طورنا طريقة simple لعزل خلايا قلب الفأر الفردية عالية الجودة عن طريق تقنية التشويش المسبق. هذه الطريقة خالية من Langendorff ومفيدة لعزل الخلايا العضلية البطينية والأبطية أو الخلايا الخلالية ، مثل الخلايا الليفية القلبية أو السلف.
في البحوث الأساسية باستخدام قلب الماوس، عزل خلايا القلب الفردية قابلة للحياة هو خطوة تقنية حاسمة للتغلب عليها. تقليديا، تم إجراء عزل خلايا القلب من الأرانب والخنازير غينيا أو الفئران عن طريق التغلغل إلى الوراء من القلب مع الإنزيمات باستخدام جهاز Langendorff. ومع ذلك، مطلوب درجة عالية من المهارة عند استخدام هذه الطريقة مع قلب الماوس صغيرة. تم الإبلاغ مؤخرا عن طريقة التغلغل التي لا تستخدم جهاز Langendorff لعزل خلايا القلب الماوس. نحن هنا تقرير بروتوكول كامل لتحسين التغلغل قبل التحلل من القلب المقتطع لعزل خلايا القلب الفردية من الفئران البالغة (8-108 أسابيع من العمر). يتم إجراء التشوه الأمامي عن طريق حقن اليرفوسات بالقرب من قمة البطين الأيسر للقلب المقتطع ، الذي تم تثبيت الشريان الأورطي منه ، باستخدام مضخة ضخ. يتم تنفيذ جميع الإجراءات على حصيرة سخان مسبقة الدفء تحت المجهر ، مما يسمح بمراقبة عمليات الحقن والتشويش. تشير النتائج إلى أن الخلايا العضلية البطينية والأبطية ، والخلايا الليفية يمكن عزلها بشكل جيد عن فأر بالغ واحد في وقت واحد.
عموما، الخطوة الأولى من عزلة خلية واحدة من الأنسجة تشريح ينطوي على قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة، تليها هضم النسيج الضام ومصفوفة خارج الخلية مع الإنزيمات. ومع ذلك ، لا يمكن عزل خلايا القلب مع مثل هذه الطريقة التقطيع ، حيث أن الإثراء بمكونات المصفوفة خارج الخلية ، بما في ذلك ألياف الكولاجين والإيلاستين ، يجعل عضلة القلب صعبة للغاية على المفروم ، وخلايا القلب حساسة للغاية لنقص الأكبسجة والتغيرات الأخرى في البيئة الدقيقة. وهكذا، باستخدام نظام الارتخاء الرجعي القائم على Langendorff1،تم تطوير طريقة لهضم المصفوفة خارج الخلية مع الإنزيمات لعزل خلايا القلب الفردية من القلب2،3،4.
في نماذج الماوس، Langendorff المستندة إلى الرجعية perfusion القلب مع الانزيمات يستخدم أيضا لعزل خلايا القلب الفردية5،6،7،8. ومع ذلك ، فإن علبة الشريان الأورطي الماوس الصغيرة والرقيقة وتصاعدها على جهاز Langendorff لأداء التخثر الرجعي يتطلب درجة عالية من المهارة ، لأن قطر الشريان الأورطي في قلب البالغين يبلغ حوالي 1.2 مم. وعلاوة على ذلك، فإنه يأخذ وقتا لإجراء تجارب متعددة كما ينبغي تنظيف جهاز Langendorff قبل التغلغل في القلب التالي.
كبديل للتشويش الرجعي ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل خلايا القلب من قلب فأر بالغ دون جهاز Langendorff. واستند هذا الأسلوب صنع عصر على التغلغل قبلغراد من الشرايين التاجية9. قمنا مؤخرا بتحسين كل خطوة من هذا البروتوكول السابق للتحلل ، مثل لقط الشريان الأورطي ، وإدخال الإبر ، والتحكم في درجة الحرارة ، ورصد جميع إجراءات التشوه بالمجهر10. نحن هنا تقرير بالتفصيل صقل هذه الطريقة التغلغل قبلغراد لتقصير الوقت للعزلة وتوفير شريط فيديو تكميلي. في هذه الطريقة ، يستغرق تغلغل القلب حوالي 7 دقائق مع 10 مل من الإنزيمات ، وتزيد فترة الهضم القصيرة هذه من صلاحية الخلايا. هذه طريقة بسيطة لعزل خلايا القلب المفردة بجودة عالية دون الحاجة إلى إضافة مواد كيميائية ، مثل 2،3 بوتانديون monoxime (BDM)6،11 أو تورين5،8. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة سوف تخفض عتبة المهارة من هذه التقنية وتعزيز فائدة خلايا القلب الماوس في البحوث الأساسية.
نظرا لأن القلب عرضة بشدة للإصابة بالكيمياء ، فيجب الحفاظ على الوقت المستغرق لاستئصال القلب وغمره في CIB-EGTA البارد لوقف الانكماش قصيرا قدر الإمكان (<1 دقيقة). هذه هي الخطوة الهامة الأولى من هذا الأسلوب. وتتعلق الخطوة الحرجة الثانية باتجاه القلب. التوجه الخاص للقلب المقتطع في الخطوة 2.1.2 يجعل من السهل رؤية وإزالة الدهون والأنسجة الضامة حول الشريان الأورطي. بعد التنظيف حول الشريان الأورطي، ضع القلب المشدون مع الجانب السطحي الأمامي على لوحة التشوه. الخطوة الحاسمة الأخيرة تنطوي على إدخال إبرة الحقن. عند التقدم الإبرة نحو القلب، لا ينبغي فصل إبرة الحقن من لوحة التشوه من أجل الحفاظ على مسافة ثابتة من لوحة. يقع موضع الإدخال بالقرب من قمة البطين الأيسر. أدخل الإبرة بعناية دون التواء ، لأن مثل هذا التواء قد تكبير الحفرة. يمكن تقدير عمق إدخال الإبرة من خلال مشاهدة العلامة الحمراء. إذا تم إدخال الإبرة عميقة جدا، قد يخترق الطرف الحاجز البطيني ويدخل البطين الأيمن أو على الرغم من الصمام التاجي ويدخل الأذين الأيسر. بعد التأكد من اختفاء الدم من الشريان التاجي ، يجب إصلاح الإبرة بشريط على لوحة التشوه.
طول الأبهر أطول يجعل من الصعب المشبك الشريان الأورطي في الموقف الصحيح. إذا كان المشبك بعيدا جدا عن الأذين ، فقد يدور القلب بعد التسريب. لمنع هذا، قطع الشريان الأورطي فقط تحت الشريان العضدي لتقصير الشريان الأورطي قبل لقط.
إذا لم يبدأ الدم في التصريف بعد التشوه بسرعة أولية تبلغ 0.5 مل/دقيقة، فرفع السرعة إلى 1 مل/دقيقة. إذا لم يساعد ذلك، فقد يتم وضع إبرة الحقن بشكل غير صحيح، كما هو الحال في البطين الأيمن أو الحاجز البطيني أو جدار عضلة القلب الأيسر. في مثل هذه الحالة، قم بإزالة الإبرة على الفور وحاول إعادة إدخالها بالقرب من قمة البطين الأيسر. عند إدخال الإبرة عدة مرات، قد تتدفق الخلايا المهضومة من الثقوب المفتوحة. لاحظ أن هذا لا يؤثر عادة بشكل خطير على عزل الخلية.
يمكن للمشغلين مراقبة العملية الكاملة للتشويش المسبق للقلب باستخدام مجهر مجسم لمراقبة التغيرات في اللون والشفافية وإعادة تشغيل ضرب الأذينين جنبا إلى جنب مع الهضم. وينبغي أن يكون ما مجموعه 10 مل من مزيج الانزيم الحد الأقصى المطلوب، حتى بالنسبة للقلب القديم. في قلوب الشباب (5-7 أسابيع من العمر)، ونحن خفض حجم إلى 9 مل، وهو ما يشبه النهج عن طريق التغلغل الرجعية مع نفس مزيج الانزيم.
يحتوي الناطور في الطرد المركزي النهائي على حطام وخلايا دم وخلايا غير عضلية في حين أن الكريات تحتوي بشكل رئيسي على خلايا القلب وتلوث الخلايا غير العضلية ، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية. لتنقية خلايا القلب، هناك حاجة إلى مزيد من الخطوات. بشكل عام، يجب إعادة إنفاق بيليه في الوسط المناسب لثقافة الخلية وpreplateed لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية على طبق زراعة الخلايا النسيجية، ومن ثم إزالة بلطف cardiomyocytes عن طريق الأنابيب وprelating للثقافة.
يحتوي مزيج الإنزيم على تركيز منخفض من Ca2+ (0.3 mM). لذلك نحن احتضان الخلايا المهضومة في CIB-Ca2+-BSA (1.2 mM Ca2+) قبل إعادة الإنفاق النهائي مع محلول إعادة إنفاق الخلية (1.8 mM Ca2+) ، والزيادة التدريجية في Ca2 + تتجنب التسبب في تلف الخلايا7. طالما أن خلايا القلب المعزولة سليمة (خلايا هادئة بدون انكماش) فإن إجراء التكيف Ca2+هذا لا يؤثر على صلاحية الخلية في الفئران. وبما أن الخلايا التالفة تموت أثناء هذا الحضانة، فإننا نحصل بالتالي على مجموعة خلايا سليمة. وبالمثل، يمكن تخزين الخلايا العضلية الأذينية المعزولة السليمة (الخلايا الكوزة دون انكماش غير منتظم) في نفس محلول إعادة الإنفاق على الخلايا. ومع ذلك ، فإن الخلايا العضلية الأذينية تميل إلى أن تكون أكثر حساسية ليتم تخزينها مقارنة بالخلايا العضلية البطينية.
في المختبر، تكون طريقة العزل هذه ناجحة دائما تقريبا ما لم يفشل إدخال الإبرة في البطين الأيسر. كما نجحنا في عزل الخلايا عن القلب المتضخم الذي أعده الانقباض الأبهري العرضي الجراحي. ومع ذلك ، في الفئران القديمة ، والتي غالبا ما يكون احتشاءات عضلة القلب الصغيرة ، يتوقف التغلغل في بعض الأماكن ، مما يؤدي إلى هضم غير مكتمل وبالتالي انخفاض العائد(الشكل 1C)، على غرار طريقة الرجعية المستندة إلى Langendorff. في مثل هذه الحالات ، يمكن ملاحظة الشكل المشوه للقلب حتى في بداية التشوه.
هذه الطريقة التغلغلية السابقة للتحلل مفيدة لعزل خلايا القلب عن الفئران من مختلف الأعمار ولكن ليس الحيوانات الكبيرة ، مثل الأرانب والخنازير الغينية. قد يكون من الممكن تطبيق هذه الطريقة على الفئران الوليدية أو الصغيرة قبل فطمها.
واحدة من مزايا هذه الطريقة التغلغل قبل التحلل هو أنه يقلل من العقبات التقنية المرتبطة باستخدام أسلوب التغلغل الرجعي القائم على Langendorff لقلوب الفئران الصغيرة. الوقت اللازم للتشويش هو حوالي 7 دقائق مع 10 مل من الإنزيمات ، تزيد فترة الهضم القصيرة هذه من صلاحية الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يمكن من إجراء التشوه من خلال الدورة الدموية التاجية للقلب ، حتى بعد هضم الصمامات الأبهري. عزل الخلايا العضلية الأذينية عادة ما يتطلب Langendorff القائم على التحلل الرجعي والحضانة مزيد من الانزيمات17. هذا النهج التغلغل قبل التحلل، ومع ذلك، يمكن أن يتغلغل بعمق الأنسجة مع الانزيم لعزل الخلايا العضلية الأذينية.
في التجارب التي تستخدم الفئران متعددة، وينبغي تنظيف جهاز Langendorff قبل التغلغل في القلب التالي. ومع ذلك ، في الطريقة الحالية السابقة للتحلل ، طالما يتم إعداد العدد المطلوب من مجموعات الأدوات (مثل إبر المحاقن ولوحات التشويش) مسبقا ، يمكن إجراء التشوه بشكل مستمر.
نحن هنا تقرير المنهجية الأساسية للتشويش السابق للقلب الماوس باستخدام نفس الحلول مثل طريقة التغلغل الرجعية Langendorff القائم مع عدم وجود مواد كيميائية إضافية. يمكن تغيير تكوين البيرفوسات ليناسب الغرض من التجربة ، مثل استخدام المنظفات التي تحتوي على EGTA بدلا من الإنزيمات لصنع قلب منزوعالخلايا 18.
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفان ت. ياماموتو وY. موري على مساعدتهما في التجارب المورفولوجية. وقد دعم هذا العمل منحة في المعونة للبحوث العلمية (C) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (18K06871 إلى M.O.K. و 17K08536 إلى H.M).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |