Summary
En åpen fartøy-vindu tilnærming ved hjelp av fluorescerende tracers gir tilstrekkelig oppløsning for cochlear blodstrøm (CoBF) måling. Metoden letter studiet av strukturelle og funksjonelle endringer i CoBF i mus under normale og patologiske forhold.
Abstract
Transduksjon av lyd er metabolsk krevende, og mikrovaskulaturens normale funksjon i sideveggen er avgjørende for å opprettholde endokokrometarpotensial, ionetransport og væskebalanse. Ulike former for hørselsforstyrrelser er rapportert å involvere unormal mikrosirkulasjon i sneglehuset. Undersøkelse av hvordan cochlear blodstrøm (CoBF) patologi påvirker hørselsfunksjonen er utfordrende på grunn av mangel på gjennomførbare avhørsmetoder og vanskeligheten med å få tilgang til det indre øret. Et åpent karvindu i den laterale sneglehusveggen, kombinert med fluorescens intravital mikroskopi, har blitt brukt til å studere CoBF-endringer in vivo, men mest hos marsvin og først nylig i musen. Dette papiret og tilhørende video beskriver den åpne fartøy-vindusmetoden for å visualisere blodstrømmen i musesneglehuset. Detaljer inkluderer 1) fremstilling av fluorescerende merket blodcellesuspensjon fra mus; 2) konstruksjon av et åpent fartøyvindu for intravital mikroskopi i en bedøvet mus, og 3) måling av blodstrømningshastighet og volum ved hjelp av et offline opptak av avbildningen. Metoden presenteres i videoformat for å vise hvordan man bruker åpen vindustilnærming i mus for å undersøke strukturelle og funksjonelle endringer i cochlear mikrosirkulasjon under normale og patologiske forhold.
Introduction
Normal funksjon av mikrosirkulasjonen i den laterale cochleaveggen (som omfatter flertallet av kapillærene i spiralligamentet og stria vascularis) er kritisk viktig for å opprettholde hørselsfunksjon1. Unormal CoBF er involvert i patofysiologien til mange indre øreforstyrrelser, inkludert støyindusert hørselstap, ørehydrops og presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering av intravital CoBF vil muliggjøre en bedre forståelse av sammenhengen mellom hørselsfunksjon og cochlear vaskulær patologi.
Selv om kompleksiteten og plasseringen av sneglehuset i tinningbenet utelukker direkte visualisering og måling av CoBF, er det utviklet ulike metoder for vurdering av CoBF, inkludert laserdoppler-flowmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonansavbildning (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroskopi (FME)15, endoskopisk laserspekkelkontrastavbildning (LSCI)16 , og tilnærminger basert på injeksjon av merkede markører og radioaktivt merkede mikrosfærer i blodet (optisk mikroangiografi, OMAG)17,18,19,20. Ingen av disse metodene har imidlertid aktivert absolutt sanntidssporing av endringer i CoBF in vivo, med unntak av FIVM. FIVM, i kombinasjon med et fartøyvindu i den laterale cochlearveggen, er en tilnærming som har blitt brukt og validert i marsvin under forskjellige eksperimentelle forhold av ulike laboratorier 14,21,22.
En FIVM-metode ble vellykket etablert for å studere strukturelle og funksjonelle endringer i cochlear mikrosirkulasjonen i mus ved bruk av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran som kontrastmedium og et fluorescensfargestoff - enten DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, green) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, red)-for forhåndsmerking av blodceller, visualisering av kar og sporing av blodstrømningshastighet. I denne studien er protokollen for denne metoden beskrevet for avbildning og kvantifisering av endringer i CoBF hos mus under normale og patologiske forhold (for eksempel etter støyeksponering). Denne teknikken gir forskeren verktøyene som trengs for å undersøke de underliggende mekanismene til CoBF relatert til hørselsdysfunksjon og patologi i stria vascularis, spesielt når de brukes sammen med lett tilgjengelige transgene musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dette er en ikke-overlevelsesoperasjon. Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Oregon Health &Science University (IACUC godkjenningsnummer: TR01_IP00000968).
1. Fremstilling av fluorescerende merkede blodceller
- Bedøv donormusene (mannlige C57BL/6J-mus i alderen ~6 uker) med en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av ketamin/xylazinbedøvelsesløsning (5 ml/kg, se materialtabellen).
