Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høj-gennemløb metabolisk profilering for model raffinementer af mikroalger

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/61913
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 3, 3,4, 1, 1, 1,3
1Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), New York University Abu Dhabi Research Institute, 2Department of Biology, United Arab Emirates University, 3Laboratory of Algal, Systems, and Synthetic Biology (LASSB), Division of Science and Math, New York University Abu Dhabi, 4Department of Marine Science, Ocean College, Zhejiang University

Summary

Denne protokol viser brugen af en fænotype microarray (PM) teknologi platform til at definere metaboliske krav til Chlamydomonas reinhardtii, en grøn mikroalger, og forfine en eksisterende metabolisk netværk model.

Abstract

Metaboliske modeller rekonstrueres baseret på en organismes tilgængelige genomanmærkning og giver prædiktive værktøjer til at studere metaboliske processer på systemniveau. Genom-skala metaboliske modeller kan omfatte huller samt reaktioner, der er ubekræftede eksperimentelt. Rekonstruerede modeller af nyligt isolerede mikroalgale arter vil resultere i svagheder på grund af disse huller, da der normalt er sparsom biokemisk dokumentation til rådighed for metabolismen af sådanne isolater. Fænotypen microarray (PM) teknologi er en effektiv, high-throughput metode, der funktionelt bestemmer cellulære metaboliske aktiviteter som reaktion på en bred vifte af indrejse metabolitter. Kombinere den høje gennemløb fænotypiske assays med metabolisk modellering kan gøre det muligt eksisterende metaboliske netværk modeller, der hurtigt rekonstrueres eller optimeres ved at give biokemiske beviser til at støtte og udvide genomisk dokumentation. Dette arbejde vil vise brugen af PM assays til undersøgelse af mikroalger ved hjælp af den grønne mikroalgal model arter Chlamydomonas reinhardtii som et eksempel. Eksperimentel dokumentation for over 254 reaktioner opnået ved PM blev brugt i denne undersøgelse til at udvide og forfine en genom-skala C. reinhardtii metaboliske netværk model, iRC1080, med ca 25 procent. Protokollen skabt her kan bruges som grundlag for funktionelt profilering af stofskiftet af andre mikroalger, herunder kendte mikroalger mutanter og nye isolater.

Introduction

Optimering af algemetabolisme til forbedret og stabil produktion af målrettede metabolitter kræver udvikling af komplekse metaboliske tekniske strategier gennem system-niveau analyser af metaboliske netværk. Metaboliske netværksmodeller kan vejlede de rationelle design til hurtig udvikling af optimeringsstrategier1,2,3,4. Selv om ca. 160 mikroalgal arter er blevet sekventeret5, der er, så vidt vi ved, kun 44 alge metaboliske modeller til rådighed4,6,7. På grund af vanskeligheden ved at opnå høj-throughput metaboliske fænotypiske data til eksperimentel validering af genomisk information, genopbygningen af høj kvalitet netværk modeller halter bagefter den hurtige udvikling af alge genom sekventering.

C. reinhardtii er et attraktivt modelsystem til algebaserede studier. Denne art kan vokse fotoautotrophically eller heterotrophically og har været meget udbredt som en model organisme i grundforskning og anvendt forskning. Dens genomsekvens blev offentliggjort i 20078, med genomskala metaboliske modeller efterfølgende rekonstrueret for arten9,10,11. Genomskalamodellen for C. reinhardtii (iRC1080) blev rekonstrueret af Chang et al. 10 baseret på genomisk dokumentation og litteratur evidens (med ~ 250 kilder). Det har 1.706 metabolitter med 2.190 reaktioner10; Modellens fuldstændighed kunne imidlertid ikke verificeres ud over de foreliggende offentliggjorte eksperimentelle beviser på det tidspunkt.

Den fænotype microarrays (PMs) teknologi er en høj-throughput platform, der kan give metabolisk profilering oplysninger for heterotrofiske mikroorganismer samt væv-kultur celler. Det kan især bruges til at afhjælpe fænotype-til-genotype videngabløften i mikroalger, som først rapporteret for Chlamydomonas reinhardtii12 og efterfølgende for en art af Chloroidium13 og Chlorella14. Ved at studere celleresponser på tusindvis af metabolitter, signalmolekyler, osmolytter og effektormolekyler kan PM-analyserne give funktionel metabolisk profilering og give indsigt i funktionen, stofskiftet og miljøfølsomheden15,16,17. Specifikt PM assays opdage celler metabolit udnyttelse i 96-brønd mikroplader med forskellige næringsstoffer, metabolitter, eller osmolytter indeholdt i hver brønd. Desuden er det også muligt at analysere bioaktive molekyler, såsom antibiotika og hormoner. Som bestemt af intensiteten af farveproduktionen ved NADH-reduktionen af et tetrazoliumbaseret redoxfarvestof evalueres den metaboliske udnyttelse af substrater i form af celle respiration15,16,17. Forsøgene i 96-brønd mikroplader kan overvåges og bestemmes automatisk over tid med fænotypen microarray instrument (PMI) platform. Tyve 96-brønd mikroplader er designet til at repræsentere de fælles sæt metabolitter til at studere cellulære fænotyper til at udnytte kulstof, kvælstof, svovl, og fosfor kilder, sammen med forskellige osmotiske / ion og pH effekter. PM-teknologien er med succes blevet brugt til opdatering og opgradering af en række eksisterende genomskala metaboliske modeller for mikroorganismer15,16,17,18.

