Summary
אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.
Abstract
המטופויזיס קלונל הוא מצב נפוץ הקשור לגיל הנובע מהצטברות של מוטציות סומטיות בתאי גזע ו אבות מהמטופויטיים (HSPCs). מוטציות בגנים של הנהג, המעניקות כושר תאי, יכולות להוביל להתפתחות של שיבוטי HSPC מתרחבים שגורמים יותר ויותר לויקוציטים צאצאים המעניקים מחסה למוטציה הסומטית. מכיוון שהמטופוזיס שיבוטי נקשר למחלות לב, שבץ ותמותה, פיתוח מערכות ניסיוניות המרכיבות תהליכים אלה הוא המפתח להבנת המנגנונים העומדים בבסיס גורם סיכון חדש זה. הליכים השתלת מח עצם מעורבים מיזוג מיאלובלטיבי בעכברים, כגון הקרנת הגוף הכולל (TBI), משמשים בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של תאים חיסוניים במחלות לב וכלי דם. עם זאת, נזק בו זמנית לגומחת מח העצם ולאתרים מעניינים אחרים, כגון הלב והמוח, הוא בלתי נמנע עם הליכים אלה. לכן, המעבדה שלנו פיתחה שתי שיטות חלופיות כדי למזער או למנוע תופעות לוואי אפשריות הנגרמות על ידי TBI: 1) השתלת מח עצם עם מיגון הקרנה ו 2) BMT מאמץ לעכברים לא מותנים. באיברים מוגנים, הסביבה המקומית נשמרת ומאפשרת ניתוח של hematopoiesis שיבוט בעוד הפונקציה של תאים חיסוניים תושב הוא ללא הפרעה. לעומת זאת, BMT מאמץ לעכברים לא מותנים יש יתרון נוסף כי הן את הסביבות המקומיות של האיברים ואת הנישה hematopoietic נשמרים. כאן, אנו משווים שלוש גישות שונות של שחזור תאים hematopoietic ולדון החוזקות והמגבלות שלהם למחקרים של hematopoiesis שיבוט במחלות לב וכלי דם.
Introduction
המטופוזיס שיבוט (CH) הוא מצב אשר נצפתה לעתים קרובות אצל אנשים קשישים מתרחשת כתוצאה של גזע hematopoietic מורחב תא אב (HSPC) שיבוט נושא מוטציהגנטית 1. הוצע כי עד גיל 50, רוב האנשים ירכשו בממוצע חמש מוטציות אקסוניק בכל HSPC2, אבל רוב המוטציות האלה יגרמו לתוצאות פנוטיפיות מועטות או לא לא לאדם. עם זאת, אם במקרה אחת מהמוטציות הללו מעניקה יתרון תחרותי ל- HSPC – למשל על-ידי קידום התפשטותו, חידושו העצמי, הישרדותו או שילוב כלשהו שלו – הדבר עשוי להוביל להרחבה מועדפת של שיבוט המוטנטים ביחס ל- HSPCs האחרים. כתוצאה מכך, המוטציה תתפשט יותר ויותר דרך מערכת hematopoietic כמו HSPC מוטציה מעוררת תאי דם בוגרים, המוביל לאוכלוסייה ברורה של תאים שעברו מוטציה בתוך הדם ההיקפי. בעוד מוטציות בעשרות גנים שונים של נהג מועמד קושרו עם אירועי שיבוט בתוך מערכת hematopoietic, בין אלה, מוטציות ב- DNA מתיל טרנספראז 3 אלפא (DNMT3A) ועשרה טרנסלוקציה 11 2 (TET2) הם הנפוצים ביותר3. מספר מחקרים אפידמיולוגיים מצאו כי אנשים הנושאים מוטציות גנטיות אלה יש סיכון גבוה יותר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם (CVD), שבץ, ותמותה סיבתית3,4,5,6,7. בעוד שמחקרים אלה זיהו כי קיים קשר בין CH לבין שכיחות מוגברת של CVD ושבץ, איננו יודעים אם קשר זה הוא סיבתי או אפיפנומנון משותף עם תהליך ההזדקנות. כדי לקבל הבנה טובה יותר של קשר זה, מודלים בעלי חיים נאותים כי נכון לסכם את המצב האנושי של CH נדרשים.
מספר מודלים של בעלי חיים CH הוקמו על ידי הקבוצה שלנו ואחרים באמצעות זברה, עכברים, פרימטים שאינם אנושיים8,9,10,11,12,13,14. מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בשיטות שחזור hematopoietic על ידי השתלת תאים מהונדסים גנטית, לפעמים באמצעות Recombination Cre-lox או מערכת CRISPR. גישה זו מאפשרת ניתוח של מוטציה גנטית ספציפית בתאים hematopoietic כדי להעריך איך זה תורם להתפתחות המחלה. בנוסף, מודלים אלה מעסיקים לעתים קרובות תאים קוגניים או תאים כתב כדי להבחין בין ההשפעות של תאים מוטנטים מתאים נורמליים או פראיים. במקרים רבים, משטר טרום מיזוג נדרש בהצלחה לחרוט תאי גזע hematopoietic התורם.
נכון לעכשיו, השתלת מח עצם לעכברים המטופל ניתן לחלק לשתי קטגוריות עיקריות: 1) מיזוג מיאלובלטיבי 2) השתלה מותנית. מיזוג Myeloablative יכול להיות מושגת על ידי אחת משתי שיטות, כלומר, הקרנת הגוף הכולל (TBI) אוכימותרפיה 15. TBI מתבצעת על ידי החשפות הנמען למנה קטלנית של הקרנת גמא או רנטגן, יצירת הפסקות DNA או קישורים צולבים בתוך תאים המפרידים במהירות, מה שהפך אותם לבלתי הפיכים16. בוסולפן וציקלופוזפיד הן שתי תרופות כימותרפיות נפוצות המשבשות את הנישה ההמטופוביטית וגורמות באופן דומה לנזק לדנ"א לתאים המפרידים במהירות. התוצאה נטו של תנאי מקדים מיאלובלטיבי הוא אפופטוזיס של תאים hematopoietic, אשר הורס את המערכת hematopoietic של המטופל. אסטרטגיה זו לא רק מאפשרת חריטה מוצלחת של HSPCs התורם, אבל יכול גם למנוע דחיית השתל על ידי דיכוי המערכת החיסונית של המטופל. עם זאת, myeloablative תנאי מוקדם יש תופעות לוואי חמורות כגון נזק לרקמות ואיברים ותאי החיסון תושב שלהם, כמו גם הרס של נישה מח עצם יליד17. לכן, הוצעו שיטות חלופיות להתגבר על תופעות לוואי לא רצויות אלה, במיוחד לגבי נזק לאיברים בעלי עניין. שיטות אלה כוללות הקרנה מוגנת של עכברים נמענים ואת BMT מאמץ לעכברים לא מותנים9,17. הגנה על בית החזה, חלל הבטן, הראש או אזורים אחרים מפני הקרנה על ידי מיקום של מחסומי עופרת שומרת על רקמות מעניינות מוגנות מפני ההשפעות המזיקות של הקרנה ושומרת על אוכלוסיית תאי החיסון התושבים שלהם. מצד שני, BMT מאמץ של HSPCs לעכברים מותנים יש יתרון נוסף כי זה משמר את הנישה hematopoietic יליד. בכתב יד זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים והתוצאות של תחריט HSPC לאחר מספר משטרי השתלה בעכברים, במיוחד מסירת HSPC לעכברי TBI, לעכברים המוגנים חלקית מפני הקרנה, ולעכברים לא מותנים. המטרה הכוללת היא לעזור לחוקרים להבין את ההשפעות הפיזיולוגיות השונות של כל שיטה, כמו גם כיצד הם משפיעים על תוצאות ניסיוניות בהגדרה של CH ומחלות לב וכלי דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הקשורים בנושאים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה.
1. לפני תנאים קודמים
- מניחים את העכברים המטופל על מים בתוספת אנטיביוטיקה (5 מ"מ סולפטוקסזול, 0.86 מ"מ trimethoprim) ~ 24 שעות לפני הקרנה. זה הכרחי כדי למנוע זיהום, כמו המערכת החיסונית דוכאה לאחר הקרנה, ומתוחזק במשך 2 שבועות לאחר הקרנה. בשלב זה, להשלים עכברים עם ג'ל תזונתי/ הידרציה כדי לעודד האכלה ולמנוע ירידה במשקל והתייבשות לאחר הקרנה.
איור 1: תמונות המציגות הגדרות שונות של תנאים מקדים. (A)מערך הקרנת הגוף הכולל של כלוב הפאי באמצעות קרן גמא (צסיום-137): קרן הקרינה מגיעה מגב הקרינה בכיוון ציר ה-y (קרינה אופקית). (B) כלוב העכבר ההתקנה הכוללת הקרנת הגוף באמצעות רנטגן: כלוב העכבר ממוקם בתא רפלקטיבי. קרן הקרינה מגיעה מראש הקרינה בצורת חרוט (קרינה אנכית). המרחק ממקור הקרינה לכלוב הוא 530 מ"מ. (C) מגש מתכוונן בקרן רנטגן: התקנה זו משמשת להקרנה מוגנת חלקית באמצעות רנטגן. קרן הקרינה מגיעה מראש הקרינה בצורת חרוט (קרינה אנכית). המרחק ממקור הקרינה למגש הוא 373 מ"מ, והרדיוס הוא 250 מ"מ.(D)מיגון בית החזה: עכברים מורדמים מונחים על מגש. העכברים ממוקמים הפוכים זה לזה בתנוחות סופיות עם ידיים ורגליים מורחבות לחלוטין. הקצה התחתון של מגן העופרת מיושר עם עצם xiphisternum ואת הקצה העליון עם התימוס. (ה)מיגון בטן: עכברים מורדמים ממוקמים כמו בהגדרת מגן בית החזה עם הקצה התחתון של מגן העופרת מיושר עם פי הטבעת ואת הקצה העליון מתחת לסרעפת. (ו)הגדרת הקרנה מגינה על הראש באמצעות קרן גמא (צסיום-137): תפאורת העכבר המורדמת מודבקת למטה והעכבר ממוקם במרסן חרוט. מגן העופרת השחור (מסומן) מכסה את ראשו ואוזניו של העכבר. קרן הקרינה מגיעה מגב הקרינה לכיוון ציר ה-Y (קרינה אופקית). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
2. תנאי מקדים של עכברים נמענים (אופציונלי)
- הקרנת גוף כוללת
- מניחים עכברים נמען לתוך כלוב עוגה פרוס באופן אחיד, או כלוב עכבר בתא רפלקטיבי בתוך הרדיוס המחושב כדי לקבל את אותה מנה הקרנה; עם זאת, מומלץ לכל היותר 8 עכברים לכלוב עוגה ו-5 עכברים לכלוב עכברים כדי להבטיח הקרנה אחידה(איור 1A,B).
- כדי להשיג myeloablation מלא, להבטיח כי עכברים המטופל לקבל מינון קרינה כולל של 11 Gy בשני שברי Gy 5.5 מופרדים על ידי מרווח של 4-24 שעות.
הערה: בעוד שניתן להשיג חריטה אופטימלית על-ידי יישום מרווח של 4 שעות בין שברים, ניתן להרחיב זאת למרווח של 24 שעות, דבר שיכול להועיל כאשר העבודה ו/או ההקרנה אינן זמינות.
- הקרנה מוגנת חלקית
- הרדמה העכברים המטופל על ידי הזרקה תוך-אישית של קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (5-10 מ"ג/ק"ג). האיפוק של תנועת העכבר הוא קריטי כדי להבטיח הקרנה אחידה והגנה יעילה של איברי המטרה במהלך תהליך המיגון.
- למיגון בית החזה והבטן, כוון את קרן הקרינה של קרינה רנטגן אנכית לעכבר (איור 1C).
- מקמו את העכברים המרופדים על צלחת שטוחה, ומרכזים את מקור הקרינה מלמעלה. הניחו את העכברים הפוכים זה לזה בתנוחת על-חושית עם ידיים ורגליים מורחבות במלואן(איור 1D,E).
הערה: מתקן הקרנת רנטגן, עבור ניסוי זה, מאפשר כי שני עכברים בכל פעם ניתן למקם ברדיוס יעיל המאפשר הקרנה אחידה. בעוד שהרדיוס האפקטיבי מחושב על סמך המרחק בין מקור הקרינה למגש, מספר בעלי החיים שניתן להקרין בו זמנית יהיה תלוי בהקרנה הספציפית. - הדקו את כפות הרגליים של העכברים על הצלחת באמצעות סרט הדבקה כדי להבטיח שהעכברים משותקים במהלך הליך ההקרנה. מקם את מיגון העופרת כך שיכסה אזורים הדורשים הגנה.
- למיגון בית החזה, הכינו את מגן העופרת על ידי מדידת האורך מעצם xiphisternum של העכבר אל התימוס וחישוב העובי שיספק הגנה מספקת ממקור ההקרנה. הנח את מיגון העופרת כך שהקצה התחתון יתיישר עם עצם ה- xiphisternum. הקצה העליון של מחסום העופרת יתאים ליד התימוס(איור 1D).
- למיגון הבטן, הכינו את מגן העופרת על ידי מדידת האורך מפי הטבעת של העכבר לסרעפת וחישוב העובי שיספק הגנה מספקת ממקור ההקרנה. הנח את מיגון ההפניה כך שהקצה התחתון יתיישר עם פי הטבעת. הקצה העליון של מגן העופרת יתאים מתחת לסרעפת (איור 1E).
הערה: לוקליזציה של מגן העופרת כך שיהיה עקבי בין קבוצות עשויה להפחית וריאציה מסוימת ביחס לגודל העכברים.
- מקמו את העכברים המרופדים על צלחת שטוחה, ומרכזים את מקור הקרינה מלמעלה. הניחו את העכברים הפוכים זה לזה בתנוחת על-חושית עם ידיים ורגליים מורחבות במלואן(איור 1D,E).
- עבור מיגון ראש, לכוון את קרן הקרינה של הקרנת צסיום אופקית לעכבר.
- בזהירות להקליט את ההסתעפות של עכבר מורדם לבטן. זה מבטיח כי הזרועות לקבל מנה מלאה של הקרנה ואינם מכוסים על ידי המגן.
- עבור מיגון ראש, למקם את העכבר במרסן חרוט, אשר מתאים בתוך מגן עופרת. לאחר שהעכבר נמצא בתוך המרסן החרוט, החלק את המרסן לתוך החריץ בתוך מגן העופרת(איור 1F). מגן העופרת אמור לכסות לחלוטין את ראשו ואוזניו של העכבר (~ 3.2 ס"מ), ולהשאיר את שאר גופו של העכבר חשוף להקרנה. ניתן להתאים את מיקום המרסן בתוך המגן כך שיתאים לבעלי חיים בגדלים שונים על ידי החלקתו פנימה או מחוץ למגן.
- מניחים עכברים בתוך ההקרנה, בניצב למקור להקרנה.
- לחשוף עכברים לשני שברי Gy 5.5 של הקרנה (המינון הכולל של 11 Gy) מופרדים על ידי מרווח של 4-24 שעות.
- לאחר כל שבר הקרנה, מניחים את הכלובים עם עכברים מורדמים על מחצלות מחוממות או תחת מנורות חום אדומות כדי למנוע היפותרמיה ולסייע בהתאוששות מהרדמה.
הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי לא לחמם יתר על המידה את העכבר המומר בעת שימוש במנורה מכיוון שהם אינם יכולים להימלט מהחום. כפי שתואר לעיל, המיקום של בעלי חיים ועובי מגן העופרת יכולים להיות שונים בין מחקרים המבוססים על התכונות הספציפיות של הקרינה (סוג קרינה / כיוון של קרן, וכו '). החוקרים יצטרכו להתאים את הניסויים שלהם בהתאם.
3. בידוד עצמות
הערה: באופן אידיאלי, עכברים תורמים ועכברים נמענים צריכים להיות דומים בגיל, ובתוך 8-12 שבועות. שימוש בלפחות 3 עכברים כתורמים (ולא כתורם יחיד) עדיף למזער את ההטרוגניות (גם בעת שימוש בעכברים עם אותו גנוטיפ). בערך, 40 מיליון תאי מח עצם לא מופרים ניתן להשיג משש עצמות (שתי עצם הירך, שתי שוקות, ושני humeri) של עכבר אחד. השתלה של 5 מיליון תאי מח עצם לכל עכבר נמען בדרך כלל תבטיח חריטה.
- המתת חסד עכברים תורמים על ידי נקע בצוואר הרחם ללא הרדמה (שיטה מועדפת כדי למנוע זיהום כימי של תאים) ומניחים כל עכבר על כרית סופגת.
- לחטא את העור באמצעות תרסיס אתנול 70%.
- לעשות חתך רוחבי קטן בעור מתחת לכלוב הצלעות ולהחזיק את העור בחוזקה משני צדי החתך, לקרוע בכיוונים מנוגדים לכיוון הראש והרגליים. לקלף את העור מכל הגפיים.
- חותכים מעל הכתפיים ומפרקי המרפק, ומסירים את השרירים המחוברים ואת רקמות החיבור בעזרת קימיפי כדי להשיג את humeri.
- בזהירות לפרוק את מפרקי הירך בין עצם הירך ועצמות הירך. השתמש מספריים קהה לחתוך לאורך ראש עצם הירך לנתק את הרגליים. חותכים מעל מפרק הברך כדי להפריד את עצם הירך ואת השוקה, ולהסיר בזהירות את השרירים המצורפים ואת רקמות החיבור בעזרת קימוויפ כדי לקצור את עצם הירך ואת השוקה.
הערה: שים לב במיוחד כדי לשמור על אפיפיזת העצם ללא פגע במהלך שלב זה. השלך את כל העצמות השבורות עקב אובדן עקרות. עצמות הירך ועצמות עמוד השדרה ניתן לאסוף בנוסף עצם הירך, השוקה, ועצם הזרוע. כדי לאסוף עצמות עמוד השדרה, מרגמה ועלי יכול לשמש כדי למחוץ את העצמות לחתיכות לקצור את תאי מח העצם. - מניחים את העצמות המבודדות מעכברים מאותו גנוטיפ לתוך צינור חרוט 50 מ"ל בהתאמה המכיל 20 מ"ל קרח קר סטרילי PBS, ולשמור אותו על הקרח עד לשימוש נוסף. שים לב במיוחד למקם את העצמות בצורה נכונה לתוך צינורות עם גנוטיפים תואמים.
- חזור על השלבים לעיל עבור כל בעל חיים תורם שינוי כפפות בין כל עכבר. כמו כן, מספריים נקיים ומכשירים אחרים עם 70% אתנול בין כל עכבר.
4. בידוד תאי מח עצם
הערה: בצע את השלבים הבאים בארון מסוג BIOSAFETY II.
- הכנת ערכות צינור: לעשות חור קטן בחלק התחתון של צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 0.5 מ"ל באמצעות מחט 18 G ומניחים אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל, אשר מכיל 100 μL של PBS סטרילי קר כקרח בתחתית.
הערה: כמו רק שש עצמות יכול להתאים לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, מומלץ להכין ערכות צינור מספיק כדי לעבד את כל העצמות באותו זמן. - שאפו את ה-PBS והעבירו את העצמות המבודדות לצלחת סטרילית של 100 מ"מ של תרבית תאים. מחזיקים כל עצם באמצעות מלקחיים עדינים, חותכים בזהירות את האפיפיזות מכל קצה באמצעות מספריים קטנות שעוקרו במובלעת אוטומטית. מניחים את העצמות החתוכות בערכות הצינור המוכנות.
- צנטריפוגה הצינורות ב 10,000 x g עבור 35 s ב 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר צנטריפוגה, לאשר כי מח העצם הוסר בהצלחה מן העצמות. עצמות אמורות להיראות לבנות ושקוף עם גלולה אדומה גדולה יחסית בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. השלך את צינור המיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
הערה: אם הבדיקה החזותית לא מצליחה לזהות מח עצם בתחתית צינור 1.5 מ"ל, לחתוך את העצם שוב ולחזור על שלב 4.3. - Resuspend מח העצם ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח, ולאחר מכן להעביר את השעיית התא מאותו גנוטיפ לצינור חרוט תואם 50 מ"ל.
- לנתק את התאים על ידי העברת אותם דרך מחט 18 G עם מזרק 10 מ"ל 10 פעמים.
- סנן מתלים של תא יחיד באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר. הוסיפו PBS קר כקרח לנפח סופי של 10 מ"ל, והשתמשו מחדש בתאים באמצעות שימוש עדין בסיוע פיפטה.
- צנטריפוגה ב 310 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשאוף את supernatant ו resuspend גלולת התא עם 10 מ"ל של מדיה RPMI ללא סרום. חילוף 30 μL של חומר זה לספירת תאים.
- לקבוע ריכוז התא עם מונה התא, ולחשב את נפח ההשעיה התא הנדרש עבור ההשתלה. לדוגמה של 100% BMT, 5 x 10 6 תאי מחעצם נדרשים עבור כל עכבר נמען.
הערה: עבור BMT תחרותי, להכין סך של 5 x 10 6 תאי מח עצם הכולליםתערובת של תאים תורמים (למשל, CD45.2+) ותאים מתחרים (למשל, CD45.1+). מומלץ מאוד להכין תאי מח עצם נוספים. לדוגמה, אם קיימים 10 עכברים נמענים לכל קבוצת ניסוי, אנו מכינים בדרך כלל מספיק תאים עבור עכברים 12 נמענים. - להעביר את הנפח המחושב של השעיית התא לתוך צינור חרוט חדש 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 310 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשאוף את supernatant ו resuspend התאים באמצעות כמות מחושבת של בינוני RPMI ללא סרום כדי להשיג את צפיפות התא המתאים ואת נפח. בדרך כלל, 200 μL הוא נפח אופטימלי עבור הזרקת רטרו מסלולית.
5. השתלת תאי מח עצם לעכברים מוקרנים
- יש למרדים את העכברים המטופלים עם 5% isoflurane.
- בעוד עכברים מורדמים, לאט להזריק 200 μL של תאי מח עצם לתוך הווריד רטרו מסלולית באמצעות מחט 28-30 G עם מזרק אינסולין.
- לחלופין, בצע את המסירה של התאים התורמים על ידי הזרקה תוך ורידי זנב והזרקה תוך-רפואית של הירך, עם נפח מרבי של 0.2 מ"ל ו- 25 μL, בהתאמה.
- לאחר התאים מוזרקים, מניחים טיפה של טיפות עיניים המכילות proparacaine על פני השטח של העין להקלה על הכאב. לאחר מכן ניתן לאפשר לחיה לחזור להכרה.
6. השתלת תאי מח עצם לעכברים לא מותנים
- יש למרדים את העכברים המטופלים על ידי שאיפה של 5% isoflurane.
- הזרק 5 x10 6 תאי מח עצם לא מופרים מגנוטיפ רטרו-מסלול לעכברים שאינם מוקרנים עם מזרק אינסולין 28-30 G.
- חזור על שלבים 6.1 ו 6.2 על פני 3 ימים רצופים, כך העכברים המטופל יושתלו עם סך של 1.5 x 107 תאי מח עצם.
הערה: מכיוון שה-BMT המאמץ ללא הליך טרום-מיזוג דורש השתלת מח עצם במשך 3 ימים רצופים, יש לנסות להחליף עיניים לכל זריקה. - לאחר ההזרקה, לנהל טיפה של טיפות עיניים המכילות proparacaine לעין המושפעת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להשוות את ההשפעה של שלוש שיטות BMT / טרום מיזוג על תחריט התא התורם, שברי תאים תורמים בדם היקפי ורקמת לב נותחו על ידי cytometry זרימה ב 1 חודש לאחר BMT. תאים מבודדים הוכתמו עבור סמני לויקוציטים ספציפיים כדי לזהות את קבוצות המשנה השונות של לויקוציטים. בניסויים אלה, תאי מח עצם תורמים מסוג בר(WT) C57BL/6 (CD45.2) הועברו ל-WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/ BoyJ (CD45.1) עכברים נמען להבחין תאים התורמים מתאי הנמען. אסטרטגיות גיטינג cytometry זרימה ששימשו מתוארים בעבר על ידי וואנג ואח'9 באיור משלים 1.
הקבוצה הכוללת של הקרנת הגוף (TBI) שטופלה קיבלה 5 x 10 6 תאי מחעצם בעקבות מינון קרינה קטלני כולל של 11 Gy בשני שברי Gy 5.5 מופרדים במרווח של 4 שעות. בדם ההיקפי של עכברים נמענים, מונוציטים, נויטרופילים ותאי B היו במידה רבה ablated והוחלפו על ידי צאצאים של תאים שמקורם במח העצם התורם. בנוסף, אוכלוסיית המונוציט והנויטרופילים הלבבית המקומית בלב עכברים נמענים הוחלפו כמעט לחלוטין בתאים שמקורם בתורם (איור 2A).
