Summary

Procedimientos de trasplante de médula ósea en ratones para estudiar la hematopoyesis clonal

Published: May 26, 2021
doi:

Summary

Describimos tres métodos de trasplante de la médula (BMT): BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación blindada, y método de BMT sin el pre-condicionamiento (BMT adoptivo) para el estudio de la hematopoyesis clónica en modelos del ratón.

Abstract

La hematopoyesis clónica es una condición edad-asociada frecuente que resulta de la acumulación de mutaciones somáticas en las células hematopoyéticas del vástago y del progenitor (HSPCs). Las mutaciones en los genes impulsores, que confieren aptitud celular, pueden conducir al desarrollo de clones de HSPC en expansión que cada vez más dan lugar a leucocitos de progenie que albergan la mutación somática. Porque la hematopoyesis clónica se ha asociado a enfermedad cardíaca, al movimiento, y a mortalidad, el desarrollo de los sistemas experimentales que modelan estos procesos es dominante a entender los mecanismos que subly este nuevo factor de riesgo. Los procedimientos del trasplante de la médula que implican el condicionamiento myeloablative en ratones, tales como irradiación de cuerpo entero (TBI), se emplean comúnmente para estudiar el papel de células inmunes en enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, el daño simultáneo al nicho de la médula ósea y otros sitios de interés, como el corazón y el cerebro, es inevitable con estos procedimientos. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha desarrollado dos métodos alternativos para minimizar o evitar los posibles efectos secundarios causados por la LCT: 1) trasplante de médula ósea con blindaje de irradiación y 2) BMT adoptivo a ratones no acondicionados. En órganos blindados, el ambiente local se preserva permitiendo el análisis de la hematopoyesis clónica mientras que la función de células inmunes residentes es imperturbable. Por el contrario, el BMT adoptivo a ratones no acondicionados tiene la ventaja adicional de que tanto los ambientes locales de los órganos como el nicho hematopoyético se conservan. Aquí, comparamos tres diversos acercamientos hematopoyéticos de la reconstitución de la célula y discutimos sus fuerzas y limitaciones para los estudios de la hematopoyesis clónica en enfermedad cardiovascular.

Introduction

La hematopoyesis clonal (CH) es una condición que se observa con frecuencia en individuos mayores y ocurre como resultado de un clon expandido de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) portador de una mutación genética1. Se ha sugerido que a la edad de 50 años, la mayoría de los individuos habrán adquirido un promedio de cinco mutaciones exónicas en cada HSPC2,pero la mayoría de estas mutaciones resultarán en pocas o ninguna consecuencia fenotípica para el individuo. Sin embargo, si por casualidad una de estas mutaciones confiere una ventaja competitiva al HSPC, por ejemplo, promoviendo su proliferación, auto-renovación, supervivencia o alguna combinación de estos, esto puede conducir a la expansión preferencial del clon mutante en relación con los otros HSPCs. Como consecuencia, la mutación se extenderá cada vez más a través del sistema hematopoyético mientras que el HSPC transformado da lugar a las células de sangre maduras, llevando a una población distinta de células transformadas dentro de la sangre periférica. Mientras que las mutaciones en docenas de genes conductores candidatos diferentes se han asociado con eventos clonales dentro del sistema hematopoyético, entre estos, las mutaciones en el ADN metiltransferasa 3 alfa(DNMT3A)y diez once translocaciones 2(TET2)son las más prevalentes3. Varios estudios epidemiológicos han encontrado que los individuos que llevan estas mutaciones genéticas tienen un riesgo perceptiblemente más alto de la enfermedad cardiovascular (CVD), del movimiento, y de la mortalidad todo-causal3,4,5,6,7. Mientras que estos estudios han identificado que existe una asociación entre el CH y la incidencia creciente del CVD y del movimiento, no sabemos si esta relación es causal o un epiphenomenon compartido con el proceso del envejecimiento. Para obtener una mejor comprensión de esta asociación, se requieren modelos animales adecuados que recapitulan correctamente la condición humana del CH.

Varios modelos animales ch han sido establecidos por nuestro grupo y otros utilizando pez cebra, ratones y primates no humanos8,9,10,11,12,13,14. Estos modelos a menudo utilizan métodos de reconstitución hematopoyética mediante trasplante de células modificadas genéticamente, a veces utilizando la recombinación Cre-lox o el sistema CRISPR. Este enfoque permite el análisis de una mutación genética específica en células hematopoyéticas para evaluar cómo contribuye al desarrollo de la enfermedad. Además, estos modelos emplean a menudo las células congénicas o del reportero para distinguir los efectos de células del mutante de las células normales o del salvaje-tipo. En muchos casos, se requiere un régimen de precondicionamiento para injerir con éxito las células madre hematopoyéticas donantes.

Actualmente, el trasplante de médula ósea a ratones receptores se puede dividir en dos categorías principales: 1) condicionamiento mieloablativo y 2) trasplante no condicionado. El condicionamiento mieloablativo puede lograrse por uno de dos métodos, a saber, la irradiación corporal total (LCT) o la quimioterapia15. La LCT se lleva a cabo sometiendo al receptor a una dosis letal de irradiación gamma o de rayos X, generando roturas de ADN o enlaces cruzados dentro de células que se dividen rápidamente, haciéndolas irreparables16. Busulfán y ciclofosfamida son dos medicamentos de quimioterapia de uso común que interrumpen el nicho hematopoyético y causan de manera similar daño en el ADN a las células que se dividen rápidamente. El resultado neto del preacondicionamiento mieloablativo es la apoptosis de las células hematopoyéticas, que destruye el sistema hematopoyético del receptor. Esta estrategia no sólo permite el engraftment acertado del HSPCs dispensador de aceite, pero puede también prevenir el rechazo del injerto suprimiendo el sistema inmune del recipiente. Sin embargo, el preacondicionamiento mieloablativo tiene efectos secundarios graves, como daño a los tejidos y órganos y a sus células inmunitarias residentes, así como la destrucción del nicho de médula ósea nativa17. Por lo tanto, se han propuesto métodos alternativos para superar estos efectos secundarios indeseables, particularmente en lo que respecta al daño a los órganos de interés. Estos métodos incluyen la irradiación blindada de ratones receptores y el BMT adoptivo a ratones no acondicionados9,17. El blindaje del tórax, la cavidad abdominal, la cabeza u otras regiones de la irradiación mediante la colocación de barreras de plomo mantiene los tejidos de interés protegidos de los efectos perjudiciales de la irradiación y mantiene su población de células inmunes residentes. Por otro lado, el BMT adoptivo de HSPCs a ratones no acondicionados tiene una ventaja adicional porque preserva el nicho hematopoyético nativo. En este manuscrito, se describen los protocolos y resultados de la injerto de HSPC después de varios regímenes de trasplante en ratones, específicamente la entrega de HSPC a ratones TBI, a ratones parcialmente protegidos de la irradiación, y a ratones no acondicionados. El objetivo general es ayudar a los investigadores a comprender los diferentes efectos fisiológicos de cada método, así como cómo afectan los resultados experimentales en el contexto del CH y las enfermedades cardiovasculares.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia. 1. Antes del preacondicionamiento Coloque los ratones receptores en agua suplementada con antibióticos (5 mM de sulfametoxazol, 0,86 mM de trimetoprima) ~ 24 h antes de la irradiación. Esto es necesario para prevenir la infección, ya que el sistema inmunológico se suprimirá después de la irradiación y se ma…

Representative Results

Para comparar el efecto de tres métodos de BMT/pre-conditioning sobre el engraftment dispensador de aceite de la célula, las fracciones de células dispensadoras de aceite en sangre periférica y tejido del corazón eran analizadas por cytometry de flujo en el poste-BMT de 1 mes. Las células aisladas fueron manchadas para que los marcadores específicos del leucocito identifiquen los diversos subconjuntos de leucocitos. En estos experimentos, el salvaje-tipo(PESO) C57BL/6 (CD45.2) las células dispensadoras d…

Discussion

Para los estudios de la hematopoyesis clónica, describimos tres métodos de BMT: BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación con el blindaje parcial, y un método menos de uso general de BMT que no implique ningún pre-condicionamiento (BMT adoptivo). Estos métodos se han utilizado para evaluar el impacto de la hematopoyesis clónica en la enfermedad cardiovascular. Los investigadores pueden modificar estos métodos en consecuencia para adaptarse al propósito específico de su estudio.

<p cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos a K. Walsh (HL131006, HL138014 y HL132564), a S. Sano (HL152174), la subvención de la Asociación Americana del Corazón a M. A. Evans (20POST35210098) y una subvención de la Japan Heart Foundation a H. Ogawa.

Materials

0.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-121 general supply
1.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-129 general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
Absolute Ethanol (200 prfof) Fisher chemical 200559 general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle Becton Dickinson 309626 general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) Becton Dickinson 395195 general supply
Cesium-137 Irradiator J. L. Shepherd  Mark IV equipment
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10 general supply
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09 general supply
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Ketamine Zoetis 043-304 injection
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimtech Science KCC34155 general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim TEVA 0703-9526-01 injection
Xylazine Akorn 139-236 injection
X-ray irradiator Rad source RS-2000 equipment

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Park, E., Evans, M. A., Doviak, H., Horitani, K., Ogawa, H., Yura, Y., Wang, Y., Sano, S., Walsh, K. Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (171), e61875, doi:10.3791/61875 (2021).

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