Protokollen og data vist her er baseret på tidligere offentliggjorte arbejde af Chaiboonchoe et al. 12 Det præsenterede arbejde beskriver brugen af PM assay metode til at karakterisere metaboliske fænotyper af mikroalger og til at udvide en eksisterende alge metaboliske model af C. reinhardtii samt at guide genopbygningen af nye metaboliske modeller.

Protocol

1. Fænotype Microarray Eksperimenter

  1. Få C. reinhardtii stamme CC-503 fra Chlamydomonas Resource Center på University of Minnesota, USA (https://www.chlamycollection.org).
  2. Knyt cellerne i friske Tris-Acetate-Phosphat (TAP) medier19 med endelige koncentrationer på 400 μg/ml timentin, 50 μg/mL ampicillin og 100 μg/ml kanamycin (for at hæmme bakterievækst) under 400 mikromolfotoner/m2s ved 25 °C i to dage til midten af logfasen.
  3. Skru ned for kulturen ved 2.000 x g i 10 min ved 22 °C, og kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
  4. Forbered friske TAP-medier, der indeholder 0,1% tetrazol violet farvestof "D".
    BEMÆRK: Rediger TAP-medier i dette trin for at udelukke nogle næringsstoffer afhængigt af den metabolitkategori, der er testet i hver plade (f.eks. udelukker ammoniumchlorid til nitrogenkildeplader).
  5. Brug pellet i friske TAP-medier, der er forberedt (fra trin 1.2) til en endelig koncentration på 1 x 106 celler/mL.
  6. Brug kemiske sammensatte array assay plader (kulstof kilder, kvælstofkilder, fosfor og svovl kilder plader, og peptid kvælstofkilder).
  7. Pod en 100 μL aliquot af celleholdige medier i hver brønd af analysen plader.
    BEMÆRK: Sørg for at duplikere analyserne.
  8. Streak celler på gær ekstrakt / peptone plader og udføre gram farvning, som i Smith et al. 20 før og efter analysen til overvågning af bakteriel forurening.
  9. Sæt analysepladerne til det kemiske stof array i mikropladelæsersystemet.
  10. Inkuber alle pladerne ved 30 °C i op til 7 dage, og programmer mikropladelæsersystemet til at læse farvefarveændringen hvert 15. minut.
    BEMÆRK: Da de fleste mikropladelæsere ikke giver en kilde til kontinuerligt lys under inkubation, bør algerne være i stand til at udføre heterotrofisk åndedræt.

2. Dataanalyse

  1. Eksporter de rå kinetiske data fra mikropladelæseren som CSV-filer, som efterfølgende vil blive brugt som input til Omnilog Phenotype Microarray (OPM)-pakken i R. Tilføj de biologiske oplysninger som metadata (f.eks. stammebetegnelse, vækstmedier, temperatur osv.).
    1. Brug af PM Kinetic data converter software; indlæse D5E-datafilerne, og konverter dem til OKA-filer ved hjælp af følgende kommandolinjer i PM-kinetisk analysesoftware:
      Indlæs | Importer (find mappen til OKA-filerne) | Udfyld filtre | Importer | Tilføj alle plader | Lukke.
      Eksporter | vælg læsedata (Kinetisk), vælg format (CSV) (Tabulate Header), og vælg plader (hver plade (individuelle filer)) | Eksporter data | Spare.
    2. Hvis du vil udføre dataanalysen for fænotypen Microarray (PM), skal du bruge OPM-softwarepakken21,22, der kører inden for R-softwaremiljøet. Pakken, selvstudiet og referencedokumentationen er tilgængelig på: http://www.goeker.org/opm/. I RStudio, en grafisk brugergrænseflade til R, skal du installere opm-pakken og dens afhængigheder ved hjælp af følgende kommandoer:
      kilde (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      bibliotek (opm)
    3. Gå til den mappe, der indeholder CSV-filerne for de kinetiske data, og importer dataene ved hjælp af funktionen read_opm:
      x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. Aggregere og discretisere de kinetiske data ved hjælp af estimering af kurveparametre.
      For (i i 1 :length(x)) {
      x[[i]]
      x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSK)
      }
      #Collection af metadataene
      metadata <- collect_template(".")
      metadata$Stamme <- c("BLANK","CC- 503")
      for (I i 1 :længde(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}
    5. Brug funktionen xy_plot til at kortlægge respirationsmålingerne (eller vækst)målingerne (y-aksen) som funktion af tid (x-akse) for de analyserede 96-brøndsplader.
      udskrive (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
    6. Visualiser dataene som et varmekort ved hjælp af funktionen level_plot for at give mulighed for en hurtig sammenlignende oversigt over de kinetiske data.
      level_plot(x, hoved = liste(), farver = opm_opt("farve.kanter"), panel.headers = metadata$Stamme, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0,7 , num.colors = 200 L)
    7. Uddrag vigtige biologiske oplysninger, kurveparametrene, fra de rå kinetiske kurver og omfatter lagfasen (λ), vækstraten (μ), det maksimale cellerespiration (A) og området under kurven (AUC)21. For at identificere positive metabolitter skal du bruge A-værdierne for den negative kontrol, som repræsenterer farvestoffets abiotiske reaktivitet med mediet, ud over blanken af hver mikrowellplade som baggrunds subtraktionsværdier. Udpakningsfunktionen bruges til at hente parameteren A.
      opm_opt("curve.param")
      param <- uddrag (x, as.labels = liste("Stamme")))

3. Identifikation af reaktioner og gener forbundet med nye metabolitter

  1. Søg KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) og MetaCyc (http://metacyc.org/) for at identificere enzymer Kommissionens numre (ECs) for reaktioner ved hjælp af metabolitter fundet fra kemiske sammensatte arrays23,2423,24.
  2. Brug de identificerede EF-numre som søgegrundlag i flere tilgængeligealgeanmærkningsressourcer, http://www.phytozome.net f.eks.
  3. Hvis en forespørgsel ikke returnerer genetiske beviser for et givet EF-nummer, identificerer du de relevante tilknyttede proteiner i andre organismer, begyndende med arter, der er tættest på C. reinhardtii, derefter udfører en profilbaseret søgning ved hjælp af NCBI PSI-BLAST-serveren med standardindstillinger og brug ikke-overflødige proteiner (nr) i C. reinhardtii (taxid:3055) for at identificere kandidatgener, der er forbundet med reaktionen12.
  4. Manuelt kuratere PSI-BLAST hits med E-værdier på < 0,05 for relevans for den søgte EF-nummer ved at forespørge disse BLAST hits gennem EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search), eller InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) protein domæne forudsigelse servere. Bemærk, at de to sidstnævnte scanninger er kritiske skridt til at sikre identifikation af den korrekte enzymatiske aktivitet for proteinet.

4. Model raffinement og evaluering

  1. Brug den nyeste COBRA Værktøjskasse v.3.028i MATLAB29,30platform til at udføre følgende trin for model raffinement. COBRA-værktøjskassen kan installeres ved at følge trinnene i: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Du kan også bemærke, at COBRA-værktøjskassen også implementeres på tværs af andre open source-programmeringssprog, f.eks.31) og fås på: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
    1. Når du har installeret COBRA Toolbox v.3.0, skal du åbne MATLAB og udføre følgende kommando for at initialisere værktøjskassen:
      initCobraToolbox;
    2. Tilføj de identificerede reaktioner med deres tilknyttede gener til den metaboliske model, såsom iRC1080, ved hjælp af COBRA Værktøjskasse funktioner addReaction og changeGeneAssociation. Gå til den mappe, der indeholder iRC1080-modellen, hentet fra http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 og udfør følgende kommandoer for at indlæse modellen, omdøbe den og tilføje en ny reaktion og den tilknyttede gen.
      Belastning('iRC 1080 .mat')
      modelNew = iRC 1080;
      modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2', ...
      {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ...
      'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ...
      'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ...
      »D-ALA 2«, »au.g 14655 _t 1« )
    3. I nogle tilfælde, hvor metabolit ikke produceres intracellulært, men tages op fra mediet, tilføje transport reaktioner for de nye metabolitter til modellen. Disse transportreaktioner repræsenterer passiv diffusion af en metabolit fra det ekstracellulære medium til cytosolen. Derudover tilføjes en tilsvarende kunstig udvekslingsreaktion ved hjælp af addExchangeRxn-funktionen for at indtaste eller output metabolit i det ekstracellulære medium.
      modelNy = addReaction(modelNew, 'CYCPt', ...
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)'
      modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000,1000 );
    4. Test den nye resulterende models adfærd, f.eks. iBD1106, ved at udføre fluxbalanceanalyse (FBA) ved hjælp af funktionen optimizeCbModel under lyse og mørke forhold for maksimering af biomasse som den objektive funktion. For lysvækst skal du indstille de nedre og øvre grænser for PRISM-sol lithoens lysreaktioner til 646,07 (maksimal sats). For mørk vækst, indstille grænserne for alle PRISM lys reaktioner til nul. Brug biomassefunktionen defineret tidligere10 til vækst under mørke og lyse forhold. FBA-løsningen vil udsende to vektorer svarende til reaktionsfluxer (solution.v) og reducerede omkostninger (solution.w) samt en vektor svarende til metabolitternes skyggepriser (solution.y).
      %Simulerer vækst under lystilstand:
      modelNy = changeRxnBounds(modelNy,{ ...
      % »PRISM_solar_litho« ...
      »PRISM_solar_exo« ...
      »PRISM_incandescent_ 60 W«, ...
      »PRISM_fluorescent_cool_ 215 W«, ...
      »PRISM_metal_halide«, ...
      »PRISM_high_pressure_sodium«, ...
      »PRISM_growth_room« ...
      »PRISM_white_LED«, ...
      »PRISM_red_LED_array_ 653 nm«, ...
      »PRISM_red_LED_ 674 nm«, ...
      »PRISM_fluorescent_warm_ 18 W«, ...
      »PRISM_design_growth« ...
      }, 0, 'b' );
      modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel (modelNew, 'max');
    5. Gentag trin 4.1.4 for iRC1080 for at sammenligne FBA-løsninger, der er opnået til iBD1106, med dem, der er opnået for iRC1080.
    6. Der findes en række COBRA-metoder, der kan bruges til at sammenligne modeller (f.eks. fluxvariationsanalyse, gensletningsundersøgelser, robusthedsanalyser, flux split forudsigelser, FBA, prøveudtagning osv.). Detaljerede tutorials kan findes på https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Her gives et eksempel, hvor iRC1080-modellen sammenlignes med dens raffinerede version, iBD1106, ved at opnå skyggepriserne (følsomheden af biomassemålfunktionen over for ændringer i systemvariabelen) for de metabolitter, der er angivet i hver model.
      Få skyggepriserne for metabolitterne:
      shadowPrices = table(modelNew.mets, ...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Representative Results

