Summary
Vi presenterar en metod speciellt skräddarsydd för att avbilda hela hjärnan hos vuxna Drosophila under beteende och som svar på stimuli. Huvudet är placerat för att ge optisk åtkomst till hela hjärnan, medan flugan kan flytta benen och antennerna, spetsen på proboscisen och ögonen kan ta emot sensoriska stimuli.
Abstract
Vi presenterar en metod som utvecklats specifikt för att avbilda hela Drosophila hjärnan under pågående beteende såsom promenader. Huvudfixering och dissekering är optimerade för att minimera deras inverkan på beteendet. Detta uppnås först genom att använda en hållare som minimerar rörelsehinder. Baksidan av flughuvudet är limmat på denna hållare i en vinkel som ger optisk åtkomst till hela hjärnan samtidigt som flugans förmåga att gå, grooma, lukta, smaka och se bibehålls. Baksidan av huvudet dissekeras för att ta bort vävnader i den optiska vägen och muskler som ansvarar för huvudrörelser. Flughjärnan kan därefter avbildas för att registrera hjärnaktivitet, till exempel med hjälp av kalcium- eller spänningsindikatorer, under specifika beteenden som promenader eller grooming, och som svar på olika stimuli. När den utmanande dissekeringen, som kräver betydande övning, har bemästrats, tillåter denna teknik att registrera rika datauppsättningar som relaterar hela hjärnaktivitet till beteende- och stimulanssvar.
Introduction
Imaging hjärnaktivitet med olika tekniker har fördjupat förståelsen av hjärnans funktion. Hos människor har hjärnavbildningstekniker viktiga begränsningar: medan funktionell magnetisk resonanstomografi (fMRI) erbjuder spatio-temporal upplösning långt under en enda neuronupplösning, tillåter snabba tekniker som elektroencefalografi (EEG) endast indirekt och partiell åtkomst till hjärnan1. I tillräckligt stora djurmodeller som gnagare tillåter registrering av fluorescerande aktivitetssensorer (t.ex. GCaMP) med hjälp av huvudmonterade mikroskop att observera hjärnaktivitet medan djuret rör sig i sin miljö2. Ändå ger dessa tekniker för närvarande endast tillgång till en liten del av hjärnan. Huvud-fixerade djur kan avbildas mer omfattande, men täckningen är fortfarande partiell (t.ex. cortexytan3). Det är bara hos små djur, som zebrafisklarverna, C. elegans och Drosophila som hela hjärnan kan avbildas med temporal och rumslig upplösning på nivån eller nära enstaka nervceller4.
D. melanogaster är särskilt lovande eftersom den länge har använts som en genetisk modellorganism5 och kraftfulla genetiska verktyg har utvecklats6. Kompletterat med det nya storskaliga anatomiska nätverket som härrör från elektronmikroskopi7,kan flugan ge unika möjligheter att studera komplex hjärndynamik som genereras på ett storskaligt nätverk8. Även om nagelband inte är transparent, och måste därför tas bort för att avbilda hjärnan, har in vivo funktionell avbildning blivit allt vanligare sedan den första studien 20029 och flera protokoll har redan publicerats. Men dessa metoder innebär att antingen separera flughuvudet från kroppen10, kraftigt begränsa flugans rörelser och / eller svar på stimuli11,12,13,14,15, eller endast tillåta en liten del av hjärnan som ska avbildas9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. För att komplettera dessa ändå kraftfulla tillvägagångssätt utvecklade vi nyligen en förberedelse för att avbilda hela hjärnan under beteende och svar på olika stimuli28.
Här bygger vi vidare på denna studie för att presentera en metod som är speciellt utvecklad för att avbilda hela hjärnan medan flugan utför semi-naturalistiskt beteende (dvs. promenader och grooming) och svarar på sensoriska stimuli. Detta uppnås genom att använda en observationshållare utformad för att ge tillgång till hela hjärnan från den rygg-bakre sidan, samtidigt som antennerna och proboscisen är intakta och tillåter flugan att flytta benen för att gå (t.ex. på en luftdämpad boll). Steg för dissekering av bakhuvudet har förfinats för hastighet, reproducerbarhet och för att minimera deras inverkan på flugans livskraft och rörlighet.
Protocol
Alla steg utförs under ett stereomikroskop.
1. Förbereda innehavaren
- Skriv ut innehavaren "FlyholderVJove.stl" (se kompletterande material)med en 3D-skrivare eller skriv ut den med hjälp av onlinetjänster(figur 1A). Både SLS (Nylon PA12) och multijet fusion (PA12) är lämpliga.
- Skapa huvudfacket.
- Placera en bit klibbig tejp rektangulärt på en plan yta. Skär en skiva på ca 5 mm x 1 cm. Skär halsfacket (~400 x 400 μm) i mitten av tejpens längre sida med fasta parallellblad (två skalpellblad som sitter ihop) för att säkerställa samma bredd i varje hållare (bild 1B).
- Placera tejpen över hålets plattare sida i hållaren på undersidan (se figur 1C och figur 1D). Tejpen kan deformeras genom att trycka ner den med tång ~500 μm runt hålet; Detta kommer att ytterligare minimera hinder för senare flugrörelser.
- Täck tejpen och hållaren uppifrån med svart nagellack för att förhindra att bufferten läcker ut. Det svarta nagellacket skyddar också flugens ögon från mikroskopets excitationsljus. Låt nagellacket torka minst en timme innan du använder hållaren.
- När nagellacket är torrt, tillsätt ~ 1 μL fett i huvudspåret med en rullad vävnad för att säkerställa att limet inte blöter baksidan av flugans huvud (Figur 2A). Se till att inte lägga fett utanför slitsen som skulle förhindra att limmet fastnar.
- Skapa karossplatsen (bild 2B).
- Förbered eventuellt tejpen som ska användas för att placera flugens kropp (se nedan) i förväg. Använd designen som visas i figur 2B (överst) för att skära en bit ~2 cm bred tejp i två delar och skära 1,5 mm breda skivor. Skär ut 0,3 mm djupa axlar och kroppsspår. Se till att den passar hållaren.
OBS: Variationen mellan flugstorlekar (särskilt med kön, ålder, genotyp eller art) kan göra det nödvändigt att justera tejpdesignen. Om huvudet tenderar att vara dåligt centrerat kan det vara bra att lägga till en V-formad tejpbit tillfälligt över nackspåret (bild 3). Applicera också några mikroliter fett inuti nackspåret och på den V-formade tejpen.
- Förbered eventuellt tejpen som ska användas för att placera flugens kropp (se nedan) i förväg. Använd designen som visas i figur 2B (överst) för att skära en bit ~2 cm bred tejp i två delar och skära 1,5 mm breda skivor. Skär ut 0,3 mm djupa axlar och kroppsspår. Se till att den passar hållaren.
2. Placera flugan
OBS: En till fyra dagar gamla kvinnliga flugor är idealiska eftersom det kvinnliga huvudet är större och därmed lättare att dissekera än det manliga huvudet, och yngre flugor har mjukare nagelband. För gångexperiment kan flugs aktivitet ökas genom att matcha experimenten med tider med högre dygnsrytmaktivitet (ZT0 eller ZT11), genom att använda saltlösning som innehåller glukos (t.ex. 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 mM trehalose 2 H2O, 10 mM glukos, 26 mM NaHCO3,1 mM NaH2PO4,2,5 mM CaCl2·2 H2O, 4 mM MgCl2·6 H2O), genom att svälta flugan upp till 24 h med endast vattenmiljö och genom att värma upp miljön till ~ 28 ° C under experimentet. Att klippa vingarna minst en dag i förväg hjälper också till att minska försöken att flyga och därmed öka frekvensen av promenaderbouts 7,29,30.
- Fyll en Petri-skål eller pipettspetslåda med is, placera en laboratorievävnad ovanpå isen och ställ hållaren upp och ner på den.
- Överför en fluga på is för att förlama den genom att suga den från flaskan till ett rör och blåsa den på isen (se till att isen inte smälts vilket skulle dränka flugan).
- När flugan slutar röra sig, använd tråkiga tångar för att skjuta in den i hållaren med nacken inuti spåret (flugan kan hållas på basen av vingen) som i figur 4 (vänster). Ögonen ska vara i lika lägen med avseende på slitsens sidor(figur 4,mitten). Tillsätt vid behov 1 μL fett på toppen av huvudet för att förhindra att limet (se nästa steg) når baksidan av huvudet och tar bort senare.
- Täck kroppen med en näsduk och lite is för att se till att flugan inte rör sig under detta steg och nästa (Bild 4, höger). Ett annat alternativ för att förhindra att benen når huvudet är att använda en tejpbit precis under huvudet (se figur 6).
3. Säkra huvudet
- Placera huvudet i en ~20° vinkel från en helt bakre vy (runt sidoaxeln, se figur 5A). Detta är en kompromiss mellan att minska djupet till bilden och på andra sidan att hålla frambenet fritt att röra sig och minimera nacken.
- Med en upprullad vävnad (Figur 5B), sätt UV-lim runt huvudet samtidigt som du undviker att smutsa ner det sensoriska intresseområdet (antenner, proboscis och / eller ögon). För smakexperiment, dra ut proboscisen och tillsätt lim vid basen för att förhindra rörelse. Om inget smakexperiment planeras trycks proboscisen bäst in i huvudet och fixeras med lim för att minimera rörelsen (Figur 6).
- Härda limet med UV-ljus i 5 s. Rengör försiktigt huvudets omgivning med en upprullad vävnad för att ta bort återstående flytande lim som kan fastna på benen och / eller jordsensoriska områden.
OBS: Tejpen kan grovbeskäras med sandpapper för att öka lim vidhäftningen vid behov. - Använd en tunn remsa tejp eller en upprullad vävnad för att flytta benen till framsidan (om de inte redan är det), så att de inte skadas av nästa steg.
4. Placering av kroppen
OBS: Det här steget måste utföras snabbt; innan flugan återhämtar sig från anestesi.
- Ta bort isbehållaren och vänd på hållaren. Ta bort vattnet runt flugan med en vävnad.
- Placera kroppsspårstejpen (skapad i steg 1) över hålet och tryck försiktigt ner flugens kropp (bild 7). Var noga med att inte sträcka nacken för mycket.
5. Täta hålet
- Täck eventuella återstående stora hål med tejp.
- Tillsätt ~ 1 μL fett på baksidan av huvudet och i nackområdet för att se till att inget lim kommer att blöta där.
- Med en hoprullad vävnad, måla UV-lim runt och ovanpå tejpen och på bröstkorgen (övre dorsala delen av mesonotum) för att fixa det. Härda limet med UV-ljus i ~5 s.
OBS: Det är viktigt att minimera användningen av UV-ljus eftersom det starkt kan påverka flugens hälsa. - Rengör försiktigt fett och ocurerat lim med laboratorievävnad.
- Lägg ~1 ml saltlösning ovanpå huvudet. Tryck undan luftbubblor med tång. Leta efter läckor genom att placera ett täckglas över saltlösningen och vända hållaren för att kontrollera saltlösningen på framsidan. Om det finns några läckor, ta bort saltlösningen och fixa hålet (antingen genom att tillsätta mer lim eller mer fett).
OBS: Detta kan vara en bra tid att pausa om det behövs. Flugan kan erbjudas en liten bit vävnad eller frigolitboll att gå på för att förhindra flailing och lugna ner flugan.
6. Dissekera huvudet
OBS: Använd slipade tångar för följande steg. Mycket fina tång är kritiska eftersom tråkiga tångar kommer att göra det svårare att öppna huvud nagelband och kan leda till ytterligare skador på flugan huvud eller hjärna. Stark förstoring kan hjälpa i detta skede. För det målet kan man ersätta kikarmikroskopets kikare med 30x okulär.
- Gör två snitt vid basen av den centrala mörka cuticular triangeln på varje sida av nacken (se kors i figur 8A).
- Skär runt den mörka triangeln och ta bort denna del av nagelbandet.
- Hålet i hjärnan genom vilket muskel 16 och matstrupen går bör nu vara synliga och röra sig rytmiskt (Video 1 presenterar denna rytmiska rörelse i en fluga med fluorescerande muskler). Nyp försiktigt toppen av detta område för att skära muskler 16 utan att punktera matstrupen. Om hjärnans rytmiska rörelse upphörde, muskel 16 var sannolikt bort, men rörelsen pausar ibland och startar om senare. Det är därför viktigt att vara uppmärksam på rytmiska rörelser och utföra detta steg igen om det behövs.
- Skär den återstående nagelbanden i små bitar och ta bort dem försiktigt. Försök att inte dra i nagelbandet för mycket. Använd istället tången som en sax för att skära bitar av vävnad. Man kan börja på de mediala kanterna, där den mörka triangeln togs bort tidigare och arbeta sig till sidorna.
OBS: Bitar av nagelband kan användas för att försiktigt skrapa fettkroppar om de finns. - Ta bort luftsäckarna en bit efter den andra genom att ta tag i dem med tången och dra långsamt och stadigt.
Representative Results
Preparatet som beskrivs ovan möjliggör observation av hela hjärnan under ett mikroskop för storskalig 3D-avbildning såsom klassiska 2 fotoner eller konfokal mikroskopi, men också snabbare tekniker somljusplåt 31 och andra strukturerade belysningsmikroskopitekniker (granskadei 32), eller ljusfältmikroskopi28.
Tillgången till hela hjärnan samtidigt som man observerar beteendet och upprätthåller funktionella sensoriska organ gör det möjligt att svara på flera frågor.
För det första, vad är den totala hjärnaktiviteten när flugan är i vila, under beteende och när den svarar på stimuli? Som ett exempel inkluderar vi data som erhållits med ett ljusfältmikroskop som visar hjärnaktivering under svar på stimuli och beteende. I video 2uttrycktes till exempel en kalciumsond i alla nervceller (nsyb-GAL4 och UAS-syt-GCaMP6s (vänster) eller UAS-GCaMP6M (höger)) och en luktpuff presenterades. Lägg märke till hur preparatet gör det möjligt att få en översikt över hjärnaktiviteten under svaret på stimulansen. De kraftfulla genetiska verktygen i Drosophila kan användas för att begränsa uttrycket av dessa sensorer till specifika neuronala subtyper. I video 3begränsade vi uttrycket av en kalciumsensor till dopaminerga och serotoninerga nervceller (TH-GAL4, DDC-GAL4 och UAS-GCaMP6M). Lägg märke till den starka synkrona aktiviteten över hjärnan tätt korrelerad med fluggången, tillåten genom att observera hela hjärnan under beteendet. Förutom kalciumaktivitet kan andra fysiska eller kemiska signaler avbildas (med hjälp av till exempel sensorer förspänning 28,33, metabolismprodukter34,35 eller specifika neuromodulatorer36).
För att förstå hjärnaktivitetens roll mer specifikt kan vi fråga vilka regioner som är involverade i vilket beteende, svar på stimuli eller spontana aktivitetsmönster. Uppgifterna kan verkligen användas som en opartisk skärm för att extrahera funktionella regioner med hjälp av tekniker som huvudkomponentanalys och oberoende komponentanalys. Figur 9A visar olika funktionella regioner i olika färger. Form och lokalisering av funktionella regioner gör det möjligt att mappa dem till anatomiska mallar för att identifiera hjärnregioner och i vissa fall neurontyp. När fluorescensvärdena är anpassade till den anatomiska mallen kan de dessutom medelvärdet i anatomiska hjärnregioner för kvantitativ analys (se figur 9B). En hierarkisk gaussisk modell som tillämpas på data i figur 9B visar till exempel att regioner är mer aktiva under promenaden (med en median på ΔF/F på 0,029, 95% trovärdigt intervall=[0,017 0,041]) men inte under brudgummen (ΔF/F median = -0,0049 med 95% trovärdigt intervall=[-0,016 0,0059]).
Utöver förståelsedjupet kan de samtidiga inspelningarna av de olika funktionella regioner som tillåts av preparatet användas för att studera de dynamiska egenskaperna hos det funktionella nätverket. Detta är viktigt eftersom hjärnregioner i alla hjärnor som studerats hittills är mycket återkommande sammankopplade och fler och fler studier visar att även sensoriska områden svarar på djurets beteendetillstånd. Flera aspekter kan ses som funktionella grafegenskaper (t.ex. moduler) och spatio-temporala mönster som kan passa med dynamiska system(se 8 för exempel).
Figur 1: Förbereda hållaren (steg 1). A) Holder design (vy uppifrån). B) Förberedelse av nackspår. topp: tejpdesign, botten: parallella blad som används för att skära nackspåret. C) Vy över innehavaren underifrån. D) Nederkant som anger var nackspårstejpen ska läggas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Ytterligare förberedelser (steg 1). A) Tillsätt fett i nackfacket för att förhindra lim för att täcka baksidan av huvudet och för att förhindra saltlösningsläckage. Skalstänger, 1 mm. B) Överst: formen på tejpen som ska användas för att trycka ner kroppen. Botten: se till att tejpen passar hållaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Placering av en v-formad tejpbit för att underlätta centrering. (A) Nedersta vyn. (B) Överst. Skalbar, 2 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Placera flugan (steg 2). Vänster, använd två tråkiga tång för att placera kroppen så att nacken är i nackspåret. Mitten, rikta in huvudet. Ögonen ligger på båda sidor på kanterna på slitsen. Flugan är rak. Stoppa in flugan med en näsduk täckt med is för att den inte ska röra sig. Skalstreck, 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Fäst huvudet (steg 3). A) Idealisk vinkel på huvudet. B) Tillsätt UV-lim runt huvudet och undvik sensoriska intresseområden. Skalstreck, 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 6: Proboscisspetsen och antennerna kan hållas fria från lim (steg 3). Den vita cirkeln anger det område där UV-limet har applicerats. Pilen visar vilka delar som lämnas fria från lim för lukt- och gustatory experiment. Notera den valfria tejpen som förhindrar att benen vidrör limområdet. Skalbar, 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Placera baktejpen (steg 4.2). Tejpen som skapas i steg 1 (se figur 2, vänster) används för att placera kroppen och täcka det stora hålet i hållaren. Skalstreck, 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 8: Dissekeringssteg (steg 6). A-B) Skär på varje sida vid botten av den mörka triangeln (kors) och ta bort denna del av nagelbandet C). D) och E) ta bort muskel 16. Ta sedan försiktigt bort resten av nagelbandet F), luftsäckarna G) och musklerna. H) Dissekerat huvud. Skalbar, 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Representativa resultat. A) Funktionella regioner (extraherade med PCA och ICA somi 28) för en fluga som uttrycker GCaMP6 panneuronally avbildat med ett ljusfältmikroskop (25x, NA=0,95 med en matchande f/12 mikrolinsmatris). Skala bommar för, 100 μm. B) Genomsnittlig calciumaktivitet i stora hjärnregioner under svar till stimuli och uppförande (reproducerat från28). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Muskel 16 rörelser (steg 6.3). GFP uttrycktes i muskler. Observera pumprörelsen som kommer från hålet precis ovanför luftstrupen. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Panneuronal kalciumaktivitet under reaktion på lukt för två olika preparat. Balsamvinäger blåstes upp i farten. Pan-neuronal kalcium aktivitet (nsyb-GAL4 förare, UAS-syt-GCaMP6s vänster och UAS-GCaMP6M höger) avbildades med ett ljusfält mikroskop (25x, NA=0,95 med en matchande f/12 microlens array). Ljusfältsbilder rekonstruerades sedan enligt beskrivningen i ref.28,37. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Kalciumaktivitet i en neuron typ delmängd under beteende. GCaMP6 uttrycktes i dopaminerga och serotoninerga nervceller (med TH-GAL4 och DDC-GAL4). I kombination med fluggenetiska verktyg gör preparatet det möjligt att observera en stark ökning av aktiviteten i många regioner under promenad. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Drosophila är ett av de sällsynta vuxna djuren där hela hjärnan kan avbildas under komplexa beteenden. Här presenterar vi en metod för att förbereda flugan och exponera hela hjärnan för bild pågående hela hjärnaktiviteten. Flera viktiga punkter bör noteras.
Att dissekera ett litet djur som D. melanogaster är utmanande. Metoden kräver alltså mycket övning och tålamod för att behärska den. Efter träningen tar dock proceduren mindre än 30 minuter och ger reproducerbara resultat.
Metoden vi presenterade har ytterligare begränsningar. För det första leder lutning av flughuvudet från sin naturliga position till att sträcka nacken som kan vara skadlig för bindväv, nerver eller muskler. För det andra, även om den ventrala subesofaguszonen (SEZ) är optiskt tillgänglig, är den under den halvtransparenta matstrupen, vilket minskar intensiteten och upplösningen i detta område. Slutligen, även om hållaren är utom räckhåll i de flesta riktningar, inser flugan fortfarande ibland sin närvaro och trycker på den för att försöka fly.
Trots dessa begränsningar kommer de omfattande data som erhålls från hel hjärnbildande under beteende och svar på stimuli att göra det möjligt att dechiffrera hjärnans funktion på nivån för hela nätverket när djuret interagerar med och navigerar komplexa, naturalistiska miljöer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Heidi Miller-Mommerskamp för teknisk hjälp och Iveth Melissa Guatibonza Arevalo för hjälpsamma kommentarer om manuskriptet. De första versionerna av protokollet utvecklades i Ralph Greenspans laboratorium. Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (DFG), särskilt genom ett bidrag FOR2705 (TP3) till IGK, och av Simons foundation (Aimon – 414701) och Kavli Institute for Brain and Mind (bidragsnummer #2017-954) som SA fick.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
| #55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
| 30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
| AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
| Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
| Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
| KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
| KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
| Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
| Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
| Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
| Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
| Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |
References
- Papanicolaou, A. C. The Oxford Handbook of Functional Brain Imaging in Neuropsychology and Cognitive Neurosciences. , Oxford University Press. (2017).
- Zong, W., et al. Fast high-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freely behaving mice. Nature Methods. 14, 713-719 (2017).
- Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements. Nature Neuroscience. 22, 1677-1686 (2019).
- Ahrens, M. B., Engert, F. Large-scale imaging in small brains. Current Opinion in Neurobiology. 32, 78-86 (2015).
- Sokolowski, M. B. Drosophila: Genetics meets behaviour. Nature Reviews Genetics. 2, 879-890 (2001).
- Venken, K. J. T., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 6, 167-178 (2005).
- Zheng, Z., et al. A Complete Electron Microscopy Volume of the Brain of Adult Drosophila melanogaster. Cell. 174, 730-743 (2018).
- Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. Journal of Neurogenetics. 34, 171-177 (2020).
- Fiala, A., et al. Genetically Expressed Cameleon in Drosophila melanogaster Is Used to Visualize Olfactory Information in Projection Neurons. Current Biology. 12, 1877-1884 (2002).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-Photon Calcium Imaging Reveals an Odor-Evoked Map of Activity in the Fly Brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
- Mann, K., Gallen, C. L., Clandinin, T. R. Whole-Brain Calcium Imaging Reveals an Intrinsic Functional Network in Drosophila. Current Biology. 27, 2389-2396 (2017).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca2+ rhythms in vivo. Science. 351, 976-981 (2016).
- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86, 1449-1460 (2015).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e1 (2012).
- Strutz, A., Völler, T., Riemensperger, T., Fiala, A., Sachse, S. Calcium imaging of neural activity in the olfactory system of Drosophila. Neuromethods. 72, 43-70 (2012).
- Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nature Methods. 7, 535-540 (2010).
- Fisher, Y. E., Lu, J., D'Alessandro, I., Wilson, R. I. Sensorimotor experience remaps visual input to a heading-direction network. Nature. 576, 121-125 (2019).
- Green, J., Vijayan, V., Mussells Pires, P., Adachi, A., Maimon, G. A neural heading estimate is compared with an internal goal to guide oriented navigation. Nature Neuroscience. 22, 1460-1468 (2019).
- Shiozaki, H. M., Ohta, K., Kazama, H. A Multi-regional Network Encoding Heading and Steering Maneuvers in Drosophila. Neuron. 106, 126-141 (2020).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9, 872 (2018).
- Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69, 498-508 (2011).
- Grover, D., Katsuki, T., Greenspan, R. J. Flyception: imaging brain activity in freely walking fruit flies. Nature Methods. 13, 569-572 (2016).
- Cohn, R., Morantte, I., Ruta, V. Coordinated and Compartmentalized Neuromodulation Shapes Sensory Processing in Drosophila. Cell. 163, 1742-1755 (2015).
- Fiala, A., Spall, T. In Vivo Calcium Imaging of Brain Activity in Drosophila by Transgenic Cameleon Expression. Science Signaling. 2003, (2003).
- Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium imaging of odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Bilz, F., Geurten, B. R. H., Hancock, C. E., Widmann, A., Fiala, A. Visualization of a Distributed Synaptic Memory Code in the Drosophila Brain. Neuron. 106, 963-976 (2020).
- Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. Sleep Facilitates Memory by Blocking Dopamine Neuron-Mediated Forgetting. Cell. 161, 1656-1667 (2015).
- Aimon, S., et al. Fast near-whole-brain imaging in adult Drosophila during responses to stimuli and behavior. PLOS Biology. 17, 2006732 (2019).
- Azevedo, A. W., et al. A size principle for recruitment of Drosophila leg motor neurons. Elife. 9, (2020).
- Haberkern, H., et al. Visually Guided Behavior and Optogenetically Induced Learning in Head-Fixed Flies Exploring a Virtual Landscape. Current Biology. 29, 1647-1659 (2019).
- Li, W., et al. SCAPE Microscopy for High Speed , 3D Whole-Brain Imaging in Drosophila Melanogaster. Biomed. Opt. Congr. 2016, 4-6 (2016).
- Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15, 1011-1019 (2018).
- Bando, Y., Grimm, C., Cornejo, V. H., Yuste, R. Genetic voltage indicators. BMC Biology. 17, 71 (2019).
- Plaçais, P. -Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 15510 (2017).
- Gándara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 19945 (2019).
- Andreoni, A., Davis, C. M. O., Tian, L. Measuring brain chemistry using genetically encoded fluorescent sensors. Current Opinion in Biomedical Engineering. 12, 59-67 (2019).
- Broxton, M., et al. Wave optics theory and 3-D deconvolution for the light field microscope. Optics Express. 21, 25418-25439 (2013).