בקבוצת ההקרנה המוגנת חלקית, עכברי המטופל הוקרנו עם מגן בית החזה והושתלו עם 5 x 10 6 תאי מחעצם בעקבות מינון קרינה כולל של 11 Gy בשני שברי Gy 5.5 מופרדים על ידי מרווח של 4 שעות. בניגוד לקבוצת TBI, תרומתם של תאים שמקורם בתורם לתאי חיסון לבביים הייתה צנועה, מה שכנראה משקף את ההשפעות המשולבות של הגנה על תאי החיסון המקומיים בליבם של עכברים נמענים ואת אכלוסם הפיזיולוגי של תאים תורמים שמקורם במח העצם מהדם ההיקפי. תאי מח עצם של עכבר נמען באזורים מוגנים עשויים גם הם לתרום לשיקוי דם היקפי, מה שמפחית את אחוז התאים שמקורם בדם היקפי בהשוואה לקבוצה שטופלה ב- TBI (איור 2B).
בקבוצה ללא BMT טרום מיזוג (BMT מאמץ), עכברים המטופל הושתלו עם 5 x 10 6 תאי מחעצם על פני 3 ימים רצופים. ב 4 שבועות שלאחר BMT, החלק של תאים שמקורם תורם בדם ובלב היקפי היה לגילוי. (כ-5%) (איור2C).
כדי להמחיש כיצד מודל BMT המאמץ יכול להיות מיושם על המחקר של מודל CH, CD45.2+ תאי מח עצם התורם (WT או Tet2-/-) הושתלו CD45.1+ עכברים המטופל. מטופלים ללא מיזוג הושתלו עם 5 x 10 6 תאי מחעצם בכל יום במשך 3 ימים רצופים (בסך הכל 1.5 x 107, n = 5-6 לכל קבוצה). ניתוח ציטומטרי זרימה של דם היקפי בוצע 4, 8, 12, ו 16 שבועות לאחר ההשתלה. התאים התורמים בעלי ה-Tet2 הוענקו יתרון תחרותי והתרחבו בהדרגה עם הזמן; WBCs, מונוציטים, Ly6Chi מונוציטים, נויטרופילים, תאי T ותאי B גדלו באופן משמעותי לאורך זמן. בהשוואה לתאי התורמים בעלי ה-Tet2 החרוטים בעכברים נמענים, עכברים נמענים חרוטים בתאי תורמים של WT הראו התרחבות שיבוטים פחות משמעותית של תאים תורמים (איור 3). עולה בקנה אחד עם הפרדיגמה הקלינית של hematopoiesis שיבוט, ההתרחבות של תאים Tet2 לקוי אינו משפיע על המספרים המוחלטים של סוגי תאי הדם השונים9 (נתונים לא מוצגים).
איור 2: ניתוח ציטומטרי זרימה של דם ולב בשיטות שונות של תנאים קדם- תנאים. ניתוח ציטומטרי זרימה של דם ולב היקפי בוצע 1 חודש לאחר השתלת מח עצם. כדי להבחין בין תאים תורמים לתאי הנמענים, הושתלו CD45.1+ עכברים נמענים בתאי מח עצםשל תורמים. (A) 5 x 10 6 תאי מחעצם הושתלו בעקבות שני שברים של הקרנת הגוף הכוללת (2 x 5.5 Gy, מרווח של 4 שעות, n = 3). (B) 5 x 10 6 תאי מחעצם הושתלו בעקבות שני שברים של הקרנת הגוף הכוללת עם מיגון בית החזה (2 x 5.5 Gy, מרווח של 4 שעות, n = 10). (ג)מטופלים ללא מיזוג הושתלו עם 5 x 10 6 תאי מחעצם במשך 3 ימים רצופים (בסך הכל 1.5 x 107, n = 4). הנתונים מבוטאים כ- SEM ± ממוצע. סה"כ WBCs מוגדרים כ- CD45+; נויטרופילים כמו Ly6G+ ; Ly6Chi מונוציטים כמו CD115+, Ly6G-, ו Ly6C+; Ly6Clo מונוציטים כמו CD115+, Ly6G-, ו Ly6C-; B תאים כ- CD45R+; CD4+ תאי T כתאי CD3e+ ו- CD4+; CD8+ תאי T כתאי CD3e+ ו- CD8+; ומאקרופאגים כ- CD64+, Ly6G-ו- Ly6C-. (WBCs: תאי דם לבנים, ניוט: נויטרופילים, מונו: מונוציטים, מק: מקופאגים). איור 2A,C שונה מוונג ואח'9. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התרחבות שיבוט של תאים עם מחסור ב-Tet2 באמצעות BMT מאמץ לעכברים לא מותנים. CD45.2+ תאי מח עצם תורם (WT או Tet2-/-) הושתלו CD45.1+ עכברים המטופל. מטופלים ללא מיזוג הושתלו עם 5 x 10 6 תאי מחעצם בכל יום במשך 3 ימים רצופים (בסך הכל 1.5 x 107, n = 5-6 לכל קבוצה). ניתוח ציטומטרי זרימה של דם היקפי בוצע לאחר 4, 8, 12, ו 16 שבועות לאחר ההשתלה. החלק של CD45.2+ תאים תורמים בכל אוכלוסייה מוצג. (A) WBCs (B) מונו (C) Ly6Chi מונו (D) תאי B (E) תאי T. הנתונים מבוטאים כמשמעותיים ±- SEM. WBCs מוגדרים כ- CD45+; נויטרופילים כמו Ly6G+ ; Ly6Chi מונוציטים כמו CD115+, Ly6G-, ו Ly6C+; Ly6Clo מונוציטים כמו CD115+, Ly6G-, ו Ly6C-; B תאים כ- CD45R+; CD4+ T תאים כמו CD3e+ (WT: סוג פראי, WBCs: כדוריות דם לבנות, מונו: מונוציטים) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקרים על hematopoiesis שיבוט, תיארנו שלוש שיטות של BMT: BMT עם הקרנה גוף כולל, BMT עם הקרנה עם מיגון חלקי, ושיטת BMT פחות נפוץ שאינו כרוך מיזוג מראש (BMT מאמץ). שיטות אלה שימשו כדי להעריך את ההשפעה של hematopoiesis שיבוט על מחלות לב וכלי דם. חוקרים יכולים לשנות שיטות אלה בהתאם כדי להתאים למטרה הספציפית של המחקר שלהם.
מודלים של המטופוזיס שיבוט
Hematopoiesis קלונל היא התופעה שבה תאים המוטנטים hematopoietic להתחרות עם תאים מסוג בר ולקבל דומיננטיות שיבוט לאורך זמן. כדי ליצור מודל של תחרות זו, עכברים יכולים להינתן מח עצם, אשר מורכב תערובת של תאים שונים מבחינה גנטית. בדרך כלל, תערובת זו תכלול תאים מוטנטים ותאי בר, שסומנו בתג פלואורסצנטי או סמני פאן-לויקוציטים שונים (כלומר, CD45.1 ו- CD45.2). לדוגמה, בעת יצירת מודלים המחקים CH בתיווך Tet2,אנו מבצעים השתלת מח עצם תחרותית למטופלים מוקרנים קטלנית הכוללת בדרך כלל ערבוב של 90% מהתאים שמקורם בתורמי CD45.1 Tet2+/+ ו- 10% מהתאים שמקורם ב- CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- או שולטים בתורמים Tet2+/+ 8. זיהוי ציטומטריית זרימה של גרסאות CD45 באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים מאפשר להבחין בין תאים תורמים (CD45.1-/CD45.2+) מתאי מתחרים (CD45.1+/CD45.2- )בתוך הדם, ולהעריך את הדינמיקה של תאי הבדיקה לאורך זמן. על ידי כך, הצלחנו לראות עלייה הדרגתית כימריזם התורם של תאים Tet2 לקוי, בעוד אחוז התאים מסוג בר להישאר על כ 10%. הגדרה ניסיונית זו מחקה את התרחיש האנושי של אנשים הנושאים מוטציה סומטית TET2, שכן מוטציות אלה מתבצעות בתחילה על ידי מספר קטן של HSPCs, אשר יתרחב בהדרגה עם הזמן. שימוש בגישה זו במודלים למחלות לב וכלי דם של טרשת עורקים ואי ספיקת לב הוביל לתיעוד של קשר סיבתי פוטנציאליבין Tet2-מתווך CH ו CVD 8,9,10.
בעת שימוש בגישות אלה, החוקרים צריכים לקחת בחשבון את ההשפעות המבלבלות האפשריות שנוצרו על ידי TBI. למרות TBI לפני ההשתלה מאפשר רמה גבוהה של חריטה HSPC, זה טרום מיזוג יוביל כמה השפעות לא רצויות מחוץ למערכת hematopoietic. זה תועד כי TBI יכול להוביל דלקת, פציעה, פיברוזיס במערכות איברים מרובים כולל עור, כבד, כליות, ריאות, מח עצם, לב, מוח, וכו'18,19,20. תופעות אלו יכולות להשפיע לרעה על איברי הלב וכלי הדם תחת המחקר, והם גם לשנות פתוגנזה המחלה21,22. דוגמה בולטת לכך היא השפעת ההקרנה על מקרופאגים מקומיים בלב. הקרנה של בית החזה גורמת להחלפה ניכרת של מקרופאגים תושבי לב עם מקרופאגים המונוצייטים המפיצים. מחקרים הראו כי מקרופאגים של תושבי לב מציגים מאפיינים ברורים ביחס למאקרופאגים המופקים ממונוציט שיחרטו בלב בעקבות פגיעה בקרינה. בהגדרות המחלה, מקרופאגים תושבי לב נחשבים לשחק תפקיד cardioprotective, ואילו חדירת מקרופאגים המועברים בדם דווחו כדי לקדם פציעה ודלקת23. לכן, זה מתקבל על הדעת כי החלפת תאים חיסוניים לב תושב עם תאים המועברים בדם ישנה את התהליכים הפתולוגיים תחת המחקר, אשר תורמים למחלות לב וכלידם 24,25,26. באופן דומה, במוח, תוצאות TBI דלדול של microglia תושב והחלפה על ידי מקרופאגים שמקורםהיקפית 27,28. בעוד שמאקרופגים המופקים באופן היקפי יכולים להתנהג כמו תאים מיקרוגליאליים, הם שומרים על זהות תפקודית ותעתיקית ייחודית בהשוואה למיקרוגליה28שמקורה במונוציט . לכן, ייתכן כי ההמשך המחלה עשוי להשתנות, במיוחד כאשר לומדים מחלות כגון שבץ איסכמי. על מנת למנוע את ההשפעות המבלבלות האלה, ניתן להמליץ על הגנה על בית החזה והראש. זה יתרון כי זה מספק הגנה על הלב והמוח, בהתאמה; וזה גם שומר על תאי החיסון המקומיים שלהם שלמים, טוב יותר recapitulating את המצב האנושי של CH. עם זאת, כפי שצוין קודם לכן, מיגון תוצאות שיעור נמוך יותר של כימריזם לעומת מיזוג מראש TBI, אשר למעשה מבטל את כל התאים hematopoietic של המארח.
מכשול חשוב נוסף במיזוג מראש הוא השפעתו המזיקה על נישה מח העצם. למרות הנזק הנגרמת על ידי הקרנה של נישה BM ניתן לשחזר במידה תת אופטימלית, לא ברור אם hematopoiesis נאיבי הוא התאושש אלה microenvironments פגום. בנוסף, השתלת HSPCs מעורבים לתוך BM ריק יוזם מרוץ לשגשוג בין שיבוטים, ולא פשוט "תחרות" עבור נישה כי הוא תפוס על ידי HSPC סוג פראי - וזה כנראה מה שקורה CH. לפיכך, גישה שעשויה להיות עדיפה על לימוד CH עשויה להיות שיטת BMT המאמצת, לפיה תאי BM מועברים לעכברים של נמענים ללא מיזוג מראש. BMT מאמץ זה ללא שיטת טרום מיזוג משפיע באופן מינימלי על hematopoiesis נאיבי מתמשך, בנאמנות ביותר recapitulating CH שנצפה בבני אדם29. איור 2C מציג את רמת הכימריזם בחודש אחד לאחר ההשתלה ללא מיזוג מקדים. בעוד הכימריזם התורם נמוך בנקודת זמן מוקדמת זו, אנו מוצאים חלק גדל והולך של שיבוטים ב-Tet2 לאורך זמן, כפי שמוצג באיור 3. יש לציין כי מודל זה שימושי ביותר כאשר לתאי המוטנטים יש יתרון תחרותי על תאים מסוג בר בתנאים הומיאוסטטיים כגון תאים לקויי Tet2. כאשר תאים עם תריסים של Tet2 חרוטים, קיימת התרחבות ניכרת באוכלוסיות לויקוציטים שונות כגון נויטרופילים, מונוציטים, תאי NK ותאי B. התרחבות איטית יותר נרשמה בתאי T, ככל הנראה בשל זמן מחצית החיים הארוך יותר של אוכלוסייה זו.
ההתרחבות של תאים לקוי Tet2 נצפתה לא רק בדם ההיקפי, אלא גם בכמה רקמות אחרות, כולל מח עצם, כבד וכליות, עם דינמיקה שונה של השבת תא hematopoietic9. לדוגמה, המאמר הקודם של המעבדה שלנו שפורסם תיאר את כימרות תא מח העצם של WT ותאי תורם לקוי Tet2 חרוט לתוך עכברים נמען CD45.1 8 חודשים לאחר מאמץ BMT9. תאי תורם לקויי Tet2 המושתלים בעכברים נמענים CD45.1 הראו יתרון תחרותי על פני שושלת לא בוגרת–תאי Sca1+c-Kit+ (LSK), תאי HSC לטווח קצר וארוך, ואבות רב-תכליתיים (MPPs) בהשוואה לתאים התורמים של WT המושתלים בעכברים הנמענים CD45.1. בנוסף, כמו Tet2-deficient תא תורם חרוט עכברים נמען, הם מפתחים פנוטיפ קרדיומיופתיה הקשורות לגיל ללא גורמים אקסוגני גרימת תפקוד לקוי של הלב, ובכך recapitulating את ההשפעה של hematopoiesis שיבוטים באופן דומה לזה של בני אדם מזדקנים. תצפית זו לוותה במידה מוגברת של כימרות בנייטרופילים לבביים ובמונוציטים Ly6Chi. באופן קולקטיבי, משטר BMT מאמץ זה יכול להיות מיושם על מחקרים עתידיים שיכולים להרחיב את ההבנה שלנו של הקשר בין התפתחות מחלות לב וכלי דם hematopoiesis שיבוט ברמה מתקדמת יותר.
לסיכום, תיארנו שלוש שיטות BMT ודנו ביישום שלהם ביצירת מודלים CH. CH מזוהה עם פרוגנוזות עניות יותר במחלות לב וכלי דם כגון טרשת עורקים ואי ספיקת לב. למרות התקדמות ניכרת נעשתה, המחקר של הקשרים הסיבתיים בין CH ו CVD עדיין בחיתוליו, חקירות נוספות נדרשות באמצעות מודלים בעלי חיים אופטימיזציה. אנו מקווים כי פרוטוקולים אלה מאפשרים לחוקרים לבחור שיטה מתאימה יותר מבחינה פיזיולוגית של BMT, אשר מינימליזציה השפעות מבלבלות פוטנציאליות על מערכת הלב וכלי הדם, בסופו של דבר מניב מחקרים המרחיבים את ההבנה שלנו של איך CH תורם למחלות לב וכלי דם.
תכנון מיגון עופרת
עובי מגן העופרת יוכתב על ידי סוג ההקרנה המשמש לגרימות המיאלובלציה. סוגי רנטגן או קרני גמא של קרינה משמשים לעתים קרובות עבור myeloablation ניסיוני אבל שונים מבחינת התדירות שלהם, אורך גל, ואנרגיית פוטון. כשמדובר מיגון, אנרגיית פוטון, המתאר את האנרגיה או המהירות שבה הקרניים נוסעות, הוא הפרמטר החשוב ביותר. בדרך כלל, מקור קרינה צילומי רנטגן יש אנרגיה של 160 kVp ואילו מקורות צסיום-137, אשר פולטים קרני גמא, יש אנרגיה של 662 KeV. האנרגיה הנפלטת ממקורות קרינה אלה משתווה לכוח החדירה שלהם, כאשר לאנרגיות גבוהות יותר יש כוח חדירה גדול יותר. לכן, עובי גדול יותר של מגן עופרת נדרש בעת שימוש צסיום מקור מבוססי הקרנה בהשוואה לשימוש בקורננים מבוססי רנטגן. הקרנה מבוססת רנטגן, בה אנו משתמשים כאשר אנו מבצעים מיגון בית החזה והבטן, דורשת מגן עופרת בעובי 7 מ"מ כדי לספק הגנה מספקת. עם זאת, עבור מקורות צסיום 137, שבהם אנו משתמשים כאשר אנו מבצעים מיגון ראש, דורש מגיני עופרת להיות לפחות 1 אינץ 'עבה כדי לספק הגנה מספקת.
ניתן לרכוש מגנים מובילים לשימוש בקרני רנטגן מספקים מסחריים. לחלופין, ניתן לחתוך גיליונות עופרת לגודל כדי להתאים לגוף החיה או כדי להתאים סביב מרסן (ראה איור 1). בעת שימוש בהקרנה מבוססת צסיום, יש להשתמש בלבני עופרת, שהן עבות במידה ניכרת וניתן להשתמש בהן בהתאמה אישית על ידי חברות המתמחות ביצירת סוגים אלה של מגנים. לדוגמה, עבור כיסוי הראש, עיצבנו בהתאמה אישית לבנה עופרת להחזיק מרסן צינור חרוט 50 מ"ל (ראה איור 1F). החיה מסוגלת להתאים בתוך המרסן, אשר לאחר מכן מחורץ לתוך חור עשה בלבנה, כדי לספק 1.5 סנטימטרים של הגנה מפני הקרנה. חשוב לציין, כל המגינים עופרת צריך להיות מצופה או עם צבע או סרט כדי למנוע חשיפה לאבק עופרת, אשר יכול להיות רעיל.
בהתבסס על הציוד והפרמטרים שלו, החוקרים יכולים לתכנן מגני עופרת משלהם עבור אתרי העניין שלהם. כאן, הצגנו מיגון בית החזה, הבטן והראש; עם זאת, אתרים אחרים כגון איבר או אגף יכול להיחשב עבור מיגון גם כן. בנוסף, בעוד שני מקורות הקרינה (צסיום-137 ורנטגן) מתאימים אבלציה מח עצם תחריט מוצלח, שונות בהשבת אוכלוסיות לימפואידים תאים מיאלואיד נצפתה בין צסיום-137 ומקורות הקרנת רנטגן30. לכן, החוקרים צריכים לקחת בחשבון את התגובות הפיזיולוגיות השונות למקור הקרינה לשימוש במחקרים.
מרווחי מנון
מינון ומרווחי מינון עשוי להשפיע על היעילות של תחריט תא התורם ושיעורי ההישרדות. בחולים אנושיים, הקרנה במינון גבוה עלולה לגרום לדלקת ריאות ביניים אידיופטית, פגיעה במערכת העיכול, היווצרות קטרקט. במודלים של עכבר, הקרנה במינון גבוה יחיד ואחריו השתלת מח עצם יכול לייצר תוצאות דומות והוא יכול גם להשפיע על שיעורי ההישרדות31. לכן, הקרנה מופרדת מומלץ מאוד עבור העכבר BMT מחקרים. בנוסף, מרווחי מנון של שברים יכולים להשפיע על שיעור ההישרדות של העכבר ואת שיעור reconstitution, המוביל שברים שונים של כימרות התא התורם באיברים המטולוגיים, כמו גם רקמות אחרות31. לכן, החוקרים צריכים להיות זהירים בתכנון לוח זמנים מינון הקרנה מופרדת למחקרי BMT.
בהקשר של שיעור ההישרדות וההחזרה של תאי החיסון, המחקר הקטן שלנו הראה כי קבוצה של עכברים שקיבלו הקרנת גוף כוללת עם מינון קרינה קטלני של 11 Gy בשני שברי Gy 5.5 מופרדים על ידי קבוצת מרווח של 24 שעות לא היו תוצאות שונות באופן משמעותי מאשר הקבוצה שקיבלה את אותו מינון TBI במרווח של 4 שעות (ראה טבלה 1). עם זאת, עם BMT מגן בית החזה, הקבוצה מרווח 24 שעות הופיע להראות יעילות פחות של כימרות התא התורם בהשוואה לקבוצת מרווח 4 שעות. הסבר אפשרי לתוצאה זו הוא שהקרנה עם מרווח זמן של 24 שעות לא הספיקה כדי להסיר את התאים האימונו-כשירים של המטופל מכיוון שהמרווחים הממושכים נתנו לעכברים המטופלים מספיק זמן לתקן תאים פגומים. בנוסף, מיגון בית החזה מגן על עצמות עמוד שדרה חלקיות המכילות גם את HSCs של המטופל. לפיכך, ייתכן שהתאים הנותרים והמחלימים של הנמען תקפו את התאים שמקורם בתורם וגרמו לתוצאה שהראתה יעילות תחריט נמוכה יותר.
| WBC (%) | תא B (%) | תא T (%) | מונו (%) | Ly6Cהיי מונו (%) | Ly6Cלו מונו (%) | נויטרופילים (%) | ||
| TBI-BMT | מרווח זמן של 4 שעות | 97.4 ± 1.0 | 100 ± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| מרווח זמן של 24 שעות | 97.2 ± 2.2 | 100 ± 0 | 79.0 ± 8.1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| BMT מגן בית החזה | מרווח זמן של 4 שעות | 56.2 ± 4.0 | 54.2 ± 6.2 | 0.5 ± 0.1 | 66.7 ± 6.1 | 63.8 ± 6.3 | 70.8 ± 5.7 | 82.0 ± 3.8 |
| מרווח זמן של 24 שעות | 34.4 ± 3.1 | 34.8 ± 3.1 | 2.9 ± 1.7 | 45.0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56.2 ± 4.9 | 56 ± 10.0 | |
טבלה 1: היעילות של חריטה של תאים תורמים באמצעות מרווחי מנון שונים. ניתוח ציטומטרי זרימה של דם היקפי בוצע חודש לאחר השתלת מח עצם. WT (נ) CD45.2+ תאי מח עצם תורם הושתלו CD45.1+ עכברים המטופל. 5 x 10 6 תאי מחעצם הושתלו בעקבות שני שברים של הקרנת הגוף הכוללת (2 x 5.5 Gy) עם או בלי בית החזה מגן מופרדים על ידי מרווח של 4 שעות או מרווח של 24 שעות. (n = 3-4 לכל קבוצה).
טיפול בבעלי חיים
צעדים מרובים המערבים עכברים נדרשים להצלחת הניסוי הזה. לכן, תשומת לב נוספת נדרשת בנקודות הבאות: ראשית, מסירת תאים תורמים קיימא היא חיונית עבור תחריט מוצלח. אחד צריך להיות מאומן כראוי באוסף של תאי BM שלמים והזרקתם לעכברים המטופל. ההשלכות של מסירה לקויה של תאים כוללות את הכישלון של HSPCs התורם לשקם את מח העצם של המטופל המוביל לתמותה. שנית, יש להקפיד לאחר ההשתלה כדי למנוע זיהום, במיוחד בעקבות טיפול מיאלובלטיבי. מגע עם פתוגנים יכול להיות קטלני, כמו עכברים להיות immunodeficient חולף בעקבות הקרנה. כפי שצוין לעיל, שכשהם את מי השתייה עם אנטיביוטיקה יכול להפחית את הסיכון לזיהום קטלני. יתר על כן, מתן בעלי חיים המטופל עם ג'ל תזונתי / הידרציה יכול למזער התייבשות וליקויים תזונתיים אשר עלולים להתרחש לאחר הקרנה, כמו הקרנה יכולה לשבש את אפיתל המעי המוביל שלשול32. כלובים צריך גם להיות מוחלף לעתים קרובות כדי להפחית את הסיכון של זיהום חיידקים צואה, בעלי חיים צריכים להיות מטופלים בתחנת העברת בעלי חיים נאותה, ואת העכברים המטופל צריך להיות במעקב בזהירות לירידה במשקל וכל סימנים של מצוקה או כאב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב מענקים K. וולש (HL131006, HL138014, ו HL132564), כדי ס סנו (HL152174), איגוד הלב האמריקאי להעניק M. A. אוונס (20POST35210098), ומענק קרן הלב יפן H. Ogawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
