Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

व्यवहार और उत्तेजनाओं प्रतिक्रियाओं के दौरान पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए वयस्क ड्रोसोफिला मेलानोगेस्टर तैयार करना

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/61876
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Chair of Neuronal Control and Metabolism, School of Life Sciences, Technical University of Munich

Summary

हम विशेष रूप से व्यवहार के दौरान और उत्तेजनाओं के जवाब में वयस्क ड्रोसोफिला के पूरे मस्तिष्क की छवि के अनुरूप एक विधि प्रस्तुत करते हैं। सिर पूरे मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति देने के लिए तैनात है, जबकि मक्खी अपने पैरों और एंटीना, सूंड की नोक, और आंखों संवेदी उत्तेजनाओं प्राप्त कर सकते हैं स्थानांतरित कर सकते हैं ।

Abstract

हम चलने जैसे चल रहे व्यवहार के दौरान पूरे ड्रोसोफिला मस्तिष्क को छवि देने के लिए विशेष रूप से विकसित एक विधि पेश करते हैं। सिर निर्धारण और विच्छेदन व्यवहार पर उनके प्रभाव को कम करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। यह पहली बार एक धारक है कि आंदोलन बाधाओं को कम करने का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है । फ्लाई के सिर के पीछे एक कोण पर इस धारक से चिपका हुआ है जो फ्लाई की चलने, दूल्हे, गंध, स्वाद और देखने की क्षमता को बनाए रखते हुए पूरे मस्तिष्क तक ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति देता है। सिर के पीछे ऑप्टिकल पथ और सिर आंदोलन कलाकृतियों के लिए जिम्मेदार मांसपेशियों में ऊतकों को हटाने के लिए विच्छेदित किया जाता है। फ्लाई ब्रेन को बाद में मस्तिष्क गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए इमेज किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कैल्शियम या वोल्टेज संकेतकों का उपयोग करके, चलने या संवारने जैसे विशिष्ट व्यवहारों के दौरान, और विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में। एक बार चुनौतीपूर्ण विच्छेदन, जो काफी अभ्यास की आवश्यकता है, महारत हासिल किया गया है, इस तकनीक के व्यवहार और उत्तेजना प्रतिक्रियाओं के लिए पूरे मस्तिष्क गतिविधि से संबंधित अमीर डेटा सेट रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है ।

Introduction

विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर मस्तिष्क गतिविधि इमेजिंग मस्तिष्क समारोह की समझ गहरा गया है। मनुष्यों में, मस्तिष्क इमेजिंग तकनीकों की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं: जबकि कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एफएमआरआई) एक न्यूरॉन संकल्प से काफी नीचे स्थानिक-लौकिक संकल्प प्रदान करता है, इलेक्ट्रोएंसेफलोग्राफी (ईईजी) जैसी तेज तकनीकें केवल मस्तिष्क तक अप्रत्यक्ष और आंशिक पहुंच की अनुमति देती हैं1। कृंतक जैसे पर्याप्त बड़े पशु मॉडलों में, सिर पर चढ़कर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसेंट गतिविधि सेंसर (जैसे, जीसीएएमपी) की रिकॉर्डिंग मस्तिष्क गतिविधि का निरीक्षण करने की अनुमति देती है, जबकि जानवर अपने पर्यावरण2में आगे बढ़ रहा है। फिर भी, ये तकनीक वर्तमान में केवल मस्तिष्क के एक छोटे से हिस्से तक पहुंच देती है। हेड-फिक्स्ड जानवरों को अधिक व्यापक रूप से चित्रित किया जा सकता है, लेकिन कवरेज अभी भी आंशिक है (उदाहरण के लिए, कॉर्टेक्स सतह3)। यह केवल छोटे जानवरों में होता है, जैसे जेब्राफिश लार्वा, सी एलिगेंस और ड्रोसोफिला कि पूरे मस्तिष्क को एकल न्यूरॉन्स4के स्तर पर या उसके करीब लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ चित्रित किया जा सकता है।

D. मेलनोगैस्टर विशेष रूप से आशाजनक है क्योंकि इसे लंबे समय से आनुवंशिक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया जाता रहा है5 और शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण विकसित किए गए हैं6। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी7से प्राप्त नए बड़े पैमाने पर शारीरिक नेटवर्क से पूरित यह फ्लाई बड़े पैमाने पर नेटवर्क8पर उत्पन्न जटिल मस्तिष्क गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान कर सकती है । हालांकि क्यूटिकल पारदर्शी नहीं है, और इस प्रकार मस्तिष्क की छवि के लिए हटा दिया जाना चाहिए, वीवो कार्यात्मक इमेजिंग में 20029 में पहले अध्ययन के बाद से अधिक से अधिक आम जगह बन गई है और कई प्रोटोकॉल पहले ही प्रकाशित किए जा चुके हैं। हालांकि, इन तरीकों में या तो मक्खी के सिर को शरीर से10से अलग करना, फ्लाई के आंदोलनों को गंभीर रूप से प्रतिबंधित करना और/या उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाएं11,12,13,14,15,या केवल एक छोटे की अनुमति शामिल है मस्तिष्क का कुछ हिस्सा9 ,16,25,26,27,17,18,19,20 ,21,22,23,24 इन फिर भी शक्तिशाली दृष्टिकोणों को पूरक करने के लिए, हमने हाल ही में विभिन्न उत्तेजनाओं28के व्यवहार और प्रतिक्रियाओं के दौरान पूरे मस्तिष्क को छवि देने की तैयारी विकसित की है।

यहां, हम इस अध्ययन पर विशेष रूप से पूरे मस्तिष्क की छवि के लिए विकसित एक विधि पेश करने के लिए निर्माण करते हैं, जबकि फ्लाई अर्ध-प्राकृतिक व्यवहार (यानी चलने और संवारने) का जवाब देती है और संवेदी उत्तेजनाओं का जवाब देती है। यह एक अवलोकन धारक का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है जो पृष्ठीय-पीछे की ओर से पूरे मस्तिष्क तक पहुंच देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि एंटीना और सूंड को बरकरार छोड़ रहा है, और फ्लाई को चलने के लिए अपने पैरों को स्थानांतरित करने की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, हवा से तकिया गेंद पर)। सिर के पीछे विच्छेदन के लिए कदम गति, प्रजनन क्षमता के लिए परिष्कृत किया गया है, और व्यवहार्यता और मक्खी की गतिशीलता पर उनके प्रभाव को कम करने के लिए ।

Protocol

सभी चरणों को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।

1. धारक की तैयारी

  1. धारक को 3डी प्रिंटर के साथ 'FlyholderVJove.stl' (अनुपूरक सामग्रीदेखें) प्रिंट करें या इसे ऑनलाइन सेवाओं(चित्रा 1 ए)का उपयोग करके मुद्रित किया जाए। दोनों SLS (नायलॉन PA12) और मल्टीजेट फ्यूजन (PA12) उपयुक्त हैं ।
  2. हेड स्लॉट बनाएं।
    1. एक सपाट सतह पर चिपचिपा टेप का एक टुकड़ा आयताकार रूप से रखें। लगभग 5 मिमी x 1 सेमी का एक टुकड़ा काटें। हर धारक(चित्रा 1B)में एक ही चौड़ाई सुनिश्चित करने के लिए निश्चित समानांतर ब्लेड (दो स्केलपेल ब्लेड एक साथ अटक) का उपयोग कर टेप के लंबे पक्ष के बीच में गर्दन स्लॉट (~ 400 x 400 μm) काटें।
    2. नीचे की ओर धारक में छेद की चापलूसी पक्ष पर टेप प्लेस (चित्रा 1C और चित्रा 1Dदेखें) । टेप को छेद के चारों ओर ~ 500 माइक्रोन के साथ इसे धक्का देकर विकृत किया जा सकता है; यह आगे बाद में मक्खी आंदोलनों में बाधा को कम करेगा।
    3. बफर को लीक होने से रोकने के लिए ब्लैक नेल पॉलिश के साथ ऊपर से टेप और धारक को कवर करें। ब्लैक नेल पॉलिश से फ्लाई की आंखों को माइक्रोस्कोप की एक्सट्रेशन लाइट से भी बचाया जा सकेगा। होल्डर का इस्तेमाल करने से कम से कम एक घंटे पहले नेल पॉलिश को सूखने दें।
    4. एक बार नेल पॉलिश सूखी है, एक लुढ़का ऊतक का उपयोग कर सिर स्लॉट में तेल के ~ 1 μL जोड़ने के लिए गोंद सुनिश्चित करने के लिए मक्खी के सिर के पीछे गीला नहीं होगा(चित्रा 2A)। सुनिश्चित करें कि स्लॉट के बाहर तेल नहीं डालना है जो गोंद को चिपकाने से रोकेगा।
  3. बॉडी स्लॉट(चित्रा 2B)बनाएं।
    1. वैकल्पिक रूप से, टेप तैयार करें जिसका उपयोग फ्लाई के शरीर को पहले से स्थिति में रखने के लिए किया जाएगा (नीचे देखें) । दो में ~ 2 सेमी चौड़े टेप के टुकड़े को काटने और 1.5 मिमी चौड़े स्लाइस काटने के लिए चित्रा 2B (शीर्ष) में दिखाए गए डिजाइन का उपयोग करें। 0.3 मिमी गहरे कंधों और शरीर स्लॉट को काट लें। सुनिश्चित करें कि यह धारक फिट बैठता है।
      नोट: फ्लाई आकार (विशेष रूप से सेक्स, उम्र, जीनोटाइप या प्रजातियों के साथ) के बीच परिवर्तनशीलता टेप डिजाइन को समायोजित करने के लिए आवश्यक बना सकती है। यदि सिर बीमार केंद्रित हो जाता है, तो गर्दन स्लॉट(चित्र 3)पर अस्थायी रूप से टेप के वी-आकार के टुकड़े को जोड़ना उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा गर्दन स्लॉट के अंदर और वी के आकार के टेप पर तेल के कुछ माइक्रोलीटर लागू करें।

2. मक्खी रखना

नोट: एक से चार दिन पुरानी मादा मक्खियां आदर्श होती हैं क्योंकि मादा सिर बड़ा होता है और इस प्रकार पुरुष सिर की तुलना में विच्छेदन करना आसान होता है, और छोटी मक्खियों में नरम क्यूटिकल होता है। चलने के प्रयोगों के लिए उच्च सर्कैडियन गतिविधि (ZT0 या ZT11) के समय के साथ प्रयोगों का मिलान करके फ्लाई की गतिविधि को बढ़ाया जा सकता है, जिसमें ग्लूकोज युक्त खारा (जैसे 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 m m trehalose 2 H2O, 10 एमएमएम ग्लूकोज, 26 एमएम नाएचसीओ3,1 एमएम एनएएच2पीओ4,2.5 एमएम सीएसीएल2·2 एच2ओ, 4 एमएम एमजीसीएल2·6 एच2ओ), पानी के साथ 24 घंटे तक फ्लाई को भूखा रखकर और प्रयोग के दौरान पर्यावरण को ~28 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके। कम से कम एक दिन पहले पंखों को क्लिप करने से भी उड़ान भरने के प्रयासों को कम करने में मदद मिलती है और इस प्रकार चलने वाले मुकाबलों की आवृत्ति7,29,30में वृद्धि होती है ।

  1. बर्फ के साथ एक पेट्री डिश या पिपेट टिप बॉक्स ढक्कन भरें, बर्फ के शीर्ष पर एक प्रयोगशाला ऊतक रखें और धारक को उस पर उल्टा सेट करें।
  2. बर्फ पर एक मक्खी हस्तांतरण के लिए यह एक ट्यूब में अपनी शीशी से चूसने और बर्फ पर उड़ाने से इसे पंगु बना (सुनिश्चित करें कि बर्फ पिघला हुआ नहीं है जो मक्खी डूब जाएगा) ।
  3. जब फ्लाई आगे बढ़ना बंद हो जाती है, तो स्लॉट के अंदर गर्दन के साथ धारक में स्लाइड करने के लिए सुस्त संदंश का उपयोग करें (फ्लाई विंग के आधार पर आयोजित की जा सकती है) जैसा कि चित्र 4 (बाएं)। स्लॉट(चित्र 4,मध्य) के पक्षों के संबंध में आंखें समान पदों पर होनी चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो गोंद को रोकने के लिए सिर के शीर्ष पर 1 μL तेल जोड़ें (अगले चरण देखें) सिर के पीछे तक पहुंचने से और बाद में हटा दें।
  4. शरीर को एक ऊतक और कुछ बर्फ के साथ कवर करने के लिए सुनिश्चित करें कि मक्खी इस कदम के दौरान कदम नहीं है और अगले(चित्रा 4,सही) । पैरों को सिर तक पहुंचने से रोकने का एक और विकल्प सिर के ठीक नीचे टेप के एक टुकड़े का उपयोग करना है (चित्रा 6देखें)।

3. सिर सुरक्षित करना

  1. सिर को पूरी तरह से पीछे के दृश्य (पार्श्व धुरी के चारों ओर, चित्रा 5Aदेखें) से ~ 20 डिग्री कोण पर रखें। यह छवि के लिए गहराई को कम करने और दूसरी तरफ गर्दन के खिंचाव को स्थानांतरित करने और कम करने के लिए मुक्त सामने पैर को बनाए रखने के बीच एक समझौता है ।
  2. एक लुढ़का हुआ ऊतक(चित्रा 5B) केसाथ, ब्याज के संवेदी क्षेत्र (एंटीना, सूंड और/ स्वाद प्रयोगों के लिए, सूंड को बाहर खींचें और आंदोलन को रोकने के लिए इसके आधार पर गोंद जोड़ें। यदि कोई स्वाद प्रयोग की योजना नहीं है, सूंड सबसे अच्छा सिर में धकेल दिया है और गोंद के साथ तय करने के लिए आंदोलन को कम करने(चित्रा 6)।
  3. 5 एस के लिए यूवी-लाइट के साथ गोंद का इलाज करें। ध्यान से एक लुढ़का ऊतक के साथ सिर के आसपास साफ करने के लिए शेष तरल गोंद है कि पैरों और/या मिट्टी संवेदी क्षेत्रों से चिपके रह सकता है हटा दें ।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो गोंद आसंजन बढ़ाने के लिए टेप को सैंडपेपर के साथ खुरदुरा किया जा सकता है।
  4. पैरों को सामने ले जाने के लिए टेप या लुढ़का हुआ ऊतक की पतली पट्टी का उपयोग करें (यदि वे पहले से ही नहीं हैं), तो वे अगले चरण से क्षतिग्रस्त नहीं होंगे।

4. शरीर की स्थिति

नोट: इस कदम को तेजी से प्रदर्शन करने की जरूरत है; इससे पहले कि मक्खी संज्ञाहरण से ठीक हो जाती है।

  1. बर्फ के कंटेनर को हटा दें और धारक को चारों ओर घुमाएं। एक ऊतक के साथ मक्खी के आसपास के पानी को हटा दें।
  2. छेद के ऊपर शरीर स्लॉट टेप (चरण 1 में बनाया गया) रखें और धीरे से फ्लाई के शरीर को नीचेधकेलें (चित्र 7)। गर्दन को बहुत ज्यादा स्ट्रेच न करने के लिए सावधान रहें।

5. छेद सील

  1. टेप के साथ किसी भी शेष बड़े छेद को कवर करें।
  2. सिर के पीछे और गर्दन के क्षेत्र में तेल के ~ 1 μL जोड़ें सुनिश्चित करें कि कोई गोंद वहां गीला होगा ।
  3. एक लुढ़का हुआ ऊतक के साथ, इसे ठीक करने के लिए टेप के चारों ओर और शीर्ष पर और छाती (मेसोनॉटम का ऊपरी पृष्ठीय हिस्सा) पर यूवी-गोंद पेंट करें। ~ 5 एस के लिए यूवी-लाइट के साथ गोंद का इलाज करें।
    नोट: यूवी प्रकाश के उपयोग को कम करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह फ्लाई के स्वास्थ्य को दृढ़ता से प्रभावित कर सकता है।
  4. सावधानी से एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ तेल और असुरक्षित गोंद को साफ करें।
  5. सिर के ऊपर खारा के ~ 1 एमएल रखो। हवा के बुलबुले को एक तरफ संदंश के साथ पुश करें। नमकीन पर एक कवरस्लिप रखकर लीक के लिए देखो और सामने की ओर खारा के लिए जांच करने के लिए चारों ओर धारक मोड़ । यदि कोई लीक होता है, तो खारा निकालें और छेद को ठीक करें (या तो अधिक गोंद या अधिक तेल जोड़कर)।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो इसे थामने के लिए यह एक अच्छा समय हो सकता है। फ्लाई को घिसटते हुए रोकने और फ्लाई को शांत करने के लिए चलने के लिए ऊतक या स्टायरोफोम गेंद का एक छोटा सा टुकड़ा पेश किया जा सकता है।

6. सिर विच्छेदन

नोट: निम्नलिखित चरणों के लिए तेज संदंश का उपयोग करें। बहुत बढ़िया संदंश महत्वपूर्ण हैं क्योंकि सुस्त संदंश सिर क्यूटिकल को खोलना अधिक कठिन बना देगा और फ्लाई के सिर या मस्तिष्क पर अतिरिक्त चोटों का कारण बन सकता है। मजबूत आवर्धन इस स्तर पर मदद कर सकता है। इस उद्देश्य के लिए, कोई भी दूरबीन माइक्रोस्कोप के नेत्रों को 30x नेत्रों के साथ बदल सकता है।

  1. गर्दन के प्रत्येक पक्ष पर केंद्रीय अंधेरे क्यूटिकुलर त्रिकोण के आधार पर दो कटौती करें (चित्रा 8Aमें क्रॉस देखें)।
  2. अंधेरे त्रिकोण के चारों ओर काटें और क्यूटिकल के इस हिस्से को हटा दें।
  3. मस्तिष्क में छेद जिसके माध्यम से मांसपेशी 16 और घेघा जाना अब दिखाई देना चाहिए और लयबद्ध रूप से स्थानांतरित करना चाहिए(वीडियो 1 फ्लोरोसेंट मांसपेशियों के साथ एक फ्लाई में इस लयबद्ध आंदोलन को प्रस्तुत करता है)। घेघा पंचर के बिना मांसपेशियों में कटौती करने के लिए इस क्षेत्र के शीर्ष को ध्यान से चुटकी लें। यदि मस्तिष्क का लयबद्ध आंदोलन बंद हो जाता है, तो मांसपेशियों 16 को हटा दिया गया था, हालांकि, आंदोलन कभी-कभी रुकता है और बाद में फिर से शुरू होता है। इस प्रकार लयबद्ध आंदोलनों पर ध्यान देना और यदि आवश्यक हो तो इस कदम को फिर से करना महत्वपूर्ण है।
  4. बचे हुए क्यूटिकल को छोटे-छोटे टुकड़ों में काट लें और ध्यान से निकाल लें। कोशिश करें कि क्यूटिकल पर बहुत ज्यादा न खींचें। इसके बजाय ऊतक के टुकड़ों को काटने के लिए कैंची की एक जोड़ी की तरह संदंश का उपयोग करें। एक मध्यीय किनारों पर शुरू कर सकते हैं, जहां अंधेरे त्रिकोण से पहले हटा दिया गया था और पक्षों के लिए एक तरह से काम करते हैं ।
    नोट: छल्ली के टुकड़े धीरे वसा निकायों के परिमार्जन अगर मौजूद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. हवा बोरी एक के बाद एक टुकड़ा उन्हें संदंश के साथ हथियाने और धीरे-धीरे और तेजी से खींच कर हटा दें।

Representative Results

ऊपर वर्णित तैयारी बड़े पैमाने पर 3 डी इमेजिंग जैसे शास्त्रीय 2 फोटॉन या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत पूरे मस्तिष्क के अवलोकन की अनुमति देती है, लेकिन प्रकाश शीट31 और अन्य संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी तकनीकों(32में समीक्षा) या हल्के क्षेत्र माइक्रोस्कोपी28जैसी तेज तकनीकें भी।

व्यवहार देख और कार्यात्मक संवेदी अंगों को बनाए रखने के दौरान पूरे मस्तिष्क तक पहुंच कई सवालों के जवाब देने की अनुमति देता है।

सबसे पहले, जब फ्लाई आराम से, व्यवहार के दौरान, और जब यह उत्तेजनाओं का जवाब देती है, तो समग्र मस्तिष्क गतिविधि क्या होती है? एक उदाहरण के रूप में, हम उत्तेजनाओं और व्यवहार के लिए प्रतिक्रियाओं के दौरान मस्तिष्क सक्रियण दिखा एक प्रकाश क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त डेटा शामिल हैं । उदाहरण के लिए, वीडियो 2में, सभी न्यूरॉन्स (nsyb-GAL4 और यूएएस-syt-GCaMP6s (बाएं) या यूएएस-GCaMP6M (दाएं)) में कैल्शियम जांच व्यक्त की गई थी और गंध का एक कश प्रस्तुत किया गया था। ध्यान दें कि तैयारी उत्तेजना की प्रतिक्रिया के दौरान मस्तिष्क गतिविधि का अवलोकन प्राप्त करने की अनुमति देती है। ड्रोसोफिला में शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग इन सेंसरों की अभिव्यक्ति को विशिष्ट न्यूरोनल उपप्रकार तक सीमित करने के लिए किया जा सकता है। वीडियो 3में, हमने कैल्शियम सेंसर की अभिव्यक्ति को डोपामिनेर्गिक और सेरोटोनिनर्जिक न्यूरॉन्स (टीएच-GAL4, डीडीसी-GAL4 और यूएएस-जीसीएएमपी 6एम) तक सीमित कर दिया। मस्तिष्क पर मजबूत समकालिक गतिविधि को ध्यान में रखें जो फ्लाई वॉकिंग के साथ कसकर सहसंबद्ध है, व्यवहार के दौरान पूरे मस्तिष्क को देख कर अनुमति दी जाती है। कैल्शियम गतिविधि के अलावा, अन्य भौतिक या रासायनिक संकेतों को इमेज किया जा सकता है (उदाहरण के लिए वोल्टेज28,33,मेटाबॉलिज्मउत्पादों 34, 35 या विशिष्ट न्यूरोमोडुलेटर36के लिए सेंसर का उपयोग करना)।

मस्तिष्क गतिविधि की भूमिका को अधिक विशेष रूप से समझने के लिए, हम पूछ सकते हैं कि कौन से क्षेत्र किस व्यवहार, उत्तेजनाओं या गतिविधि के सहज पैटर्न की प्रतिक्रिया में शामिल हैं। डेटा वास्तव में इस तरह के प्रमुख घटक विश्लेषण और स्वतंत्र घटक विश्लेषण के रूप में तकनीकों का उपयोग कर कार्यात्मक क्षेत्रों निकालने के लिए एक निष्पक्ष स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 9A विभिन्न रंगों में विभिन्न कार्यात्मक क्षेत्रों को दिखाता है। कार्यात्मक क्षेत्रों का आकार और स्थानीयकरण उन्हें मस्तिष्क क्षेत्रों और कुछ मामलों में न्यूरॉन प्रकार की पहचान करने के लिए शारीरिक टेम्पलेट्स पर मैप करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक बार शारीरिक टेम्पलेट के साथ गठबंधन करने के बाद, फ्लोरेसेंस मूल्यों को मात्रात्मक विश्लेषण के लिए शारीरिक मस्तिष्क क्षेत्रों में औसत किया जा सकता है (चित्रा 9Bदेखें)। उदाहरण के लिए, चित्रा 9B में डेटा पर लागू एक पदानुक्रमित गॉसियन मॉडल से पता चलता है कि क्षेत्र चलने के दौरान अधिक सक्रिय होते हैं (0.029 के एफ मीडियन के साथ, 95% विश्वसनीय अंतराल =[0.017 0.041]) लेकिन दूल्हे के दौरान नहीं (15% विश्वसनीय अंतराल के साथ -0.0049 =[-0.016 0.0059])।

समझ गहराई को जोड़ते हुए, तैयारी द्वारा अनुमेए गए विभिन्न कार्यात्मक क्षेत्रों की एक साथ रिकॉर्डिंग का उपयोग कार्यात्मक नेटवर्क के गतिशील गुणों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि अब तक अध्ययन किए गए सभी दिमागों में मस्तिष्क क्षेत्र अत्यधिक बार-बार जुड़े हुए हैं और अधिक से अधिक अध्ययनों से पता चलता है कि संवेदी क्षेत्र भी जानवर के व्यवहार की स्थिति का जवाब देते हैं। कई पहलुओं को कार्यात्मक ग्राफ गुणों (जैसे, मॉड्यूल) और स्पेटियो-टेम्पोरल पैटर्न जैसे देखा जा सकता है जो गतिशील प्रणालियों के साथ फिट हो सकते हैं (उदाहरण के लिए8 देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: धारक (चरण 1) तैयार करना। A)होल्डर डिजाइन (ऊपर से देखें) । ख) नैक स्लॉट तैयारी। शीर्ष: टेप डिजाइन, नीचे: गर्दन स्लॉट को काटने के लिए समानांतर ब्लेड का उपयोग किया जाता है। C)नीचे से धारक का दृश्य। घ) बॉटम व्यू यह दर्शाता है कि गर्दन स्लॉट टेप कहां जोड़ना है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आगे की तैयारी (चरण 1)। A)सिर के पीछे को कवर करने और खारा लीक को रोकने के लिए गोंद को रोकने के लिए गर्दन स्लॉट में तेल जोड़ें। स्केल बार, 1 मिमी बी) शीर्ष: टेप के टुकड़े का आकार जिसका उपयोग शरीर को नीचे धकेलने के लिए किया जाएगा। नीचे: सुनिश्चित करें कि टेप धारक फिट बैठता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: केंद्र सहायता के लिए टेप के एक वी के आकार का टुकड़ा की नियुक्ति । (A)बॉटम व्यू । (ख)टॉप व्यू । स्केल बार, 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: फ्लाई (चरण 2) रखें। बाएं, शरीर को रखने के लिए दो सुस्त संदंश का उपयोग करें ताकि गर्दन गर्दन के स्लॉट में हो। मध्य, सिर संरेखित करें। आंखें स्लॉट के किनारों पर दोनों तरफ झूठ बोलती हैं। मक्खी का सिर सीधा है। ठीक है, इसे आगे बढ़ने से रखने के लिए बर्फ से ढके ऊतक के साथ फ्लाई को टक करें। स्केल बार, 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सिर को ठीक करें (चरण 3)। A)सिर का आदर्श कोण। B)ब्याज के संवेदी क्षेत्रों से परहेज करते हुए सिर के चारों ओर यूवी गोंद जोड़ें। स्केल बार, 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: सूंड की नोक और एंटीना गोंद (चरण 3) से मुक्त रखा जा सकता है। सफेद चक्र उस क्षेत्र को इंगित करता है जहां यूवी-गोंद लागू किया गया है। तीर से पता चलता है कि घ्राण और गुस्ताखी प्रयोगों के लिए गोंद से कौन से हिस्से मुक्त रह जाते हैं। वैकल्पिक टेप पर ध्यान दें जो पैरों को गोंद क्षेत्र को छूने से रोकता है। स्केल बार, 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: पीछे टेप (चरण 4.2) रखें। चरण 1 में बनाया गया टेप (चित्रा 2, बाएंदेखें) का उपयोग शरीर को रखने और धारक में बड़े छेद को कवर करने के लिए किया जाता है। स्केल बार, 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: विच्छेदन चरण (चरण 6)। ए-बी) अंधेरे त्रिकोण (पार) के आधार पर प्रत्येक तरफ कट और क्यूटिकल सीके इस हिस्से को हटा दें) । घ)और ई)मांसपेशियों को 16 हटा दें । फिर धीरे-धीरे बाकी क्यूटिकल एफ),हवा के बोरे जी,और मांसपेशियों को हटा दें। ज)विच्छेदित सिर। स्केल बार, 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: प्रतिनिधि परिणाम। A)कार्यात्मक क्षेत्रों(28में पीसीए और आईसीए का उपयोग करके निकाले गए) एक फ्लाई के लिए GCaMP6 पैन-न्यूरोली इमेज डे एक हल्के क्षेत्र माइक्रोस्कोप (25x, NA = 0.95 एक मिलान एफ/12 माइक्रो लेंस सरणी के साथ) के साथ । स्केल बार, 100 माइक्रोन बी) उत्तेजनाओं और व्यवहार के जवाब के दौरान बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों में औसत कैल्शियम गतिविधि(28से पुन: पेश) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: मांसपेशी 16 आंदोलनों (चरण 6.3)। जीएफपी मांसपेशियों में व्यक्त किया गया था। श्वासनली के ठीक ऊपर छेद से आने वाले पंपिंग मूवमेंट पर ध्यान दें। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2: दो अलग-अलग तैयारी के लिए गंध के जवाब के दौरान पैन-न्यूरोनल कैल्शियम गतिविधि। बाल्सामिक सिरका मक्खी पर फूला हुआ था। पैन-न्यूरोनल कैल्शियम गतिविधि (nsyb-GAL4 ड्राइवर, यूएएस-syt-GCaMP6s बाएं और यूएएस-GCaMP6M दाएं) को एक हल्के क्षेत्र माइक्रोस्कोप (25x, NA = 0.95 एक मिलान एफ/12 माइक्रोलेंस सरणी के साथ) के साथ चित्रित किया गया था। इसके बाद लाइट फील्ड चित्रों को रेफ में वर्णित के रूप में खंगाला गया। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 3: व्यवहार के दौरान न्यूरॉन टाइप सबसेट में कैल्शियम गतिविधि। GCaMP6 डोपामिनेर्गिक और सेरोटोनिनर्जिक न्यूरॉन्स (TH-GAL4 और डीडीसी-GAL4 के साथ) में व्यक्त किया गया था। फ्लाई जेनेटिक टूल्स के संयोजन में, तैयारी चलने के दौरान कई क्षेत्रों में गतिविधि में मजबूत वृद्धि का निरीक्षण करने की अनुमति देती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक सामग्री। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ड्रोसोफिला दुर्लभ वयस्क जानवरों में से एक है जहां जटिल व्यवहार के दौरान पूरे मस्तिष्क को चित्रित किया जा सकता है। यहां, हम मक्खी को तैयार करने और अपने पूरे मस्तिष्क को चालू पूरे मस्तिष्क गतिविधि की छवि के लिए बेनकाब करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए ।

डी मेलनोगास्टर जैसे छोटे जानवर को विच्छेदन करना चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार विधि को इसमें महारत हासिल करने के लिए बहुत अभ्यास और धैर्य की आवश्यकता होती है। हालांकि, प्रशिक्षण के बाद, प्रक्रिया में 30 मिनट से भी कम समय लगता है और प्रजनन योग्य परिणाम पैदा होता है।

हमारे द्वारा प्रस्तुत विधि में अतिरिक्त सीमाएं हैं। सबसे पहले, अपनी प्राकृतिक स्थिति से मक्खी सिर झुकाव गर्दन जो संयोजी ऊतक, नसों या मांसपेशियों के लिए हानिकारक हो सकता है खींच की ओर जाता है । दूसरा, हालांकि वेंट्रल सब्सोफेगल जोन (एसईजेड) ऑप्टिकल रूप से सुलभ है, यह अर्ध-पारदर्शी घेघा से नीचे है, जो इस क्षेत्र में तीव्रता और संकल्प को कम करता है। अंत में, हालांकि धारक अधिकांश दिशाओं में पहुंच से बाहर है, मक्खी अभी भी कभी-कभी अपनी उपस्थिति का एहसास करती है और बचने की कोशिश करने के लिए उस पर धक्का देती है।

इन सीमाओं के बावजूद, व्यवहार और उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं के दौरान पूरे मस्तिष्क इमेजिंग से प्राप्त व्यापक डेटा पूरे नेटवर्क के स्तर पर मस्तिष्क समारोह को समझना संभव बना देगा जब जानवर जटिल, प्रकृतिवादी वातावरण के साथ बातचीत करता है और नेविगेट करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी मदद के लिए हीदी मिलर-मोमर्सकम्प और पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए इवथ मेलिसा गुआटिबोन्ज़ा अरेवालो का शुक्रिया अदा करते हैं। प्रोटोकॉल के प्रारंभिक संस्करण राल्फ ग्रीनस्पैन की प्रयोगशाला में विकसित किए गए थे। इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा विशेष रूप से आईजीके को अनुदान FOR2705 (TP3) के माध्यम से, और सिमंस फाउंडेशन (एमऑन - 414701) और कावली इंस्टीट्यूट फॉर ब्रेन एंड माइंड (अनुदान संख्या #2017-954) द्वारा एसए द्वारा प्राप्त किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 forceps FST by DUMONT 11252-30 straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long
#55 forceps FST by DUMONT 11255-20 straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long
30x oculars yegren WF30-9-30-H WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle
AHOME/UV flashlight Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd B07V2W9543 (ASIN) 365 nm
Fotoplast Gel/UV Glue Dreve Otoplastik GmbH 44791 GHS07, GHS08
Gloss Finish Transparent Tape 3M Scotch
KIMTECH Science/Precision wipes Kimberly-Clark Professional 7552 11 x 21 cm
KL 1500 LCD/Microscope light Schott
Leica MS5 Microscope Leica WF30X/9
Nail Lacqueur Opi Products Inc., N. Hollywood 6306585338 black
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose Sigma Aldrich
Scalpel Werner Dorsch GmbH 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) soft handle
Vacuum grease Dow corning 0020080 /100 gr Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papanicolaou, A. C. The Oxford Handbook of Functional Brain Imaging in Neuropsychology and Cognitive Neurosciences. , Oxford University Press. (2017).
  2. Zong, W., et al. Fast high-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freely behaving mice. Nature Methods. 14, 713-719 (2017).
  3. Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements. Nature Neuroscience. 22, 1677-1686 (2019).
  4. Ahrens, M. B., Engert, F. Large-scale imaging in small brains. Current Opinion in Neurobiology. 32, 78-86 (2015).
  5. Sokolowski, M. B. Drosophila: Genetics meets behaviour. Nature Reviews Genetics. 2, 879-890 (2001).
  6. Venken, K. J. T., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 6, 167-178 (2005).
  7. Zheng, Z., et al. A Complete Electron Microscopy Volume of the Brain of Adult Drosophila melanogaster. Cell. 174, 730-743 (2018).
  8. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. Journal of Neurogenetics. 34, 171-177 (2020).
  9. Fiala, A., et al. Genetically Expressed Cameleon in Drosophila melanogaster Is Used to Visualize Olfactory Information in Projection Neurons. Current Biology. 12, 1877-1884 (2002).
  10. Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-Photon Calcium Imaging Reveals an Odor-Evoked Map of Activity in the Fly Brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
  11. Mann, K., Gallen, C. L., Clandinin, T. R. Whole-Brain Calcium Imaging Reveals an Intrinsic Functional Network in Drosophila. Current Biology. 27, 2389-2396 (2017).
  12. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca2+ rhythms in vivo. Science. 351, 976-981 (2016).
  13. Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86, 1449-1460 (2015).
  14. Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e1 (2012).
  15. Strutz, A., Völler, T., Riemensperger, T., Fiala, A., Sachse, S. Calcium imaging of neural activity in the olfactory system of Drosophila. Neuromethods. 72, 43-70 (2012).
  16. Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nature Methods. 7, 535-540 (2010).
  17. Fisher, Y. E., Lu, J., D'Alessandro, I., Wilson, R. I. Sensorimotor experience remaps visual input to a heading-direction network. Nature. 576, 121-125 (2019).
  18. Green, J., Vijayan, V., Mussells Pires, P., Adachi, A., Maimon, G. A neural heading estimate is compared with an internal goal to guide oriented navigation. Nature Neuroscience. 22, 1460-1468 (2019).
  19. Shiozaki, H. M., Ohta, K., Kazama, H. A Multi-regional Network Encoding Heading and Steering Maneuvers in Drosophila. Neuron. 106, 126-141 (2020).
  20. Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9, 872 (2018).
  21. Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69, 498-508 (2011).
  22. Grover, D., Katsuki, T., Greenspan, R. J. Flyception: imaging brain activity in freely walking fruit flies. Nature Methods. 13, 569-572 (2016).
  23. Cohn, R., Morantte, I., Ruta, V. Coordinated and Compartmentalized Neuromodulation Shapes Sensory Processing in Drosophila. Cell. 163, 1742-1755 (2015).
  24. Fiala, A., Spall, T. In Vivo Calcium Imaging of Brain Activity in Drosophila by Transgenic Cameleon Expression. Science Signaling. 2003, (2003).
  25. Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium imaging of odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  26. Bilz, F., Geurten, B. R. H., Hancock, C. E., Widmann, A., Fiala, A. Visualization of a Distributed Synaptic Memory Code in the Drosophila Brain. Neuron. 106, 963-976 (2020).
  27. Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. Sleep Facilitates Memory by Blocking Dopamine Neuron-Mediated Forgetting. Cell. 161, 1656-1667 (2015).
  28. Aimon, S., et al. Fast near-whole-brain imaging in adult Drosophila during responses to stimuli and behavior. PLOS Biology. 17, 2006732 (2019).
  29. Azevedo, A. W., et al. A size principle for recruitment of Drosophila leg motor neurons. Elife. 9, (2020).
  30. Haberkern, H., et al. Visually Guided Behavior and Optogenetically Induced Learning in Head-Fixed Flies Exploring a Virtual Landscape. Current Biology. 29, 1647-1659 (2019).
  31. Li, W., et al. SCAPE Microscopy for High Speed , 3D Whole-Brain Imaging in Drosophila Melanogaster. Biomed. Opt. Congr. 2016, 4-6 (2016).
  32. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15, 1011-1019 (2018).
  33. Bando, Y., Grimm, C., Cornejo, V. H., Yuste, R. Genetic voltage indicators. BMC Biology. 17, 71 (2019).
  34. Plaçais, P. -Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 15510 (2017).
  35. Gándara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 19945 (2019).
  36. Andreoni, A., Davis, C. M. O., Tian, L. Measuring brain chemistry using genetically encoded fluorescent sensors. Current Opinion in Biomedical Engineering. 12, 59-67 (2019).
  37. Broxton, M., et al. Wave optics theory and 3-D deconvolution for the light field microscope. Optics Express. 21, 25418-25439 (2013).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 170 लाइव इमेजिंग ड्रोसोफिला,व्यवहार पूरे मस्तिष्क गतिविधि फ्लोरेसेंस कैल्शियम सेंसर आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर
व्यवहार और उत्तेजनाओं प्रतिक्रियाओं के दौरान पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए वयस्क <em>ड्रोसोफिला मेलानोगेस्टर</em> तैयार करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woller, A., Bandow, P., Aimon, S.,… More

Woller, A., Bandow, P., Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses. J. Vis. Exp. (170), e61876, doi:10.3791/61876 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter