Vi beskriver tre metoder for benmargstransplantasjon (BMT): BMT med total kroppsbestråling, BMT med skjermet bestråling og BMT-metode uten prekondisjonering (adoptiv BMT) for studiet av klone hematopoiesis i musemodeller.
Clonal hematopoiesis er en utbredt aldersrelatert tilstand som skyldes akkumulering av somatiske mutasjoner i hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer). Mutasjoner i førergener, som gir cellulær kondisjon, kan føre til utvikling av ekspanderende HSPC-kloner som i økende grad gir opphav til avkom leukocytter som skjuler den somatiske mutasjonen. Fordi klonisk hematopoiesis har vært assosiert med hjertesykdom, hjerneslag og dødelighet, er utviklingen av eksperimentelle systemer som modellerer disse prosessene nøkkelen til å forstå mekanismene som under denne nye risikofaktoren. Benmargstransplantasjonsprosedyrer som involverer myeloablativ kondisjonering hos mus, som total kroppsbestråling (TBI), brukes ofte til å studere immuncellenes rolle i kardiovaskulære sykdommer. Imidlertid er samtidig skade på benmargsnisjen og andre steder av interesse, som hjerte og hjerne, uunngåelig med disse prosedyrene. Dermed har laboratoriet vårt utviklet to alternative metoder for å minimere eller unngå mulige bivirkninger forårsaket av TBI: 1) benmargstransplantasjon med bestrålingsskjerming og 2) adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus. I skjermede organer bevares det lokale miljøet slik at analysen av klonnal hematopoiesis mens funksjonen til bosatte immunceller er uforstyrret. I motsetning har adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus den ekstra fordelen at både de lokale miljøene i organene og den hematopoietiske nisjen bevares. Her sammenligner vi tre forskjellige hematopoietiske cellerekonstitueringsmetoder og diskuterer deres styrker og begrensninger for studier av klonnal hematopoiesis ved kardiovaskulær sykdom.
Clonal hematopoiesis (CH) er en tilstand som ofte observeres hos eldre individer og oppstår som følge av en utvidet hematopoietisk stamme og stamcelle (HSPC) klone som bærer en genetisk mutasjon1. Det har blitt antydet at i en alder av 50 år vil de fleste individer ha fått i gjennomsnitt fem eksoniske mutasjoner i hver HSPC2, men de fleste av disse mutasjonene vil resultere i små eller ingen fenotypiske konsekvenser for individet. Men hvis en av disse mutasjonene ved en tilfeldighet gir HSPC et konkurransefortrinn – for eksempel ved å fremme spredning, selvfornyelse, overlevelse eller en kombinasjon av disse – kan dette føre til den foretrukne utvidelsen av mutantklonen i forhold til de andre HSPCene. Som et resultat vil mutasjonen i økende grad spre seg gjennom det hematopoietiske systemet, da den muterte HSPC gir opphav til modne blodlegemer, noe som fører til en tydelig populasjon av muterte celler i perifert blod. Mens mutasjoner i dusinvis av forskjellige kandidatdrivergener har vært forbundet med kloniske hendelser i det hematopoietiske systemet, er mutasjoner i DNA-metyltransferase 3 alfa (DNMT3A) og ti elleve translokasjon 2 (TET2) de mest utbredte3. Flere epidemiologiske studier har funnet at personer som bærer disse genetiske mutasjonene har en betydelig høyere risiko for kardiovaskulær sykdom (CVD), hjerneslag og all-kausaldødelighet 3,4,5,6,7. Selv om disse studiene har identifisert at det finnes en sammenheng mellom CH og økt forekomst av CVD og hjerneslag, vet vi ikke om dette forholdet er årsakssammenheng eller et delt epifenomenon med aldringsprosessen. For å få en bedre forståelse av denne foreningen, er det nødvendig med riktige dyremodeller som riktig rekapitulerer den menneskelige tilstanden til CH.
Flere CH dyremodeller er etablert av vår gruppe og andre ved hjelp av sebrafisk, mus og ikke-menneskelige primater8,9,10,11,12,13,14. Disse modellene bruker ofte hematopoietiske rekonstitueringsmetoder ved transplantasjon av genetisk modifiserte celler, noen ganger ved hjelp av Cre-lox rekombinasjon eller CRISPR-systemet. Denne tilnærmingen gjør det mulig for analyse av en bestemt genmutasjon i hematopoietiske celler å vurdere hvordan det bidrar til sykdomsutvikling. I tillegg bruker disse modellene ofte congenic eller reporterceller for å skille effekten av mutantceller fra normale eller ville celler. I mange tilfeller er det nødvendig med et prekondisjoneringsregime for å lykkes med å engraft donor hematopoietiske stamceller.
For tiden kan transplantasjonen av benmarg til mottakermus deles inn i to hovedkategorier: 1) myeloablativ kondisjonering og 2) ikke-betinget transplantasjon. Myeloablativ kondisjonering kan oppnås ved en av to metoder, nemlig total kroppsbestråling (TBI) eller kjemoterapi15. TBI utføres ved å utsette mottakeren for en dødelig dose gamma- eller røntgenbestråling, generere DNA-pauser eller krysskoblinger i raskt dele celler, noe som gjør dem uopprettelige16. Busulfan og cyklofosfamid er to ofte brukte kjemoterapimedisiner som forstyrrer den hematopoietiske nisjen og på samme måte forårsaker DNA-skade på raskt delte celler. Nettoresultatet av myeloablativ forutsetning er apoptose av hematopoietiske celler, som ødelegger mottakerens hematopoietiske system. Denne strategien tillater ikke bare vellykket engraftment av donor HSPCs, men kan også forhindre graft avvisning ved å undertrykke mottakerens immunsystem. Imidlertid har myeloablativ forutsetning alvorlige bivirkninger som skade på vev og organer og deres bosatte immunceller samt ødeleggelse av den innfødte benmargsnisjen17. Derfor er det foreslått alternative metoder for å overvinne disse uønskede bivirkningene, spesielt med hensyn til skade på organer av interesse. Disse metodene inkluderer skjermet bestråling av mottakermus og adoptiv BMT til ikke-kondisjonerte mus9,17. Skjerming av thorax, bukhule, hode eller andre regioner fra bestråling ved plassering av blybarrierer holder vev av interesse beskyttet mot de skadelige effektene av bestråling og opprettholder deres bosatte immuncellepopulasjon. På den annen side har adoptiv BMT av HSPCer til ikke-kondisjonerte mus en ekstra fordel fordi den bevarer den innfødte hematopoietiske nisjen. I dette manuskriptet beskriver vi protokollene og resultatene av HSPC-engraftment etter flere transplantasjonsregimer hos mus, spesielt levering av HSPC til TBI-mus, til mus delvis skjermet fra bestråling og til ikke-kondisjonerte mus. Det overordnede målet er å hjelpe forskere med å forstå de forskjellige fysiologiske effektene av hver metode, samt hvordan de påvirker eksperimentelle resultater i innstillingen av CH og kardiovaskulær sykdom.
For studier av klonisk hematopoiesis beskrev vi tre metoder for BMT: BMT med total kroppsbestråling, BMT med bestråling med delvis skjerming, og en mindre vanlig BRUKT BMT-metode som ikke innebærer pre-conditioning (adoptiv BMT). Disse metodene har blitt brukt til å vurdere effekten av klonisk hematopoiesis på kardiovaskulær sykdom. Forskere kan endre disse metodene tilsvarende for å passe til det spesifikke formålet med studien.
Clonal hematopoiesis modeller
Clonal…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health grants til K. Walsh (HL131006, HL138014 og HL132564), til S. Sano (HL152174), American Heart Association grant til M. A. Evans (20POST35210098), og et Japan Heart Foundation-tilskudd til H. Ogawa.
0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |