Summary
Descrevemos três métodos de transplante de medula óssea (TMO): TMO com irradiação total do corpo, TMO com irradiação blindada e método de TMO sem pré-condicionamento (TMO adotivo) para o estudo da hematopoiese clonal em modelos de camundongos.
Abstract
A hematopoiese clonal é uma condição predominante associada à idade que resulta do acúmulo de mutações somáticas em células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Mutações nos genes do driver, que conferem aptidão celular, podem levar ao desenvolvimento da expansão de clones HSPC que cada vez mais dão origem a leucócitos progêneros que abrigam a mutação somática. Como a hematopoiese clonal tem sido associada a doenças cardíacas, acidente vascular cerebral e mortalidade, o desenvolvimento de sistemas experimentais que modelam esses processos é fundamental para entender os mecanismos que fundamentam esse novo fator de risco. Procedimentos de transplante de medula óssea envolvendo condicionamento mieloablativo em camundongos, como a irradiação total do corpo (TCE), são comumente empregados para estudar o papel das células imunes em doenças cardiovasculares. No entanto, danos simultâneos ao nicho da medula óssea e outros locais de interesse, como o coração e o cérebro, são inevitáveis com esses procedimentos. Assim, nosso laboratório desenvolveu dois métodos alternativos para minimizar ou evitar possíveis efeitos colaterais causados pelo TCE: 1) transplante de medula óssea com blindagem de irradiação e 2) TMO adotivo para camundongos não condicionados. Em órgãos blindados, o ambiente local é preservado permitindo a análise de hematopoiese clonal enquanto a função das células imunes residentes não é perturbada. Em contrapartida, o BMT adotivo para camundongos não condicionados tem a vantagem adicional de que tanto os ambientes locais dos órgãos quanto o nicho hematopoiético sejam preservados. Aqui, comparamos três diferentes abordagens de reconstituição de células hematopoiéticas e discutimos suas forças e limitações para estudos de hematopoiese clonal em doenças cardiovasculares.
Introduction
A hematopoiese clonal (CH) é uma condição que é frequentemente observada em idosos e ocorre como resultado de um clone de célula hematopoiética e progenitora expandida (HSPC) portador de uma mutação genética1. Foi sugerido que, aos 50 anos, a maioria dos indivíduos terá adquirido uma média de cinco mutações exônicas em cada HSPC2,mas a maioria dessas mutações resultará em pequenas ou nenhuma consequências fenotípicas para o indivíduo. No entanto, se por acaso uma dessas mutações confere uma vantagem competitiva ao HSPC — como promover sua proliferação, auto-renovação, sobrevivência ou alguma combinação delas — isso pode levar à expansão preferencial do clone mutante em relação aos outros HSPCs. Como resultado, a mutação se espalhará cada vez mais pelo sistema hematopoiético à medida que o HSPC mutado dá origem a células sanguíneas maduras, levando a uma população distinta de células mutantes dentro do sangue periférico. Enquanto mutações em dezenas de diferentes genes de driver candidatos têm sido associadas a eventos clonais dentro do sistema hematopoiético, entre eles, mutações no DNA metiltransferase 3 alfa(DNMT3A) e dez onze translocação 2(TET2) são as mais prevalentes3. Vários estudos epidemiológicos descobriram que indivíduos que carregam essas mutações genéticas têm um risco significativamente maior de doenças cardiovasculares (DCV), acidente vascular cerebral e mortalidade causal3,4,5,6,7. Embora esses estudos tenham identificado que existe associação entre ACS e aumento da incidência de DCV e AVC, não sabemos se essa relação é causal ou um epifenômeno compartilhado com o processo de envelhecimento. Para obter uma melhor compreensão dessa associação, são necessários modelos animais adequados que recapitulem corretamente a condição humana do ACS.
Vários modelos de animais CH foram estabelecidos pelo nosso grupo e outros usando zebrafish, camundongos e primatas não humanos8,9,10,11,12,13,14. Esses modelos frequentemente usam métodos de reconstituição hematopoiética por meio do transplante de células geneticamente modificadas, às vezes usando recombinação cre-lox ou o sistema CRISPR. Essa abordagem permite a análise de uma mutação genética específica em células hematopoiéticas para avaliar como ela contribui para o desenvolvimento da doença. Além disso, esses modelos geralmente empregam células congênicas ou repórteres para distinguir os efeitos das células mutantes de células normais ou do tipo selvagem. Em muitos casos, um regime pré-condicionado é necessário para engrafar com sucesso células-tronco hematopoiéticas doadoras.
Atualmente, o transplante de medula óssea para camundongos receptores pode ser dividido em duas categorias principais: 1) condicionamento mieleloblativo e 2) transplante não condicionado. O condicionamento mieloblativo pode ser alcançado por um dos dois métodos, a ver: irradiação corporal total (TCE) ou quimioterapia15. O TBI é realizado submetendo o receptor a uma dose letal de irradiação gama ou raios-X, gerando quebras de DNA ou cruzamentos dentro de células rapidamente divididas, tornando-as irreparáveis16. Busulfan e ciclofosfameda são duas drogas quimioterapias comumente usadas que interrompem o nicho hematopoiético e causam danos ao DNA para células rapidamente divididas. O resultado líquido do pré-condicionamento mieloblativo é apoptose das células hematopoiéticas, que destrói o sistema hematopoiético do receptor. Essa estratégia não só permite o enxerto bem-sucedido dos HSPCs doadores, mas também pode evitar a rejeição do enxerto suprimindo o sistema imunológico do receptor. No entanto, o pré-condicionamento mieloblativo tem efeitos colaterais graves, como danos a tecidos e órgãos e suas células imunes residentes, bem como destruição do nicho de medula óssea nativo17. Por conseguinte, foram propostos métodos alternativos para superar esses efeitos colaterais indesejáveis, particularmente no que diz respeito aos danos aos órgãos de interesse. Esses métodos incluem a irradiação blindada de camundongos receptores e o BMT adotivo para camundongos não condicionados9,17. Proteger o tórax, a cavidade abdominal, a cabeça ou outras regiões da irradiação pela colocação de barreiras de chumbo mantém os tecidos de interesse protegidos dos efeitos nocivos da irradiação e mantém sua população de células imunes residentes. Por outro lado, o BMT adotivo de HSPCs para camundongos não condicionados tem uma vantagem adicional porque preserva o nicho hematopoiético nativo. Neste manuscrito, descrevemos os protocolos e resultados do enxerto de HSPC após vários regimes de transplante em camundongos, especificamente a entrega de HSPC a camundongos TBI, a camundongos parcialmente protegidos da irradiação e a ratos não condicionados. O objetivo geral é ajudar os pesquisadores a entender os diferentes efeitos fisiológicos de cada método, bem como como eles afetam os desfechos experimentais no cenário de ACS e doenças cardiovasculares.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia.
1. Antes do pré-condicionamento
- Coloque os camundongos receptores em água suplementada com antibióticos (5 mM sulfametoxazol, 0,86 mM trimeoprim) ~24 h antes da irradiação. Isso é necessário para prevenir a infecção, pois o sistema imunológico será suprimido após a irradiação, e mantido por 2 semanas após a irradiação. Neste ponto, suplemente camundongos com gel nutricional/hidratante para incentivar a alimentação e prevenir a perda de peso e a desidratação após a irradiação.
Figura 1: Imagens que mostram várias configurações de pré-condicionamento. (A) Configuração de irradiação total do corpo da gaiola de torta usando raios gama (Césio-137): O feixe de radiação vem da parte de trás do irradiador na direção do eixo y (radiação horizontal). (B) Configuração total de irradiação do corpo da gaiola do rato usando raio-X: A gaiola do rato é colocada na câmara reflexiva. O feixe de radiação vem do topo do irradiador na forma de um cone (radiação vertical). A distância da fonte de radiação até a gaiola é de 530 mm. (C) Bandeja ajustável no irradiador de raios-X: Esta configuração é usada para irradiação parcialmente blindada usando raios-X. O feixe de radiação vem do topo do irradiador na forma de um cone (radiação vertical). A distância da fonte de radiação até a bandeja é de 373 mm, e o raio é de 250 mm.(D) Escudo de tórax: ratos anestesiados são colocados em uma bandeja. Os ratos são colocados invertidos uns aos outros em posições supinas com braços e pernas totalmente estendidos. A extremidade inferior do escudo de chumbo está alinhada com o osso xiphisternum e a extremidade superior com o timo. (E) Blindagem abdominal: Camundongos anestesiados são colocados como na configuração de proteção ao tórax com a extremidade inferior do escudo de chumbo alinhada com o ânus e a extremidade superior abaixo do diafragma. (F) Configuração de irradiação de proteção da cabeça usando raios gama (Césio-137): As prevabas do rato anestesiado são coladas e o mouse é colocado em um conterrâneo cônico. O escudo de chumbo preto (marcado) cobre a cabeça e as orelhas do mouse. O feixe de radiação vem da parte de trás do irradiador na direção do eixo Y (radiação horizontal). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Pré-condicionamento de camundongos receptores (opcional)
- Irradiação total do corpo
- Coloque ratos receptores em uma gaiola de torta uniformemente fatiada, ou uma gaiola de rato na câmara reflexiva dentro do raio calculado para receber a mesma dose de irradiação; no entanto, recomenda-se um máximo de 8 ratos por pie-cage e 5 ratos por gaiola de rato para garantir a irradiação uniforme(Figura 1A,B).
- Para alcançar a mieloablação completa, certifique-se de que os camundongos receptores recebam uma dose total de radiação de 11 Gy em duas frações de 5,5 Gy separadas por um intervalo de 4-24 horas.
NOTA: Embora o enxerto ideal possa ser obtido implementando um intervalo de 4h entre frações, isso pode ser estendido para um intervalo de 24 horas, o que pode ser útil quando o trabalho e/ou o irradiador não estiver disponível.
- Irradiação parcialmente blindada
- Anestesiar os camundongos receptores por injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). A contenção do movimento do rato é fundamental para garantir a irradiação uniforme e a proteção efetiva dos órgãos de mira durante o processo de blindagem.
- Para blindagem do tórax e abdômen, oriente o feixe de radiação do irradiador de raios-X verticalmente para o camundongo(Figura 1C).
- Posicione os ratos anestesiados em uma placa plana, centralizando a fonte de radiação de cima. Coloque os ratos invertidos uns aos outros em uma posição supina com braços e pernas totalmente estendidos(Figura 1D,E).
NOTA: A instalação de irradiador de raios-X, para este experimento, permite que dois ratos por vez possam ser posicionados dentro do raio eficaz que permite a irradiação uniforme. Embora o raio efetivo seja calculado com base na distância entre a fonte de radiação e a bandeja, o número de animais que podem ser irradiados simultaneamente dependerá do irradiador específico. - Fixe as patas dos ratos na placa usando fita adesiva para garantir que os ratos sejam imobilizados durante o procedimento de irradiação. Coloque a blindagem de chumbo para cobrir regiões que requerem proteção.
- Para blindagem do tórax, prepare o escudo de chumbo medindo o comprimento do osso xiphisternum do rato até o timo e calculando a espessura que fornecerá proteção suficiente da fonte de irradiação. Coloque a blindagem de chumbo para que a extremidade inferior se alinhe com o osso xiphisternum. A extremidade superior da barreira de chumbo caberá perto do timo(Figura 1D).
- Para blindagem do abdômen, prepare o escudo de chumbo medindo o comprimento do ânus do rato até o diafragma e calculando a espessura que fornecerá proteção suficiente da fonte de irradiação. Coloque a blindagem de chumbo para que a extremidade inferior se alinhe com o ânus. A extremidade superior do escudo de chumbo caberá abaixo do diafragma(Figura 1E).
NOTA: A localização do escudo de chumbo para ser consistente entre as coortes pode reduzir alguma variação em relação ao tamanho dos ratos.
- Posicione os ratos anestesiados em uma placa plana, centralizando a fonte de radiação de cima. Coloque os ratos invertidos uns aos outros em uma posição supina com braços e pernas totalmente estendidos(Figura 1D,E).
- Para blindagem da cabeça, oriente o feixe de radiação do irradiador de césio horizontalmente para o rato.
- Grave cuidadosamente as previs de um rato anestesiado no abdômen. Isso garante que os braços obtenham uma dose completa de irradiação e não sejam cobertos pelo escudo.
- Para blindagem da cabeça, coloque o mouse em um contidor cônico, que se encaixa dentro de um escudo de chumbo. Uma vez que o mouse esteja dentro do conterrâneo cônico, deslize o conterrâneo para dentro do slot dentro do escudo de chumbo(Figura 1F). O escudo de chumbo deve cobrir completamente a cabeça e as orelhas do mouse (~3,2 cm), deixando o resto do corpo do rato exposto para irradiação. A posição do conterrâneo dentro do escudo pode ser ajustada para caber animais de diferentes tamanhos deslizando-o mais para dentro ou fora do escudo.
- Coloque ratos dentro do irradiador, perpendicular à fonte de irradiação.
- Exponha os camundongos a duas frações de 5,5 gy de irradiação (dose total de 11 Gy) separadas por um intervalo de 4-24 horas.
- Após cada fração de irradiação, coloque as gaiolas com camundongos anestesiados em tapetes aquecidos ou sob lâmpadas de calor vermelhas para evitar hipotermia e ajudar na recuperação da anestesia.
NOTA: Deve-se ter cuidado para não superaquecer o rato anestesiado ao usar uma lâmpada, pois não podem escapar do calor. Como descrito acima, o posicionamento dos animais e a espessura do escudo de chumbo podem diferir entre estudos baseados nas características específicas do irradiador (tipo de radiação/direção do feixe, etc.). Os pesquisadores precisarão ajustar seus experimentos de acordo.
3. Isolamento ósseo
NOTA: Idealmente, camundongos doadores e camundongos receptores devem ser semelhantes em idade, e dentro de 8 a 12 semanas de idade. Usar pelo menos 3 camundongos como doadores (em vez de doador único) é preferido para minimizar a heterogeneidade (mesmo quando se usa camundongos com o mesmo genótipo). Aproximadamente, 40 milhões de células de medula óssea não fratuladas podem ser obtidas de seis ossos (dois fêmures, duas tíbias e dois úmeros) de um único rato. O transplante de 5 milhões de células de medula óssea em cada rato receptor normalmente garantirá o enxerto.
- Eutanize camundongos doadores por luxação cervical sem anestesia (método preferido para evitar contaminação química das células) e coloque cada rato em uma almofada absorvente.
- Desinfete a pele usando um spray de 70% de etanol.
- Faça um pequeno corte transverso na pele abaixo da caixa torácica e segure a pele firmemente em ambos os lados da incisão, rasgue em direções opostas em direção à cabeça e aos pés. Retire a pele de todos os membros.
- Corte sobre os ombros e as articulações do cotovelo, e remova os músculos ligados e tecidos conjuntivos com o auxílio de um Kimwipe para obter o úmero.
- Desloque cuidadosamente as articulações do quadril entre os ossos do fêmur e do quadril. Use uma tesoura sem corte para cortar ao longo da cabeça do fêmur e desprender as pernas. Corte sobre a articulação do joelho para separar o fêmur e a tíbia, e remova cuidadosamente os músculos ligados e os tecidos conjuntivos com o auxílio de um Kimwipe para colher o fêmur e a tíbia.
NOTA: Preste atenção especial para manter a epífise óssea intacta durante esta etapa. Descarte os ossos quebrados devido à perda de esterilidade. Ossos do quadril e ossos da coluna podem ser coletados além do fêmur, tíbia e úmero. Para coletar ossos da coluna vertebral, uma argamassa e um pilão podem ser usados para esmagar os ossos em pedaços e colher as células da medula óssea. - Coloque os ossos isolados de camundongos do mesmo genótipo em um tubo cônico correspondente de 50 mL contendo PBS estéreis de 20 mL, e mantenha-o no gelo até que seja usado. Preste especial atenção para colocar corretamente os ossos em tubos com genótipos combinados.
- Repita os passos acima para cada animal doador trocando luvas entre cada rato. Além disso, tesoura limpa e outros instrumentos com 70% de etanol entre cada rato.
4. Isolamento da célula de medula óssea
NOTA: Execute as seguintes etapas em um gabinete de classe II de biossegurança.
- Preparação de conjuntos de tubos: Faça um pequeno furo na parte inferior de um tubo de microcentrifus de 0,5 mL estéril usando uma agulha de 18 G e coloque-o em um tubo de microcentrifuge estéril de 1,5 mL, que contém 100 μL de PBS estéril estéril no fundo.
NOTA: Como apenas seis ossos podem caber no tubo de microcentrifus de 0,5 mL, recomenda-se preparar conjuntos de tubos suficientes para processar todos os ossos ao mesmo tempo. - Aspire o PBS e transfira os ossos isolados para um prato de cultura celular estéril de 100 mm. Segurando cada osso usando fórceps finos, corte cuidadosamente as epífitas de cada extremidade usando uma pequena tesoura que foi esterilizada em uma autoclave. Coloque os ossos cortados nos conjuntos de tubos preparados.
- Centrifugar os tubos a 10.000 x g para 35 s a 4 °C.
- Após a centrifugação, confirme que a medula óssea foi removida com sucesso dos ossos. Os ossos devem parecer brancos e translúcidos com uma pelota vermelha relativamente grande na parte inferior do tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Descarte o tubo de microcentrifuuge de 0,5 mL.
NOTA: Se a inspeção visual não detectar medula óssea na parte inferior do tubo de 1,5 mL, corte o osso novamente e repita o passo 4.3. - Resuspend a medula óssea em 1 mL de PBS gelado, em seguida, transfira a suspensão celular do mesmo genótipo para um tubo cônico de 50 mL compatível.
- Dissociar as células passando-as através de uma agulha de 18 G com uma seringa de 10 mL 10 vezes.
- Filtrar suspensões de célula única através de um coador de células de 70 μm. Adicione PBS frio adicional a um volume final de 10 mL, e resuspense as células através do uso suave de pipeta-aid.
- Centrifugar a 310 x g por 10 min a 4 °C.
- Aspire o supernatante e resuspende a pelota celular com 10 mL de mídia RPMI sem soro. Poupe 30 μL deste material para a contagem de células.
- Determine a concentração celular com um contador celular e calcule o volume de suspensão celular necessário para o transplante. Para o exemplo de um 100% BMT, 5 x 106 células de medula óssea são necessárias para cada rato receptor.
NOTA: Para um BMT competitivo, prepare um total de 5 x 106 células de medula óssea que compõem uma mistura de células doadoras (por exemplo, CD45.2+) e células concorrentes (por exemplo, CD45.1+). Preparar células extras de medula óssea é altamente recomendado. Por exemplo, se há 10 ratos receptores por grupo experimental, normalmente preparamos células suficientes para 12 camundongos receptores. - Transfira o volume calculado de suspensão celular para um novo tubo cônico de 50 mL. Centrifugar a 310 x g por 10 min a 4 °C.
- Aspire o supernasce e resuspende as células usando a quantidade calculada de meio RPMI livre de soro para alcançar a densidade e volume celular apropriados. Normalmente, 200 μL é o volume ideal para uma injeção retro-orbital.
5. Transplante de células de medula óssea para camundongos irradiados
- Anestesiar os camundongos receptores com 5% de isoflurane.
- Enquanto os camundongos são anestesiados, injete lentamente 200 μL de células de medula óssea na veia retro-orbital usando uma agulha de 28-30 G com uma seringa de insulina.
- Alternativamente, realize a entrega das células doadoras por injeção intravenosa da veia da cauda e injeção intramedular femoral, com volume máximo de 0,2 mL e 25 μL, respectivamente.
- Uma vez que as células são injetadas, coloque uma gota de colírios contendo proparaca na superfície do olho para alívio da dor. O animal pode então ser autorizado a recuperar a consciência.
6. Transplante de células de medula óssea para camundongos não condicionados
- Anestesiar os camundongos receptores por inalação de 5% de isoflurane.
- Injete 5 x 106 células de medula óssea não fracionados de qualquer genótipo retro-orbitalmente em camundongos receptores não irradiados com seringa de insulina de 28 a 30 G.
- Repetir as etapas 6.1 e 6.2 ao longo de 3 dias consecutivos, de tal forma que os camundongos receptores serão transplantados com um total de 1,5 x 107 células de medula óssea.
NOTA: Como o TMO adotivo sem procedimento de pré-condicionamento requer transplante de medula óssea por 3 dias consecutivos, deve-se tentar alternar os olhos para cada injeção. - Após a injeção, administre uma gota de colírios contendo proparacaína no olho afetado.
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Representative Results
Para comparar o efeito de três métodos de TMO/pré-condicionamento no enxerto celular doador, as frações de células doadoras no sangue e tecido cardíaco periféricos foram analisadas por citometria de fluxo em 1 mês após o TMO. Células isoladas foram manchadas por marcadores leucócitos específicos para identificar os diferentes subconjuntos de leucócitos. Nestes experimentos, foram entregues células de medula óssea do tipo selvagem(WT) C57BL/6 (CD45.2) ao WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ(CD45.1) camundongos receptores para distinguir células doadoras das células do receptor. As estratégias de gating de citometria de fluxo utilizadas são descritas anteriormente por Wang et al.9 na Figura Suplementar 1.
O grupo tratado de irradiação corporal total (TBI) recebeu 5 x 106 células de medula óssea após uma dose total de radiação letal de 11 Gy em duas frações de 5,5 Giros separadas por um intervalo de 4h. No sangue periférico de camundongos receptores, monócitos, neutrófilos e células B foram largamente ablados e substituídos pela prole de células derivadas da medula óssea. Além disso, a população de monócitos cardíacos residentes e neutrófilos em corações de camundongos receptores foi quase completamente substituída por células derivadas de doadores(Figura 2A).
No grupo de irradiação parcialmente blindado, os camundongos receptores foram irradiados com um escudo de tórax e transplantados com 5 x 106 células de medula óssea após uma dose total de radiação de 11 Gy em duas frações de 5,5 Giros separadas por um intervalo de 4 horas. Em contraste com o grupo TBI, a contribuição das células derivadas de doadores para células imunes cardíacas foi modesta, o que provavelmente reflete os efeitos combinados da proteção das células imunes locais nos corações dos camundongos receptores e a repopulação fisiológica de células doadoras derivadas da medula óssea do sangue periférico. As células de medula óssea do camundongo receptor em regiões protegidas também provavelmente contribuíram para a reconstituição do sangue periférico, o que reduz a porcentagem de células derivadas de doadores no sangue periférico em comparação com o grupo tratado TBI(Figura 2B).
No grupo sem pré-condicionamento de TMO (TMO adotivo), os camundongos receptores foram transplantados com 5 x 106 células de medula óssea durante 3 dias consecutivos. Com 4 semanas após o BMT, a porção de células derivadas de doadores no sangue e no coração periféricos era detectável. (aproximadamente 5%) (Figura 2C).
Para ilustrar como o modelo de TMO adotivo pode ser aplicado ao estudo do modelo CH, as células de medula óssea CD45.2+ doador(WT ou Tet2-/-) foram transplantadas em camundongos receptores CD45.1+ Os receptores sem condicionamento foram transplantados com 5 x 106 células de medula óssea por dia durante 3 dias consecutivos (para um total de 1,5 x 107, n = 5-6 por grupo). A análise citométrica de fluxo de sangue periférico foi realizada 4, 8, 12 e 16 semanas após o transplante. As células doadoras deficientes do Tet2 conferiram uma vantagem competitiva e gradualmente se expandiram ao longo do tempo; WBCs, monócitos, ly6Chi monocitos, neutrófilos, células T e células B aumentaram significativamente ao longo do tempo. Em comparação com as células doadoras deficientes de Tet2 engrafadas em camundongos receptores, os camundongos receptores engrafados com células doadoras de TT apresentaram expansão clonal menos significativa das células doadoras(Figura 3). Consistente com o paradigma clínico da hematopoiese clonal, a expansão das células deficientes de Tet2 não impacta os números absolutos dos vários tipos de células sanguíneas9 (dados não mostrados).
Figura 2: Análise citométrica de fluxo de sangue e coração utilizando diferentes métodos de pré-condicionamento. A análise citométrica de fluxo de sangue e coração periférico foi realizada 1 mês após o transplante de medula óssea. Para distinguir as células doadoras das células dos receptores, os camundongos receptores CD45.1+ foram transplantados com células cd45.2+ de medula óssea doadoras. (A) 5 x 106 células de medula óssea foram transplantadas após duas frações de irradiação corporal total (2 x 5,5 Giro, intervalo de 4h, n = 3). (B) 5 x 106 células de medula óssea foram transplantadas após duas frações de irradiação corporal total com proteção do tórax (2 x 5,5 Gy, intervalo de 4h, n = 10). (C) Os receptores sem condicionamento foram transplantados com 5 x 106 células de medula óssea por 3 dias consecutivos (totalizando 1,5 x 107, n = 4). Os dados são expressos como ± SEM. O total de WBCs é definido como CD45+; Neutrófilos como Ly6G+; Ly6Chi monocytes como CD115+, Ly6G-, e Ly6C+; Ly6Clo monocytes como CD115+, Ly6G-, e Ly6C-; Células B como CD45R+; Células CD4+ T como CD3e+ e CD4+; Células CD8+ T como CD3e+ e CD8+; e Macrófagos como CD64+, Ly6G-, e Ly6C-. (WBCs: glóbulos brancos, Neut: neufilos, monocitos, Mac: macrófagos). A Figura 2A,C foi modificada de Wang et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expansão clonal de células deficientes de Tet2 usando BMT adotivo para camundongos não condicionados. CD45.2+ células de medula óssea doadoras (WT ou Tet2-/-) foram transplantadas em camundongos receptores CD45.1+. Os receptores sem condicionamento foram transplantados com 5 x 106 células de medula óssea por dia durante 3 dias consecutivos (para um total de 1,5 x 107, n = 5-6 por grupo). A análise citométrica de fluxo do sangue periférico foi realizada após 4, 8, 12 e 16 semanas após o transplante. A fração de CÉLULAS CD45.2+ doadoras em cada população é mostrada. (A) WBCs (B) Mono (C) Ly6Chi mono(D) células B(E) células T. Os dados são expressos como ± SEM. Os WBCs são definidos como CD45+; Neutrófilos como Ly6G+; Ly6Chi monocytes como CD115+, Ly6G-, e Ly6C+; Ly6Clo monocytes como CD115+, Ly6G-, e Ly6C-; Células B como CD45R+; Células CD4+ T como CD3e+ (WT: tipo selvagem, WBCs: glóbulos brancos, monocitos) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para estudos de hematopoiese clonal, descrevemos três métodos de BMT: BMT com irradiação total do corpo, BMT com irradiação com blindagem parcial, e um método de BMT menos comumente utilizado que não envolve pré-condicionamento (BMT adotivo). Esses métodos têm sido utilizados para avaliar o impacto da hematopoiese clonal em doenças cardiovasculares. Os pesquisadores podem modificar esses métodos de acordo para se adequarem ao propósito específico de seu estudo.
Modelos de hematopoiesis clonais
Hematopoiese clonal é o fenômeno no qual células hematopoiéticas mutantes competem com células do tipo selvagem e obtém domínio clonal ao longo do tempo. Para criar um modelo dessa competição, os camundongos podem ser administrados medula óssea, que consiste em uma mistura de células geneticamente diferentes. Geralmente, essa mistura incluirá células mutantes e do tipo selvagem, que foram rotuladas com uma etiqueta fluorescente ou diferentes marcadores pan-leucócitos (ou seja, CD45.1 e CD45.2). Por exemplo, ao criar modelos que imitam o CH mediado por Tet2,realizamos um transplante competitivo de medula óssea em receptores letalmente irradiados que normalmente envolve a mistura de 90% das células que se originam de doadores de CD45.1 Tet2+/+ e 10% das células originárias de CD45.2 Tet2-/- Tet2+/- ou controle Tet2+/+ doadores8. A detecção de citometria de fluxo das variantes CD45 usando anticorpos monoclonais específicos permite distinguir células doadoras (CD45.1-/CD45.2+) de células concorrentes (CD45.1+/CD45.2-dentro do sangue, e avaliar a dinâmica clonal das células de teste ao longo do tempo. Ao fazer isso, pudemos observar um aumento gradual do chimerismo dos doadores de células deficientes de Tet2, enquanto a porcentagem de células do tipo selvagem permanece em aproximadamente 10%. Esta configuração experimental imita o cenário humano de indivíduos portadores de uma mutação somática TET2, uma vez que essas mutações são inicialmente transportadas por um pequeno número de HSPCs, que se expandirão gradualmente ao longo do tempo. A prática dessa abordagem em modelos de doenças cardiovasculares de aterosclerose e insuficiência cardíaca levou à documentação de um potencial nexo causal entre o CH mediado por Tet2e o CVD8,9,10.
Ao utilizar essas abordagens, os pesquisadores devem levar em consideração os possíveis efeitos de confusão gerados pelo TCE. Embora o TCE antes do transplante permita um alto grau de enxerto de HSPC, esse pré-condicionamento levará a vários efeitos indesejáveis fora do sistema hematopoiético. Foi documentado que o TCE pode levar a inflamação, lesão e fibrose em múltiplos sistemas de órgãos, incluindo pele, fígado, rins, pulmões, medula óssea, coração, cérebro, etc.18,19,20. Esses efeitos colaterais podem impactar negativamente os órgãos cardiovasculares em estudo, e também alteram a patogênese da doença21,22. Um exemplo notável é o efeito da irradiação em macrófagos residentes no coração. A irradiação do tórax resulta em uma substituição acentuada de macrófagos residentes cardíacos por macrófagos derivados de monócitos circulantes. Estudos mostraram que macrófagos residentes cardíacos apresentam características distintas em relação aos macrófagos derivados de monócitos que se engrafarão no coração após lesão por radiação. Em ambientes de doenças, acredita-se que macrófagos residentes cardíacos desempenham um papel cardioprotetor, enquanto macrófagos transmitidos pelo sangue foram relatados para promover lesões e inflamações23. Portanto, é concebível que a substituição de células imunes cardíacas residentes por células transmitidas pelo sangue altere os processos patológicos em estudo, que contribuem para doenças cardiovasculares24,25,26. Da mesma forma, no cérebro, o TCE resulta em esgotamento da microglia residente e substituição por macrófagos periféricos27,28. Embora macrófagos periféricos possam se comportar como células microgliais, eles mantêm uma identidade funcional e transcricional única em comparação com a microglia derivada de monocitos28. Portanto, é possível que a sequela da doença possa ser alterada, principalmente no estudo de doenças como derrames isquêmicos. Para evitar esses efeitos confusos, pode-se recomendar a blindagem do tórax e da cabeça. Isso é vantajoso porque fornece proteção ao coração e ao cérebro, respectivamente; e também mantém suas células imunes residentes intactas, melhor recapitulando a condição humana de CH. No entanto, como observado anteriormente, a blindagem resulta em uma taxa menor de chimerismo em comparação com o pré-condicionamento do TBI, o que essencialmente elimina todas as células hematopoiéticas do hospedeiro.
Outro impedimento importante no pré-condicionamento é seu efeito deletério no nicho da medula óssea. Embora os danos induzidos pela irradiação do nicho de MM possam ser restaurados em uma extensão subótima, não está claro se a hematopoiese ingênua é recuperada nesses microambientes danificados. Além disso, o transplante de HSPCs mistos em BM vazio inicia uma corrida pela proliferação entre clones, em vez da simples "competição" para um nicho que é ocupado por um HSPC do tipo selvagem — que é presumivelmente o que ocorre no CH. Assim, uma abordagem potencialmente preferível para estudar CH pode ser o método Adotivo de BMT, pelo qual as células BM são transferidas para camundongos receptores sem pré-condicionamento. Este BMT adotivo sem método pré-condicionamento afeta minimamente a hematopoiese ingênua em curso, mais fielmente recapitulando o CH observado em humanos29. A Figura 2C mostra o nível de chimerismo em 1 mês após o transplante sem pré-condicionamento. Embora o chimerismo do doador seja baixo neste ponto de tempo inicial, encontramos uma fração progressivamente crescente de clones deficientes de Tet2 ao longo do tempo, como apresentado na Figura 3. Deve-se notar que este modelo é mais útil quando as células mutantes têm uma vantagem competitiva sobre células do tipo selvagem sob condições homeostáticas, como células deficientes de Tet2. Quando as células deficientes de Tet2 são engrafadas, há uma expansão acentuada em várias populações de leucócitos, como neutrófilos, monócitos, células NK e células B. Uma expansão mais lenta foi observada nas células T, presumivelmente devido à meia-vida mais longa desta população.
A expansão das células deficientes de Tet2 tem sido observada não apenas no sangue periférico, mas também em vários outros tecidos, incluindo medula óssea, fígado e rim, com diferentes dinâmicas de reconstituição celular hematopoiética9. Por exemplo, o artigo publicado anteriormente do nosso laboratório descreveu o chimerismo das células de medula óssea das células doadoras deficientes de TT e Tet2 engrafadas em camundongos receptores de CD45.1 8 meses após o BMTadotivo 9. Células doadoras deficientes tet2 transplantadas em camundongos receptores cd45.1 mostraram uma vantagem competitiva sobre a linhagem imatura–células Sca1+c-Kit+ (LSK), células HSC de curto e longo prazo e progenitores multipotentes (MPPs) em comparação com as células doadoras WT transplantadas em camundongos receptores CD45.1. Além disso, como Tet2- célula doadorade deficient engrafado camundongos receptores, eles desenvolvem um fenótipo de cardiomiopatia relacionado à idade sem fatores exógenos causando disfunção cardíaca, recapitulando assim o efeito da hematopoiese clonal de forma semelhante à do envelhecimento humano. Esta observação foi acompanhada com aumento do grau de chimerismo em neutrófilos cardíacos e monócitos deoi ly6C. Coletivamente, esse regime de BMT adotivo pode ser aplicado a estudos futuros que poderiam expandir nossa compreensão da associação entre o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e hematopoiese clonal em um nível mais avançado.
Em resumo, descrevemos três métodos de BMT e discutimos sua aplicação na geração de modelos CH. O ACS está associado a prognósticos mais pobres em doenças cardiovasculares, como aterosclerose e insuficiência cardíaca. Embora tenham sido feitos progressos consideráveis, o estudo das ligações causais entre CH e DCV ainda está em sua infância, e novas investigações são necessárias através do uso de modelos animais otimizados. Esperamos que esses protocolos permitam aos pesquisadores selecionar um método mais fisiologicamente apropriado de BMT, que minimalize potenciais efeitos de confusão no sistema cardiovascular, produzindo estudos que expandam nossa compreensão de como o ACS contribui para doenças cardiovasculares.
Projeto de blindagem de chumbo
A espessura do escudo de chumbo será ditada pelo tipo de irradiação usada para induzir a mieloablação. Os tipos de radiação de raios-X ou raios gama são frequentemente usados para mieloablasção experimental, mas diferem em termos de sua frequência, comprimento de onda e energia de fótons. Quando se trata de blindagem, a energia do fóton, que descreve a energia ou a velocidade com que os raios estão viajando, é o parâmetro mais importante. Normalmente, os raios-X de fonte de radiação têm uma energia de 160 kVp, enquanto as fontes de cesium-137, que emitem raios gama, têm uma energia de 662 KeV. A energia emitida por essas fontes de radiação equivale ao seu poder de penetração, com energias mais elevadas tendo maior poder de penetração. Portanto, é necessária uma maior espessura do escudo de chumbo ao usar irradiadores baseados em césio em comparação com o uso de irradiadores baseados em raios-X. Irradiação baseada em raios-X, que usamos quando realizamos tórax e proteção abdominal, requer um escudo de chumbo de 7 mm de espessura para fornecer proteção suficiente. No entanto, para fontes de césio 137, que usamos quando realizamos blindagem na cabeça, requer que os escudos de chumbo sejam pelo menos 1 polegada de espessura para fornecer proteção suficiente.
Os escudos de chumbo para uso em irradiadores de raios-X podem ser adquiridos de fornecedores comerciais. Alternativamente, as folhas de chumbo podem ser cortadas em tamanho para caber ao redor do corpo do animal ou para caber em torno de um contidor (ver Figura 1). Ao usar um irradiador à base de césio, os tijolos de chumbo, que são consideravelmente mais espessos, devem ser usados e podem ser feitos sob medida por empresas especializadas na fabricação desses tipos de escudos. Por exemplo, para o protetor de cabeça, nós projetamos um tijolo de chumbo para segurar um contêdeiro de tubo cônico de 50 mL (ver Figura 1F). O animal é capaz de caber dentro do contêdeiro, que é então ranhuado em um buraco feito no tijolo, para fornecer 1,5 polegadas de proteção contra a irradiação. É importante ressaltar que todos os escudos de chumbo devem ser revestidos com tinta ou fita para evitar a exposição ao pó de chumbo, que pode ser tóxico.
Com base nos equipamentos e seus parâmetros, os pesquisadores podem projetar seus próprios escudos de chumbo para seus locais de interesse. Aqui, introduzimos o tórax, o abdômen e a proteção da cabeça; no entanto, outros locais como membro ou flanco também podem ser considerados para blindagem. Além disso, enquanto ambas as fontes de radiação (Césio-137 e Raio-X) são adequadas para a ablação da medula óssea e enxerto bem-sucedido, a variabilidade na reconstituição de populações de células linfoides e mieloides tem sido observada entre as fontes de irradiação de Césio-137 e raios-X30. Assim, os pesquisadores devem levar em conta as respostas fisiológicas díspares à fonte de radiação para uso em estudos.
Intervalos de dosagem
Os intervalos de dosagem e dosagem podem afetar a eficiência do enxerto celular doador e as taxas de sobrevivência. Em pacientes humanos, a irradiação de alta dose pode causar pneumonia intersticética idiopática, lesão gastrointestinal e formação de catarata. Nos modelos de camundongos, a irradiação de alta dose única seguida de transplante de medula óssea pode produzir resultados semelhantes e também pode afetar as taxas de sobrevivência31. Portanto, a irradiação fracionada é altamente recomendada para os estudos de BMT do camundongo. Além disso, os intervalos de dosagem de frações podem impactar a taxa de sobrevivência e a taxa de reconstituição do camundongo, levando a diferentes frações de chimerismo celular doador nos órgãos hematológicos, bem como em outros tecidos31. Assim, os pesquisadores devem ter cuidado ao projetar um cronograma de dosagem de irradiação fracionado para estudos de BMT.
No contexto da taxa de sobrevivência e da reconstituição das células imunes, nosso pequeno estudo mostrou que um grupo de camundongos que receberam irradiação corporal total com uma dose letal de radiação de 11 Gy em duas frações de giro de 5,5 separadas por um grupo de intervalo de 24 horas não teve resultados significativamente diferentes do grupo que recebeu a mesma dosagem de TCE em um intervalo de 4h (ver Tabela 1). No entanto, com o TMO de proteção do tórax, o grupo intervalado de 24 horas parecia mostrar menos eficiência do chimerismo celular doador em comparação com o grupo de intervalo de 4h. Uma possível explicação para este resultado é que a irradiação com intervalo de 24 horas pode não ter sido suficiente para remover as células imunocompetentes do receptor porque os intervalos prolongados deram aos ratos receptores tempo suficiente para reparar células danificadas. Além disso, o tórax protege ossos parciais da coluna vertebral que também contêm os HSCs do receptor. Assim, as células receptoras imunocompetuntes remanescentes e recuperadas podem ter atacado as células derivadas do doador e induzido um desfecho que mostrou menor eficiência de enenxermento.
| WBC (%) | Célula B (%) | Célula T (%) | Mono (%) | Ly6Chi mono (%) | Ly6Clo mono (%) | Neutrófilo (%) | ||
| TBI-BMT | Intervalo de 4h | 97,4 ± 1.0 | 100 ± 0 | 59.1 ± 18.7 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| Intervalo de 24h | 97,2 ± 2.2 | 100 ± 0 | 79,0 ± 8.1 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | 100 ± 0 | |
| BMT de proteção tórax | Intervalo de 4h | 56,2 ± 4.0 | 54.2 ± 6.2 | 0,5 ± 0,1 | 66,7 ± 6.1 | 63,8 ± 6,3 | 70,8 ± 5,7 | 82,0 ± 3,8 |
| Intervalo de 24h | 34.4 ± 3.1 | 34,8 ± 3.1 | 2.9 ± 1.7 | 45,0 ± 3.2 | 34.2 ± 3.6 | 56.2 ± 4.9 | 56 ± 10.0 | |
Tabela 1: A eficiência do enxerto celular do doador utilizando diferentes intervalos de dosagem. A análise citométrica de fluxo do sangue periférico foi realizada 1 mês após o transplante de medula óssea. WT CD45.2+ células de medula óssea doadora foram transplantadas em cd45.1+ camundongos receptores. 5 x 106 células de medula óssea foram transplantadas após duas frações de irradiação corporal total (2 x 5,5 Giro) com ou sem tórax separado por um intervalo de 4h ou intervalo de 24h. (n = 3-4 por grupo).
Cuidados com os animais
Múltiplos passos envolvendo camundongos são necessários para o sucesso deste experimento. Assim, é necessária uma atenção extra nos seguintes pontos: Primeiro, a entrega de células doadoras viáveis é crucial para o enxerto bem-sucedido. Deve-se ser devidamente treinado na coleta de células BM intactas e sua injeção em camundongos receptores. As consequências da má entrega das células incluem a falha dos doadores de HSPCs em reconstituir a medula óssea receptora levando à mortalidade. Em segundo lugar, deve-se tomar cuidado após o transplante para evitar infecções, especialmente após a terapia mieloablativa. O contato com patógenos pode ser fatal, pois os camundongos tornam-se transitoriamente imunodeficientes após a irradiação. Como indicado acima, complementar a água potável com antibióticos pode diminuir o risco de infecção fatal. Além disso, fornecer aos animais receptores gel nutricional/hidratante pode minimizar a desidratação e deficiências nutricionais que podem ocorrer após a irradiação, pois a irradiação pode interromper o epitélio intestinal que leva à diarreia32. As gaiolas também devem ser substituídas com frequência para reduzir o risco de contaminação de bactérias fecais, os animais devem ser manuseados em uma estação de transferência de animais adequada, e os camundongos receptores devem ser monitorados cuidadosamente para perda de peso e quaisquer sinais de angústia ou dor.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do Instituto Nacional de Saúde dos EUA a K. Walsh (HL131006, HL138014 e HL132564), à S. Sano (HL152174), subvenção da American Heart Association a M. A. Evans (20POST35210098), e uma bolsa da Japan Heart Foundation para H. Ogawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
References
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