MERK: Denne anestesiprotokollen er svært pålitelig og opprettholder systemisk blodtrykk. - Legg musen på ryggen, åpne huden og utsett brysthulen ved hjelp av pinsett og dissekere saks. Klipp opp membranen, ta tak i bunnen av brystbenet med klemmesaks, kutt gjennom brystkassen og løft for å eksponere hjertet. Samle 1 ml blod i heparin (15 IE / ml blod) ved hjertepunksjon, og sentrifuge ved 3000 × g i 3 minutter ved 4 ° C. Avlive musen ved cervikal dislokasjon etter blodinnsamling.
- Fjern plasmaet, vask blodcellepelleten med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og sentrifuge 3x ved 3000 × g i 3 minutter ved 4 °C.
- Merk blodcellene med 1 ml 20 mM DiO eller Dil i PBS, og inkuber i mørket i 30 minutter ved romtemperatur23,24.
- Sentrifuge og vask de merkede blodcellene med 1 ml PBS, sentrifuge 3x ved 3000 × g i 3 minutter ved 4 ° C, og resuspender cellepelleten i 30% hematokrit med ~ 0,9 ml PBS (sluttvolum ~ 1,3 ml) før injeksjon.
2. Kirurgi for å lage et åpent vindu 25
- Klargjør de sterile kirurgiske instrumentene og bildeplattformen, og plasser en varmepute under draperiet (figur 1A). Bedøv musene (mannlige C57BL/6J-mus i alderen ~6 uker) som beskrevet i trinn 1.1, og kontroller anestesidybden ved å overvåke poterefleksen og den generelle muskeltonen. Plasser dyret på den varme varmeputen, og hold rektaltemperaturen ved 37 °C.
- Plasser dyrehalen i CODATM-monitorsystemet for overvåking av blodtrykk og hjerterytme (se materialtabellen). Registrer dyrets systoliske blodtrykk, diastoliske blodtrykk og gjennomsnittlig blodtrykk (MBP) i bedøvet tilstand.
MERK: Ingen forskjell er sett i dyr MBP i bedøvet og ikke-bedøvet tilstand (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). Dyrets hjertefrekvens er stabil under bedøvelse, men lavere (fortsatt innenfor normalområdet) enn i ikke-bedøvet tilstand (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). En litt økt hjerterytme bør forventes hos dyr som er plassert i fastholdelse26. - Åpne venstre tympanisk bulla via en lateral og ventral tilnærming under et stereomikroskop (se materialtabellen), og la trommehinnen og ossiklene være intakte21.
- Lag et snitt langs midtlinjen av dyrets nakke med hodet immobilisert og plassert for å minimere bevegelse (figur 1B). Fjern venstre submandibulær kjertel og bakre mage av den digastriske muskelen og cauterize.
MERK: Subkutant injiser buprenorfin ved 0,05 mg/kg for å redusere smerten under operasjonen. - Finn og utsett den benete bulla ved å identifisere sternocleidomastoid muskel og ansiktsnerve som strekker seg fremre mot bulla.
- Åpne benete bulla med en 30 G nål, og fjern forsiktig det omkringliggende beinet med kirurgisk pinsett for å gi et klart syn på sneglehuset og stapedialisarterien, med sin mediale margin liggende over kanten av den runde vindusnisjen, og coursing anterior-superior mot det ovale vinduet (figur 1C, D).
MERK: Trakeotomi utføres for å holde luftveiene uhindret og bør bare gjøres når dyret har et åndedrettsproblem under operasjonen. Generelt har de fleste dyrene under anestesi jevn pust. Men hvis dyr fikk trakeotomi under operasjonen, bør den registrerte blodstrømmen ikke brukes til noen sammenligning.
- Lag et snitt langs midtlinjen av dyrets nakke med hodet immobilisert og plassert for å minimere bevegelse (figur 1B). Fjern venstre submandibulær kjertel og bakre mage av den digastriske muskelen og cauterize.
- Bruk et lite knivblad (spesialfrest #16 skalpell) til å skrape sideveggbenet ved topp-midtre sving på musesneglehuset, ca. 1,25 mm fra toppunktet til en tynn flekk er sprukket. Fjern beinflisene med små trådkroker (figur 1E).
- Dekk fartøyvinduet med en kuttet deksel for å bevare normale fysiologiske forhold og gi en optisk visning for opptak av fartøybilder.
