Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Benmargstransplantasjonsprosedyrer hos mus for å studere klonisk hematopoiesis

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/61875
Automatic Translation
1, 4, 4, 4, 4, 4, 2, 3,4, 1,4
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

Summary

Vi beskriver tre metoder for benmargstransplantasjon (BMT): BMT med total kroppsbestråling, BMT med skjermet bestråling og BMT-metode uten prekondisjonering (adoptiv BMT) for studiet av klone hematopoiesis i musemodeller.

Abstract

Clonal hematopoiesis er en utbredt aldersrelatert tilstand som skyldes akkumulering av somatiske mutasjoner i hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer). Mutasjoner i førergener, som gir cellulær kondisjon, kan føre til utvikling av ekspanderende HSPC-kloner som i økende grad gir opphav til avkom leukocytter som skjuler den somatiske mutasjonen. Fordi klonisk hematopoiesis har vært assosiert med hjertesykdom, hjerneslag og dødelighet, er utviklingen av eksperimentelle systemer som modellerer disse prosessene nøkkelen til å forstå mekanismene som under denne nye risikofaktoren. Benmargstransplantasjonsprosedyrer som involverer myeloablativ kondisjonering hos mus, som total kroppsbestråling (TBI), brukes ofte til å studere immuncellenes rolle i kardiovaskulære sykdommer. Imidlertid er samtidig skade på benmargsnisjen og andre steder av interesse, som hjerte og hjerne, uunngåelig med disse prosedyrene. Dermed har laboratoriet vårt utviklet to alternative metoder for å minimere eller unngå mulige bivirkninger forårsaket av TBI: 1) benmargstransplantasjon med bestrålingsskjerming og 2) adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus. I skjermede organer bevares det lokale miljøet slik at analysen av klonnal hematopoiesis mens funksjonen til bosatte immunceller er uforstyrret. I motsetning har adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus den ekstra fordelen at både de lokale miljøene i organene og den hematopoietiske nisjen bevares. Her sammenligner vi tre forskjellige hematopoietiske cellerekonstitueringsmetoder og diskuterer deres styrker og begrensninger for studier av klonnal hematopoiesis ved kardiovaskulær sykdom.

Introduction

Clonal hematopoiesis (CH) er en tilstand som ofte observeres hos eldre individer og oppstår som følge av en utvidet hematopoietisk stamme og stamcelle (HSPC) klone som bærer en genetisk mutasjon1. Det har blitt antydet at i en alder av 50 år vil de fleste individer ha fått i gjennomsnitt fem eksoniske mutasjoner i hver HSPC2, men de fleste av disse mutasjonene vil resultere i små eller ingen fenotypiske konsekvenser for individet. Men hvis en av disse mutasjonene ved en tilfeldighet gir HSPC et konkurransefortrinn – for eksempel ved å fremme spredning, selvfornyelse, overlevelse eller en kombinasjon av disse – kan dette føre til den foretrukne utvidelsen av mutantklonen i forhold til de andre HSPCene. Som et resultat vil mutasjonen i økende grad spre seg gjennom det hematopoietiske systemet, da den muterte HSPC gir opphav til modne blodlegemer, noe som fører til en tydelig populasjon av muterte celler i perifert blod. Mens mutasjoner i dusinvis av forskjellige kandidatdrivergener har vært forbundet med kloniske hendelser i det hematopoietiske systemet, er mutasjoner i DNA-metyltransferase 3 alfa (DNMT3A) og ti elleve translokasjon 2 (TET2) de mest utbredte3. Flere epidemiologiske studier har funnet at personer som bærer disse genetiske mutasjonene har en betydelig høyere risiko for kardiovaskulær sykdom (CVD), hjerneslag og all-kausaldødelighet 3,4,5,6,7. Selv om disse studiene har identifisert at det finnes en sammenheng mellom CH og økt forekomst av CVD og hjerneslag, vet vi ikke om dette forholdet er årsakssammenheng eller et delt epifenomenon med aldringsprosessen. For å få en bedre forståelse av denne foreningen, er det nødvendig med riktige dyremodeller som riktig rekapitulerer den menneskelige tilstanden til CH.

Flere CH dyremodeller er etablert av vår gruppe og andre ved hjelp av sebrafisk, mus og ikke-menneskelige primater8,9,10,11,12,13,14. Disse modellene bruker ofte hematopoietiske rekonstitueringsmetoder ved transplantasjon av genetisk modifiserte celler, noen ganger ved hjelp av Cre-lox rekombinasjon eller CRISPR-systemet. Denne tilnærmingen gjør det mulig for analyse av en bestemt genmutasjon i hematopoietiske celler å vurdere hvordan det bidrar til sykdomsutvikling. I tillegg bruker disse modellene ofte congenic eller reporterceller for å skille effekten av mutantceller fra normale eller ville celler. I mange tilfeller er det nødvendig med et prekondisjoneringsregime for å lykkes med å engraft donor hematopoietiske stamceller.

For tiden kan transplantasjonen av benmarg til mottakermus deles inn i to hovedkategorier: 1) myeloablativ kondisjonering og 2) ikke-betinget transplantasjon. Myeloablativ kondisjonering kan oppnås ved en av to metoder, nemlig total kroppsbestråling (TBI) eller kjemoterapi15. TBI utføres ved å utsette mottakeren for en dødelig dose gamma- eller røntgenbestråling, generere DNA-pauser eller krysskoblinger i raskt dele celler, noe som gjør dem uopprettelige16. Busulfan og cyklofosfamid er to ofte brukte kjemoterapimedisiner som forstyrrer den hematopoietiske nisjen og på samme måte forårsaker DNA-skade på raskt delte celler. Nettoresultatet av myeloablativ forutsetning er apoptose av hematopoietiske celler, som ødelegger mottakerens hematopoietiske system. Denne strategien tillater ikke bare vellykket engraftment av donor HSPCs, men kan også forhindre graft avvisning ved å undertrykke mottakerens immunsystem. Imidlertid har myeloablativ forutsetning alvorlige bivirkninger som skade på vev og organer og deres bosatte immunceller samt ødeleggelse av den innfødte benmargsnisjen17. Derfor er det foreslått alternative metoder for å overvinne disse uønskede bivirkningene, spesielt med hensyn til skade på organer av interesse. Disse metodene inkluderer skjermet bestråling av mottakermus og adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus9,17. Skjerming av thorax, bukhule, hode eller andre regioner fra bestråling ved plassering av blybarrierer holder vev av interesse beskyttet mot de skadelige effektene av bestråling og opprettholder deres bosatte immuncellepopulasjon. På den annen side har adoptiv BMT av HSPCer til ikke-kondisjonerte mus en ekstra fordel fordi den bevarer den innfødte hematopoietiske nisjen. I dette manuskriptet beskriver vi protokollene og resultatene av HSPC-engraftment etter flere transplantasjonsregimer hos mus, spesielt levering av HSPC til TBI-mus, til mus delvis skjermet fra bestråling og til ikke-kondisjonerte mus. Det overordnede målet er å hjelpe forskere med å forstå de forskjellige fysiologiske effektene av hver metode, samt hvordan de påvirker eksperimentelle resultater i innstillingen av CH og kardiovaskulær sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Virginia.

1. Før forutsetning

  1. Plasser mottakermusene på antibiotika-supplert vann (5 mM sulfametoksazol, 0,86 mM trimetoprim) ~ 24 timer før bestråling. Dette er nødvendig for å forhindre infeksjon, da immunsystemet vil bli undertrykt etter bestråling, og opprettholdes i 2 uker etter bestråling. På dette tidspunktet, supplere mus med en ernæringsmessig / hydrering gel for å oppmuntre fôring og for å forhindre vekttap og dehydrering etter bestråling.

Figure 1
Figur 1: Bilder som viser ulike forhåndskondisjoneringsoppsett. (A) Pie-cage totalt kroppsbestråling oppsett ved hjelp av gamma-ray (Cesium-137): Strålingsstrålen kommer fra baksiden av bestråleren i y-akseretningen (horisontal stråling). (B) Musebur total kroppsbestråling oppsett ved hjelp av røntgen: Museburet er plassert i reflekterende kammeret. Strålingsstrålen kommer fra toppen av bestråleren i form av en kjegle (vertikal stråling). Avstanden fra strålingskilden til buret er 530 mm. (C) Justerbar skuff i røntgenbestråler: Dette oppsettet brukes til delvis skjermet bestråling ved hjelp av røntgen. Strålingsstrålen kommer fra toppen av bestråleren i form av en kjegle (vertikal stråling). Avstanden fra strålingskilden til brettet er 373 mm, og radiusen er 250 mm. (D) Thorax-skjerming: Bedøvede mus plasseres på et brett. Musene er plassert invertert til hverandre i liggende posisjoner med armer og ben helt utvidet. Den nedre enden av blyskjoldet er på linje med xiphisternum-beinet og den øvre enden med tymusen. (E) Abdominal-skjerming: Bedøvede mus er plassert som i thorax-skjermingsoppsettet med den nedre enden av blyskjoldet på linje med anusen og den øvre enden under membranen. (F) Head-shielding bestråling oppsett ved hjelp av gamma-ray (Cesium-137): Bedøvelse musens forpaws er teipet ned og musen er plassert i en konisk restrainer. Det svarte blyskjoldet (merket) dekker musens hode og ører. Strålingsstrålen kommer fra baksiden av bestråleren i retning av Y-aksen (horisontal stråling). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Forutsetning av mottakermus (valgfritt)

  1. Total kroppsbestråling
    1. Plasser mottakermus i et jevnt skiver paibur, eller et musebur i reflekterende kammer innenfor den beregnede radiusen for å få samme bestrålingsdose; Det anbefales imidlertid maksimalt 8 mus per paibur og 5 mus per musebur for å sikre jevn bestråling (Figur 1A, B).
    2. For å oppnå fullstendig myeloablasjon, sørg for at mottakermus får en total strålingsdose på 11 Gy i to 5,5 Gy-fraksjoner skilt med et intervall på 4-24 timer.
      MERK: Selv om optimal engraftment kan oppnås ved å implementere et intervall på 4 timer mellom brøker, kan dette utvides til et intervall på 24 timer, noe som kan være nyttig når arbeidskraft og/eller bestråleren ikke er tilgjengelig.
  2. Delvis skjermet bestråling
    1. Bedøv mottakermusene ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (80–100 mg/kg) og xylazin (5–10 mg/kg). Selvbeherskelsen av musebevegelsen er avgjørende for å sikre jevn bestråling og effektiv beskyttelse av målorganene under skjermingsprosessen.
    2. For thorax- og mageskjerming orienterer du strålingsstrålen til røntgenstrålen vertikalt til musen (Figur 1C).
      1. Plasser de bedøvede musene på en flat plate, sentrert strålingskilden ovenfra. Plasser musene invertert til hverandre i en liggende stilling med armer og ben helt forlenget (Figur 1D,E).
        MERK: Røntgenbestråleanlegg, for dette eksperimentet, gjør at to mus om gangen kan plasseres innenfor den effektive radiusen som tillater jevn bestråling. Mens den effektive radiusen beregnes basert på avstanden mellom strålingskilden og brettet, vil antall dyr som samtidig kan bestråles avhenge av den spesifikke bestråleren.
      2. Fest musenes poter på platen ved hjelp av tape for å sikre at musene blir immobilisert under bestrålingsprosedyren. Plasser blyskjerming slik at den dekker områder som krever beskyttelse.
      3. For thoraxskjerming, forbered blyskjoldet ved å måle lengden fra musens xiphisternumben til tymus og beregne tykkelsen som vil gi tilstrekkelig beskyttelse mot kilden til bestråling. Plasser blyskjermingen slik at den nedre enden stemmer overens med xiphisternum-beinet. Den øvre enden av blybarrieren passer i nærheten av tymusen (figur 1D).
      4. For abdomen skjerming, forberede blyskjoldet ved å måle lengden fra musens anus til membranen og beregne tykkelsen som vil gi tilstrekkelig beskyttelse mot kilden til bestråling. Plasser blyskjermingen slik at den nedre enden stemmer overens med anusen. Den øvre enden av blyskjoldet passer under membranen (figur 1E).
        MERK: Lokalisering av blyskjoldet for å være konsistent blant kohorter kan redusere noe variasjon med hensyn til musenes størrelse.
    3. For hodeskjerming orienterer du strålingsstrålen til Cesium-bestråleren horisontalt til musen.
      1. Tape forsiktig forpaws av en bedøvet mus til magen. Dette sikrer at armene får en full dose bestråling og ikke er dekket av skjoldet.
      2. For hodeskjerming, plasser musen i en konisk restrainer, som passer inn i et blyskjold. Når musen er inne i den koniske holdeplassen, skyver du festestøtten inn i sporet innenfor ledeskjoldet (Figur 1F). Blyskjoldet skal helt dekke musens hode og ører (~ 3,2 cm), slik at resten av musens kropp blir utsatt for bestråling. Posisjonen til holderen inne i skjoldet kan justeres for å passe til dyr i forskjellige størrelser ved å skyve den lenger inne i eller utenfor skjoldet.
      3. Plasser mus inne i bestråleren, vinkelrett på kilden for bestråling.
    4. Utsett mus for to 5,5 Gy-fraksjoner av bestråling (total dose på 11 Gy) separert med et intervall på 4–24 timer.
    5. Etter hver bestrålingsfraksjon plasserer du burene med bedøvede mus på oppvarmede matter eller under røde varmelamper for å forhindre hypotermi og hjelpe til med utvinning fra anestesi.
      MERK: Det må utvises forsiktighet for ikke å overopphete den bedøvede musen når du bruker en lampe, da de ikke kan unnslippe varmen. Som beskrevet ovenfor kan plasseringen av dyr og tykkelsen på blyskjoldet variere mellom studier basert på de spesifikke egenskapene til bestråleren (strålingstype / retning av stråle, etc.). Forskere må justere sine eksperimenter deretter.

3. Benisolasjon

MERK: Ideelt sett bør donormus og mottakermus være like i alderen, og innen 8-12 uker gammel. Å bruke minst 3 mus som donorer (i stedet for enkeltdonor) foretrekkes for å minimere for heterogenitet (selv når du bruker mus med samme genotype). Omtrent 40 millioner ukfraksjonerte benmargsceller kan fås fra seks bein (to lårben, to tibias og to humeri) av en enkelt mus. Transplantasjon av 5 millioner benmargsceller til hver mottakermus vil vanligvis sikre engraftment.

  1. Euthanize donor mus ved cervical dislokasjon uten anestesi (foretrukket metode for å unngå kjemisk forurensning av celler) og plassere hver mus på en absorberende pute.
  2. Desinfiser huden ved hjelp av en 70% etanolspray.
  3. Lag et lite tverrsnitt i huden under ribbeburet og hold huden tett på hver side av snittet, rive i motsatte retninger mot hodet og føttene. Skrell av huden fra alle lemmer.
  4. Klipp over skuldrene og albueleddene, og fjern de vedlagte musklene og bindevevene ved hjelp av en Kimwipe for å få humeri.
  5. Forvreng forsiktig hofteleddene mellom lårbenet og hoftebenene. Bruk stump saks til å kutte langs lårbenet og løsne bena. Klipp over kneleddet for å skille lårbenet og tibia, og fjern forsiktig de vedlagte musklene og bindevevet ved hjelp av en Kimwipe for å høste lårbenet og tibia.
    MERK: Vær spesielt oppmerksom på å holde benefysen intakt i dette trinnet. Kast eventuelle ødelagte bein på grunn av tap av sterilitet. Hofteben og ryggben kan samles i tillegg til lårben, tibia og humerus. For å samle ryggben, kan en mørtel og en pestle brukes til å knuse beinene i stykker og høste benmargscellene.
  6. Plasser de isolerte beinene fra mus av samme genotype i tilsvarende 50 ml konisk rør som inneholder 20 ml iskald steril PBS, og hold den på is til videre bruk. Vær spesielt oppmerksom på å plassere beinene riktig i rør med matchede genotyper.
  7. Gjenta trinnene ovenfor for hvert donordyr som skifter hansker mellom hver mus. Rengjør også saks og andre instrumenter med 70% etanol mellom hver mus.

4. Benmargscelleisolasjon

MERK: Utfør følgende trinn i et kabinett i biosikkerhetsklasse II.

  1. Forberedelse av rørsett: Lag et lite hull i bunnen av et sterilt 0,5 ml mikrosenterrør ved hjelp av en 18 G nål og legg det i et sterilt 1,5 ml mikrosenterrør, som inneholder 100 μL iskald steril PBS nederst.
    MERK: Siden bare seks bein kan passe inn i 0,5 ml mikrosenterrør, anbefales det å forberede tilstrekkelige rørsett til å behandle alle beinene samtidig.
  2. Aspirer PBS og overfør de isolerte beinene til en steril 100 mm cellekulturrett. Hold hvert bein ved hjelp av fine tang, kutt forsiktig epifysene av hver ende ved hjelp av små saks som ble sterilisert i en autoklav. Plasser de kuttede beinene i de forberedte rørsettene.
  3. Sentrifuger rørene ved 10.000 x g i 35 s ved 4 °C.
  4. Etter sentrifugering, bekreft at benmargen er fjernet fra beinene. Bein skal virke hvite og gjennomskinnelige med en relativt stor rød pellets på bunnen av 1,5 ml mikrocentrifugerøret. Kast mikrosenterrøret på 0,5 ml.
    MERK: Hvis den visuelle inspeksjonen ikke oppdager benmarg på bunnen av 1,5 ml-røret, kutt benet igjen og gjenta trinn 4.3.
  5. Resuspend benmargen i 1 ml iskald PBS, og overfør deretter cellefjæringen fra samme genotype til et matchet konisk rør på 50 ml.
  6. Fjern cellene ved å sende dem gjennom en 18 G nål med en 10 ml sprøyte 10 ganger.
  7. Filtrer enkeltcellesuspensjoner gjennom en 70 μm cellesil. Tilsett ekstra iskald PBS til et endelig volum på 10 ml, og resuspender cellene gjennom skånsom bruk av pipettehjelp.
  8. Sentrifuge ved 310 x g i 10 min ved 4 °C.
  9. Aspirer den supernatante og resuspend cellepelleten med 10 ml serumfrie RPMI-medier. Spar 30 μL av dette materialet for celletelling.
  10. Bestem cellekonsentrasjon med en celleteller, og beregn volumet av celleoppheng som kreves for transplantasjonen. For eksempel en 100% BMT kreves 5 x 106 benmargceller for hver mottakermus.
    MERK: For en konkurransedyktig BMT, lag totalt 5 x 106 benmargsceller som består av en blanding av donorceller (f.eks. CD45,2+) og konkurrentceller (f.eks. CD45,1+). Forberedelse av ekstra benmargsceller anbefales på det sterkeste. For eksempel, hvis det er 10 mottakermus per eksperimentell gruppe, forbereder vi vanligvis nok celler for 12 mottakermus.
  11. Overfør det beregnede volumet av cellefjæring til et nytt 50 ml konisk rør. Sentrifuge ved 310 x g i 10 min ved 4 °C.
  12. Aspirer supernatanten og resuspend cellene ved hjelp av den beregnede mengden serumfritt RPMI-medium for å oppnå riktig celletetthet og volum. Vanligvis er 200 μL det optimale volumet for en retro-orbital injeksjon.

5. Transplantasjon av benmargsceller til bestrålede mus

  1. Bedøv mottakermusene med 5% isofluran.
  2. Mens mus er bedøvet, injiser sakte 200 μL benmargsceller i retro-orbital vene ved hjelp av en 28-30 G nål med en insulin sprøyte.
    1. Alternativt kan du utføre levering av donorcellene ved hale vene intravenøs injeksjon og femoral intramedullær injeksjon, med et maksimalt volum på henholdsvis 0,2 ml og 25 μL.
  3. Når cellene er injisert, legg en dråpe proparakainholdige øyedråper på overflaten av øyet for smertelindring. Dyret kan da få lov til å gjenvinne bevisstheten.

6. Transplantasjon av benmargsceller til ikke-kondisjonerte mus

  1. Bedøv mottakermusene ved innånding av 5% isofluran.
  2. Injiser 5 x10 6 ukfraksjonerte benmargsceller fra enten genotype retro-orbitalt i ikke-bestrålede mottakermus med 28–30 G insulinsprøyte.
  3. Gjenta trinn 6.1 og 6.2 over 3 påfølgende dager, slik at mottakermusene blir transplantert med totalt 1,5 x 107 benmargsceller.
    MERK: Fordi adoptiv-BMT uten prekondisjoneringsprosedyre krever benmargstransplantasjon i 3 påfølgende dager, bør man forsøke å skifte øyne for hver injeksjon.
  4. Etter injeksjon, administrer en dråpe proparakainholdige øyedråper til det berørte øyet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å sammenligne effekten av tre BMT/prekondisjoneringsmetoder på donorcelle-engraftment, ble fraksjonene av donorceller i perifert blod og hjertevev analysert ved strømningscytometri ved 1 måned etter BMT. Isolerte celler ble farget for spesifikke leukocyttmarkører for å identifisere de forskjellige undergruppene av leukocytter. I disse eksperimentene ble wild-type (WT) C57BL/6 (CD45.2) donorbenmargceller levert til WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) mottakermus for å skille donorceller fra mottakerens celler. Strømningscytometri gating strategier som ble brukt er beskrevet tidligere av Wang et al.9 i Supplerende figur 1.

Den totale kroppsbestrålingen (TBI) behandlet gruppe fikk 5 x 106 benmargsceller etter en total dødelig strålingsdose på 11 Gy i to 5,5 Gy-fraksjoner skilt med et 4 h intervall. I perifert blod av mottakermus ble monocytter, nøytrofiler og B-celler i stor grad ablated og erstattet av avkom av donorbenmargsavledede celler. I tillegg ble den bosatte hjertemonocytten og nøytrofilpopulasjonen i hjertene til mottakermus nesten fullstendig erstattet av donor-avledede celler (Figur 2A).

I den delvis skjermede bestrålingsgruppen ble mottakermus bestrålet med thoraxskjold og transplantert med 5 x 106 benmargsceller etter en total strålingsdose på 11 Gy i to 5,5 Gy-fraksjoner separert med et 4 h intervall. I motsetning til TBI-gruppen var bidraget fra donor-avledede celler til hjerteimmunceller beskjeden, noe som sannsynligvis gjenspeiler de kombinerte effektene av å beskytte de lokale immuncellene i hjertene til mottakermus og den fysiologiske repopuleringen av benmargsavledede donorceller fra perifert blod. Mottakermus benmarg celler i skjermede områder er også sannsynlig å ha bidratt til perifer blod rekonstituering, noe som reduserer prosentandelen av donor avledede celler i perifert blod sammenlignet med TBI behandlet gruppe (Figur 2B).

I gruppen uten BMT prekondisjonering (adoptiv BMT) ble mottakermus transplantert med 5 x 106 benmargsceller over 3 påfølgende dager. Ved 4 uker etter BMT var andelen donoravledede celler i perifert blod og hjerte påviselig. (ca. 5 %) (Figur 2C).

For å illustrere hvordan den adoptive BMT-modellen kan brukes på studiet av CH-modellen, ble CD45.2+ donorbenmargsceller (WT eller Tet2-/-) transplantert i CD45.1+ mottakermus. Mottakere uten kondisjonering ble transplantert med 5 x 106 benmargsceller hver dag i 3 påfølgende dager (i totalt 1,5 x 107, n = 5-6 per gruppe). Strømningscytometrisk analyse av perifert blod ble utført 4, 8, 12 og 16 uker etter transplantasjon. De Tet2-mangelfulle donorcellene ga et konkurransefortrinn og utvidet seg gradvis over tid; WBCer, monocytter, Ly6Chi monocytter, nøytrofiler, T-celler og B-celler økte betydelig over tid. Sammenlignet med de Tet2-mangelfulle donorcellene som ble engrafert inn i mottakermus, viste mottakermus engrafted med WT-donorceller mindre signifikant klonisk utvidelse av donorceller (Figur 3). I samsvar med det kliniske paradigmet av klonisk hematopoiesis, påvirker utvidelsen av Tet2-mangelfulle celler ikke det absolutte antallet av de forskjellige blodcelletypene9 (data ikke vist).

Figure 2
Figur 2: Strømningscytometrisk analyse av blod og hjerte ved hjelp av ulike metoder for forutsetning. Flow cytometrisk analyse av perifert blod og hjerte ble utført 1 måned etter benmargstransplantasjon. For å skille donorceller fra mottakernes celler ble CD45.1+ mottakermus transplantert med CD45.2+ donorbenmargsceller. (A) 5 x 106 benmargsceller ble transplantert etter to brøkdeler av total kroppsbestråling (2 x 5,5 Gy, 4 h intervall, n = 3). (B) 5 x 106 benmargsceller ble transplantert etter to brøkdeler av total kroppsbestråling med thoraxskjerming (2 x 5,5 Gy, 4 t intervall, n = 10). (C) Mottakere uten kondisjonering ble transplantert med 5 x 106 benmargsceller i 3 påfølgende dager (i totalt 1,5 x 107, n = 4). Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM. Totale WBCer er definert som CD45+; Nøytrofiler som Ly6G+; Ly6Chi monocytter som CD115+, Ly6G-og Ly6C+; Ly6Clo monocytter som CD115+, Ly6G-og Ly6C-; B celler som CD45R+; CD4+ T celler som CD3e+ og CD4+; CD8+ T celler som CD3e+ og CD8+; og Makrofager som CD64+, Ly6G-og Ly6C-. (WBC: hvite blodlegemer, Neut: nøytrofiler, Mono: monocytter, Mac: makrofager). Figur 2A;C er endret fra Wang et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Klonisk utvidelse av Tet2-mangelfulle celler ved bruk av adoptiv BMT til ikke-betingede mus. CD45.2+ donorbenmargsceller (WT eller Tet2-/-) ble transplantert til CD45,1+ mottakermus. Mottakere uten kondisjonering ble transplantert med 5 x 106 benmargsceller hver dag i 3 påfølgende dager (i totalt 1,5 x 107, n = 5-6 per gruppe). Strømningscytometrisk analyse av perifert blod ble utført etter 4, 8, 12 og 16 uker etter transplantasjon. Brøkdelen av CD45,2+ donorceller i hver populasjon vises. (A) WBCer (B) Mono (C) Ly6Chi mono (D) B celler (E) T celler. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM. WBCer er definert som CD45+; Nøytrofiler som Ly6G+; Ly6Chi monocytter som CD115+, Ly6G-og Ly6C+; Ly6Clo monocytter som CD115+, Ly6G-og Ly6C-; B celler som CD45R+; CD4+ T celler som CD3e+ (WT: wild-type, WBCs: hvite blodlegemer, Mono: monocytter) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For studier av klonisk hematopoiesis beskrev vi tre metoder for BMT: BMT med total kroppsbestråling, BMT med bestråling med delvis skjerming, og en mindre vanlig BRUKT BMT-metode som ikke innebærer pre-conditioning (adoptiv BMT). Disse metodene har blitt brukt til å vurdere effekten av klonisk hematopoiesis på kardiovaskulær sykdom. Forskere kan endre disse metodene tilsvarende for å passe til det spesifikke formålet med studien.

Clonal hematopoiesis modeller
Clonal hematopoiesis er fenomenet der mutante hematopoietiske celler konkurrerer med ville celler og oppnår klonisk dominans over tid. For å lage en modell av denne konkurransen kan mus administreres benmarg, som består av en blanding av genetisk forskjellige celler. Vanligvis vil denne blandingen inkludere mutant- og wild-type celler, som har blitt merket med en fluorescerende tag eller forskjellige pan-leukocyttmarkører (dvs. CD45.1 og CD45.2). Når vi for eksempel lager modeller som etterligner Tet2-mediert CH, utfører vi en konkurransedyktig benmargstransplantasjon til dødelig bestrålede mottakere som vanligvis innebærer blanding av 90% av cellene som stammer fra CD45.1 Tet2+/+ givere og 10% av cellene som stammer fra CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- eller kontroll Tet2+/+ donorer8. Flow cytometrideteksjon av CD45-variantene ved hjelp av spesifikke monoklonale antistoffer gjør det mulig å skille donorceller (CD45.1-/CD45.2+) fra konkurrentceller (CD45.1+/CD45.2-) i blodet, og vurdere testcellenes kloniske dynamikk over tid. Ved å gjøre det har vi vært i stand til å observere en gradvis økning i donor chimerism av Tet2-mangelfulle celler, mens prosentandelen av wild-type celler forblir på ca 10%. Denne eksperimentelle innstillingen etterligner det menneskelige scenariet til individer som bærer en TET2 somatisk mutasjon, siden disse mutasjonene i utgangspunktet bæres av et lite antall HSPCer, som gradvis vil ekspandere over tid. Bruk av denne tilnærmingen i kardiovaskulære sykdomsmodeller av aterosklerose og hjertesvikt har ført til dokumentasjon av en potensiell årsakssammenheng mellom Tet2-mediertCH og CVD8,9,10.

Ved bruk av disse tilnærmingene bør forskeren ta hensyn til mulige forvirrende effekter generert av TBI. Selv om TBI før transplantasjon muliggjør en høy grad av HSPC-engraftment, vil denne prekondisjoneringen føre til flere uønskede effekter utenfor det hematopoietiske systemet. Det er dokumentert at TBI kan føre til betennelse, skade og fibrose i flere organsystemer, inkludert hud, lever, nyrer, lunger, benmarg, hjerte, hjerne, etc.18,19,20. Disse bivirkningene kan påvirke kardiovaskulære organer som studeres negativt, og de endrer også sykdomspatogenese21,22. Et bemerkelsesverdig eksempel er effekten av bestråling på beboermakrofager i hjertet. Bestråling av thoraxen resulterer i en markert erstatning av hjerte-bosatte makrofager med sirkulerende monocytt-avledede makrofager. Studier har vist at hjerte-bosatte makrofager viser tydelige egenskaper i forhold til sirkulerende monocytt-avledede makrofager som vil engraft i hjertet etter strålingsskade. I sykdomsmiljøer antas hjerte-bosatte makrofager å spille en kardiobeskyttende rolle, mens infiltrering av blodbårne makrofager har blitt rapportert å fremme skade og betennelse23. Derfor er det tenkelig at å erstatte hjemmehørende hjerteimmuneceller med blodbårne celler vil endre de patologiske prosessene som studeres, noe som bidrar til kardiovaskulær sykdom24,25,26. På samme måte, i hjernen, resulterer TBI i uttømming av bosatt mikroglia og erstatning ved perifert avledede makrofager27,28. Mens perifert avledede makrofager kan oppføre seg som mikrogliale celler, opprettholder de en unik funksjonell og transkripsjonell identitet sammenlignet med monocytt-avledet mikroglia28. Derfor er det mulig at sykdomsoppfølgeren kan endres, spesielt når man studerer sykdommer som iskemiske slag. For å unngå disse forvirrende effektene, kan det anbefales å skjerme thoraxen og hodet. Dette er fordelaktig fordi det gir beskyttelse til henholdsvis hjerte og hjerne; og det opprettholder også deres bosatte immunceller intakt, bedre recapitulating den menneskelige tilstanden til CH. Men som nevnt tidligere, resulterer skjerming i en lavere chimerisme sammenlignet med TBI pre-conditioning, som i hovedsak eliminerer alle vertens hematopoietiske celler.

En annen viktig hindring i pre-conditioning er dens skadelige effekt på benmargsnisjen. Selv om bestrålingsindusert skade på BM-nisjen kan gjenopprettes i suboptimal grad, er det uklart om naiv hematopoiesis gjenopprettes i disse skadede mikromiljøet. I tillegg starter transplantasjon av blandede HSPCer i tom BM et kappløp om spredning mellom kloner, i stedet for den enkle "konkurransen" for en nisje som er okkupert av en villtype HSPC - som antagelig er det som skjer i CH. Dermed kan en potensielt å foretrekke tilnærming til å studere CH være den adoptive BMT-metoden, der BM-celler overføres til mottakermus uten prekondisjonering. Denne adoptiv BMT uten pre-conditioning metode minimalt påvirker den pågående naive hematopoiesis, mest trofast recapitulating CH observert hos mennesker29. Figur 2C viser nivået av chimerisme ved 1 måned etter transplantasjon uten prekondisjonering. Mens donor chimerismen er lav på dette tidlige tidspunktet, finner vi en gradvis økende brøkdel av Tet2-mangelfulle kloner over tid, som presentert i figur 3. Det skal bemerkes at denne modellen er mest nyttig når mutantcellene har et konkurransefortrinn i forhold til ville celler under homeostatiske forhold som Tet2-mangelfulle celler. Når Tet2-mangelfulle celler er engraftert, er det en markert utvidelse i ulike leukocyttpopulasjoner som nøytrofiler, monocytter, NK-celler og B-celler. En langsommere ekspansjon ble notert i T-celler, antagelig på grunn av den lengre halveringstiden til denne befolkningen.

Utvidelsen av Tet2-mangelfulle celler har blitt observert ikke bare i perifert blod, men også i flere andre vev, inkludert benmarg, lever og nyre, med forskjellig dynamikk av hematopoietisk celle rekonstituering9. For eksempel beskrev laboratoriets tidligere publiserte artikkel benmargscelle chimerismen til WT og Tet2-mangelfulle donorceller som er engrafert i CD45.1-mottakermus 8 måneder etter adoptiv BMT9. Tet2-mangelfulle donorceller transplantert i CD45.1-mottakermus har vist et konkurransefortrinn i forhold til umoden avstamning-Sca1+c-Kit+ (LSK) celler, kortsiktige og langsiktige HSC-celler og multipotente forfedre (MPPer) sammenlignet med WT-donorceller transplantert i CD45.1-mottakermusene. I tillegg, som Tet2-deficient donor celle engrafted mottaker mus, utvikler de en aldersrelatert kardiomyopati fenotype uten eksogene faktorer som forårsaker hjertedysfunksjon, og dermed rekapitulerer effekten av kloniske hematopoiesis på en måte som ligner på aldrende mennesker. Denne observasjonen ble ledsaget av økt grad av chimerisme i hjerte-nøytrofiler og Ly6Chi monocytter. Samlet kan dette adoptive BMT-regimet brukes på fremtidige studier som kan utvide vår forståelse av sammenhengen mellom kardiovaskulær sykdomsutvikling og kloniske hematopoiesis på et mer avansert nivå.

Oppsummert beskrev vi tre BMT-metoder og diskuterte deres anvendelse i å generere CH-modeller. CH er forbundet med dårligere prognoser ved hjerte- og karsykdommer som aterosklerose og hjertesvikt. Selv om det er gjort betydelige fremskritt, er studien av årsakssammenhengene mellom CH og CVD fortsatt i sin spede begynnelse, og videre undersøkelser er nødvendig ved bruk av optimaliserte dyremodeller. Vi håper at disse protokollene tillater forskere å velge en mer fysiologisk hensiktsmessig metode for BMT, som minimaliserer potensielle forvirrende effekter på kardiovaskulærsystemet, og til slutt gir studier som utvider vår forståelse av hvordan CH bidrar til kardiovaskulær sykdom.

Design av blyskjerming
Tykkelsen på blyskjoldet vil bli diktert av typen bestråling som brukes til å indusere myeloablasjonen. Røntgen- eller gammastråletyper av stråling brukes ofte til eksperimentell myeloablasjon, men varierer når det gjelder frekvens, bølgelengde og fotonenergi. Når det gjelder skjerming, er fotonenergien, som beskriver energien eller hastigheten som strålene reiser på, den viktigste parameteren. Vanligvis har strålingskilde røntgenstråler en energi på 160 kVp, mens cesium-137 kilder, som avgir gammastråler, har en energi på 662 KeV. Energien som slippes ut av disse strålingskildene tilsvarer deres penetrasjonskraft, med høyere energier som har større penetrasjonskraft. Derfor er det nødvendig med en større tykkelse på blyskjoldet ved bruk av cesiumkildebaserte bestrålere sammenlignet med bruk av røntgenbaserte bestrålere. Røntgenbasert bestråling, som vi bruker når vi utfører thorax og abdominal skjerming, krever et 7 mm tykt blyskjold for å gi tilstrekkelig beskyttelse. Men for cesium 137 kilder, som vi bruker når vi utfører hodeskjerming, krever blyskjold å være minst 1 tomme tykk for å gi tilstrekkelig beskyttelse.

Blyskjold for bruk i røntgenbestrålere kan kjøpes fra kommersielle leverandører. Alternativt kan blyplater kuttes i størrelse for enten å passe rundt dyrets kropp eller for å passe rundt en restrainer (se figur 1). Når du bruker en cesiumbasert bestråler, bør bly murstein, som er betydelig tykkere, brukes og kan tilpasses av selskaper som spesialiserer seg på å lage denne typen skjold. For eksempel, for hodeskjoldet, spesialdesignet vi en bly murstein for å holde en 50 ml konisk rørbeherskelse (se figur 1F). Dyret er i stand til å passe inne i restraineren, som deretter slisses inn i et hull laget i mursteinen, for å gi 1,5 tommer beskyttelse mot bestrålingen. Det er viktig at alle blyskjold belegges enten med maling eller tape for å forhindre eksponering for blystøv, noe som kan være giftig.

Basert på utstyret og dets parametere kan forskere designe sine egne blyskjold for sine interessesteder. Her introduserte vi thorax, buk og hodeskjerming; Imidlertid kan andre steder som lem eller flanke også vurderes for skjerming. I tillegg, mens begge strålingskildene (Cesium-137 og røntgen) er egnet for benmargsablasjon og vellykket engraftment, har variasjon i rekonstituering av lymfoide og myeloide cellepopulasjoner blitt observert mellom Cesium-137 og røntgenbestrålingskilder30. Dermed bør forskere ta hensyn til de forskjellige fysiologiske responsene på strålingskilden for bruk i studier.

Doseringsintervaller
Doserings- og doseringsintervaller kan påvirke effektiviteten til donorcelle-engraftment og overlevelsesrate. Hos menneskelige pasienter kan høydosebestråling forårsake idiopatisk interstitiell lungebetennelse, gastrointestinal skade og kataraktdannelse. I musemodeller kan enkeltdosebestråling etterfulgt av benmargstransplantasjon gi lignende resultater og kan også påvirke overlevelsesraten31. Derfor anbefales fraksjonert bestråling sterkt for mus BMT-studiene. I tillegg kan doseringsintervallene for fraksjoner påvirke musens overlevelsesrate og rekonstitueringsrate, noe som fører til forskjellige brøkdeler av donorcelle chimerisme i hematologiske organer samt andre vev31. Dermed bør forskere være forsiktige med å designe en fraksjonert bestrålings doseringsplan for BMT-studier.

I forbindelse med overlevelsesrate og rekonstituering av immunceller viste vår lille studie at en gruppe mus som fikk total kroppsbestråling med en dødelig strålingsdose på 11 Gy i to 5,5 Gy-fraksjoner atskilt med en intervallgruppe på 24 timer, ikke hadde vesentlig andre resultater enn gruppen som fikk samme TBI-dosering med 4 timers intervall (se tabell 1). Men med thorax-skjerming BMT så intervallgruppen på 24 timer ut til å vise mindre effektivitet av donorcelle chimerisme sammenlignet med 4 h intervallgruppen. En mulig forklaring på dette resultatet er at bestråling med 24 h intervall kanskje ikke var tilstrekkelig til å fjerne mottakerens immunotokmpente celler fordi de langvarige intervallene ga mottakermus tilstrekkelig tid til å reparere skadede celler. I tillegg beskytter thoraxskjerming delvise ryggbein som også inneholder mottakerens HSC-er. Dermed kan de resterende og gjenvunnet immunompende mottakercellene ha angrepet donor-avledede celler og indusert et resultat som viste lavere engraftmenteffektivitet.

   

WBC (%) B-celle (%) T-celle (%) Mono (%) Ly6Chi mono (%) Ly6Clo mono (%) Nøytrofil (%)
TBI-BMT 4t intervall 97.4 ± 1.0 100 ± 0 59.1 ± 18.7 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
24t intervall 97.2 ± 2.2 100 ± 0 79.0 ± 8.1 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
thorax-skjerming BMT 4t intervall 56.2 ± 4.0 54.2 ± 6.2 0,5 ± 0,1 66.7 ± 6.1 63.8 ± 6.3 70,8 ± 5,7 82.0 ± 3.8
24t intervall 34.4 ± 3.1 34.8 ± 3.1 2.9 ± 1.7 45.0 ± 3.2 34.2 ± 3.6 56.2 ± 4.9 56 ± 10.0

Tabell 1: Effektiviteten til donorcelle-engraftment ved hjelp av ulike doseringsintervaller. Flow cytometrisk analyse av perifert blod ble utført 1 måned etter benmargstransplantasjon. WT CD45.2+ donorbenmargsceller ble transplantert i CD45.1+ mottakermus. 5 x 106 benmargsceller ble transplantert etter to brøkdeler av total kroppsbestråling (2 x 5,5 Gy) med eller uten thoraxskjerming separert med et intervall på 4 timer eller 24 timer. (n = 3–4 per gruppe).

Dyrepleie
Flere trinn som involverer mus er nødvendig for å lykkes med dette eksperimentet. Dermed er det nødvendig med ekstra oppmerksomhet på følgende punkter: For det første er levering av levedyktige donorceller avgjørende for vellykket engraftment. Man bør være riktig opplært i samlingen av intakte BM-celler og deres injeksjon i mottakermus. Konsekvenser av dårlig levering av celler inkluderer svikt i donor HSPCs å rekonstituere mottaker benmarg som fører til dødelighet. For det andre må det tas hensyn etter transplantasjon for å unngå infeksjon, spesielt etter myeloablativ terapi. Kontakt med patogener kan være dødelig, da mus blir forbigående immunodeficient etter bestråling. Som angitt ovenfor kan supplere drikkevannet med antibiotika redusere risikoen for dødelig infeksjon. Videre kan det å gi mottakerdyr ernæringsmessig / hydreringsgel minimere dehydrering og ernæringsmessige mangler som kan oppstå etter bestråling, da bestråling kan forstyrre tarmepitelet som fører til diaré32. Bure bør også byttes ofte for å redusere risikoen for fekale bakterier forurensning, dyr bør håndteres i en riktig dyreoverføringsstasjon, og mottakermusene bør overvåkes nøye for vekttap og tegn på nød eller smerte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health grants til K. Walsh (HL131006, HL138014 og HL132564), til S. Sano (HL152174), American Heart Association grant til M. A. Evans (20POST35210098), og et Japan Heart Foundation-tilskudd til H. Ogawa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-121 general supply
1.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-129 general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
Absolute Ethanol (200 prfof) Fisher chemical 200559 general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle Becton Dickinson 309626 general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) Becton Dickinson 395195 general supply
Cesium-137 Irradiator J. L. Shepherd  Mark IV equipment
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10 general supply
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09 general supply
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Ketamine Zoetis 043-304 injection
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimtech Science KCC34155 general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim TEVA 0703-9526-01 injection
Xylazine Akorn 139-236 injection
X-ray irradiator Rad source RS-2000 equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
  2. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
  4. Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
  5. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  6. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  7. Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
  8. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
  9. Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
  10. Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
  11. Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
  12. Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
  13. Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
  14. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
  15. Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
  16. Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
  17. Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
  18. Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
  19. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  20. Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
  21. Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
  22. Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
  23. Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
  24. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  25. Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
  26. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  27. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  28. Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
  29. Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
  30. Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
  31. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  32. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 171 klonnal hematopoiesis myeloablativ prekondisjonering ikke-myeloablativ kondisjonering hematopoietisk cellerekonstituering benmargstransplantasjon adoptivoverføring
Benmargstransplantasjonsprosedyrer hos mus for å studere klonisk hematopoiesis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, E., Evans, M. A., Doviak, H.,… More

Park, E., Evans, M. A., Doviak, H., Horitani, K., Ogawa, H., Yura, Y., Wang, Y., Sano, S., Walsh, K. Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (171), e61875, doi:10.3791/61875 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter