Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.
Abstract
A invasão de células cancerígenas do tumor primário para os tecidos saudáveis adjacentes é um passo inicial na metástase. As células cancerígenas invasivas representam um grande desafio clínico porque não existem métodos eficientes para sua eliminação uma vez que sua disseminação está em andamento. Uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a invasão de células cancerosas pode levar ao desenvolvimento de novas terapias potentes. Devido à sua semelhança fisiológica com tumores, os esferoides incorporados no colágeno tenho sido amplamente utilizado pelos pesquisadores para estudar os mecanismos que regem a invasão de células cancerígenas na matriz extracelular (ECM). No entanto, este ensaio é limitado por (1) falta de controle sobre a incorporação de esferoides no ECM; (2) alto custo de colágeno I e pratos de fundo de vidro, (3) rotulagem imunofluorescente não confiável, devido à penetração ineficiente de anticorpos e corantes fluorescentes e (4) processamento de imagem demorado e quantificação dos dados. Para enfrentar esses desafios, otimizamos o protocolo esferoide tridimensional (3D) para imagem fluorescente rotulada células cancerígenas embutidas no colágeno I, seja usando vídeos de lapso de tempo ou imagens longitudinais, e analisar a invasão de células cancerosas. Primeiro, descrevemos a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide (SID) para incorporar esferoides de forma confiável e em um volume mínimo de colágeno I, reduzindo o custo do ensaio. Em seguida, delineamos os passos para rotulagem robusta de fluorescência de esferoides vivos e fixos. Finalmente, oferecemos uma macro Fiji fácil de usar para processamento de imagens e quantificação de dados. Ao todo, essa metodologia simples fornece uma plataforma confiável e acessível para monitorar a invasão de células cancerígenas no colágeno I. Além disso, este protocolo pode ser facilmente modificado para atender às necessidades dos usuários.
Introduction
Durante a progressão do câncer, as células cancerígenas podem adquirir um fenótipo motile e invasivo, permitindo-lhes escapar da massa tumoral e invadir os tecidos circundantes1. Eventualmente, essas células cancerígenas invasivas podem alcançar e crescer dentro de órgãos secundários, um processo chamado metástase do câncer1. A metástase causa mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer2. Uma das razões para isso é que, embora os tumores localizados sejam clinicamente gerenciáveis, não existem métodos eficientes para a eliminação de células cancerígenas invasivas uma vez que a propagação metastática tenha ocorrido. Portanto, o surgimento de células cancerígenas invasivas e a transição de uma doença localizada para uma doença invasiva está representando um grande desafio clínico. Determinar como as células cancerígenas iniciam e sustentam um comportamento invasivo pode levar ao desenvolvimento de novas terapias potentes.
O modelo esferoide 3D é uma plataforma ideal para investigar o comportamento motil das células cancerosas sob condições controladas, mas fisiologicamente relevantes3. De fato, neste ensaio, esferoides de células cancerosas são incorporados dentro da matriz extracelular (ECM), por exemplo, colágeno I, que imita um tumor simplificado. Em seguida, a imagem é usada para visualizar a invasão de células cancerígenas do esferoide para a matriz de colágeno. No entanto, vários desafios limitam esse procedimento.
O primeiro desafio ocorre na etapa de incorporação, onde a matriz de colágeno líquido pode se espalhar pela superfície do prato, fazendo com que o esferoide toque na parte inferior do prato. Consequentemente, as células do esferoide se espalham na superfície bidimensional (2D), quebrando a morfologia esferoide tridimensional (3D). Aumentar o volume de colágeno é uma solução eficiente, mas cara. Para evitar que as células se espalhassem na superfície 2D, mantendo um volume mínimo de colágeno, desenvolvemos um dispositivo de imagem esferoide (SID) delimitando uma inserção de polidimtilsiloxano de 3 furos de espessura (PDMS) em uma placa de fundo de vidro.
O segundo desafio do ensaio esferoide é a rotulagem de células cancerígenas em esferoides, que é limitada pela má penetração de anticorpos e corantes fluorescentes, um efeito que aumenta com o tamanho esferoide. Embora a solução ideal para rotular células seja o estabelecimento de linhas celulares expressando de forma estável proteínas fluorescentes, essa opção é restrita principalmente a linhas celulares imortalizadas e é limitada pela disponibilidade de quimeras de proteína fluorescente. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a coloração de imunofluorescência de esferoides fixos, bem como o uso eficiente de um corante citoplasmado para rotular células imediatamente antes de incorporar o esferoide.
O terceiro desafio do ensaio esferoide é a falta de macros fiji simples para quantificação semi-automatizada da invasão celular ao longo do tempo. Para enfrentar esse desafio, descrevemos uma metodologia simples para analisar a área esferoide ao longo do tempo. Ilustramos as vantagens deste protocolo usando as linhas celulares 4T1 e 67NR como exemplos.
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Protocol
1. Fabricação de um Dispositivo de Imagem Esferoide (SID) para otimizar a incorporação de esferoides (Duração de 1 dia)
- Crie o espaçador usando uma impressora 3D (Figura 1A, B e Arquivo Suplementar 1).
- Pese uma proporção de 10:1 (wt/wt) de polímero base: crosslinker em um copo plástico [por exemplo, 20 g de polímero de base de etilbenzeno e 2 g de interlinker de resina de silicone para criar polidimethylsiloxano (PDMS)].
- Misture bem a solução PDMS no copo de plástico usando uma pipeta descartável.
- Coloque o copo de plástico em uma câmara de vácuo para remover as bolhas de ar da mistura. Solte rapidamente a pressão de vácuo para remover a pequena quantidade de ar presa na superfície da mistura e dissipar as bolhas de ar restantes.
- Incubar o espaçador impresso em 3D a 100 °C por 5 minutos para aumentar sua flexibilidade.
- Limpe as duas placas de vidro que serão usadas para construir o molde PDMS completamente, limpando-as com isopropanol 100%. Se as placas de vidro foram usadas anteriormente para lançar PDMS, certifique-se de remover qualquer PDMS velho restante raspando suavemente as placas de vidro com uma lâmina de barbear e limpando-as com isopropanol 100%.
- Construa o molde colocando o espaçador impresso em 3D no meio das duas placas de vidro limpas.
- Sele o molde usando grandes clipes de aglutinante nas bordas externas das placas de vidro. Coloque dois clipes de aglutinante na borda inferior e um no canto superior.
- Inspecione a parte superior do molde para garantir que o espaçador esteja alinhado com as placas de vidro. Isso garante que não haverá deformações e que uma folha uniforme de PDMS será criada.
NOTA: Se a folha resultante não for de espessura uniforme, os clipes precisam ser ajustados ligeiramente. - Corte a ponta de uma pipeta descartável (~2 cm da ponta) e adicione a mistura de PDMS a uma velocidade lenta e constante ao canto superior esquerdo do molde. Despeje a mistura lentamente para evitar a criação de grandes bolsões de ar.
- Coloque o molde em uma câmara de vácuo para remover bolhas de ar que se formaram durante o derramamento.
- Cure o PDMS incubando o molde a 100 °C por 1 h.
- Recupere o molde da incubadora e deixe esfriar para tocar.
- Remova os clipes de aglutinante e as placas de vidro do espaçador contendo o PDMS curado.
- Use uma lâmina de barbear para cortar o selo que foi criado em todos os quatro lados do molde entre o espaçador e a placa de vidro. Com todos os quatro lados cortados, comece a separar o molde para revelar a folha PDMS no espaçador.
- Retire cuidadosamente a nova folha PDMS do espaçador usando pinças.
- Em um tapete de corte, solte discos PDMS de 17,5 mm de diâmetro da folha e, em seguida, soque três furos distribuídos uniformemente de 5,5 mm de diâmetro, usando socos de biópsia de tamanho diferente. Aqui esses discos PDMS de 3 furos são chamados de "inserções"(Figura 1C).
NOTA: Cortes não uniformes feitos no PDMS, ou uma ligação defeituosa via tratamento plasmápico, podem resultar em vazamentos futuros. - Limpe cada inserção removendo suavemente quaisquer partículas de poeira usando fita adesiva.
- Coloque as pastilhas em um pedaço de fita dupla face e enrole a fita ao redor da tampa de uma placa de Petri de 10 cm.
- Coloque a tampa da placa de Petri na máquina de plasma, juntamente com os pratos abertos de fundo de vidro de 35 mm.
- Ative a superfície das pastilhas e do vidro através do tratamento plasmá-plasmá-lo por 1 min a 300 mTorr. Uma varinha de plasma portátil pode ser usada.
- Utilizando pinças, conecte rapidamente o lado positivo, ou seja, tratado, de uma inserção(Figura 1D) à parte de vidro de um prato de fundo de vidro(Figura 1E). Repita para todos os pratos.
- Use o dedo indicador e o polegar para aplicar uma pressão uniforme enquanto gira o prato de fundo de vidro. Isso garantirá a fixação estável da inserção na placa de fundo de vidro.
- Incubar os SIDs (Figura 1F) a 60 °C por 20 minutos para fortalecer a adesão entre vidro e PDMS.
- Realize uma segunda rodada de tratamento plasmático nos SIDs, usando as mesmas configurações da etapa 1.21 ou com a varinha portátil. Isso fará com que a superfície PDMS livre adere à poli-L-lysina na solução de revestimento (ver 1,26).
- Prepare-se recentemente as seguintes soluções.
- Solução de revestimento: 1x PBS contendo 0,01% (vol/vol) poli-L-Lysine [por exemplo, adicionar 10 μL de 0,1% (vol/vol) poli-L-Lysine a 90 μL de 1x PBS].
- Solução de crosslinking: Água destilada contendo 1x (vol/vol) glutaraldeído [por exemplo, adicionar 10 μL de glutaraldeído de 10x a 90 μL de água destilada].
- Solução de armazenamento: 1x PBS contendo penicilina-estreptomicina 10x (vol/vol) Penicilina-Streptomycina [por exemplo, adicionar 1 mL de Penicillin-Streptomicina a 9 mL de 1x PBS].
- Adicione 35 μL de solução de revestimento por cada orifício e incubar por 1h à temperatura ambiente.
- Aspire a poli-L-Lysine e enxágue todo o SID 3 vezes com água destilada.
- Adicione 35 μL de solução de crosslinking por cada orifício incubado por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Aspire a solução de crosslinking e enxágue todo o SID 3 vezes com água destilada.
- Adicione 70% de etanol em cada SID e coloque sob luz ultravioleta (UV) por 30 minutos.
- Sob o capô, aspire o etanol e enxágue o SID 3 vezes com água destilada.
- Adicione 2,5 mL de solução de armazenamento por cada SID.
NOTA: Nesta fase, os SIDs podem ser armazenados a 4 °C durante uma semana. Observou-se que a força de ligação entre PDMS e vidro diminui ao longo do tempo. Além de uma semana, recomenda-se que os usuários testem os SIDs para possíveis vazamentos antes do uso. Para isso, aspire a solução de armazenamento e adicione 35 μL de 1x PBS em cada orifício. Após o uso, as pastilhas PDMS podem ser descascadas dos pratos de fundo de vidro. Para obter uma limpeza ideal dos pratos de fundo de vidro, várias lavagens com isopropanol e ácido clorídrico devem ser usadas para remover resíduos de PDMS.
2. Formação esferoide e incorporação em colágeno (Duração de 4 dias)
NOTA: Para imagens ao vivo de esferoides, longitudinalmente ou em vídeos de lapso de tempo, use uma linha celular expressando uma proteína citoplasmática e/ou fluorescente nuclear. Se essa linha de célula estiver disponível, siga as etapas descritas nesta seção. Alternativamente, na seção 3, propõe-se um protocolo para rotular células cancerígenas em esferoides usando um corante citoplasmado.
- Formar esferoides de células 4T1 e/ou 67NR utilizando a técnica de queda suspensa, como descrito anteriormente4,5,6,7, com 3.000 células/40 gotículas μL e um tempo de incubação de 3 dias. Adicione o atelocollagen bovino que eu solução por último e manter todas as soluções no gelo, em todos os momentos.
- Identifique os esferoides corretamente formados usando um microscópio de campo brilhante.
- Encha um tubo cônico de 15 mL com 8 mL de meio completo pré-aquecido.
- Colete esferoides com uma pipeta P1000 e transfira para o tubo cônico de 15 mL. Molhe a ponta da pipeta, colocando algum meio completo dentro e fora para evitar que os esferoides grudem nas paredes internas da ponta da pipeta e limitem a perda de esferoides.
- Deixe que os esferoides afundem no fundo do tubo e lave cuidadosamente os esferoides trocando o meio. Repita duas vezes.
- Prepare uma solução de colágeno de 5 mg/mL I de acordo com as recomendações do fabricante (procedimento de gelação alternativa, veja cálculo exemplar abaixo). Substitua a água destilada por meio completo. Ao calcular o volume de meio a ser utilizado, leve-se em conta que os esferoides serão adicionados em 20 μL de meio completo [por exemplo, para um SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL de 5 mg/mL de colágeno I é necessário (prepare 20 % extra para explicar a perda de tubulação ao manusear fluidos viscosos); 22 μL de médio completo + 10,8 μL de 10x PBS + 1,2 μL de 1 M NaOH + 54 μL de 10 mg/mL de colágeno I].
- Colete todos os esferoides em 20 μL de médio, utilizando uma pipeta P200, e adicione-os à solução de colágeno I preparada na etapa 2.6.
- Misture lentamente a solução ao subir e descer para evitar a heterogeneidade na concentração de colágeno I, limitando a formação de bolhas. Mantenha a solução no gelo.
- Remova a solução de armazenamento dos SID(s) e lave 3 vezes com 3 mL de PBS 1x. Após a lavagem final, deixe os SID(s) secos para não diluir a solução de colágeno I.
- Inicie um temporizador e dispense 30 μL da solução de colágeno I contendo um esferoide em um dos três orifícios do SID. Certifique-se visualmente de que um único esferoide esteja contido no 30 μL.
- Repita o passo 2.10 mais duas vezes para preencher todos os 3 orifícios de um SID.
- Use uma ponta de pipeta de 10 μL para centralizar o esferoide se ele estiver localizado perto da fronteira PDMS. Se dois ou três esferoides acabarem dispensados em um dos orifícios, a mesma ponta de pipeta pode ser usada para separar os esferoides um do outro. Pare o temporizador.
NOTA: Invertendo frequentemente o SID de cabeça para baixo e de cabeça para cima, durante todo o período da polimerização e solidificação do colágeno I, garante que o esferoide esteja posicionado no centro vertical da camada ECM, e previne a invasão de células em 2D. A frequência de inverter (inversão) deve ser maximizada. Como a frequência de inversão é controlada pelo "tempo de dispensação" esferoide medido em 2.10-2.12, o tempo de dispensação deve ser minimizado. Em nosso laboratório, o tempo de distribuição é de 2 minutos em média. - Para centralizar verticalmente o esferoide na camada de colágeno, vire o SID de cabeça para baixo e incubar a 37 °C para tempo de distribuição.
- Vire o SID de cabeça para cima e incubar a 37 °C para o tempo de distribuição.
NOTA: O tempo que os esferoides passam na orientação de cabeça para baixo deve ser igual ao tempo gasto na orientação de cabeça para cima. - Repita as etapas 2.13 e 2.14 por 30 minutos, até que o colágeno I polimerize.
- Adicione 2,5 mL de meio/SID completo e, se necessário, adquira uma imagem dos esferoides para o ponto de tempo inicial.
- Repetir as etapas 2.10-2.16 se vários SIDs forem usados.
3. Rotulagem de fluorescência de esferoides
- Imagem ao vivo (Duração de 6-7 dias)
NOTA: Se uma linha celular expressando uma proteína citoplasmática e/ou fluorescente nuclear estiver disponível, siga os passos descritos na seção 2. Alternativamente, para rotulagem citoplasmática, propõe-se o seguinte protocolo.- Siga os passos 2.1-2.5 do protocolo descrito na seção 2.
- Diluir o corante citoplasmámico para 25 μM em 200 μL de meio livre de soro.
NOTA: Enquanto um corante citoplasmônico vermelho é usado neste experimento, qualquer outra cor disponível deve ser adequada. As células cancerígenas foram rotuladas dentro de esferoides usando corantes nucleares diluídos a 20 μM em 200 μL de meio livre de soro (ver Tabela de Materiais). - Após a lavagem final, resuspende esferoides na solução citoplasmática ou de corante nuclear e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos, protegidos da luz.
NOTA: Com esta abordagem, a rotulagem das células no centro esferoide não será eficiente. Para conseguir a rotulagem de todas as células, a incubação pode ser estendida durante a noite, colocando o prato em um roqueiro. Alternativas são descritas em Discussão. - Lave esferoides 3 vezes em meio completo.
- Prossiga para as etapas 2.6-2.17 do protocolo descrito na seção 2.
- Imagens eferóides via imagem de lapso de tempo a cada 10 minutos por 24-72 h(Figura 2), ou via imagem longitudinal, diariamente, por até 7 dias(Figura 3). Use um microscópio confocal de varredura a laser, objetivo de ar 10x (0,4 abertura numérica e 3,1 mm de distância de trabalho), 1024 x 1024 pixels, tempo de exposição 8 μs/pixel, pinhole 90 μm, 6 x 15 μm z-steps e 3 campos de visualização cada contendo um spheroid.
NOTA: Para imagens de lapso de tempo, use potência laser mínima e equipe o microscópio com uma câmara ambiental com temperatura, umidade e controle de gás. Cultue os esferoides incorporados a 37 °C para > 8 h ou durante a noite antes da imagem para minimizar o tempo no microscópio.
- Coloração de imunofluorescência de esferoides (Duração 2 dias)
NOTA: O procedimento descrito aqui é adaptado e otimizado a partir dos protocolos publicados anteriormente8,9. Este método pode ser usado após o protocolo delineado nas seções 2 e 3.1.- Prepare-se recentemente as seguintes soluções.
- Solução de fixação: 1x PBS contendo 4% PFA (vol/vol) [por exemplo, adicionar 5 mL de 16% (vol/vol) PFA a 15 mL de 1x PBS].
- Solução de fixação e permeabilização: 1x PBS contendo 4% PFA (vol/vol) e 0,5% Triton X-100 (vol/vol) [por exemplo, adicionar 50 μL de Triton X-100 a 10 mL de solução de fixação].
- Solução de bloqueio: 1x PBS contendo 1% de FBS (vol/vol) e 1% BSA (wt/vol) [por exemplo, dissolver 100 mg de BSA em 10 mL de 1x PBS, depois adicionar 100 μL de FBS].
- Solução de lavagem: 1x PBS contendo 0,05% Interpol 20 (vol/vol) [por exemplo, adicionar 25 μL de Tween 20 a 50 mL de 1x PBS].
- Remova o meio de cultura dos SID(s) e lave uma vez com 1x pbs quente.
- Adicione 2 mL de solução de fixação e permeabilização por SID e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
- Remova a solução de fixação e permeabilização e adicione 2 mL de solução por SID e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
- Lave 3 vezes com a solução de lavagem.
- Adicione 2 mL de solução de bloqueio por SID e incubar a 4 °C por 24 h com leve agitação.
NOTA: Nesta etapa, as amostras podem ser incubadas a 4 °C, durante o fim de semana. Observe que um tempo de bloqueio mais longo pode interferir no procedimento de rotulagem da imunofluorescência. - Diluir anticorpos primários na solução de bloqueio.
- Adicione 150 μL de solução de bloqueio com anticorpos primários/bem em uma placa de 48 poços.
- Usando pinças finas, desprende cuidadosamente o plugue de colágeno I contendo um esferoide e transfira para um poço. Repita se vários esferoides forem rotulados. Limpe qualquer líquido que possa permanecer na pinça ao trabalhar com diferentes anticorpos, para evitar contaminação.
- Incubar durante a noite a 4 °C com leve agitação.
- Adicione 300 μL de solução de lavagem a poços vazios e cheios.
- Transfira cuidadosamente o plugue de colágeno que eu contenha um esferoide em um poço de "lavagem".
- Lave 3 vezes com solução de lavagem por 2h, em temperatura ambiente e com leve agitação.
NOTA: Transferir os plugues de colágeno I contendo um esferoide, em vez de aspirar as soluções, pode ajudar a reduzir a perda de amostras e danos à amostra. - Diluir anticorpos secundários, 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) e/ou falooidina na solução de bloqueio.
- Adicione 150 μL de solução de bloqueio com anticorpos secundários, DAPI e/ou faloideina por poço.
- Usando pinças, transfira cuidadosamente o plugue de colágeno contendo os esferoides para o poço. Repita se vários esferoides forem rotulados.
- Incubar em temperatura ambiente por 1h com leve agitação.
- Repetir as etapas 3.2.11 e 3.2.12.
- Lave 3 vezes com solução de lavagem por 30 minutos, em temperatura ambiente com leve agitação.
- Usando uma lâmina de barbear, corte uma inserção PDMS de 3 orifícios em três partes para que cada peça contenha um orifício.
- Coloque dois pedaços de PDMS em um slide de microscópio.
- Adicione uma gota de solução de montagem usando uma ponta P200 com a extremidade cortada. Evite a formação de bolhas.
- Transfira cuidadosamente um colágeno que eu conecto em cada orifício.
NOTA: Se o esferoide estiver posicionado na parte superior do plugue de colágeno, inverta o plugue de colágeno para que o esferoide acabe mais perto da tampa de vidro. - Coloque uma mancha de cobertura em cima e vedar usando fita adesiva.
- Deixe a amostra secar à temperatura ambiente por 10 minutos, protegida da luz.
- Armazene amostras a 4 °C, protegidas da luz até a imagem.
- Prepare-se recentemente as seguintes soluções.
4. Processamento de imagem para analisar a invasão do câncer ao longo do tempo
NOTA: O formato necessário para esta macro é uma imagem de um único canal x,y,t salva como um arquivo .tiff.
- Se várias fatias z forem adquiridas(ou seja, x,y,z,t imagem), abra a imagem em Fiji e selecione Imagem | Pilhas | Projeto Z. Recomenda-se usar a opção Intensidade Máxima. Alternativamente, uma única fatia z pode ser usada para executar a macro. Salve a imagem como um arquivo .tiff.
- Crie uma pasta separada de "Processamento" na área de trabalho.
- Selecione | de arquivos Salve como | Sequência de imagem. Use o formato TIFF, atualize o número de dígitos de acordo com o número de quadros, marque a caixa para usar a etiqueta da fatia como nome do arquivo e selecione Ok. Selecione a pasta "Processamento" criada na etapa 2.
- Abra uma imagem da pasta "Processamento". Deve ser uma imagem x,y, correspondente a um único ponto de tempo.
- Selecione | de imagem Ajuste | Limiar automático. No menu suspenso selecione o método Experimente tudo e verifique se há objetos brancos na caixa em fundo preto.
- Uma imagem de montagem aparece mostrando o resultado de cada método de limiar automatizado.
- Identifique o melhor método de limiar automatizado, por exemplo RenyIEntropy.
- Para confirmar a escolha do método de limiar automatizado, abra qualquer outra imagem da pasta "Processamento" e teste o método de limiar escolhido usando o Image | Ajuste | Limiar automático.
- Feche todas as imagens.
- Baixe a macro SpheroidAreaTime (Arquivo Suplementar 2).
- Abra a macro Fiji por arrastar e soltar.
- Na linha 58, atualize o método de limiar automatizado conforme necessário.
- Na linha 62, atualize a faixa de tamanho de acordo com as dimensões celulares.
- Selecione Executar.
- Selecione a pasta "Processamento" e digite "Processamento" como pasta Pai e selecione Ok.
- Uma vez que a corrida acabou, salve a tabela "Resumo". A primeira coluna indica o nome da imagem; a terceira coluna indica a área esferoide; a sexta, sétima e oito colunas especificam os parâmetros para uma elipse instalada no esferoide.
- A pasta "Processamento" agora contém uma imagem processada para cada ponto de tempo, com a extensão _SpheroidArea.
NOTA: Se o centro esferoide estiver escuro, preencha-o com branco usando as ferramentas de seleção, para todos os pontos de tempo, e, em seguida, prossiga para o passo 3. Da mesma forma, o espaço ao redor do esferoide pode ser preenchido com preto para "limpar" a imagem. Se a imagem estiver limpa, comente a linha 61 para acelerar a corrida.
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Representative Results
Devido à sua biocompatibilidade, o PDMS é amplamente utilizado para microfabificação de poços, selos e moldes de confinamento, o que revolucionou os dispositivos micropatterning e microfluidos. No método descrito aqui, é usado para criar SIDs, poços personalizáveis que otimizam o procedimento de incorporação e imagem de spheroid. A Figura 1 ilustra os principais componentes utilizados na fabricação dos SIDs. Para lançar o molde PDMS, um espaçador de 1 mm de espessura é impresso em 3D(Figura 1A,B),colocado entre as duas placas de vidro, selado com clipes grandes. Derramar e assar PDMS no espaço entre as placas forma uma folha de 1 mm de espessura de PDMS. O esquema SID (Figura 1C) indica as dimensões do dispositivo ideal, porém uma pequena variação ocorre nas distâncias do orifício, devido ao perfuração manual de furos usando socos de biópsia(Figura 1D). Figura 1D,F indica cortes circulares limpos com orifícios espaçados uniformemente dentro da inserção PDMS.
O uso dos SIDs facilita a incorporação eficiente e, portanto, o registro da invasão de células cancerígenas dentro do colágeno I usando o lapso de tempo(Figura 2, Vídeo 1) ou imagens longitudinais(Figura 3). Apesar de usar as mesmas frequências de inversão para todos os SIDs durante a polimerização do colágeno I, as posições esferoides dentro do plugue de colágeno variam ligeiramente. Por isso, é importante utilizar um objetivo com uma longa distância de trabalho (>1 mm). Caso contrário, o foco e a imagem podem ser difíceis para os esferoides posicionados perto da parte superior do plugue de colágeno. Em contraste, os esferoides posicionados perto da parte inferior do plugue de colágeno, terão células que se movem para a superfície de vidro e migram para o vidro, em vez de invadir a matriz do colágeno I. Vídeos de tais esferoides precisam ser descartados. A espessura do plugue de colágeno, aqui aproximadamente 800 μm, é controlada pelo volume dispensado em cada orifício do SID e ajustado a distâncias de invasão que os spheroids exibem neste protocolo. A espessura do plugue de colágeno pode ser reduzida dispensando um volume menor de colágeno I em cada orifício do SID, ao usar esferoides menores ou menos invasivos.
Para uma análise adequada da invasão usando a macro fiji, é fundamental que as células cancerígenas sejam devidamente rotuladas ao longo da sessão de imagem. Como observado na etapa 4.17., a etapa de processamento de imagem permite a correção de imagem se a rotulagem for sub-ideal. Enquanto ilustramos imagens longitudinais ao longo de 6 dias(Figura 3), que requer a expressão estável de proteína citoplasmática e/ou fluorescente nuclear, imagens longitudinais semelhantes poderiam ser realizadas em um tempo menor usando rotulagem com corantes.
Após a imagem ao vivo, apresentamos alguns resultados do procedimento de imunolabeling para a cadherina epitelial (E-cadherin), cortactina e F-actin(Figura 4). Nestes exemplos, utilizamos as linhas celulares 4T1 e 67NR. A Figura 5 mostra a ilustração passo a passo do procedimento de processamento de imagem usando a macro Fiji para medir a área do esferoide ao longo do tempo.
Figura 1: Fabricação dos SIDs. (A) Representação esquemática de visão superior do espaçador. (B) Espaçador impresso em 3D. (C) Representação esquemática de vista superior do SID. Um PDMS de 3 furos(D)está ligado a um prato de fundo de vidro(E),criando o SID final(F). As dimensões estão em milímetros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem ao vivo de esferoides. Representante 20h e 40h de pontos de tempo do Vídeo 1, projeção máxima de um esferoide 4T1. As células 4T1 foram rotuladas usando um corante citoplasmado. Barra de escala, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem longitudinal de esferoides. Micrografos representativos (projeção máxima) de um esferoide 4T1/67NR misto, retratado diariamente. As células 4T1 e 67NR expressam a proteína citoplasmática mScarlet e fluorescente verde (GFP), respectivamente. Barra de escala, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens de imunofluorescência de esferoides. Foram rotulados micrografos representativos (projeção máxima) de um esferoide 4T1 fixados 2 dias após a incorporação em colágeno I. E-cadherin (ciano, A), cortactina (amarelo, B) e F-actin (magenta, A e B). Barra de escala, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise de processamento de imagem. Ilustração passo a passo do procedimento de processamento de imagem utilizando a macro Fiji (A) para medir a área do esferoide ao longo do tempo(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Vídeo representativo de um esferoide 4T1 imagens a cada 10 minutos por 46 h e 10 min. 4T1 células foram rotuladas usando um corante citoplasmético. Barra de escala, 100 μm. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Arquivo suplementar 1: modelo 3D do espaçador (arquivo STL). Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 2: SpheroidAreaTime macro. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O espaçador impresso 3D foi projetado para criar folhas de 1 mm de espessura de PDMS que podem então ser usadas para criar facilmente várias formas de PDMS, conforme exigido pelas aplicações experimentais. Devido à simplicidade de sua fabricação e à liberdade de alterar o design, este método de fundição PDMS foi escolhido para o design inicial do SID. Se for necessário um alto volume de SIDs, a produção pode ser mais eficiente criando um molde impresso em 3D, que já contém discos PDMS com três orifícios igualmente espaçados e reduzindo o processo a uma etapa. Isso eliminaria a necessidade de perfurar cada disco, juntamente com os três orifícios subsequentes, e diminuiria o tempo total de preparação.
Enquanto o soco de 3 buracos é desenvolvido para uso com pratos de fundo de vidro de 35 mm, outros tamanhos estão disponíveis que permitem mais furos e, portanto, mais esferoides a serem imagens em paralelo. Além disso, o vidro de cobertura de tamanho personalizado também está disponível comercialmente, o que, em combinação com suportes impressos em 3D, pode permitir ensaios esferoides de alto rendimento. Com essa abordagem, fator limitante é a velocidade de aquisição de dados, por exemplo, em nossa imagem confocal de lapso de tempo multicolorido, adquirir pilha 3D de um único esferoide requer aproximadamente 2,5 minutos. Portanto, a aquisição de pilhas 3D para 3 esferoides no SID requer aproximadamente 8 minutos. Como resultado, para manter nossa frequência preferida de imagem a 10 minutos por pilha, não podemos aumentar o número de buracos nos SIDs.
Para registrar e quantificar a invasão de células cancerígenas vivas no modelo esferoide 3D, pode-se usar imagens de campo brilhante5. No entanto, a microscopia de fluorescência é a preferida, pois proporciona maior contraste, facilidade e precisão no processamento de imagens. Se a geração de uma linha celular expressando uma proteína citoplasmática e/ou fluorescente nuclear não for possível, propomos o uso dos corantes citoplasmicos. Como o tempo de retenção dos corantes citoplasmados dentro das células é de três dias em nossas condições de imagem, as células devem ser rotuladas após o período de 3 dias em queda suspensa, e imediatamente antes da incorporação. A rotulagem de células pós-incorporação pode rotular não especificamente o colágeno e reduzir a rotulagem celular. A imagem por mais de 3 dias após a incorporação requer o uso de um protocolo de semeadura esferoide diferente10 ou linhas celulares expressando com estomica fluorescente.
Formamos com sucesso e imagem de esferoides contendo entre 60 e 5.000 células/queda. Pequenos esferoides são ideais para registrar a invasão ao longo de vários dias, já que toda a sua área de invasão pode facilmente se encaixar em um único campo de visão de objetivos de ampliação mais alta (20x-30x). Além disso, eles podem ser facilmente rotulados com corantes citoplasmados ou nucleares. Finalmente, devido à dispersão reduzida, cada célula no esferoide pode ser visualizada e segmentada. No entanto, pequenos esferoides são pouco visíveis a olhos nus e podem exigir rotulagem adicional com marcadores de tecido. Em contraste, esferoides maiores são mais fáceis de manusear, mas mais suscetíveis a afundar até o fundo do prato, devido ao seu peso. Além disso, as células do centro esferoide nem sempre são rotuladas quando usam corantes, ou visíveis usando microscopia confocal, que tem profundidade de penetração de aproximadamente 100 micrômetros. Para visualizar todas as células cancerígenas em todos os grandes esferoides usando imagens de lapso de tempo, a microscopia multifotônica pode ser usada, oferecendo uma vantagem extra da visualização das fibras de colágeno por segunda geração harmônica (SHG) sem a necessidade de rotulagem. Além disso, a imagem pode ser feita com microscopia de folha de luz8,11,12, proporcionando tempo reduzido de aquisição de imagens e, portanto, permitindo ensaios esferoides de alto rendimento, mas também exigindo mais armazenamento de dados e processamento avançado de imagens. Se não forem necessários vídeos de lapso de tempo, nosso procedimento de rotulagem para esferoides 3D fixos pode ser ainda mais combinado com compensação óptica8,10. Além disso, a crioseção dos esferoides incorporados pode eliminar problemas com penetração de corante ou anticorpo durante a rotulagem, bem como penetração de luz durante a imagem. Em nossas mãos, no entanto, o criosectioning bem sucedido limitava-se aos estágios iniciais de invasão e células não invasivas, devido aos desafios técnicos na preservação de fios longos e frágeis invasivos.
Nosso protocolo também é compatível com o uso de corantes nucleares, para rotular células cancerígenas dentro dos esferoides, permitindo o rastreamento de células únicas de dados de lapso de tempo. O plugin Desarmete De FijiTrackMate 13 pode ser usado para automatizar o rastreamento de células e extrair parâmetros de motilidade de células únicas, como velocidade, velocidade instantânea e persistência.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros da Temple Bioengineering por discussões valiosas. Agradecemos a David Ambrose no núcleo de citometria de fluxo (Lewis Katz School of Medicine) por sua ajuda com a triagem celular e Tony Boehm do IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) por ajuda com a impressão 3D. Agradecemos também aos nossos recursos de financiamento: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 e R01 CA230777, todos para a BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
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