MERK: Alle prosedyrer skal utføres med forsiktighet. I tillegg til å overvåke kroppstemperaturen, bør dyrets vitale tegn, inkludert blodtrykk og hjerterytme, også overvåkes gjennom hele operasjonen.
3. Avbildning av CoBF under FIVM
- Gjør et ~ 1 cm snitt langs høyre saphenous vene for å eksponere fartøyet (figur 1F).
- Tilfør 100 μL av FITC-dekstranoppløsningen (2000 kDa, 40 mg / ml i PBS) og 100 μL av en blodcellesuspensjon (30% hematokrit) suksessivt inn i dyret gjennom saphenøs vene (figur 1G) for å muliggjøre visualisering av blodkarene og sporing av blodstrømningshastigheten.
- Følg blodstrømmen i sanntid direkte på en videomonitor 5 minutter etter injeksjonen. Avbilde blodkarene ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med en lang arbeidsavstand (WD) mål (WD 30,5 mm, 10x, 0,26 numerisk blenderåpning) og et lampehus som inneholder et multibånds eksitasjonsfilter og kompatibelt utslippsfilter (materialtabell). Ta opp videoen med et høyoppløselig digitalt svart-hvitt ladekoblet enhetskamera (Table of Materials) med 2 bilder / s). Få mer enn 350 bilder per video for å sikre vellykket analyse av strømningshastigheten.
MERK: Blodkar i både spiralbåndet og stria vascularis kan avbildes ved å justere det optiske fokuset (supplerende video 1).
4. Videoanalyse
- Mål fartøyets diameter ved hjelp av passende programvare (Table of Materials), og bestem avstanden mellom to faste punkter over fartøyet i de oppkjøpte bildene.
- Beregn blodstrømningshastigheten fra fangede videorammer ved å spore bevegelsen av merkede blodcelleri den romlige avstanden mellom bildesteder27.
- Åpne videoen av blodstrømmen i programvaren (Fiji [ImageJ] ble brukt i denne protokollen), og angi omfanget av bildene.
- Spor de valgte DiO-fargede blodcellene ved hjelp av sporingsfunksjonen. Bruk avstanden cellene har flyttet og tidsintervallet mellom bilderammer i videoen for automatisk beregning av strømningshastigheten.
- Beregn volumetrisk strømning (F) per følgende ligning: F = V × A. (V: hastighet; A: tverrsnittsareal av fartøyet).
5. Støyeksponering
- Plasser dyrene i nettingbur. Utsett dem for bredbåndsstøy ved 120 dB lydtrykknivå i en lydeksponeringsboks i 3 timer og i ytterligere 3 timer neste dag.
MERK: Dette støyeksponeringsregimet, som rutinemessig brukes i dette laboratoriet, gir permanent tap av cochleasensitivitet28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter kirurgisk eksponering av cochlea-kapillærene i sideveggen (figur 1) var intravital høyoppløselig fluorescensmikroskopisk observasjon av dilmerkede blodceller i FITC-dextran-merkede kar mulig gjennom et åpent fartøyvindu. Figur 2A er et representativt bilde tatt under FIVM som viser kapillærene til musecochlear apex-midtre sving sidevegg. Lumina av disse fartøyene er synliggjort av fluorescensen av FITC-dextran blandet med plasma. Individuelt merkede blodceller fordelt i det vaskulære nettverket er også tydelig synlig i dette bildet. To forskjellige nettverk - kapillærene i spiralligamentet og kapillærene i stria vascularis - er preget av plassering (under et oppreist mikroskop går stria vascularis optisk under spiralligamentet, og det inneholder flere kapillærsløyfer og mindre fartøy25). Begge kan vurderes for blodstrøm med justering av det optiske fokuset. Som vist i figur 2B, C, er fartøyets tetthet av spiralligamentet sparsommere enn stria vascularis.
Vaskulær funksjon i den støyeksponerte musemodellen ble sammenlignet med vaskulær funksjon i kontrollgruppen. CoBF-måling ble tatt 2 uker etter støyeksponering. Figur 3A,B er representative bilder som viser strømningsmønstrene i kontroll- og støyutsatte grupper. Det ble sett et forstyrret blodgjennomstrømningsmønster i den støyeksponerte gruppen (figur 3B). Uregelmessigheter inkluderte redusert kardiameter (figur 3C) og økt variasjon i kardiameter (figur 3D). Som illustrert i figur 4A, B, ble blodstrømningshastighetene i kontroll- og støyeksponerte grupper beregnet ved å spore rutene til de DiO-merkede blodcellene (tilleggsvideo 2). Resultatene viser at blodhastighet og volum i den støyeksponerte gruppen var signifikant lavere enn i kontrollgruppen (figur 4C, D). Disse dataene indikerer at høy lyd spesielt påvirker blodsirkulasjonen og forårsaker redusert og forstyrret blodstrøm.
Figur 1: Klargjøring av et åpent fartøyvindu for IVM-avbildning i mus . (A) Klargjøring av instrumenter og verktøy for operasjonen. (B) Venstre bulla ble eksponert via en lateral og ventral tilnærming. (C) Sneglehuset ble eksponert etter fjerning av bulla. (D) Forstørret bilde av sneglehuset, fra sirkelen i (C). (E) Et åpent fartøyvindu ble opprettet ved apex-midtre sving av cochlear sidevegg (boks). (F og G) Intravenøs infusjon av FITC-dextran og merkede blodceller gjennom saphenøs vene. Forkortelser: OW = ovalt vindu; RW = rundt vindu; IVM = intravital mikroskopi; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative bilder av cochlear kapillærer i sideveggen. (A) Dil-merkede blodceller (rød, pil) i strial fartøy merket med FITC-dextran (grønn). (B) DiO-merkede blodceller (grønne) i spiralligamentkar merket med FITC-dextran (piler, grønn). Merk at fartøyene er sparsomme. (C) DiO-merkede blodceller (grønne) i strialkar merket med FITC-dextran (grønn). Merk at fartøyene er tettere. Skala barer: 50 μm og 100 μm. Forkortelser: Dil = 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Endring i kardiameter i stria to uker etter støyeksponering. (A og B) Representative bilder av blodsirkulasjonen etter merking av kar med FITC-dextran (grønn) og blodceller med DiO (grønn) i kontroll- og støyeksponerte (NE) grupper med høyoppløselig IVM. (C) Meanvessel diameter beregnet for kontroll- og NE-grupper. Sammenlignet med kontrollgruppen ble fartøyets diameter redusert i den støyeksponerte gruppen. (n = 18, t (34) = 2,880, **p = 0,007, Student t-test, gjennomsnitt ± standardavvik [SD]). (D) Varians av fartøydiameter i kontroll- og NE-grupper. Fartøydiameteren varierte mye mer i NE-gruppen enn i kontrollgruppen. (n = 6, t (10) = 6,630, ****p < 0,0001, Student t-test, gjennomsnitt ± SD). Skala barer: 100 μm. Forkortelser: DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate; FITC = fluoresceinisotiocyanat; IVM = intravital mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Blodstrømmen endres i stria to uker etter støyeksponering. (A og B) Representative bilder viser sporingsrutene (røde, grønne og blå linjer) til DiO-merkede blodceller (grønne) for måling av blodstrømningshastighet i kontroll- og støyeksponerte grupper. (C og D) Blodstrømshastighet (μm/s) og volumetrisk strømningshastighet (μm3/s) ble henholdsvis beregnet for kontroll- og støyeksponerte grupper. Blodstrømningshastighet og volumetrisk strømningshastighet i den støyeksponerte gruppen var lavere enn i kontrollgruppen (n = 54,t hastighet (106) = 19,705, ****p hastighet < 0,0001; t volum (106) = 15,342, ****p volum < 0,0001, Student t-test, gjennomsnitt ± standardavvik). Skala barer: 100 μm. Forkortelser: DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate1; FITC = fluoresceinisotiocyanat; NE 2W = to ukers støyeksponering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende video 1: Blodkar i både spiralbåndet og stria vascularis. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo 2: Sporing av rutene til DiO-merkede blodcellerfor beregning av blodstrømningshastighetene i et kontrolldyr. Forkortelser: DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret demonstrerer hvordan kapillærene i cochlear lateral veggen (og i stria vascularis) av en musemodell kan visualiseres med fluoroformerking i et åpent fartøy-vindu forberedelse under et FIVM-system. Musmodell er mye brukt og foretrukket som en pattedyrmodell for å undersøke menneskers helse og sykdom. Protokollen beskrevet her er en mulig tilnærming for avbildning og undersøkelse av CoBF i musens sidevegg (spesielt i stria vascularis) ved bruk av et åpent fartøyvindu under FIVM-system Metoden gir tilstrekkelig oppløsning for å bestemme blodstrømningshastighet og volum ved bruk av fluorescensmerkede blodceller som sporstoff (som vist i figur 3 og figur 4 ). Denne tilnærmingen kan brukes til flere forskjellige applikasjoner, for eksempel vurdering av vaskulær permeabilitet og undersøkelse av pericyttkontraktilitet, og sporing av sirkulerende benmargscellemigrasjon25. Akutte endringer i CoBF som respons på traumer, infeksjoner, støy, fremmedlegemer, ototoksiske stoffer eller andre midler som påvirker sideveggen, kan også overvåkes i sanntid25,29.
I de siste tiårene ble flere relativt ikke-invasive metoder etablert for å vurdere CoBF uten å fjerne cochlear benete vegg, inkludert LDF, MR, OMAG, endoskopisk LSCI, endoskopisk FME , og injeksjon av mikrosfærer i blodplasmaet. Ingen av disse tilnærmingene kan imidlertid brukes til å evaluere den absolutte strømningshastigheten i individuelle fartøy. For eksempel kan ikke-invasiv endoskopisk FME bare brukes til å avbilde begrensede regioner nær det runde vinduet, men ikke blodstrømmen i stria vascularis. Imidlertid har blodsirkulasjonen i stria vascularis avgjørende roller for å opprettholde EP, ionetransport og endolymfatisk væskebalanse, alt avgjørende for hørselsfølsomhet (Zhang et al., 2021). OMAG er også nyttig for visualisering av blodstrømmen i det intakte sneglehuset, men oppløsningen er for dårlig til å avbilde individuelle kapillærer i stria vascularis av en musemodell19.
Et åpent fartøyvindu, sammen med en FIVM, muliggjør sanntidsvisualisering av blodstrømmen i cochlear sidevegg og måling av vaskulær diameter og blodstrømningshastighet i de registrerte områdene. IVM-systemet har flere fordeler i forhold til andre metoder. For eksempel kan dyret enkelt plasseres og manipuleres etter behov. Det er fleksibilitet til å justere kontrasten til fluorescensmerket plasma og blodceller for å optimalisere visualisering av vaskulær arkitektur og fremheve relevante strukturer. De forskjellige molekylvektene til FITC-konjugerte sporstoffer kan også velges for å optimalisere evalueringen av vaskulær permeabilitet. e Valget av om du vil bruke Dil (lex = 550 nm; lem = 564 nm) eller Dio (lex = 484 nm; lem = 501 nm) for å merke blodcellene, i motsetning til FITC-dekstranet som brukes til å merke plasmaet, bestemmes av eksperimentmål. Generelt gir Dil bedre kontrast for visualisering av fartøyets lumen og individuelle blodceller, mens Dio foretrekkes når samtidig avbildning brukes til visualisering av blodceller og lumen i samme oppkjøpskanal. Dessuten oppnås sporing best med et lite antall merkede celler, siden blodcellefluorescens vil maskere fartøyets lumenfluorescens hvis alle blodceller i karet er merket21. I tillegg bør det utvises forsiktighet for å begrense mengden oppløsning som administreres til blod, for å minimere fortynning og viskositetsrelaterte blodstrømendringer i sneglehuset30.
Samlet sett er denne metoden robust og kan brukes til å undersøke strukturelle og funksjonelle endringer i CoBF under normale og patologiske forhold som betennelse, støy og aldring. Det er viktig at en konstant og normal EP opprettholdes under operasjonen, noe som indikerer at prosedyren er ufarlig for cochleafunksjonen når den utføres nøye nok25. Den vellykkede etableringen av det åpne fartøyvinduet krever imidlertid en høy grad av kirurgisk ferdighet. For eksempel må det utvises forsiktighet ved fjerning av beinet i cochlear lateral veggen for å forhindre tap av perilymfatisk væske og mikroskade på det ytre laget av cochlear spiralligamentet. Disse kan påvirke cochlear homeostase negativt og kompromittere bildebehandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) og Medical Research Foundation fra Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
- Shi, X.
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al.
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A.
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc'h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
