Summary
Uma abordagem aberta da janela do vaso usando rastreadores fluorescentes fornece resolução suficiente para a medição do fluxo sanguíneo coclear (CoBF). O método facilita o estudo de mudanças estruturais e funcionais no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas.
Abstract
A transdução do som é metabolicamente exigente, e a função normal da microvasculatura na parede lateral é fundamental para manter o potencial endococlear, o transporte de íons e o equilíbrio de fluidos. Diferentes formas de distúrbios auditivos envolvem microcirculação anormal na cóclea. A investigação de como a patologia do fluxo sanguíneo coclear (CoBF) afeta a função auditiva é desafiadora devido à falta de métodos de interrogatório viáveis e à dificuldade de acesso ao ouvido interno. Uma janela de vaso aberto na parede coclear lateral, combinada com microscopia intravital de fluorescência, tem sido usada para estudar mudanças de CoBF in vivo, mas principalmente em cobaia e apenas recentemente no mouse. Este papel e o vídeo associado descrevem o método aberto da janela do vaso para visualizar o fluxo sanguíneo na cóclea do rato. Os detalhes incluem 1) preparação da suspensão de células sanguíneas rotuladas por fluorescentes em camundongos; 2) construção de uma janela de vaso aberta para microscopia intravital em um rato anestesiado, e 3) medição da velocidade e volume do fluxo sanguíneo usando uma gravação offline da imagem. O método é apresentado em formato de vídeo para mostrar como usar a abordagem da janela aberta no mouse para investigar alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear em condições normais e patológicas.
Introduction
A função normal da microcirculação na parede coclear lateral (compreendendo a maioria dos capilares no ligamento espiral e estria vascularis) é criticamente importante para a manutenção da função auditiva1. CoBF anormal está implicado na fisiopatologia de muitos distúrbios do ouvido interno, incluindo perda auditiva induzida por ruído, hidrops de ouvido e presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. A visualização do CoBF intravital permitirá uma melhor compreensão dos vínculos entre a função auditiva e a patologia vascular coclear.
Embora a complexidade e a localização da cóclea dentro do osso temporal impeça a visualização direta e a medição do CoBF, vários métodos foram desenvolvidos para a avaliação da CoBF, incluindo a estirmetria de fluxo de doppler a laser (LDF)10,11,12, ressonância magnética (RM)13, microscopia intravital fluorescência (FIVM)14, microendoscopia de fluorescência (FME)15, endoscópica de análise de contraste de ondas laser (LSCI)16 , e abordagens baseadas na injeção de marcadores rotulados e microesferas marcadas radioativamente na corrente sanguínea (microangiografia óptica, OMAG)17,18,19,20. No entanto, nenhum desses métodos permitiu o acompanhamento absoluto em tempo real das alterações no CoBF in vivo, com exceção da FIVM. FIVM, em combinação com uma janela de vaso na parede coclear lateral, é uma abordagem que tem sido usada e validada em cobaia em diferentes condições experimentais por vários laboratórios 14,21,22.
Um método FIVM foi estabelecido com sucesso para estudar as alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear no camundongo usando isothiocnato fluoresceína (FITC)-dextran como meio de contraste e um corante de fluorescência - ou DiO (3, 3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato, verde) ou Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-3-tetramethylindocarbocyanine perclorato, vermelho)-para pré-rotular glóbulos, visualizar vasos e rastrear a velocidade do fluxo sanguíneo. No presente estudo, o protocolo deste método foi descrito para imagens e alterações quantificantes no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas (como após exposição ao ruído). Esta técnica dá ao pesquisador as ferramentas necessárias para investigar os mecanismos subjacentes do CoBF relacionados à disfunção auditiva e patologia na estria vascularis, especialmente quando aplicada em conjunto com modelos de camundongos transgênicos prontamente disponíveis.
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Protocol
NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência. Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oregon Health & Science University (número de aprovação da IACUC: TR01_IP00000968).
1. Preparação das células sanguíneas rotuladas por fluorescentes
- Anestesiar os camundongos doadores (camundongos C57BL/6J machos com idade ~6 semanas) com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de solução anestésico de cetamina/xilazina (5 mL/kg, consulte a Tabela de Materiais).
NOTA: Este protocolo de anestesia é muito confiável e mantém a pressão arterial sistêmica. - Coloque o rato nas costas, abra a pele e exponha a cavidade torácica usando pinças e dissecando tesouras. Corte o diafragma, pegue na base do esterno usando uma tesoura de grampo, corte a caixa torácica e levante para expor o coração. Coletar 1 mL de sangue em heparina (15 UI/mL de sangue) por punção cardíaca, e centrífuga a 3.000 × g por 3 min a 4 °C. Eutanize o rato por luxação cervical após coleta de sangue.
- Remova o plasma, lave a pelota de célula sanguínea com 1 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e centrífuga 3x a 3000 × g por 3 min a 4 °C.
- Rotule as células sanguíneas com 1 mL de 20 mM DiO ou Dil em PBS, e incubar no escuro por 30 minutos a temperatura ambiente23,24.
- Centrifugar e lavar as células sanguíneas rotuladas com 1 mL de PBS, centrífugas 3x a 3000 × g por 3 min a 4 °C, e resuspensar a pelota celular em 30% de hematócrito com ~0,9 mL de PBS (volume final ~1,3 mL) antes da injeção.
2. Cirurgia para criar uma janela aberta 25
- Prepare os instrumentos cirúrgicos estéreis e a plataforma de imagem, e coloque uma almofada de aquecimento sob a cortina (Figura 1A). Anestesiar os camundongos (camundongos C57BL/6J machos com idade ~6 semanas) conforme descrito na etapa 1.1, e verificar a profundidade da anestesia monitorando o reflexo da pata e o tônus muscular geral. Coloque o animal na almofada de aquecimento quente e mantenha a temperatura retal a 37 °C.
- Coloque a cauda animal no sistema de monitor CODATM para monitorar a pressão arterial e os batimentos cardíacos (consulte a Tabela de Materiais). Registosos a pressão arterial sistólica do animal, a pressão arterial diastólica e a pressão arterial média (MBP) na condição anestesiada.
NOTA: Não é observada diferença no MBP animal no estado anestesiado e não anestesiado (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). A frequência cardíaca animal é estável sob anestesia, embora menor (ainda dentro da faixa normal) do que na condição não anestesiada (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). Uma batida cardíaca ligeiramente aumentada deve ser esperada em animais colocados na contenção26. - Abra a bula timpânica esquerda através de uma abordagem lateral e ventral sob um microscópio estéreo (veja a Tabela de Materiais), deixando a membrana timpânica e ossículos intactas21.
- Faça uma incisão ao longo da linha média do pescoço do animal com a cabeça imobilizada e posicionada para minimizar o movimento (Figura 1B). Remova a glândula submandibular esquerda e a barriga posterior do músculo digastric e cauterize.
NOTA: Injete subcutâneamente buprenorfina a 0,05 mg/kg para reduzir a dor durante a cirurgia. - Localize e exponha a bula óssea identificando o músculo estenicleidomastoide e o nervo facial estendendo-se anteriormente em direção à bula.
- Abra a bula óssea com uma agulha de 30 G, e remova cuidadosamente o osso circundante com pinças cirúrgicas para fornecer uma visão clara da cóclea e artéria stapedial, com sua margem medial sobre a borda do nicho da janela redonda, e correndo anteriormente superior em direção à janela oval (Figura 1C, D).
NOTA: A traqueotomia é realizada para manter as vias aéreas desobstruídas e só deve ser feita quando o animal tiver um problema respiratório durante a cirurgia. Em geral, a maioria dos animais sob anestesia tem respiração suave. No entanto, se os animais receberam uma traqueotomia durante a cirurgia, o fluxo sanguíneo registrado não deve ser usado para qualquer comparação.
- Faça uma incisão ao longo da linha média do pescoço do animal com a cabeça imobilizada e posicionada para minimizar o movimento (Figura 1B). Remova a glândula submandibular esquerda e a barriga posterior do músculo digastric e cauterize.
- Use uma pequena lâmina de faca (bisturi nº 16 frenado personalizado) para raspar o osso lateral da parede na curva do meio do ápice da cóclea do rato, aproximadamente 1,25 mm do ápice até que um ponto fino seja rachado. Remova os lascas ósseas com pequenos ganchos de arame (Figura 1E).
- Cubra a janela do vaso com um deslizamento de tampa de corte para preservar as condições fisiológicas normais e forneça uma visão óptica para registrar imagens do vaso.
NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados com cautela. Além do monitoramento da temperatura corporal, os sinais vitais do animal, incluindo pressão arterial e batimentos cardíacos, também devem ser monitorados durante toda a cirurgia.
3. Imagem de CoBF sob FIVM
- Faça uma incisão de ~1 cm ao longo da veia safena direita para expor o vaso (Figura 1F).
- Infundir 100 μL da solução FITC-dextran (2000 kDa, 40 mg/mL em PBS) e 100 μL de uma suspensão de células sanguíneas (30% hematócrito) sucessivamente no animal através da veia safena (Figura 1G) para permitir a visualização dos vasos sanguíneos e o rastreamento da velocidade do fluxo sanguíneo.
- Observe o fluxo sanguíneo em tempo real diretamente em um monitor de vídeo 5 minutos após a injeção. Imagem dos vasos sanguíneos usando um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de longa distância de trabalho (W.D.) objetivo (W.D. 30,5 mm, 10x, 0,26 abertura numérica) e uma caixa de lâmpada contendo um filtro de excitação de banda múltipla e filtro de emissão compatível (Tabela de Materiais). Grave o vídeo usando uma câmera de dispositivo digital de alta resolução em preto e branco (Tabela de Materiais) a 2 quadros/s). Adquira mais de 350 imagens por vídeo para garantir uma análise bem-sucedida da velocidade de fluxo.
NOTA: Os vasos sanguíneos tanto do ligamento espiral quanto da estria vascularis podem ser imagens ajustando o foco óptico (Vídeo Suplementar 1).
4. Análise de vídeo
- Meça o diâmetro da embarcação utilizando um software apropriado (Tabela de Materiais) e determine a distância entre dois pontos fixos através da embarcação nas imagens adquiridas.
- Calcule a velocidade de fluxo sanguíneo a partir de quadros de vídeo capturados traçando o movimento das células sanguíneas rotuladas na distância espacial entre os locaisde imagem 27.
- Abra o vídeo do fluxo sanguíneo no software (Fiji [ImageJ] foi usado neste protocolo), e defina a escala das imagens.
- Rastreie as células sanguíneas manchadas de DiO selecionadas usando a função de rastreamento. Use a distância que as células moveram e o intervalo de tempo entre os quadros de imagem no vídeo para o auto-cálculo da velocidade de fluxo.
- Calcular o fluxo volumoso (F) pela seguinte equação: F = V × A. (V: velocidade; A: área transversal da embarcação).
5. Exposição ao ruído
- Coloque os animais em gaiolas de malha de arame. Exponha-os ao ruído de banda larga a 120 dB nível de pressão sonora em uma cabine de exposição sonora por 3h e por mais 3 h no dia seguinte.
NOTA: Este regime de exposição ao ruído, rotineiramente utilizado neste laboratório, produz perda permanente de sensibilidade coclear28.
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Representative Results
Após a exposição cirúrgica dos capilares cocleares na parede lateral (Figura 1), a observação microscópica de fluorescência intravital de alta resolução das células sanguíneas rotuladas por Dil em vasos rotulados pelo FITC-dextran era viável através de uma janela de vaso aberto. Figura 2A é uma imagem representativa tirada sob FIVM que mostra os capilares da parede lateral do ápice coclear do mouse. A lumina destes vasos é visível pela fluorescência do FITC-dextran misturado com plasma. Células sanguíneas rotuladas individualmente distribuídas na rede vascular também são claramente visíveis nesta imagem. Duas redes distintas-capilares do ligamento espiral e capilares da estria vascularis -são distinguidos pela localização (sob um microscópio vertical, a estria vascularis corre opticamente abaixo do ligamento espiral, e contém mais laços capilares e vasos menores25). Ambos podem ser avaliados para o fluxo sanguíneo com ajuste do foco óptico. Como mostrado na Figura 2B, C, a densidade do vaso do ligamento espiral é mais escassa que a da estria vascularis.
A função vascular no modelo de mouse exposto ao ruído foi comparada com a função vascular no grupo controle. A medição do COBF foi feita 2 semanas após a exposição ao ruído. Figura 3A,B são imagens representativas que mostram os padrões de fluxo em grupos controlados e expostos ao ruído. Um padrão perturbado de fluxo sanguíneo foi visto no grupo exposto ao ruído (Figura 3B). As anomalias incluíram redução do diâmetro do vaso (Figura 3C) e aumento da variação do diâmetro do vaso (Figura 3D). Conforme ilustrado na Figura 4A,B, as velocidades de fluxo sanguíneo nos grupos de controle e expostos ao ruído foram calculadas através do rastreamento das rotas das células sanguíneas rotuladas pelo DiO (vídeo suplementar 2). Os resultados mostram que a velocidade e o volume sanguíneo no grupo exposto ao ruído foram significativamente menores do que no grupo controle (Figura 4C, D). Esses dados indicam que o som alto afeta notavelmente a circulação sanguínea e causa redução e perturbação do fluxo sanguíneo.
Figura 1: Preparação de uma janela de vaso aberta para imagem IVM em camundongos. (A) Preparação de instrumentos e ferramentas para a cirurgia. (B) A bula esquerda foi exposta através de uma abordagem lateral e ventral. (C) A cóclea foi exposta após a remoção da bula. (D) Imagem ampliada da cóclea, do círculo em (C). (E) Uma janela de vaso aberto foi criada na curva do meio do ápice da parede lateral coclear (caixa). (F e G) Infusão intravenosa de FITC-dextran e células sanguíneas rotuladas através da veia safena. Abreviaturas: OW = janela oval; RW = janela redonda; IVM = microscopia intravital; FITC = isocitonato de fluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de capilares cocleares na parede lateral. (A) Glóbulos sanguíneos rotulados em dil (vermelho, seta) em vasos desarmados com FITC-dextran (verde). (B) Células sanguíneas rotuladas por DiO (verde) em vasos de ligamento espiral rotulados com FITC-dextran (setas, verde). Note que os vasos são escassos. (C) Células sanguíneas rotuladas por DiO (verde) em vasos strial rotulados com FITC-dextran (verde). Note que os vasos são mais densos. Barras de escala: 50 μm e 100 μm. Abreviaturas: Dil = 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3,3-3-tetramethylindocarbocyanine perclorato; Dio = 3, 3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato; FITC = isocitonato de fluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mudança no diâmetro do vaso na estria duas semanas após exposição ao ruído. (A e B) Imagens representativas da circulação sanguínea após rotular vasos com FITC-dextran (verde) e células sanguíneas com DiO (verde) em grupos de controle e ruído expostos (NE) com IVM de alta resolução. (C) Diâmetro médio calculado para os grupos de controle e NE. Em comparação com o grupo controle, o diâmetro do vaso foi reduzido no grupo exposto ao ruído. (n = 18, t (34) = 2.880, **p = 0,007, teste t do aluno, média ± desvio padrão [DP]). (D) Variância do diâmetro do vaso no controle e nos grupos NE. O diâmetro do vaso variou muito mais no grupo NE do que no grupo controle. (n = 6, t (10) = 6.630, ****p < 0,0001, teste t do aluno, média ± SD). Barras de escala: 100 μm. Abreviaturas: DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato; FITC = isocitonato de fluoresceína; IVM = microscopia intravital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Alterações no fluxo sanguíneo na estria duas semanas após a exposição ao ruído. (A e B) Imagens representativas mostram as rotas de rastreamento (linhas vermelhas, verdes e azuis) de glóbulos rotulados por DiO (verde) para medição da velocidade do fluxo sanguíneo em grupos controlados e expostos ao ruído. (C e D) A velocidade de fluxo sanguíneo (μm/s) e a taxa de fluxo volumoso (μm3/s) foram respectivamente calculadas para grupos de controle e expostos ao ruído. A taxa de fluxo sanguíneo e a taxa de fluxo volumoso no grupo exposto ao ruído foram menores do que no grupo controle (n = velocidade de 54,t (106) = 19,705, velocidade ****p< 0,0001; tvolume (106) = 15.342, ****pvolume < 0,0001, teste t do aluno, média ± desvio padrão). Barras de escala: 100 μm. Abreviaturas: DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato1; FITC = isocitonato de fluoresceína; NE 2W = exposição ao ruído de duas semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1: Vasos sanguíneos tanto do ligamento espiral quanto da estria vascularis. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar 2: Seguindo as rotas das células sanguíneas rotuladas por DiOpara o cálculo das velocidades de fluxo sanguíneo em um animal de controle. Abreviaturas: Dio = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Este artigo demonstra como os capilares na parede lateral coclear (e na estria vascularis) de um modelo de mouse podem ser visualizados com rotulagem fluorófora em uma preparação aberta de janela de vaso sob um sistema FIVM. O modelo de camundongos é amplamente utilizado e preferido como um modelo mamífero para investigar a saúde e a doença humana. O protocolo descrito aqui é uma abordagem viável para a imagem e investigação de CoBF na parede lateral do rato (particularmente na estria vascularis) usando uma janela de vaso aberto sob o sistema FIVM O método fornece resolução suficiente para determinar a velocidade e o volume do fluxo sanguíneo usando células sanguíneas rotuladas por fluorescência como um rastreador (como mostrado na Figura 3 & Figura 4 ). Essa abordagem pode ser utilizada para diversas aplicações diferentes, como a avaliação da permeabilidade vascular e o exame da contratilidade pericíte, e o rastreamento da migração de células de medula ósseacirculante 25. Alterações agudas no CoBF em resposta a traumas, infecções, ruídos, corpos estranhos, drogas ototóxias ou outros agentes que afetam a parede lateral também podem ser monitoradas em tempo real25,29.
Nas últimas décadas, vários métodos relativamente não invasivos foram estabelecidos para avaliar a CoBF sem remover a parede óssea coclear, incluindo LDF, MRI, OMAG, LSCI endoscópica, FME endoscópica e a injeção de microesferas no plasma de sangue. No entanto, nenhuma dessas abordagens pode ser usada para avaliar a taxa de fluxo absoluta em embarcações individuais. Por exemplo, fme endoscópica não invasiva só pode ser usado para imagem de regiões limitadas perto da janela redonda, mas não fluxo sanguíneo na estria vascularis. No entanto, a circulação sanguínea na estria vascularis tem papéis cruciais na manutenção do EP, transporte de íons e equilíbrio de fluidos endoglifáticos, todos essenciais para a sensibilidade auditiva (Zhang et al., 2021). O OMAG também é útil para visualização do fluxo sanguíneo na cóclea intacta, no entanto, a resolução é muito ruim para a imagem de capilares individuais na estria vascularis de um rato modelo19.
Uma janela de vaso aberto, em conjunto com um FIVM, permite a visualização em tempo real do fluxo sanguíneo na parede lateral coclear e a medição do diâmetro vascular e da velocidade do fluxo sanguíneo nas regiões registradas. O sistema IVM tem várias vantagens em relação a outros métodos. Por exemplo, o animal pode ser convenientemente posicionado e manipulado conforme necessário. Há flexibilidade para ajustar o contraste do plasma e células sanguíneas rotulados pela fluorescência para otimizar a visualização da arquitetura vascular e destacar estruturas relevantes. Os diferentes pesos moleculares dos rastreadores conjugados pelo FITC também podem ser selecionados para otimizar a avaliação da permeabilidade vascular. e A escolha de usar Dil (lex = 550 nm; lem = 564 nm) ou Dio (lex = 484 nm; lem = 501 nm) para rotular as células sanguíneas, em contraste com o FITC-dextran usado para rotular o plasma, é determinada por objetivos de experimento. Em geral, Dil proporciona melhor contraste para a visualização do lúmen do vaso e das células sanguíneas individuais, enquanto Dio é preferido quando a imagem simultânea é usada para visualização de células sanguíneas e lúmen no mesmo canal de aquisição. Além disso, o rastreamento é melhor realizado com um pequeno número de células rotuladas, uma vez que a fluorescência das células sanguíneas mascarará a fluorescência do lúmen do vaso se todas as células sanguíneas do vaso forem rotuladas como21. Além disso, deve-se ter cuidado para limitar a quantidade de solução administrada ao sangue, para minimizar a diluição e as alterações de fluxo sanguíneo relacionadas à viscosidade na cóclea30.
No geral, este método é robusto e pode ser usado para investigar mudanças estruturais e funcionais no CoBF em condições normais e patológicas, como inflamação, ruído e envelhecimento. É importante ressaltar que um EP constante e normal pode ser mantido durante a cirurgia, indicando que o procedimento é inofensivo para a função coclear quando realizado cuidadosamente25. No entanto, o estabelecimento bem sucedido da janela aberta do vaso requer um alto grau de habilidade cirúrgica. Por exemplo, deve-se ter cuidado na remoção do osso da parede lateral coclear para evitar a perda de fluido perifático e micro-lesão na camada externa do ligamento espiral coclear. Isso pode afetar negativamente a homeostase coclear e comprometer a imagem.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) e Medical Research Foundation da Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
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