Time-Resolved Флуоресценция Изображения и анализ вторжения раковых клеток в 3D-модель сфероидов
Summary
Здесь представлен протокол по изготовлению сфероидного устройства визуализации. Это устройство позволяет динамические или продольные флуоресценции изображения сфероидов раковых клеток. Протокол также предлагает простую процедуру обработки изображений для анализа вторжения раковых клеток.
Abstract
Вторжение раковых клеток из первичной опухоли в соседние здоровые ткани является ранним шагом в метастазах. Инвазивные раковые клетки представляют собой серьезную клиническую проблему, поскольку после их распространения не существует эффективного метода их ликвидации. Лучшее понимание механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток может привести к разработке новых мощных методов лечения. Из-за их физиологического сходства с опухолями, сфероиды, встроенные в коллаген, я был широко использован исследователями для изучения механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток во внеклеточную матрицу (ECM). Однако этот анализ ограничен (1) отсутствием контроля над встраиванием сфероидов в ЭКМ; (2) высокая стоимость коллагена I и стеклянных нижних блюд, (3) ненадежная иммунофлуоресцентная маркировка, из-за неэффективного проникновения антител и флуоресцентных красителей и (4) трудоемкой обработки изображений и количественной оценки данных. Для решения этих проблем мы оптимизировали трехмерный (3D) сфероидный протокол для изображения флуоресцентно помеченных раковых клеток, встроенных в коллаген I, либо используя покадровые видео или продольную визуализацию, и анализируем вторжение раковых клеток. Во-первых, мы описываем изготовление сфероидного устройства визуализации (SID) для надежного встраивания сфероидов в минимальный объем коллагена I, снижая стоимость анализа. Далее мы разграничим шаги для надежной маркировки флуоресценции живых и фиксированных сфероидов. Наконец, мы предлагаем простой в использовании макрос Фиджи для обработки изображений и количественной оценки данных. В целом, эта простая методология обеспечивает надежную и доступную платформу для мониторинга вторжения раковых клеток в коллаген I. Кроме того, этот протокол можно легко модифицировать в соответствии с потребностями пользователей.
Introduction
Во время прогрессирования рака, раковые клетки могут приобрести пестрый и инвазивный фенотип, что позволяет им избежать опухолевой массы и вторгнуться в окружающиеткани 1. В конце концов, эти инвазивные раковые клетки могут достичь и расти внутри вторичных органов, процесс, называемый метастазированиерака 1. Метастазы вызывает более 90% смертей, связанных с раком2. Одна из причин этого заключается в том, что, хотя локализованные опухоли клинически управляемы, эффективных методов для ликвидации инвазивных раковых клеток после метастатического распространения не существует. Таким образом, появление инвазивных раковых клеток и переход от локализованных к инвазивным заболеваниям создает серьезную клиническую проблему. Определение того, как раковые клетки инициировать и поддерживать инвазивное поведение может привести к разработке новых мощных методов лечения.
3D-модель сфероидов является идеальной платформой для исследования подвижного поведения раковых клеток под контролем, но физиологически релевантных условий3. Действительно, в этом анализе, сфероиды раковых клеток встроены внутри внеклеточной матрицы (ECM), например коллагена I, который имитирует упрощенную опухоль. Затем визуализация используется для визуализации вторжения раковых клеток из сфероида в коллагеновую матрицу. Однако многочисленные проблемы ограничивают эту процедуру.
Первая проблема возникает на этапе встраивания, где жидкий коллаген матрицы может распространяться по поверхности блюда, в результате чего сфероид коснуться нижней части блюда. Следовательно, клетки сфероида распространяются на двумерной (2D) поверхности, нарушая трехмерную (3D) сфероидную морфологию. Увеличение объема коллагена является эффективным, но дорогостоящим решением. Чтобы предотвратить распространение клеток на 2D-поверхности, сохраняя при этом минимальный объем коллагена, мы разработали устройство сфероидной визуализации (SID), охвачив 1 мм толщиной, 3-луночное полидиметилсилоксан (PDMS) вставить на стеклянное дно блюдо.
Второй проблемой сфероидного анализа является маркировка раковых клеток в сфероидах, которая ограничена плохим проникновением антител и флуоресцентных красителей, эффект, который увеличивается с размером сфероида. В то время как идеальным решением для маркировки клеток является создание клеточных линий, стабилизированно выражаюющих флуоресцентный белок (ы), этот вариант в основном ограничивается увековеченными клеточными линиями и ограничен наличием флуоресцентных белковых химер. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для иммунофлуоресценции окрашивания фиксированных сфероидов, а также эффективное использование цитоплазмического красителя для обозначения клеток непосредственно перед встраиванием сфероида.
Третьей проблемой сфероидного анализа является отсутствие простых макросов Фиджи для полуавтоматической количественной оценки вторжения клеток с течением времени. Для решения этой задачи мы описываем простую методологию анализа сфероидной области с течением времени. В качестве примеров мы иллюстр работаем с преимуществами этого протокола, используя линии ячеек 4T1 и 67NR.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D печатный спейсер был разработан для создания 1-мм толщиной листов PDMS, которые затем могут быть использованы для легкого создания различных форм PDMS, как того требуют экспериментальные приложения. Благодаря простоте его изготовления и свободе изменять конструкцию, этот метод литья PDMS ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов Temple Bioengineering за ценные дискуссии. Мы благодарим Дэвида Амброуза в центре цитометрии потока (Школа медицины Льюиса Каца) за помощь в сортировке клеток и Тони Бёма из IdeaS Hub (Колледж инженерии, Университет Темпл) за помощь в 3D-печати. Мы также благодарим наши ресурсы финансирования: Американское онкологическое общество научно-исследовательский грант 134415-RSG-20-034-01-CSM, Победить рак сейчас / Молодые следователи премии, Национальные институты здравоохранения, R00 CA172360 и R01 CA230777, все для BG.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. . SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V., Dmitriev, R. I. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
