Tid-løst fluorescens imaging og analyse av kreft celle invasjon i 3D sfæroid modell
Summary
Presentert her er en protokoll for fabrikasjon av en sfæroid bildeenhet. Denne enheten muliggjør dynamisk eller langsgående fluorescensavbildning av kreftcellesfæroider. Protokollen tilbyr også en enkel bildebehandlingsprosedyre for analyse av kreftcelleinvasjon.
Abstract
Invasjonen av kreftceller fra den primære svulsten inn i det tilstøtende sunne vevet er et tidlig skritt i metastase. Invasive kreftceller utgjør en stor klinisk utfordring fordi det ikke finnes noen effektiv metode for eliminering når spredningen er i gang. En bedre forståelse av mekanismene som regulerer kreftcelleinvasjon kan føre til utvikling av nye potente terapier. På grunn av deres fysiologiske likhet med svulster, sfæroider innebygd i kollagen har jeg blitt mye brukt av forskere for å studere mekanismene som styrer kreftcelleinvasjon i den ekstracellulære matrisen (ECM). Denne analysen er imidlertid begrenset av (1) mangel på kontroll over innebygging av sfæroider i ECM; (2) høye kostnader for kollagen I og glass bunnretter, (3) upålitelig immunofluorescent merking, på grunn av ineffektiv penetrasjon av antistoffer og fluorescerende fargestoffer og (4) tidkrevende bildebehandling og kvantifisering av dataene. For å løse disse utfordringene optimaliserte vi den tredimensjonale (3D) sfæroidprotokollen til bilde fluorescerende merkede kreftceller innebygd i kollagen I, enten ved hjelp av time-lapse videoer eller langsgående bildebehandling, og analysere kreftcelleinvasjon. Først beskriver vi fabrikasjonen av en sfæroid bildeenhet (SID) for å bygge inn sfæroider pålitelig og i et minimalt kollagen I-volum, noe som reduserer analysekostnaden. Deretter avgrenser vi trinnene for robust fluorescensmerking av levende og faste sfæroider. Til slutt tilbyr vi en brukervennlig Fiji-makro for bildebehandling og datakvantifisering. Til sammen gir denne enkle metodikken en pålitelig og rimelig plattform for å overvåke kreftcelleinvasjon i kollagen I. Videre kan denne protokollen enkelt endres for å passe brukernes behov.
Introduction
Under kreftprogresjon kan kreftceller skaffe seg en motil og invasiv fenotype, slik at de kan unnslippe tumormassen og invadere inn i det omkringliggendevevet 1. Til slutt kan disse invasive kreftcellene nå og vokse inne i sekundære organer, en prosess som kalles kreftmetastase1. Metastase forårsaker mer enn 90% av kreftrelaterte dødsfall2. En grunn til dette er at mens lokaliserte svulster er klinisk håndterbare, finnes det ingen effektive metoder for eliminering av invasive kreftceller når metastatisk spredning har oppstått. Derfor utgjør fremveksten av invasive kreftceller og overgangen fra en lokalisert til en invasiv sykdom en stor klinisk utfordring. Å bestemme hvordan kreftceller initierer og opprettholder en invasiv atferd kan føre til utvikling av nye potente terapier.
3D-sfæroidmodellen er en ideell plattform for å undersøke motile oppførsel av kreftceller under kontrollerte, men fysiologisk relevante forhold3. Faktisk, i denne analysen, er sfæroider av kreftceller innebygd i ekstracellulær matrise (ECM), for eksempel kollagen I, som etterligner en forenklet svulst. Deretter brukes avbildning til å visualisere invasjonen av kreftceller fra sfæroiden til kollagenmatrisen. Flere utfordringer begrenser imidlertid denne prosedyren.
Den første utfordringen oppstår ved innebyggingstrinnet, hvor den flytende kollagenmatrisen kan spre seg over paraboloverflaten, noe som får sfæroiden til å berøre bunnen av parabolen. Følgelig spredte celler fra sfæroid på den todimensjonale (2D) overflaten, og brøt den tredimensjonale (3D) sfæroidmorfologien. Å øke volumet av kollagen er en effektiv, men kostbar løsning. For å hindre at celler sprer seg på 2D-overflaten, samtidig som vi opprettholder et minimalt volum kollagen, utviklet vi en spheroid bildeenhet (SID) ved å avgrense en 1 mm tykk, 3-hulls polydimetylsiloxane (PDMS) innsats på en glassbunnsrett.
Den andre utfordringen med sfæroidanalysen er merking av kreftceller i sfæroider, som er begrenset av dårlig penetrasjon av antistoffer og fluorescerende fargestoffer, en effekt som øker med sfæroidstørrelse. Mens den ideelle løsningen for merking av celler er etableringen av cellelinjer stabilt uttrykker fluorescerende protein(er), er dette alternativet for det meste begrenset til udødeliggjorte cellelinjer og er begrenset av tilgjengeligheten av fluorescerende protein chimeras. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for immunofluorescence farging av faste sfæroider, samt effektiv bruk av et cytoplasmatisk fargestoff for å merke celler umiddelbart før du bygger inn sfæroid.
Den tredje utfordringen med spheroid analysen er mangelen på enkle Fiji-makroer for halvautomatisk kvantifisering av celleinvasjon over tid. For å løse denne utfordringen beskriver vi en enkel metodikk for å analysere spheroidområdet over tid. Vi illustrerer fordelene med denne protokollen ved hjelp av 4T1- og 67NR-cellelinjene som eksempler.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D-utskrevne avstandssnitt ble designet for å lage 1 mm tykke ark med PDMS som deretter enkelt kan brukes til å lage ulike former for PDMS, som kreves av eksperimentelle applikasjoner. På grunn av enkelheten i fabrikasjonen og friheten til å endre designen, ble denne metoden for PDMS-støping valgt for den første utformingen av SID. Hvis det kreves høyt volum av SIDer, kan produksjonen gjøres mer effektiv ved å opprette en 3D-trykt form, som allerede inneholder PDMS-disker med tre like avstandshull, og redusere p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke medlemmer av Temple Bioengineering for verdifulle diskusjoner. Vi takker David Ambrose ved flytcytometrikjernen (Lewis Katz School of Medicine) for hans hjelp med cellesortering og Tony Boehm fra IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) for hjelp med 3D-utskriften. Vi takker også våre finansieringsressurser: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 og R01 CA230777, alt til BG.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. . SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V., Dmitriev, R. I. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
