller à limiter la quantité de solution administrée au sang, à minimiser la dilution et les changements de flux sanguin liés à la viscosité dans la cochlée30.

Dans l’ensemble, cette méthode est robuste et peut être utilisée pour étudier les changements structurels et fonctionnels dans le CoBF dans des conditions normales et pathologiques telles que l’inflammation, le bruit et le vieillissement. Il est important de noter qu’une EP constante et normale peut être maintenue pendant la chirurgie, ce qui indique que la procédure est inoffensive pour la fonction cochléaire lorsqu’elle est effectuée avec suffisamment de soin25. Cependant, l’établissement réussi de la fenêtre de vaisseau ouverte nécessite un haut degré de compétence chirurgicale. Par exemple, il faut prendre soin d’enlever l’os de la paroi latérale cochléaire pour éviter la perte de liquide périlymphatique et les micro-lésions de la couche externe du ligament en spirale cochléaire. Ceux-ci pourraient nuire à l’homéostasie cochléaire et compromettre l’imagerie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) et Medical Research Foundation de l’Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Hospira NDC 0409-1966-02 0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma Aldrich 468495 20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate Sigma Aldrich D4292 20 µM
CODA Monitor system Kent scientific CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip Fisher Scientific 12-542A
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fiji/ImageJ NIH Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa) Sigma Aldrich FD2000s 40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV Mylan NDC 67457-374-12 5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL) Henry Schein NDC 11695-0702-1 0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective Mitutoyo 378-823-5 Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera Hamamatsu Model: C4742-80-12AG
PBS Gibco 2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) Lloyd LPFL04821 0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope Olympus Model: SZ61, fluorescent microscope

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References

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Médecine numéro 175 souris flux sanguin cochléaire microscopie à fluorescence intravitale cellules sanguines marquées par fluorescence fenêtre de vaisseau ouverte vitesse du flux sanguin volume sanguin
Mesure du débit sanguin strial dans la cochlée de souris à l’aide d’une fenêtre vasculaire ouverte et d’une microscopie à fluorescence intravitale
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Hou, Z., Zhang, Y., Neng, L., Zhang, … More

Hou, Z., Zhang, Y., Neng, L., Zhang, J., Shi, X. Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (175), e61857, doi:10.3791/61857 (2021).

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