Vi udviklede enforenklet metode til isolering af individuelle musehjerteceller af høj kvalitet ved antegrade perfusionsteknikken. Denne metode er Langendorff-fri og nyttig til isolering af ventrikulære og atrie myocytter eller interstitielle celler, såsom hjertefibroblaster eller forfædre.
I grundforskning ved hjælp af musehjerte er isolering af levedygtige individuelle kardiomyocytter et afgørende teknisk skridt at overvinde. Traditionelt er isolerende kardiomyocytter fra kaniner, marsvin eller rotter blevet udført via retrograd perfusion af hjertet med enzymer ved hjælp af et Langendorff-apparat. Der kræves dog en høj grad af dygtighed, når denne metode bruges med et lille musehjerte. En antegrade perfusionsmetode, der ikke bruger et Langendorff-apparat, blev for nylig rapporteret til isolering af musdiomyocytter. Vi rapporterer heri en komplet protokol for forbedret antegrade perfusion af det punkterede hjerte for at isolere individuelle hjerteceller fra voksne mus (8 – 108 uger gamle). Antegrade perfusion udføres ved at injicere perfusate nær toppen af venstre hjertekammer af det punkterede hjerte, hvis aorta blev fastspændt ved hjælp af en infusionspumpe. Alle procedurer udføres på en forvarmet varmemåtte under et mikroskop, hvilket gør det muligt at overvåge injektions- og perfusionsprocesserne. Resultaterne tyder på, at ventrikulær og atrie myocytter, og fibroblaster kan være godt isoleret fra en enkelt voksen mus samtidigt.
Generelt indebærer det første trin i enkeltcelleisoleringen af dissekeret væv at hakke vævet i små stykker efterfulgt af fordøjelsen af bindevævet og ekstracellulær matrix med enzymer. Kardiomyocytter kan dog ikke isoleres med en sådan snitningsmetode, da berigelse med ekstracellulære matrixkomponenter, herunder kollagen- og elastinfibre, gør myokardiet for svært at hakke, og kardiomyocytterne er meget følsomme over for hypoxi og andre ændringer i mikromiljøet. Ved hjælp af langendorff-baseret retrograd perfusionssystem1er der således udviklet en metode til at fordøje den ekstracellulære matrix med enzymer for at isolere individuelle kardiomyocytter fra hjertet2,3,4.
I musemodeller anvendes Langendorff-baseret retrograd perfusion af hjertet med enzymer også til isolering af individuelle kardiomyocytter5,6,7,8. Imidlertid kræver kannulationen af den lille og tynde museorta og dens montering på Langendorff-apparatet for at udføre retrograd perfusion en høj grad af dygtighed, da aortaens diameter i voksenhjertet er ca. 1,2 mm. Desuden tager det tid at udføre flere eksperimenter, da Langendorff-apparatet skal rengøres, før det næste hjerte gennemsyres.
Som et alternativ til retrograd perfusion blev der udviklet en ny metode til isolering af kardiomyocytter fra et voksent musehjerte uden et Langendorff-apparat. Denne epokegørende metode var baseret på antegrade perfusion af kranspulsårerne9. Vi har for nylig forbedret hvert trin i denne antegrade protokol, såsom fastspænding af aorta, nåleindføring og temperaturkontrol og overvåget alle perfusionsprocedurer med et mikroskop10. Vi heri rapporterer detaljeret om forfinelsen af denne antegrade perfusionsmetode for at forkorte tiden for isolation og give en supplerende video. I denne metode tager perfusionen af hjertet ca. 7 minutter med 10 mL enzymer, og denne korte fordøjelsesperiode øger cellernes levedygtighed. Dette er en simpel metode til isolering af enkelthjerteceller i høj kvalitet uden at kræve tilsætning af kemikalier, såsom 2,3-butanedion monoxime (BDM)6,11 eller taurin5,8. Vi mener, at denne metode vil sænke færdighedsgrænsen for teknikken og øge nytten af mus cardiomyocytes i grundforskning.
Da hjertet er meget modtageligt for iskæmi, bør den tid, det tager at fjerne hjertet og nedsænke det i iskold CIB-EGTA for at stoppe sammentrækning, holdes kort som muligt (<1 min). Dette er det første kritiske skridt i denne metode. Det andet kritiske skridt vedrører hjertets retning. Den særlige orientering af det punkterede hjerte i trin 2.1.2 gør det lettere at se og fjerne fedt og bindevæv omkring aorta. Efter rengøring omkring aorta, placere fastspændt hjerte med forreste overflade side op på perfusion plade. Det sidste kritiske trin indebærer indsættelse af injektionsnålen. Når kanylen føres mod hjertet, bør injektionsnålen ikke løsnes fra perfusionspladen for at opretholde en konstant afstand fra pladen. Placeringen af indsættelsen er nær toppen af venstre hjertekammer. Sæt nålen forsigtigt uden at vride, da en sådan vridning kan forstørre hullet. Dybden af indføringen af nålen kan estimeres ved at se det røde mærke. Hvis nålen er indsat for dybt, kan spidsen gennembore gennem ventrikulær septum og ind i højre ventrikel eller om mitralklap og ind i venstre atrium. Efter at have bekræftet blodets forsvinden fra kranspulsåren, skal nålen fastgøres med tape til perfusionspladen.
En længere aorta længde gør det vanskeligt at klemme aorta på den rigtige position. Hvis klemmen er for langt væk fra atrierne, kan hjertet rotere efter perfusate infusion. For at forhindre dette skal du afskære aorta lige under brachiocephalic arterien for at forkorte aorta før fastspænding.
Hvis blodet ikke begynder at aflade efter perfusion ved en starthastighed på 0,5 mL/min,skal hastigheden øges til 1 mL/min. Hvis det ikke hjælper, kan injektionsnålen placeres forkert, f.eks. I et sådant tilfælde skal du straks fjerne nålen og forsøge at indsætte den igen nær toppen af venstre ventrikel. Når nålen indsættes flere gange, kan fordøjede celler strømme ud fra de åbnede huller. Bemærk, at dette normalt ikke påvirker celleisolationen alvorligt.
Operatørerne kan overvåge hele processen med antegrade perfusion af hjertet ved hjælp af et stereoskopisk mikroskop for at observere ændringerne i farve og gennemsigtighed og genstart af atriernes slag sammen med fordøjelsen. I alt 10 mL enzymblanding bør være det maksimale, der kræves, selv for et gammelt hjerte. I yngre hjerter (5-7 uger gamle) reducerer vi volumenet til 9 mL, hvilket svarer til tilgangen via retrograd perfusion med samme enzymblanding.
Supernatanten ved den endelige centrifugering indeholder snavs, blodlegemer og ikke-myocytter, mens pellet hovedsageligt indeholder kardiomyocytter og forurener ikke-myokytter, såsom fibroblaster og endotelceller. For at rense kardiomyocytterne er der brug for flere trin. Generelt skal pelletpen genbruges i det relevante cellekulturmedium og forforstilles i 2 timer ved 37 °C på en vævscellekulturskål og derefter forsigtigt fjerne kardiomyocytterne ved pipettering og forberedelse til kultur.
Enzymet indeholder en lav koncentration på Ca2+ (0,3 mM). Vi inkuberer derfor fordøjede celler i CIB-Ca2+-BSA (1,2 mM Ca2+) før den endelige genopstpension med cellerepensionsopløsningen (1,8 mM Ca2+), og den gradvise stigning i Ca2+ undgår at forårsage celleskade7. Så længe de isolerede kardiomyocytter er intakte (hvilende celler uden sammentrækning) påvirker denne Ca2+-tilpasningsprocedure ikke celle levedygtighed hos mus. Da de beskadigede celler dør under denne inkubation, får vi derfor en sund cellegruppe. Tilsvarende kan isolerede intakte atrie myocytter (hvilende celler uden uregelmæssig sammentrækning) opbevares i samme cellerepensionsopløsning. Men atrie myocytter tendens til at være mere delikat at blive opbevaret sammenlignet med ventrikulær myocytter.
I laboratoriet er denne isolationsmetode næsten altid vellykket, medmindre nåleindføringen i venstre hjertekammer mislykkes. Det er også lykkedes os at isolere celler fra det hypertrophied hjerte udarbejdet af kirurgisk tværgående aorta indsnævring. Men hos ældre mus, som ofte har små myokardieinfarkter, ophører perfusion nogle steder, hvilket resulterer i ufuldstændig fordøjelse og dermed et lavt udbytte (figur 1C), svarende til den Langendorff-baserede retrograde metode. I sådanne tilfælde kan hjertets forvrængede form observeres selv i starten af perfusion.
Denne antegrade perfusionsmetode er nyttig til isolering af hjerteceller fra mus i forskellige aldre, men ikke større dyr, såsom kaniner og marsvin. Det kan være muligt at anvende denne metode på neonatal eller unge rotter før fravænning.
En af fordelene ved denne antegrade perfusionsmetode er, at den reducerer de tekniske hindringer, der er forbundet med at bruge langendorff-baseret retrograd perfusionsmetode til små musehjerter. Den tid, der kræves til perfusion, er ca. 7 minutter med 10 mL enzymer, denne korte fordøjelsesperiode øger cellernes levedygtighed. Derudover gør det det muligt at udføre perfusion gennem hjertets koronarcirkulation, selv efter at aortaklapperne er fordøjet. Isolering af atrie myocytter kræver normalt Langendorff-baseret retrograd perfusion og yderligere inkubation med enzymer17. Denne antegrade perfusion tilgang, dog, kan dybt gennemsyre vævet med enzymet til at isolere atrie myocytter.
I forsøg med flere mus skal Langendorff-apparatet rengøres, før det næste hjerte perfusing. I den nuværende antegrade-metode, så længe det ønskede antal instrumentsæt (f.eks. sprøjter nåle og perfusionsplader) fremstilles på forhånd, kan perfusion udføres kontinuerligt.
Vi heri rapporterer den grundlæggende metode til antegrade perfusion af musehjertet ved hjælp af de samme løsninger som langendorff-baseret retrograd perfusionsmetode uden yderligere kemikalier. Sammensætningen af perfusatet kan ændres, så den passer til formålet med forsøget, såsom at bruge et vaskemiddel, der indeholder EGTA i stedet for enzymerne til at lave et decellulariseret hjerte18.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker T. Yamamoto og Y. Mori for deres hjælp i morfologiske eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af en Grant-in-Aid for Scientific Research (C) fra Japan Society for the Promotion of Science (18K06871 til M.O.K. og 17K08536 til H.M.).
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |