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Immunology and Infection

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/61875
Automatic Translation
1, 4, 4, 4, 4, 4, 2, 3,4, 1,4
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

Summary

Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.

Abstract

Die klonale Hämatopoese ist eine weit verbreitete altersbedingte Erkrankung, die sich aus der Anhäufung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) ergibt. Mutationen in Treibergenen, die zelluläre Fitness verleihen, können zur Entwicklung expandierender HSPC-Klone führen, die zunehmend zu Nachkommenleukozyten führen, die die somatische Mutation beherbergen. Da klonale Hämatopoese mit Herzerkrankungen, Schlaganfall und Mortalität in Verbindung gebracht wurde, ist die Entwicklung experimenteller Systeme, die diese Prozesse modellieren, der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen, die diesem neuen Risikofaktor zugrunde liegen. Knochenmarktransplantationsverfahren mit myeloablativer Konditionierung bei Mäusen, wie z. B. Ganzkörperbestrahlung (TBI), werden häufig eingesetzt, um die Rolle von Immunzellen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen. Eine gleichzeitige Schädigung der Knochenmarknische und anderer interessensvoller Stellen wie Herz und Gehirn ist bei diesen Verfahren jedoch unvermeidbar. Daher hat unser Labor zwei alternative Methoden entwickelt, um mögliche Nebenwirkungen durch TBI zu minimieren oder zu vermeiden: 1) Knochenmarktransplantation mit Bestrahlungsabschirmung und 2) adoptive BMT bei nicht konditionierten Mäusen. In abgeschirmten Organen bleibt die lokale Umgebung erhalten, was die Analyse der klonalen Hämatopoese ermöglicht, während die Funktion der ansässigen Immunzellen ungestört ist. Im Gegensatz dazu hat die adoptive BMT bei nicht konditionierten Mäusen den zusätzlichen Vorteil, dass sowohl die lokale Umgebung der Organe als auch die hämatopoetische Nische erhalten bleiben. Hier vergleichen wir drei verschiedene hämatopoetische Zellrekonstitutionsansätze und diskutieren ihre Stärken und Grenzen für Studien zur klonalen Hämatopoese bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Introduction

Klonale Hämatopoese (CH) ist eine Erkrankung, die häufig bei älteren Menschen beobachtet wird und als Folge eines erweiterten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellklons (HSPC) auftritt, der eine genetische Mutation trägt1. Es wurde vermutet, dass die meisten Individuen im Alter von 50 Jahren durchschnittlich fünf exonische Mutationen in jedem HSPC2erworben haben, aber die meisten dieser Mutationen werden zu wenig oder keinen phänotypischen Folgen für das Individuum führen. Wenn jedoch zufällig eine dieser Mutationen dem HSPC einen Wettbewerbsvorteil verschafft - z. B. durch die Förderung seiner Proliferation, Selbsterneuerung, Überleben oder einer Kombination davon - kann dies zu einer bevorzugten Expansion des mutierten Klons im Vergleich zu den anderen HSPCs führen. Infolgedessen wird sich die Mutation zunehmend durch das hämatopoetische System ausbreiten, da das mutierte HSPC zu reifen Blutzellen führt, was zu einer ausgeprägten Population mutierter Zellen im peripheren Blut führt. Während Mutationen in Dutzenden verschiedener Kandidatentreibergene mit klonalen Ereignissen innerhalb des hämatopoetischen Systems in Verbindung gebracht wurden, sind unter diesen Mutationen in DNA-Methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) und zehn elf Translokation 2 (TET2) am häufigsten3. Mehrere epidemiologische Studien haben ergeben, dass Personen, die diese genetischen Mutationen tragen, ein signifikant höheres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), Schlaganfall und gesamtverursachende Mortalität haben3,4,5,6,7. Während diese Studien festgestellt haben, dass ein Zusammenhang zwischen CH und erhöhter Inzidenz von CVD und Schlaganfall besteht, wissen wir nicht, ob dieser Zusammenhang kausal oder ein gemeinsames Epiphänomen mit dem Alterungsprozess ist. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, sind geeignete Tiermodelle erforderlich, die den menschlichen Zustand von CH korrekt rekapitulieren.

Mehrere CH-Tiermodelle wurden von unserer Gruppe und anderen mit Zebrafischen, Mäusen und nicht-menschlichen Primaten8,9,10,11,12,13,14erstellt. Diese Modelle verwenden häufig hämatopoetische Rekonstitutionsmethoden durch Transplantation genetisch veränderter Zellen, manchmal unter Verwendung der Cre-lox-Rekombination oder des CRISPR-Systems. Dieser Ansatz ermöglicht die Analyse einer spezifischen Genmutation in hämatopoetischen Zellen, um zu beurteilen, wie sie zur Krankheitsentwicklung beiträgt. Darüber hinaus verwenden diese Modelle oft kongenische oder Reporterzellen, um die Wirkungen mutierter Zellen von normalen oder Wildtypzellen zu unterscheiden. In vielen Fällen ist ein Vorkonditionierungsschema erforderlich, um hämatopoetische Spenderstammzellen erfolgreich zu transplantieren.

Derzeit kann die Transplantation von Knochenmark auf Empfängermäuse in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: 1) myeloablative Konditionierung und 2) nicht konditionierte Transplantation. Die myeloablative Konditionierung kann durch eine von zwei Methoden erreicht werden, nämlich Die Ganzkörperbestrahlung (TBI) oder die Chemotherapie15. TBI wird durchgeführt, indem der Empfänger einer tödlichen Dosis Gamma- oder Röntgenbestrahlung unterzogen wird, wodurch DNA-Brüche oder Querverbindungen innerhalb sich schnell teilender Zellen erzeugt werden, wodurch sie irreparabel werden16. Busulfan und Cyclophosphamid sind zwei häufig verwendete Chemotherapeutika, die die hämatopoetische Nische stören und in ähnlicher Weise DNA-Schäden an sich schnell teilenden Zellen verursachen. Das Nettoergebnis der myeloablativen Vorkonditionierung ist die Apoptose hämatopoetischer Zellen, die das hämatopoetische System des Empfängers zerstört. Diese Strategie ermöglicht nicht nur die erfolgreiche Transplantation der Spender-HSPCs, sondern kann auch eine Transplantatabstoßung verhindern, indem das Immunsystem des Empfängers unterdrückt wird. Die myeloablative Vorkonditionierung hat jedoch schwere Nebenwirkungen wie Schäden an Geweben und Organen und deren ansässigen Immunzellen sowie Die Zerstörung der nativen Knochenmarknische17. Daher wurden alternative Methoden vorgeschlagen, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu überwinden, insbesondere im Hinblick auf Schäden an den interessierender Organen. Diese Methoden umfassen die abgeschirmte Bestrahlung von Empfängermäusen und die adoptive BMT auf nicht konditionierte Mäuse9,17. Die Abschirmung des Thorax, der Bauchhöhle, des Kopfes oder anderer Regionen vor Bestrahlung durch die Platzierung einer Bleibarriere schützt das interessierende Gewebe vor den schädlichen Auswirkungen der Bestrahlung und erhält seine ansässige Immunzellpopulation. Auf der anderen Seite hat die adoptive BMT von HSPCs für nicht konditionierte Mäuse einen zusätzlichen Vorteil, da sie die native hämatopoetische Nische bewahrt. In diesem Manuskript beschreiben wir die Protokolle und Ergebnisse der HSPC-Transplantation nach mehreren Transplantationsschemata bei Mäusen, insbesondere die Abgabe von HSPC an TBI-Mäuse, an Mäuse, die teilweise vor Bestrahlung geschützt sind, und an nicht konditionierte Mäuse. Das übergeordnete Ziel ist es, den Forschern zu helfen, die verschiedenen physiologischen Auswirkungen jeder Methode zu verstehen und zu verstehen, wie sie die experimentellen Ergebnisse im Rahmen von CH und Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflussen.

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Protocol

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Virginia genehmigt.

1. Vor der Vorkonditionierung

  1. Legen Sie die Empfängermäuse ~24 h vor der Bestrahlung auf antibiotikahaltiges Wasser (5 mM Sulfamethoxazol, 0,86 mM Trimethoprim). Dies ist notwendig, um eine Infektion zu verhindern, da das Immunsystem nach der Bestrahlung unterdrückt und nach der Bestrahlung für 2 Wochen aufrechterhalten wird. Ergänzen Sie Mäuse an dieser Stelle mit einem Ernährungs- / Trinkgel, um die Fütterung zu fördern und Gewichtsverlust und Austrocknung nach der Bestrahlung zu verhindern.

Figure 1
Abbildung 1: Bilder, die verschiedene Vorkonditionierungs-Setups zeigen. (A) Pie-cage Ganzkörperbestrahlungsaufbau mittels Gammastrahl (Cäsium-137): Der Strahlungsstrahl kommt von der Rückseite des Bestrahlungsgeräts in y-Achsenrichtung (horizontale Strahlung). (B) Mauskäfig Ganzkörperbestrahlungsaufbau mittels Röntgenstrahlen: Der Mauskäfig wird in die reflektierende Kammer gelegt. Der Strahlungsstrahl kommt von der Oberseite des Bestrahlungskörpers in Form eines Kegels (vertikale Strahlung). Der Abstand von der Strahlungsquelle zum Käfig beträgt 530 mm. (C) Einstellbares Fach im Röntgenstrahler: Dieser Aufbau wird für die teilweise abgeschirmte Bestrahlung mittels Röntgen verwendet. Der Strahlungsstrahl kommt von der Oberseite des Bestrahlungskörpers in Form eines Kegels (vertikale Strahlung). Der Abstand von der Strahlungsquelle zum Tablett beträgt 373 mm und der Radius beträgt 250 mm. (D) Thorax-Abschirmung: Anästhesierte Mäuse werden auf ein Tablett gelegt. Die Mäuse werden in Rückenlage in Rückenlage mit voll ausgestreckten Armen und Beinen in Rückenlage platziert. Das untere Ende des Bleischildes ist mit dem Xiphisternumknochen und das obere Ende mit dem Thymus ausgerichtet. (E) Abdominal-Abschirmung: Betäubtete Mäuse werden wie in der Thorax-Abschirmung platziert, wobei das untere Ende des Bleischildes mit dem Anus und das obere Ende unterhalb des Zwerchfells ausgerichtet sind. (F) Kopfabschirmungsbestrahlung mit Gammastrahlen (Cäsium-137): Die Forepaws der betäubten Maus werden abgeklebt und die Maus in einen konischen Rückhaltegriff gelegt. Der schwarze Bleischild (markiert) bedeckt den Kopf und die Ohren der Maus. Der Strahlungsstrahl kommt von der Rückseite des Bestrahlungsgerätes in Richtung der Y-Achse (horizontale Strahlung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Vorkonditionierung von Empfängermäusen (optional)

  1. Ganzkörperbestrahlung
    1. Setzen Sie die Empfängermäuse in einen gleichmäßig geschnittenen Tortenkäfig oder einen Mauskäfig in der reflektierenden Kammer innerhalb des berechneten Radius, um die gleiche Bestrahlungsdosis zu erhalten. Es wird jedoch empfohlen, maximal 8 Mäuse pro Tortenkäfig und 5 Mäuse pro Mauskäfig zu gewährleisten (Abbildung 1A, B).
    2. Um eine vollständige Myeloablation zu erreichen, stellen Sie sicher, dass die Empfängermäuse eine Gesamtstrahlendosis von 11 Gy in zwei 5,5 Gy-Fraktionen erhalten, die durch ein Intervall von 4-24 h getrennt sind.
      HINWEIS: Während eine optimale Transplantation durch die Implementierung eines 4-Stunden-Intervalls zwischen den Fraktionen erreicht werden kann, kann dies auf ein 24-Stunden-Intervall ausgedehnt werden, was hilfreich sein kann, wenn die Arbeit und / oder der Bestrahlungskörper nicht verfügbar sind.
  2. Teilweise abgeschirmte Bestrahlung
    1. Anästhesie der Empfängermäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80–100 mg/kg) und Xylazin (5–10 mg/kg). Die Zurückhaltung der Mausbewegung ist entscheidend, um eine gleichmäßige Bestrahlung und einen wirksamen Schutz der Zielorgane während des Abschirmungsprozesses zu gewährleisten.
    2. Zur Thorax- und Abdomenabschirmung richten Sie den Strahlungsstrahl des Röntgenstrahlers vertikal zur Maus aus (Abbildung 1C).
      1. Positionieren Sie die betäubten Mäuse auf einer flachen Platte und zentrieren Sie die Strahlungsquelle von oben. Platzieren Sie die Mäuse umgekehrt in Rückenlage mit voll ausgestreckten Armen und Beinen (Abbildung 1D, E).
        HINWEIS: Die Röntgenbestrahlungsanlage ermöglicht für dieses Experiment, dass zwei Mäuse gleichzeitig innerhalb des effektiven Radius positioniert werden können, der eine gleichmäßige Bestrahlung ermöglicht. Während der effektive Radius auf der Grundlage des Abstands zwischen der Strahlungsquelle und der Schale berechnet wird, hängt die Anzahl der Tiere, die gleichzeitig bestrahlt werden können, vom spezifischen Bestrahlungskörper ab.
      2. Befestigen Sie die Pfoten der Mäuse mit Klebeband auf der Platte, um sicherzustellen, dass die Mäuse während des Bestrahlungsverfahrens immobilisiert werden. Platzieren Sie die Bleiabschirmung so, dass sie Bereiche abdeckt, die geschützt werden müssen.
      3. Für die Thoraxabschirmung bereiten Sie den Bleischild vor, indem Sie die Länge vom Xiphisternumknochen der Maus bis zum Thymus messen und die Dicke berechnen, die einen ausreichenden Schutz vor der Bestrahlungsquelle bietet. Platzieren Sie die Bleiabschirmung so, dass das untere Ende mit dem Xiphisternumknochen ausgerichtet ist. Das obere Ende der Bleibarriere passt in die Nähe des Thymus (Abbildung 1D).
      4. Bereiten Sie für die Bauchabschirmung den Bleischild vor, indem Sie die Länge vom Anus der Maus bis zur Membran messen und die Dicke berechnen, die einen ausreichenden Schutz vor der Bestrahlungsquelle bietet. Platzieren Sie die Bleiabschirmung so, dass das untere Ende mit dem Anus ausgerichtet ist. Das obere Ende der Bleiabschirmung passt unter die Membran (Abbildung 1E).
        HINWEIS: Die Lokalisierung des Bleischildes, um zwischen den Kohorten konsistent zu sein, kann einige Unterschiede in Bezug auf die Größe der Mäuse reduzieren.
    3. Zur Kopfabschirmung richten Sie den Strahlungsstrahl des Cäsiumbestrahlungsators horizontal zur Maus aus.
      1. Kleben Sie die Forepaws einer betäubten Maus vorsichtig auf den Bauch. Dies stellt sicher, dass die Arme eine volle Bestrahlungsdosis erhalten und nicht vom Schild bedeckt sind.
      2. Zur Kopfabschirmung legen Sie die Maus in einen konischen Rückhalteer, der in einen Bleischild passt. Sobald sich die Maus im konischen Rückhalteschild befindet, schieben Sie den Rückhalteer in den Steckplatz innerhalb der Bleiabschirmung (Abbildung 1F). Der Bleischild sollte den Kopf und die Ohren der Maus vollständig bedecken (~ 3,2 cm), so dass der Rest des Mauskörpers für die Bestrahlung freigelegt bleibt. Die Position des Rückhalteers im Inneren des Schildes kann an Tiere unterschiedlicher Größe angepasst werden, indem er weiter innerhalb oder außerhalb des Schildes liegt.
      3. Platzieren Sie Mäuse in den Bestrahlungskörper, senkrecht zur Bestrahlungsquelle.
    4. Setzen Sie Mäuse zwei 5,5-Gy-Bestrahlungsfraktionen (Gesamtdosis von 11 Gy) aus, die durch ein Intervall von 4 bis 24 Stunden getrennt sind.
    5. Nach jeder Bestrahlungsfraktion legen Sie die Käfige mit betäubten Mäusen auf beheizte Matten oder unter rote Wärmelampen, um Unterkühlung zu verhindern und die Erholung von der Anästhesie zu unterstützen.
      HINWEIS: Es ist vorsichtsgemerkt, die betäubte Maus bei der Verwendung einer Lampe nicht zu überhitzen, da sie der Hitze nicht entkommen kann. Wie oben beschrieben, können die Positionierung der Tiere und die Dicke des Bleischildes zwischen den Studien aufgrund der spezifischen Merkmale des Bestrahlungskörpers (Strahlungsart/Strahlrichtung usw.) variieren. Die Forscher müssen ihre Experimente entsprechend anpassen.

3. Knochenisolierung

HINWEIS: Idealerweise sollten Spendermäuse und Empfängermäuse im Alter ähnlich sein und innerhalb von 8-12 Wochen alt sein. Die Verwendung von mindestens 3 Mäusen als Spender (anstelle eines einzelnen Spenders) wird bevorzugt, um die Heterogenität zu minimieren (selbst bei Verwendung von Mäusen mit demselben Genotyp). Ungefähr 40 Millionen unfraktionierte Knochenmarkzellen können aus sechs Knochen (zwei Oberschenkelknochen, zwei Tibias und zwei Humeri) einer einzigen Maus gewonnen werden. Die Transplantation von 5 Millionen Knochenmarkzellen an jede Empfängermaus sorgt typischerweise für die Transplantation.

  1. Euthanisieren Sie Spendermäuse durch zervikale Dislokation ohne Anästhesie (bevorzugte Methode, um eine chemische Kontamination der Zellen zu vermeiden) und legen Sie jede Maus auf ein saugfähiges Pad.
  2. Desinfizieren Sie die Haut mit einem 70% Ethanolspray.
  3. Machen Sie einen kleinen Querschnitt in der Haut unterhalb des Brustkorbs und halten Sie die Haut fest auf beiden Seiten des Schnitts, reißen Sie in entgegengesetzte Richtungen zum Kopf und zu den Füßen. Schälen Sie die Haut von allen Gliedmaßen ab.
  4. Schneiden Sie über die Schultern und die Ellenbogengelenke und entfernen Sie die angeschlossenen Muskeln und bindegewebe mit Hilfe eines Kimwipe, um die Humeri zu erhalten.
  5. Verrenken Sie vorsichtig die Hüftgelenke zwischen Femur und Hüftknochen. Verwenden Sie eine stumpfe Schere, um den Femurkopf entlang zu schneiden und die Beine zu lösen. Schneiden Sie über das Kniegelenk, um Femur und Tibia zu trennen, und entfernen Sie vorsichtig die angeschlossenen Muskeln und Bindegewebe mit Hilfe eines Kimwipe, um den Femur und die Tibia zu ernten.
    HINWEIS: Achten Sie besonders darauf, die Knochenepiphyse während dieses Schritts intakt zu halten. Entsorgen Sie alle gebrochenen Knochen aufgrund des Verlustes der Sterilität. Hüftknochen und Wirbelsäulenknochen können zusätzlich zu Femur, Tibia und Humerus gesammelt werden. Um Wirbelsäulenknochen zu sammeln, können ein Mörser und ein Stößel verwendet werden, um die Knochen in Stücke zu zerkleinern und die Knochenmarkzellen zu ernten.
  6. Legen Sie die isolierten Knochen von Mäusen des gleichen Genotyps in ein entsprechend 50 ml konisches Röhrchen mit 20 ml eiskaltem sterilem PBS und halten Sie es bis zur weiteren Verwendung auf Eis. Achten Sie besonders darauf, die Knochen korrekt in Röhren mit abgestimmten Genotypen zu legen.
  7. Wiederholen Sie die obigen Schritte für jedes Spendertier, das zwischen jeder Maus handschuhe wechselt. Reinigen Sie auch Scheren und andere Instrumente mit 70% Ethanol zwischen jeder Maus.

4. Isolierung von Knochenmarkzellen

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II aus.

  1. Vorbereitung von Röhrchensets: Machen Sie ein kleines Loch in den Boden eines sterilen 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens mit einer 18 G Nadel und legen Sie es in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das unten 100 μL eiskaltes steriles PBS enthält.
    HINWEIS: Da nur sechs Knochen in das 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen passen, wird empfohlen, ausreichende Röhrchensätze vorzubereiten, um alle Knochen gleichzeitig zu verarbeiten.
  2. Saugen Sie das PBS an und übertragen Sie die isolierten Knochen auf eine sterile 100-mm-Zellkulturschale. Halten Sie jeden Knochen mit einer feinen Zange, schneiden Sie die Epiphysen vorsichtig von jedem Ende mit einer kleinen Schere, die in einem Autoklaven sterilisiert wurde. Legen Sie die geschnittenen Knochen in die vorbereiteten Rohrsets.
  3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 35 s bei 4 °C.
  4. Bestätigen Sie nach der Zentrifugation, dass das Knochenmark erfolgreich aus den Knochen entfernt wurde. Knochen sollten weiß und durchscheinend mit einem relativ großen roten Pellet am Boden des 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens erscheinen. Entsorgen Sie das 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Wenn die visuelle Inspektion kein Knochenmark am Boden des 1,5-ml-Röhrchens erkennt, schneiden Sie den Knochen erneut ab und wiederholen Sie Schritt 4.3.
  5. Resuspendieren Sie das Knochenmark in 1 ml eiskaltem PBS und übertragen Sie dann die Zellsuspension aus demselben Genotyp in ein abgestimmtes 50 ml konisches Rohr.
  6. Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Mal durch eine 18 G-Nadel mit einer 10-ml-Spritze führen.
  7. Filtern Sie Einzelzellsuspensionen durch ein 70 μm Zellsieb. Fügen Sie zusätzliches eiskaltes PBS zu einem Endvolumen von 10 ml hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch die sanfte Verwendung von Pipettenhilfe.
  8. Zentrifuge bei 310 x g für 10 min bei 4 °C.
  9. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 ml serumfreiem RPMI-Medium. 30 μL dieses Materials für die Zellzählung frei.
  10. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler und berechnen Sie das volumen der Zellsuspension, das für die Transplantation erforderlich ist. Für das Beispiel einer 100% BMT werden für jede Empfängermaus 5 x10 6 Knochenmarkzellen benötigt.
    HINWEIS: Für eine kompetitive BMT bereiten Sie insgesamt 5 x 106 Knochenmarkzellen vor, die eine Mischung aus Spenderzellen (z. B. CD45.2+) und Konkurrenzzellen (z. B. CD45.1+) enthalten. Die Vorbereitung zusätzlicher Knochenmarkzellen wird dringend empfohlen. Wenn es beispielsweise 10 Empfängermäuse pro Versuchsgruppe gibt, bereiten wir typischerweise genügend Zellen für 12 Empfängermäuse vor.
  11. Übertragen Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension in ein neues 50 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 310 x g für 10 min bei 4 °C.
  12. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen mit der berechneten Menge an serumfreiem RPMI-Medium, um die entsprechende Zelldichte und das entsprechende Zellvolumen zu erreichen. Typischerweise sind 200 μL das optimale Volumen für eine retroorbitale Injektion.

5. Transplantation von Knochenmarkzellen an bestrahlte Mäuse

  1. Betäuben Sie die Empfängermäuse mit 5% Isofluran.
  2. Während Mäuse betäubt werden, injizieren Sie langsam 200 μL Knochenmarkzellen in die retroorbitale Vene mit einer 28-30 G Nadel mit einer Insulinspritze.
    1. Alternativ können Sie die Abgabe der Spenderzellen durch intravenöse Injektion der Schwanzvene und intramedulläre Femurinjektion mit einem maximalen Volumen von 0,2 ml bzw. 25 μL durchführen.
  3. Sobald die Zellen injiziert sind, legen Sie einen Tropfen Proparacain-haltige Augentropfen auf die Oberfläche des Auges zur Schmerzlinderung. Dem Tier kann dann erlaubt werden, das Bewusstsein wiederzuerlangen.

6. Transplantation von Knochenmarkzellen an nicht konditionierte Mäuse

  1. Betäuben Sie die Empfängermäuse durch Inhalation von 5% Isofluran.
  2. Injizieren Sie 5 x10 6 unfraktionierte Knochenmarkzellen aus beiden Genotypen retroorbital in nicht bestrahlte Empfängermäuse mit 28–30 G Insulinspritze.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 und 6.2 an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, so dass die Empfängermäuse mit insgesamt 1,5 x 107 Knochenmarkzellen transplantiert werden.
    HINWEIS: Da die adoptive BMT ohne Vorkonditionierungsverfahren eine Knochenmarktransplantation für 3 aufeinanderfolgende Tage erfordert, sollte man versuchen, die Augen für jede Injektion zu wechseln.
  4. Nach der Injektion verabreichen Sie dem betroffenen Auge einen Tropfen Proparacain-haltige Augentropfen.

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Representative Results

Um die Wirkung von drei BMT/Vorkonditionierungsmethoden auf die Spenderzelltransplantation zu vergleichen, wurden die Fraktionen von Spenderzellen in peripherem Blut und Herzgewebe mittels Durchflusszytometrie nach 1 Monat nach BMT analysiert. Isolierte Zellen wurden für spezifische Leukozytenmarker gefärbt, um die verschiedenen Untergruppen von Leukozyten zu identifizieren. In diesen Experimenten wurden Wildtyp(WT) C57BL/6 (CD45.2) Spenderknochenmarkzellen an WT B6 abgegeben. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) Empfängermäuse zur Unterscheidung von Spenderzellen von den Zellen des Empfängers. Die verwendeten Durchflusszytometrie-Gating-Strategien wurden zuvor von Wang et al.9 in Supplementary Figure 1beschrieben.

Die mit Ganzkörperbestrahlung (TBI) behandelte Gruppe erhielt 5 x 106 Knochenmarkzellen nach einer letalen Gesamtstrahlungsdosis von 11 Gy in zwei 5,5 Gy-Fraktionen, die durch ein 4-Stunden-Intervall getrennt waren. Im peripheren Blut von Empfängermäusen wurden Monozyten, Neutrophile und B-Zellen weitgehend abgetragen und durch die Nachkommen von Spenderknochenmarkzellen ersetzt. Darüber hinaus wurden die residenten Herzmonozyten und Neutrophilenpopulationen in Herzen von Empfängermäusen fast vollständig durch Spenderzellen ersetzt (Abbildung 2A).

In der teilweise abgeschirmten Bestrahlungsgruppe wurden Empfängermäuse mit einem Thoraxschild bestrahlt und mit 5 x 106 Knochenmarkzellen nach einer Gesamtstrahlungsdosis von 11 Gy in zwei 5,5 Gy-Fraktionen transplantiert, die durch ein 4-Stunden-Intervall getrennt waren. Im Gegensatz zur TBI-Gruppe war der Beitrag von Spenderzellen zu kardialen Immunzellen bescheiden, was wahrscheinlich die kombinierten Effekte des Schutzes der lokalen Immunzellen in den Herzen der Empfängermäuse und der physiologischen Wiederbesiedlung von Knochenmark-abgeleiteten Spenderzellen aus dem peripheren Blut widerspiegelt. Empfänger-Maus-Knochenmarkzellen in abgeschirmten Regionen haben wahrscheinlich auch zur peripheren Blutrekonstitution beigetragen, was den Prozentsatz der Spenderzellen im peripheren Blut im Vergleich zur TBI-behandelten Gruppe reduziert (Abbildung 2B).

In der Gruppe ohne BMT-Vorkonditionierung (adoptive BMT) wurden Empfängermäuse an 3 aufeinanderfolgenden Tagen mit 5 x10 6 Knochenmarkzellen transplantiert. 4 Wochen nach der BMT war der Anteil der aus Spendern gewonnenen Zellen im peripheren Blut und Herzen nachweisbar. (ca. 5%) (Abbildung 2C).

Um zu veranschaulichen, wie das adoptive BMT-Modell auf die Untersuchung des CH-Modells angewendet werden kann, wurden CD45.2+ Spenderknochenmarkzellen (WT oder Tet2-/-) in CD45.1+ Empfängermäuse transplantiert. Empfänger ohne Konditionierung wurden mit 5 x 106 Knochenmarkzellen pro Tag für 3 aufeinanderfolgende Tage transplantiert (für insgesamt 1,5 x 107, n = 5-6 pro Gruppe). Die durchflusszytometrische Analyse des peripheren Blutes wurde 4, 8, 12 und 16 Wochen nach der Transplantation durchgeführt. Die Tet2-defizienten Spenderzellen verschafften einen Wettbewerbsvorteil und dehnten sich im Laufe der Zeit allmählich aus; WBCs, Monozyten,Ly6C-Hi-Monozyten, Neutrophile, T-Zellen und B-Zellen nahmen im Laufe der Zeit signifikant zu. Im Vergleich zu den Tet2-defizienten Spenderzellen, die in Empfängermäuse transplantiert wurden, zeigten Empfängermäuse, die mit WT-Spenderzellen transplantiert wurden, eine weniger signifikante klonale Expansion von Spenderzellen ( Abbildung3). In Übereinstimmung mit dem klinischen Paradigma der klonalen Hämatopoese hat die Expansion von Tet2-defizienten Zellen keinen Einfluss auf die absoluten Zahlen der verschiedenen Blutzelltypen9 (Daten nicht gezeigt).

Figure 2
Abbildung 2: Durchflusszytometrische Analyse von Blut und Herz mit verschiedenen Methoden der Vorkonditionierung. Die durchflusszytometrische Analyse von peripherem Blut und Herz wurde 1 Monat nach knochenmarktransplantation durchgeführt. Um Spenderzellen von den Zellen der Empfänger zu unterscheiden, wurden CD45.1+ Empfängermäuse mit CD45.2+ Spenderknochenmarkzellen transplantiert. (A) 5 x 106 Knochenmarkzellen wurden nach zwei Fraktionen der Ganzkörperbestrahlung (2 x 5,5 Gy, 4 h Intervall, n = 3) transplantiert. (B) 5 x 106 Knochenmarkzellen wurden nach zwei Fraktionen der Ganzkörperbestrahlung mit Thoraxabschirmung (2 x 5,5 Gy, 4 h Intervall, n = 10) transplantiert. (C) Die Empfänger ohne Konditionierung wurden an 3 aufeinanderfolgenden Tagen mit 5 x10 6 Knochenmarkzellen transplantiert (insgesamt 1,5 x 107, n = 4). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. WbCs insgesamt sind definiert als CD45+; Neutrophile als Ly6G+; Ly6CHi Monozyten als CD115+, Ly6G-und Ly6C+; Ly6Clo Monozyten als CD115+, Ly6G-und Ly6C-; B-Zellen als CD45R+; CD4+ T-Zellen als CD3e+ und CD4+; CD8+ T-Zellen als CD3e+ und CD8+; und Makrophagen als CD64+,Ly6G-und Ly6C-. (WBCs: weiße Blutkörperchen, Neut: Neutrophile, Mono: Monozyten, Mac: Makrophagen). Abbildung 2A,C wurden von Wang et al.9modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Klonale Expansion von Tet2-defizienten Zellen unter Verwendung von adoptiver BMT auf nicht konditionierte Mäuse. CD45.2+ Spenderknochenmarkzellen (WT oder Tet2-/-) wurden in CD45.1+ Empfängermäuse transplantiert. Empfänger ohne Konditionierung wurden mit 5 x 106 Knochenmarkzellen pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen transplantiert (für insgesamt 1,5 x 107, n = 5-6 pro Gruppe). Die durchflusszytometrische Analyse des peripheren Blutes wurde nach 4, 8, 12 und 16 Wochen nach der Transplantation durchgeführt. Der Anteil von CD45.2+ Spenderzellen in jeder Population wird gezeigt. (A) WBCs (B) Mono (C) Ly6Chi mono (D) B-Zellen (E) T-Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. WBCs werden als CD45+definiert; Neutrophile als Ly6G+; Ly6CHi Monozyten als CD115+, Ly6G-und Ly6C+; Ly6Clo Monozyten als CD115+, Ly6G-und Ly6C-; B-Zellen als CD45R+; CD4+ T-Zellen als CD3e+ (WT: Wildtyp, WBCs: weiße Blutkörperchen, Mono: Monozyten) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Für Studien der klonalen Hämatopoese beschrieben wir drei Methoden der BMT: BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit Bestrahlung mit partieller Abschirmung und eine weniger häufig verwendete BMT-Methode, die keine Vorkonditionierung beinhaltet (adoptive BMT). Diese Methoden wurden verwendet, um die Auswirkungen der klonalen Hämatopoese auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu bewerten. Forscher können diese Methoden entsprechend dem spezifischen Zweck ihrer Studie modifizieren.

Klonale Hämatopoese-Modelle
Klonale Hämatopoese ist das Phänomen, bei dem mutierte hämatopoetische Zellen mit Wildtypzellen konkurrieren und im Laufe der Zeit eine klonale Dominanz erlangen. Um ein Modell dieser Konkurrenz zu erstellen, kann Mäusen Knochenmark verabreicht werden, das aus einer Mischung genetisch unterschiedlicher Zellen besteht. Im Allgemeinen umfasst diese Mischung mutierte und Wildtypzellen, die mit einem fluoreszierenden Tag oder verschiedenen Pan-Leukozyten-Markern (d. H. CD45.1 und CD45.2) markiert wurden. Wenn wir beispielsweise Modelle erstellen, die Tet2-vermittelteCH nachahmen, führen wir eine kompetitive Knochenmarktransplantation in tödlich bestrahlte Empfänger durch, bei der typischerweise 90% der Zellen gemischt werden, die von CD45.1 Tet2+/+ Spendern stammen, und 10% der Zellen, die von CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- oder Kontroll-Tet2+/+ Spendern stammen8. Der durchflusszytometrische Nachweis der CD45-Varianten mit spezifischen monoklonalen Antikörpern ermöglicht es, Spenderzellen (CD45.1-/CD45.2+) von Konkurrenzzellen (CD45.1+/CD45.2-) im Blut zu unterscheiden und die klonale Dynamik der Testzellen im Laufe der Zeit zu beurteilen. Auf diese Weise konnten wir einen allmählichen Anstieg des Spenderchismismus von Tet2-defizienten Zellen beobachten, während der Prozentsatz der Wildtypzellen bei etwa 10% bleibt. Diese experimentelle Umgebung ahmt das menschliche Szenario von Individuen nach, die eine somatische TET2-Mutation tragen, da diese Mutationen zunächst von einer kleinen Anzahl von HSPCs getragen werden, die sich im Laufe der Zeit allmählich ausdehnen werden. Die Anwendung dieses Ansatzes in Kardiovaskulären Krankheitsmodellen von Atherosklerose und Herzinsuffizienz hat zur Dokumentation eines möglichen kausalen Zusammenhangs zwischen Tet2-vermittelterCH und CVD geführt8,9,10.

Bei der Anwendung dieser Ansätze sollten Forscher die möglichen Störeffekte berücksichtigen, die durch TBI erzeugt werden. Obwohl TBI vor der Transplantation einen hohen Grad an HSPC-Transplantation ermöglicht, führt diese Vorkonditionierung zu mehreren unerwünschten Wirkungen außerhalb des hämatopoetischen Systems. Es wurde dokumentiert, dass TBI zu Entzündungen, Verletzungen und Fibrose in mehreren Organsystemen wie Haut, Leber, Nieren, Lunge, Knochenmark, Herz, Gehirn usw. führen kann.18,19,20. Diese Nebenwirkungen können sich negativ auf die untersuchten Herz-Kreislauf-Organe auswirken und verändern auch die Krankheitspathogenese21,22. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Wirkung der Bestrahlung auf ansässige Makrophagen im Herzen. Die Bestrahlung des Thorax führt zu einem deutlichen Ersatz kardial residenter Makrophagen durch zirkulierende Monozyten-abgeleitete Makrophagen. Studien haben gezeigt, dass kardiale Makrophagen unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu zirkulierenden, aus Monozyten abgeleiteten Makrophagen aufweisen, die nach einer Strahlenverletzung im Herzen transplantiert werden. In Krankheitsumgebungen wird angenommen, dass kardiale Makrophagen eine kardioprotektive Rolle spielen, während infiltrierende durch Blut übertragene Makrophagen Berichten zufolge Verletzungen und Entzündungen fördern23. Daher ist es denkbar, dass der Ersatz von ansässigen kardialen Immunzellen durch blutübertragene Zellen die untersuchten pathologischen Prozesse verändert, die zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen beitragen24,25,26. In ähnlicher Weise führt TBI im Gehirn zu einer Erschöpfung der ansässigen Mikroglia und zum Ersatz durch peripher abgeleitete Makrophagen27,28. Während sich peripher abgeleitete Makrophagen wie Mikrogliazellen verhalten können, behalten sie eine einzigartige funktionelle und transkriptionelle Identität im Vergleich zu Monozyten-abgeleiteten Mikroglia28bei. Daher ist es möglich, dass die Krankheitsfolgen verändert werden, insbesondere bei der Untersuchung von Krankheiten wie ischämischen Schlaganfällen. Um diese Störeffekte zu vermeiden, kann eine Abschirmung von Thorax und Kopf empfohlen werden. Dies ist von Vorteil, da es dem Herzen bzw. dem Gehirn Schutz bietet; und es hält auch ihre ansässigen Immunzellen intakt und rekapituliert den menschlichen Zustand von CH besser. Wie bereits erwähnt, führt die Abschirmung jedoch zu einer geringeren Chimärismusrate im Vergleich zur TBI-Vorkonditionierung, die im Wesentlichen alle hämatopoetischen Zellen des Wirts eliminiert.

Ein weiteres wichtiges Hindernis bei der Vorkonditionierung ist seine schädliche Wirkung auf die Knochenmarknische. Obwohl bestrahlungsinduzierte Schäden der BM-Nische in einem suboptimalen Ausmaß wiederhergestellt werden können, ist unklar, ob in diesen geschädigten Mikroumgebungen eine naive Hämatopoese wiederhergestellt wird. Darüber hinaus initiiert die Transplantation von gemischten HSPCs in leere BM einen Wettlauf um die Proliferation zwischen Klonen und nicht den einfachen "Wettbewerb" um eine Nische, die von einem Wildtyp-HSPC besetzt ist - was vermutlich in CH vorkommt. Daher könnte ein potenziell bevorzugter Ansatz zur Untersuchung von CH die adoptive BMT-Methode sein, bei der BM-Zellen ohne Vorkonditionierung in Empfängermäuse übertragen werden. Diese adoptive BMT ohne Vorkonditionierungsmethode wirkt sich minimal auf die anhaltende naive Hämatopoese aus, die am treuesten die beim Menschen beobachtete CH rekapituliert29. Abbildung 2C zeigt das Niveau des Chimärismus nach 1 Monat nach der Transplantation ohne Vorkonditionierung. Während der Spenderchism zu diesem frühen Zeitpunkt niedrig ist, finden wir im Laufe der Zeit einen zunehmenden Anteil von Tet2-defizienten Klonen, wie in Abbildung 3dargestellt. Es sollte beachtet werden, dass dieses Modell am nützlichsten ist, wenn die mutierten Zellen unter homöostatischen Bedingungen wie Tet2-defizienten Zellen einen Wettbewerbsvorteil gegenüber Wildtypzellen haben. Wenn Tet2-defiziente Zellen transplantiert werden, kommt es zu einer deutlichen Expansion in verschiedenen Leukozytenpopulationen wie Neutrophilen, Monozyten, NK-Zellen und B-Zellen. Eine langsamere Expansion wurde in T-Zellen festgestellt, vermutlich aufgrund der längeren Halbwertszeit dieser Population.

Die Ausdehnung von Tet2-defizientienten Zellen wurde nicht nur im peripheren Blut, sondern auch in mehreren anderen Geweben, einschließlich Knochenmark, Leber und Niere, mit unterschiedlicher Dynamik der hämatopoetischen Zellrekonstitution beobachtet9. Zum Beispiel beschrieb die zuvor veröffentlichte Arbeit unseres Labors den Knochenmarkzellchmärismus von WT- und Tet2-defizienten Spenderzellen, die 8 Monate nach der Adoptiv-BMT9in CD45.1-Empfängermäuse transplantiert wurden. Tet2-defiziente Spenderzellen, die in CD45.1-Empfängermäuse transplantiert wurden, haben einen Wettbewerbsvorteil gegenüber der unreifen Abstammunggezeigt -Sca1+c-Kit+ (LSK) -Zellen, Kurz- und Langzeit-HSC-Zellen und multipotente Vorläuferzellen (MPPs) im Vergleich zu WT-Spenderzellen, die in die CD45.1-Empfängermäuse transplantiert wurden. Darüber hinaus entwickeln sie als Tet2-deficient Spenderzellen-transplantierte Empfängermäuse einen altersbedingten Kardiomyopathie-Phänotyp ohne exogene Faktoren, die Herzfunktionsstörungen verursachen, und rekapitulieren dadurch die Wirkung der klonalen Hämatopoese ähnlich der alternder Menschen. Diese Beobachtung wurde mit einem erhöhten Grad an Chimärismus bei Herzneutrophilen und Ly6C-Hi-Monozyten begleitet. Insgesamt kann dieses adoptive BMT-Regime auf zukünftige Studien angewendet werden, die unser Verständnis des Zusammenhangs zwischen der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und der klonalen Hämatopoese auf einem fortgeschritteneren Niveau erweitern könnten.

Zusammenfassend haben wir drei BMT-Methoden beschrieben und ihre Anwendung bei der Generierung von CH-Modellen diskutiert. CH ist mit schlechteren Prognosen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Atherosklerose und Herzinsuffizienz verbunden. Obwohl erhebliche Fortschritte erzielt wurden, steckt die Untersuchung der kausalen Zusammenhänge zwischen CH und CVD noch in den Kinderschuhen, und weitere Untersuchungen sind durch den Einsatz optimierter Tiermodelle erforderlich. Wir hoffen, dass diese Protokolle es den Forschern ermöglichen, eine physiologisch angemessenere Methode der BMT zu wählen, die mögliche verwirrende Auswirkungen auf das Herz-Kreislauf-System minimiert und letztendlich Studien liefert, die unser Verständnis darüber erweitern, wie CH zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen beiträgt.

Design der Bleiabschirmung
Die Dicke des Bleischildes wird von der Art der Bestrahlung bestimmt, die zur Induktion der Myeloablation verwendet wird. Röntgen- oder Gammastrahlungstypen werden häufig für die experimentelle Myeloablation verwendet, unterscheiden sich jedoch in Bezug auf Frequenz, Wellenlänge und Photonenenergie. Wenn es um die Abschirmung geht, ist die Photonenenergie, die die Energie oder Geschwindigkeit beschreibt, mit der sich die Strahlen bewegen, der wichtigste Parameter. Typischerweise haben Röntgenstrahlen einer Strahlungsquelle eine Energie von 160 kVp, während Cäsium-137-Quellen, die Gammastrahlen emittieren, eine Energie von 662 KeV haben. Die von diesen Strahlungsquellen emittierte Energie entspricht ihrer Durchdringungskraft, wobei höhere Energien eine größere Durchdringungskraft haben. Daher ist bei der Verwendung von Cäsiumquellen-basierten Bestrahlungsgeräten im Vergleich zur Verwendung von Röntgenbestrahlungsgeräten eine größere Dicke der Bleiabschirmung erforderlich. Die röntgenbasierte Bestrahlung, die wir bei der Thorax- und Bauchabschirmung verwenden, erfordert einen 7 mm dicken Bleischild, um einen ausreichenden Schutz zu bieten. Für Cäsium-137-Quellen, die wir verwenden, wenn wir Kopfabschirmungen durchführen, müssen Bleischilde jedoch mindestens 1 Zoll dick sein, um einen ausreichenden Schutz zu bieten.

Bleiabschirmungen für den Einsatz in Röntgenstrahlern können von kommerziellen Anbietern erworben werden. Alternativ können Bleibleche so zugeschnitten werden, dass sie entweder um den Körper des Tieres oder um einen Rückhalter passen (siehe Abbildung 1). Bei der Verwendung eines Bestrahlungsgerätes auf Cäsiumbasis sollten Bleiziegel verwendet werden, die wesentlich dicker sind und von Unternehmen, die sich auf die Herstellung dieser Art von Schilden spezialisiert haben, maßgefertigt werden können. Zum Beispiel haben wir für den Headshield einen Bleiziegel speziell entwickelt, um einen konischen 50-ml-Rohr-Rückhaltegriff zu halten (siehe Abbildung 1F). Das Tier kann in den Rückhaltekörper passen, der dann in ein Loch im Ziegel geschlitzt wird, um 1,5 Zoll Schutz vor der Bestrahlung zu bieten. Wichtig ist, dass alle Bleischilde entweder mit Farbe oder Klebeband beschichtet werden sollten, um die Exposition gegenüber Bleistaub zu verhindern, der giftig sein kann.

Basierend auf der Ausrüstung und ihren Parametern können Forscher ihre eigenen Bleischilde für ihre Sehenswürdigkeiten entwerfen. Hier haben wir Thorax-, Bauch- und Kopfabschirmung eingeführt; Andere Stellen wie Glied oder Flanke können jedoch auch für die Abschirmung in Betracht gezogen werden. Während beide Strahlungsquellen (Cäsium-137 und Röntgen) für die Knochenmarkablation und erfolgreiche Transplantation geeignet sind, wurde eine Variabilität in der Rekonstitution von lymphatischen und myeloischen Zellpopulationen zwischen Cäsium-137 und Röntgenbestrahlungsquellen beobachtet30. Daher sollten Forscher die unterschiedlichen physiologischen Reaktionen auf die Strahlungsquelle für die Verwendung in Studien berücksichtigen.

Dosierintervalle
Dosierungs- und Dosierungsintervalle können die Effizienz der Spenderzelltransplantation und die Überlebensraten beeinflussen. Bei menschlichen Patienten kann eine hochdosierte Bestrahlung eine idiopathische interstitielle Pneumonie, Magen-Darm-Verletzungen und Kataraktbildung verursachen. In Mausmodellen kann eine einmalige hochdosierte Bestrahlung mit anschließender Knochenmarktransplantation ähnliche Ergebnisse liefern und auch die Überlebensraten beeinflussen31. Daher wird eine fraktionierte Bestrahlung für bmT-Studien der Maus dringend empfohlen. Darüber hinaus können die Dosierungsintervalle von Fraktionen die Überlebensrate und Rekonstitutionsrate der Maus beeinflussen, was zu verschiedenen Anteilen des Spenderzellchism in den hämatologischen Organen sowie anderen Geweben führt31. Daher sollten Forscher bei der Entwicklung eines dosierungsplans für fraktionierte Bestrahlung für BMT-Studien vorsichtig sein.

Im Zusammenhang mit der Überlebensrate und der Rekonstitution von Immunzellen zeigte unsere kleine Studie, dass eine Gruppe von Mäusen, die eine Ganzkörperbestrahlung mit einer tödlichen Strahlendosis von 11 Gy in zwei 5,5-Gy-Fraktionen erhielten, die durch eine 24-Stunden-Intervallgruppe getrennt waren, keine signifikant anderen Ergebnisse aufwies als die Gruppe, die die gleiche TBI-Dosierung in einem 4-Stunden-Intervall erhielt (siehe Tabelle 1). Bei der thoraxabschirmenden BMT schien die 24-Stunden-Intervallgruppe jedoch im Vergleich zur 4-Stunden-Intervallgruppe eine geringere Effizienz des Spenderzellchismen zu zeigen. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis ist, dass die Bestrahlung mit einem Intervall von 24 Stunden möglicherweise nicht ausreichte, um die immunkompetenten Zellen des Empfängers zu entfernen, da die verlängerten Intervalle den Empfängermäusen genügend Zeit gaben, beschädigte Zellen zu reparieren. Darüber hinaus schützt die Thoraxabschirmung partielle Wirbelsäulenknochen, die auch die HSCs des Empfängers enthalten. So könnten die verbleibenden und wiederhergestellten immunkompetenten Empfängerzellen die vom Spender abgeleiteten Zellen angegriffen und ein Ergebnis induziert haben, das eine geringere Transplantationseffizienz zeigte.

   

WBC (%) B-Zelle (%) T-Zelle (%) Mono (%) Ly6Chi mono (%) Ly6Clo mono (%) Neutrophil (%)
TBI-BMT 4h Intervall 97,4 ± 1,0 100 ± 0 59,1 ± 18,7 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
24h Intervall 97,2 ± 2,2 100 ± 0 79,0 ± 8,1 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
thoraxabschirmende BMT 4h Intervall 56,2 ± 4,0 54,2 ± 6,2 0,5 ± 0,1 66,7 ± 6,1 63,8 ± 6,3 70,8 ± 5,7 82,0 ± 3,8
24h Intervall 34.4 ± 3.1 34.8 ± 3.1 2.9 ± 1.7 45,0 ± 3,2 34,2 ± 3,6 56,2 ± 4,9 56 ± 10,0

Tabelle 1: Die Effizienz der Spenderzelltransplantation unter Verwendung verschiedener Dosierungsintervalle. Die durchflusszytometrische Analyse des peripheren Blutes wurde 1 Monat nach der Knochenmarktransplantation durchgeführt. WT CD45.2+ Spenderknochenmarkzellen wurden in CD45.1+ Empfängermäuse transplantiert. 5 x 106 Knochenmarkzellen wurden nach zwei Fraktionen der Ganzkörperbestrahlung (2 x 5,5 Gy) mit oder ohne Thoraxabschirmung transplantiert, getrennt durch ein 4 h Intervall oder 24 h Intervall. (n = 3–4 pro Gruppe).

Tierpflege
Für den Erfolg dieses Experiments sind mehrere Schritte mit Mäusen erforderlich. Daher ist an folgenden Stellen besondere Aufmerksamkeit erforderlich: Erstens ist die Lieferung lebensfähiger Spenderzellen entscheidend für eine erfolgreiche Transplantation. Man sollte in der Sammlung intakter BM-Zellen und deren Injektion in Empfängermäuse richtig geschult werden. Zu den Folgen einer schlechten Abgabe von Zellen gehört das Versagen von Spender-HSPCs, das Knochenmark des Empfängers zu rekonstituieren, was zur Mortalität führt. Zweitens muss nach der Transplantation darauf geachtet werden, eine Infektion zu vermeiden, insbesondere nach einer myeloablativen Therapie. Der Kontakt mit Krankheitserregern kann tödlich sein, da Mäuse nach der Bestrahlung vorübergehend immundefizient werden. Wie oben angegeben, kann die Ergänzung des Trinkwassers mit Antibiotika das Risiko einer tödlichen Infektion senken. Darüber hinaus kann die Versorgung der Empfängertiere mit Ernährungs- / Trinkgel Dehydrierung und Ernährungsmängeln minimieren, die nach der Bestrahlung auftreten können, da die Bestrahlung das Darmepithel stören kann, was zu Durchfall führt32. Käfige sollten auch häufig ausgetauscht werden, um das Risiko einer Kontamination mit Fäkalbakterien zu verringern, Tiere sollten in einer geeigneten Tiertransferstation behandelt werden, und die Empfängermäuse sollten sorgfältig auf Gewichtsverlust und Anzeichen von Stress oder Schmerzen überwacht werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health an K. Walsh (HL131006, HL138014 und HL132564), an S. Sano (HL152174), american Heart Association grant an M. A. Evans (20POST35210098) und ein Japan Heart Foundation Grant an H. Ogawa unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-121 general supply
1.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-129 general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
Absolute Ethanol (200 prfof) Fisher chemical 200559 general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle Becton Dickinson 309626 general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) Becton Dickinson 395195 general supply
Cesium-137 Irradiator J. L. Shepherd  Mark IV equipment
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10 general supply
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09 general supply
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Ketamine Zoetis 043-304 injection
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimtech Science KCC34155 general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim TEVA 0703-9526-01 injection
Xylazine Akorn 139-236 injection
X-ray irradiator Rad source RS-2000 equipment

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