Fænotype Microarray screening af model alge Chlamydomonas reinhardtii
PM-analyserne tester algeens evne til at udnytte forskellige kilder til kulstof, nitrogen, svovl og fosfor i et minimalt medium. I denne metodebeskrivelse demonstrerede vi, hvordan PM-analyser blev brugt til at identificere kulstof- og kvælstofmetabolisme. Kulstof- og kvælstofudnyttelses kinetikere blev målt med en mikropladelæser. Data blev analyseret ved hjælp af PMI-software. Resuméet kinetiker af udvalgte PM assay plader (PM01 og PM03) er vist i figur 1. "xy-plots" viser respirationsmålingerne over tid afbildet til de 96-brønds pladers analyser, hvor y-aksen og x-aksen repræsenterer værdierne for henholdsvis rå målinger og tid. Dataene blev konverteret til et varmekortmønster for at sammenligne samlingen af de kinetiske data.

Rørledningen til raffinering af genom-skala metaboliske netværk ved hjælp af PM data (Figur 2) illustrerer integrationen af high-throughput PM assays med eksperimentel dokumentation fra genomiske søgninger kan udvide en metabolisk netværk model.

For at bestemme reproducerbarheden af PM-data fra PM01 - 04- og PM10-plader blev der analyseret en lineær regression for at afbilde dataene fra to uafhængige replikeringseksperimenter mod hinanden (Figur 3). Figur 3 viser, at størstedelen af dataene var næsten ens, da de falder på 45°-linjen, idet kun nogle få afvigelser var til stede, og deres bestemmelseskoefficient R2 var 0,9. Konsistensen og reproducerbarheden af forsøgene for alge verificeres af dette plot.

Identifikation af nye metabolitter
PM-analysen identificerede 662 metabolitter i syv plader. PM01-PM04 og PM06-PM08, mens GasKromatografi Time-Of-Flight (GC-TOF) havde identificeret 77 metabolitter32 (Figur 4). Ved sammenligning af disse to sæt med de 1068 metabolitter, der blev taget i betragtning iRC1080, overlappede kun seks metabolitter mellem de tre sæt, og 149 overlappede hinanden mellem iRC1080 og PM. Dette resultat viser, at den metaboliske profilering platform kan være en væsentlig kilde til nye metaboliske oplysninger.

Eddikesyre var den eneste kulstofkilde, der blev påvist i plade PM01 som et understøttende kulstof efter at have trukket baggrundssignalet fra. Dette fund er i overensstemmelse med litteraturen33 og viser specificiteten af PM assays. PM assays afslørede nye svovl, fosfor, og kvælstof kilder, som C. reinhardtii kan udnytte til vækst. Svovlmetabolitterne var sulfat, thiosulfat, tetrathionat og DL-Lipoamid. Fosforkilderne var thiophosphat, dithiophosphat, D-3-fosfo-glycersyre og cysteamin-S-fosfat. Kvælstofkilde metabolitterne var L-amino- og D-aminosyrer, herunder mindre almindelige aminosyrer; L-homoserin, L-pyroglutamisk, methylamin, ethylamin, ethanolamin, og D,L-α-amino-butyric, og 108 Di-peptider og fem Tri-peptider (tabel 1). Alle de 128 nyligt identificerede metabolitter blev søgt i KEGG og MetaCyc for deres tilknyttede reaktioner, EF-numre og veje.

De nye 128 metabolitter var forbundet med 49 unikke EF-numre. Af disse var 15 ECs knyttet til deres genomiske beviser ved hjælp af fem kilder, herunder; Phytozome Version 10.0.234 JGI Version 435, AUGUSTUS 5.0 og 5.210 anmærkninger fra Manichaikul et al. 36 og KEGG13. Metabolitter uden genomisk evidens blev indgået på Universal Protein Resource hjemmeside (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38, hvor deres relaterede sekvenser blev fundet i andre organismer. Homologe sekvenser i C. reinhardtii blev identificeret ved at køre Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) fra NCBI's websted, der kun overvejede sekvenser, der producerede betydelige justeringer (E-værdi <0.005).

Model raffinement
Reaktioner forbundet med de nye 128 metabolitter, sammen med deres kodede gener, blev tilføjet til iRC1080-modellen og udvidede netværket. Den resulterende model iBD1106, tegner sig for 2.444 reaktioner, 1.959 metabolitter og 1.106 gener (Tabel 2). De nye 254 tilsatte reaktioner var 20 aminosyreoxidationsreaktioner, 108 di-peptid hydrolysereaktioner, fem tripeptid hydrolysereaktioner og 120 transportreaktioner, kodet af fire gener (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

I alt 113 tilføjede nye reaktioner tegner sig for hydrolyse af di-peptider og tri-peptider. Hydrolyse af di-peptider og tri-peptider er forbundet med to gener, en for di-peptider (Cre02.g078650.t1.3) og en for tri-peptider (Cre16.g675350.t1.3).

Med hensyn til kilder til fosfor blev der tilføjet en reaktion for hydrolyse af cysteamin-S-fosfat i cysteamin og fosfat forbundet med genet JLM_162926.

WoLF PSORT-værktøjet39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) og resultater rapporteret af Ghamsari et al. 35 blev anvendt for at opnå specifikationen af de cellulære rum, hvor de nye reaktioner finder sted. Ved at analysere proteinsekvenser forbundet med de nye reaktioner forudsagde WoLF PSORT cytosol som det cellulære rum for reaktionerne.

En genereret metabolisk model kan indeholde huller, når de biokemiske oplysninger er ufuldstændige. I sådanne tilfælde anvendes gapFind, A COBRA kommando. Den opregner rodhuller og gør det muligt at identificere nye huller i den nye model. De metabolitter , der ikke kan produceres i en metabolisk model, kaldes rodgab40,41. Analyse af rodgabet indikerede, at både iRC1080 og iBD1106 modeller indeholder de samme 91 huller. Dette viser, at tilføjelsen af de nye metabolitter og deres tilknyttede reaktioner ikke indførte yderligere rodhuller. Det skal bemærkes, at phenotyping metode, der anvendes i denne protokol ikke lukke huller i roden, fordi den oprindelige rod hul metabolitter mangler transport eller produktionsmekanismer, som ikke blev behandlet i phenotyping assays. Flux balance analyse blev udført for at teste den metaboliske adfærd i BD1106 under lyse og mørke forhold; (ingen acetat) og (med acetat). Algoritmen maksimerer biomasseprækursorreaktionerne for en objektiv funktion (biomassevækst). For at evaluere hver metabolits involvering i den fastsatte objektive funktion blev der beregnet "skyggepriser" for alle metabolitter. Ændringen i den objektive funktion vedrørende fluxændringer i metabolit definerer skyggeprisen for en metabolit30,42. Angivelsen af, om en metabolit er "overskydende" eller "begrænser" den objektive funktion, kan bestemmes ved skyggeprisanalyse, f.eks. biomasseproduktion. Negative eller positive skyggeprisværdier afslører metabolitter, der ved tilføjelse vil reducere eller øge den objektive funktion. Nul værdier af skyggepriser afslører metabolitter, der ikke vil påvirke den objektive funktion. Sammenligningen af skyggepriserne mellem iBD1106 og iRC1080 i figur 5 viser, at der for de fleste metabolitter ikke observeres en væsentlig ændring. der findes dog forskelle i henholdsvis 105 og 70 tilfælde under lyse og mørke vækstforhold. Tabel 4 indeholder eksempler på sådanne metabolitter.

Figure 1
Figur 1: Fænotypisk mikroarray profilering af C. reinhardtii. Respiration XY-plots og niveau plots af PM01 (Carbon kilder; A, C) og PM03 (kvælstofkilder; B, D) assay plader er vist. Figuren er et 8x12 array, hvor hver celle repræsenterer en brøndplade og dermed et givet metabolit- eller vækstmiljø. Inden for hver celle eller brønd repræsentation, kurver repræsenterer farvestof konvertering ved reduktion (y-akse) som en funktion af tid (x-akse). PM respiration kurver fra CC-503 og tomme brønde er vist i hver celle og er angivet med farve (blågrøn farve repræsenterer tomme brønde og lilla farve repræsenterer CC-503). Niveauplottet repræsenterer hver respirationskurve som en tynd vandret streg, der skifter farve (eller forbliver uændret) over tid. Heatmap farveændringer er fra lysegul (lidt at ingen respiration har fundet sted) til mørk orange eller brun (betydelig respiration har fundet sted). Metabolitter, der anvendes af C. reinhardtii (CC-503), og de tomme plader vises. Dette tal er fra et tidligere udgivet værk af Chaiboonchoe et al. 12Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2: Genom-skala metaboliske netværk raffinement pipeline ved hjælp af PM data. Efter at en ny forbindelse er testet positiv i en PM-analyse, identificeres dens enzymkommissionsnummer (EF), reaktion og vej fra tilgængelige databaser, f.eks. KEGG og MetaCyc. Genomisk dokumentation udvindes derefter af genomiske ressourcer og anmærkningsressourcer, når de er tilgængelige, og udgør en forbindelse mellem genotype og fænotype. Når direkte genomisk dokumentation ikke er tilgængelig, identificeres proteinsekvensen ud fra EF-numrene, og genetiske beviser identificeres via PSI-Blast. Det rekonstruerede metaboliske netværk raffineres derefter baseret på nyligt identificerede forbindelser, men først efter et kvalitetskontroltrin, der indebærer at forespørge proteindomænerne ved hjælp af relevante databaser. Dette tal er blevet ændret fra tidligere offentliggjorte arbejde af Chaiboonchoe et al. 12Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3: Reproducerbarhed af PM-test. PMI-værdierne blev indsamlet over en periode på 168 timer, og de maksimale PMI-værdier blev afbildet for to replikerede undersøgelser. Hver akse repræsenterer de maksimale PMI-værdier for hvert studie (x-aksen er en replikeret undersøgelse og y-aksen en anden). De reproducerede værdier er lige langt fra hver akse. Hvert punkt repræsenterer en enkelt maksimumværdi. Den lineære regression blev udført af et regnearkssoftware, og den resulterende bestemmelseskoefficient (R2) vises. Dette tal er blevet ændret fra tidligere offentliggjorte arbejde af Chaiboonchoe et al. 12Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4: Venn diagram af metabolitter. Venn-diagrammet optæller metabolitter identificeret ved PM-plader, iRC1080 metabolisk model og Gas Chromatography Time of Flight (GC-TOF) eksperimenter. Hver cirkel angiver det samlede antal metabolitter, der findes i hver enkelt undersøgelsesmetode. Samtidig repræsenterer de overlappende regioner antallet af metabolitter, der deles mellem disse metoder. I RC1080 metaboliske model indeholder i alt 1.068 unikke metabolitter. GC-TOF identificerede i alt 77 metabolitter32, mens der er i alt 662 metabolitter identificeret ved hjælp af PM-pladerne. Dette tal er fra tidligere offentliggjorte værker af Chaiboonchoe et al. 12Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Skyggepriserne på metabolitter i rc1080 og iBD1106 under forskellige betingelser for biomassemaksimering. Hver cirkel på "radarplottet" svarer til en skyggeprisværdi, mens hver linje, der strækker sig fra midten af et plot, angiver en metabolit. (A) Skyggepriser og metabolisk adfærd i iRC1080 og iBD1106 under en let væksttilstand; (B), forskellige metaboliske adfærd i iRC1080 og iBD1106 under en mørk vækst tilstand. Dette tal er fra tidligere offentliggjorte værker af Chaiboonchoe et al. 12Klik her for at se en større version af dette tal.

Biologi kemiske EF* Genanmærkning PSI-BLAST
Cysteamin-S-Fosfat 3.1.3.1 JLM_1629261,2,3,4
Tetrathionat 1.8.2.2 ubetydelig E-værdi
1.8.5.2 ubetydelig E-værdi
D-Alanine 1.4.1.1 XP_001700222.1
1.5.1.22 fejlbehæftet manuel QC
2.1.2.7 ubetydelig E-værdi
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10 ubetydelig E-værdi
2.3.2.14 ubetydelig E-værdi
2.3.2.16 ubetydelig E-værdi
2.3.2.17 ubetydelig E-værdi
2.3.2.18 ubetydelig E-værdi
2.6.1.21 fejlbehæftet manuel QC
3.4.13.22 XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4 Chlre2_kg.stillads_ 140000391,2,3
3.4.17.8 fejlbehæftet manuel QC
3.4.17.13 ubetydelig E-værdi
3.4.17.14 ubetydelig E-værdi
4.5.1.2 ubetydelig E-værdi
6.1.1.13 fejlbehæftet manuel QC
6.1.2.1 fejlbehæftet manuel QC
6.3.2.4 au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10 fejlbehæftet manuel QC
6.3.2.16 ubetydelig E-værdi
6.3.2.35 ubetydelig E-værdi
D-Asparagine 1.4.5.1 ubetydelig E-værdi
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96 ubetydelig E-værdi
2.3.1.36 ubetydelig E-værdi
1.4.99.1 XP_001692123.1
3.5.1.77 e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81 ubetydelig E-værdi
5.1.1.10 fejlbehæftet manuel QC
D-aspartic syre 6.3.1.12 ubetydelig E-værdi
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
D-glutaminsyre 1.4.3.7 ubetydelig E-værdi
1.4.3.3 ubetydelig E-værdi
D-Lysin 5.4.3.4 ubetydelig E-værdi
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37 fejlbehæftet manuel QC
D-Serin 2.7.11.8 ubetydelig E-værdi
2.7.11.17 Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78 fejlbehæftet manuel QC
3.4.21.104 fejlbehæftet manuel QC
4.3.1.18 g6244.t14 fejlbehæftet manuel QC
6.3.2.35 ubetydelig E-værdi
6.3.3.5 ubetydelig E-værdi
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
D-Valine 1.21.3.1 fejlbehæftet manuel QC
6.3.2.26 fejlbehæftet manuel QC
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
L-Pyroglutamic Acid
Thiophosphat
Dithiophosphat
Ethylamin 6.3.1.6
D,L-a-Amino-Butyric Acid 2.1.1.49 ubetydelig E-værdi
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
Di-peptid 3.4.13.18 Cre02.g078650.t1.31
Tri-peptid 3.4.11.4 Cre16.g675350.t1.31

Tabel 1: Liste over identificerede positive substratudnyttelses metabolitter (C, P, S, N), der ikke findes i iRC1080-metabolisk model.  *Reaktionen var ikke inkluderet, hvis der ikke blev identificeret et gen.  1 Phytozome version 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   2 JGI version 4 35.  3 Augustus version 510.  4 Kegg (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI version 3.136.  Denne tabel er fra tidligere offentliggjorte arbejde af Chaiboonchoe et al. 12

Model Reaktioner Metabolitter Gener
iRC1080 2,191 1,706 1,086
iBD1106 2,445 1,959 1,106

Tabel 2: Indholdet af iRC1080 og iBD1106.  Denne tabel er fra tidligere offentliggjorte arbejde af Chaiboonchoe et al. 12

Kategori eller klasse af reaktioner Antal reaktioner
Aminosyrer 20
Dipeptider 108
Tripeptider 5
Transport reaktion 120

Tabel 3: Resumé af nye reaktioner i BD1106. Denne tabel er fra tidligere offentliggjorte arbejde af Chaiboonchoe et al. 12

Vækstbetingelse Metabolit Navn iRC1080 iBD1106
4r5au 4-(1-D-Ribitylamino)-5-aminouracil 0 0.168
5aprbu 5-Amino-6-(5'-phosphoribitylamino)uracil -0.009 0.158
Lys pa1819Z18111Z 1-(9Z)-octadecenoyl,2-(11Z)-octadecenoyl-sn-glycerol3-fosfat -0.009 -0.65
Mørk 4abut 4-aminobutanoate 0.18 -0.05

Tabel 4: Eksempel på betydelige skyggepriser for iRC1080 og iBD1106. Denne tabel er fra tidligere offentliggjorte arbejde af Chaiboonchoe et al. 12

Discussion

Metabolisk phenotyping af den grønne mikroalga, C. reinhardtii, blev beskrevet her ved hjælp af høj gennemløb PM assay plader og en uændret PMI. Analyserne blev udnyttet til i alt 190 kulstofkilder (PM01 og PM02), 95 kvælstofkilder (PM03), 59 fosforkilder og 35 svovlkilder (PM04) sammen med peptid nitrogenkilder (PM06-08). Positiv respiration blev observeret for 148 næringsstoffer (en positiv analyse for C-source udnyttelse, fire positive analyser for hver S-kilde og P-source udnyttelser, og 139 positive analyser for N-kildeudnyttelse). Mediets substrater eller næringsstoffer (kulstof,kvælstof, fosfor eller svovl) må ikke tilsættes til det definerede medium, når de påføres de relevante PM-mikroplader, der tester for hver af disse kilder.

Den metode, der vises her, er effektiv til at karakterisere metaboliske mikroalger fænotyper, der kan bruges til at udvide eksisterende metaboliske netværk modeller eller direkte genopbygningen af nye modeller. Da de ernæringsmæssige krav i de fleste mikroalger ikke er kendt, kan denne platform bruges til at definere disse hurtigt. Nelson et al. 43 havde med succes anvendt disse metoder til at identificere nye forbindelser, der understøtter væksten af mikroalgeren Chloroidium sp. UTEX 3007 og brugte de opnåede oplysninger til at definere arternes indgangsmet metabolitter, som i modsætning til klamydomonaer omfatter 40 forskellige kulstofkilder.

En væsentlig begrænsning af PM til profilering af mikroalger er, at PMI ikke har nogen belysning i inkubationskammeret, og mikroalgeren skal være i stand til at udføre heterotrofisk metabolisme. Fraværet af lys kan påvirke fortolkningen af modeller, der inkorporerer lys til at beregne metaboliske fluxer. Genpar med koordinerende funktioner har udviklet sig til at udgøre metaboliske netværkshubs, og sondringen mellem fotosyntetiske og ikke-fotosyntetiske netværkshubs kan foretages44. Generelt ville fotosyntetiske netværkshubs (dvs. stærkt tilsluttede noder i modellen) blive udeladt af heterotrofiske modeller. I praksis bør modellering af heterotrofi i mixotrofiske arter udelade reaktioner, der vides at være drevet af lys, og tage højde for energibalanceforskellene mellem forholdene. Således modellering lys-afhængige og lys-uafhængige stofskifte er standard praksis i Chlamydomonas metabolisk modellering6,45.

Nogle grønne mikroalger, som Trebouxiophytes, er kendt for at assimilere en række kulstofmolekyler til vækst, og dette menes at være opstået fra deres lange evolutionære historie som medlemmer af lav46. Mens klorofytter som Chlamydomonas kan bruge acetat til vækst, kan den brune marine mikroalga Tisochrysis lutea, der er kendt for sit potentiale til kommercielt at producere meget langkædede flerumættede fedtsyrer (VLC-PUFAs), ikke bruge acetat, men kan bruge glycerol til vækst47. Biomassekoncentrationen på mere end 100 g l−1 tørcellevægt er opnået med Chlorella med optimeret tilsætning af organiske kulstofkilder i en fed batch-tilstand48. Desuden kan tilsætning af sukker til Chlorellavulgaris forhøje bindingen af CO2og dermed give en additiv fordel under fotosyntetisk vækst49. De fleste heterotrofiske mikroalger kan også vokse mixotrophically, men klorofyt Chromochloris zofingiensis har vist sig at slukke fotosyntese ved tilsætning af sukker50.

Diatomer, der tilhører divisionen Bacillariophyta, er en stor gruppe af fytoplankton. Selv om de fleste af diatomerne kun kan vokse fotoautotrophically, nogle af dem kan dyrkes mixotrophically eller heterotrophically51. For eksempel blev glycerol fundet at støtte væksten i lyset i mangel af CO2 i nogle diatomer, herunder modelarten Phaeodactylum tricornutum52. Også nogle bentiske diatomer som Nitzschia linearis kan vokse på kulhydrater i den mørke53. Det er sandsynligt, at udvide PM assays til diatomer og andre algegrupper ved at supplere egnede organiske kulstofkilder til at gøre det muligt for cellerne at vokse heterotrofisk, og en mixotrophy strategi kan også potentielt anvendes til den obligatoriske autotrofiske mikroalger giver en minimalt krævede lysforsyning.

For at vurdere dataenes reproducerbarhed anbefales det stærkt at udføre dublerede analyser for alle plader. En analyse kan kun betragtes som positiv, hvis absorbansen (PMI-værdien) efter fratrækning fra den negative kontrol og de respektive blankbjætter er positiv. Denne beskrivelse, i nærværelse af den testede forbindelse, er en afspejling af farvestoffets abiotiske reaktion med mediet.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Stor støtte til dette arbejde blev ydet af NYUAD Center for Genomforskning og Systems Biology (CGSB), finansieret af Tamkeen under New York University Abu Dhabi Research Institute tilskud (73 71210 CGSB9) og NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. blev desuden støttet af Hundred Talents Program af Zhejiang University. Vi takker Ashish Jaiswal for hjælp til at optage videoen. Vi takker Hong Cai for at generere metaboliske fænotype data.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin VWR 97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08] Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog Instrument Biolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA. Regents of the University of Minnesota
Kanamycin VWR 0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D” Biolog, Hayward, CA, USA
Timentin GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd 42010012-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oberhardt, M. A., Palsson, B. Ø, Papin, J. A. J. M. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5 (1), 320 (2009).
  2. Schmidt, B. J., Lin-Schmidt, X., Chamberlin, A., Salehi-Ashtiani, K., Papin, J. A. Metabolic systems analysis to advance algal biotechnology. Biotechnology Journal. 5 (7), 660-670 (2010).
  3. Koskimaki, J. E., Blazier, A. S., Clarens, A. F., Papin, J. A. J. I. B. Computational models of algae metabolism for industrial applications. Industrial Biotechnology. 9 (4), 185-195 (2013).
  4. Koussa, J., Chaiboonchoe, A., Salehi-Ashtiani, K. J. B. Computational approaches for microalgal biofuel optimization: a review. BioMed Research. 2014, 649453 (2014).
  5. Nelson, D. R., et al. Large-scale genome sequencing reveals the driving forces of viruses in microalgal evolution. Cell Host & Microbe. 29 (2), 250-266 (2021).
  6. Shene, C., Asenjo, J. A., Chisti, Y. Metabolic modelling and simulation of the light and dark metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 96 (5), 1076-1088 (2018).
  7. Tibocha-Bonilla, J. D., Zuñiga, C., Godoy-Silva, R. D., Zengler, K. Advances in metabolic modeling of oleaginous microalgae. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 241 (2018).
  8. Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318 (5848), 245-250 (2007).
  9. May, P., Christian, J. -O., Kempa, S., Walther, D. J. B. G. ChlamyCyc: an integrative systems biology database and web-portal for Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 10 (1), 209 (2009).
  10. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), (2011).
  11. de Oliveira Dal'Molin, C. G., Quek, L. -E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM - a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. BMC Genomics. 12 (5), (2011).
  12. Chaiboonchoe, A., et al. Microalgal metabolic network model refinement through high-throughput functional metabolic profiling. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, 68 (2014).
  13. Kanehisa, M., et al. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Research. 42 (1), 199-205 (2014).
  14. Zuñiga, C., et al. Genome-scale metabolic model for the green alga Chlorella vulgaris UTEX 395 accurately predicts phenotypes under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic growth conditions. Plant Physiology. 172 (1), 589-602 (2016).
  15. Bochner, B. R. New technologies to assess genotype-phenotype relationships. Nature Reviews Genetics. 4 (4), 309-314 (2003).
  16. Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 33 (1), 191-205 (2009).
  17. Bochner, B. R., Gadzinski, P., Panomitros, E. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research. 11 (7), 1246-1255 (2001).
  18. Bartell, J. A., Yen, P., Varga, J. J., Goldberg, J. B., Papin, J. A. Comparative metabolic systems analysis of pathogenic Burkholderia. Journal of Bacteriology. 196 (2), 210-226 (2014).
  19. Gorman, D. S., Levine, R. J. P. otN. A. oS. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. PNAS. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  20. Smith, A. C., Hussey, M. A. Gram stain protocols. American Society for Microbiology. , 1-9 (2005).
  21. Vaas, L. A. I., et al. opm: an R package for analysing OmniLog phenotype microarray data. Bioinformatics. 29 (14), 1823-1824 (2013).
  22. Vaas, L. A. I., Sikorski, J., Michael, V., Göker, M., Klenk, H. -P. Visualization and Curve-Parameter Estimation Strategies for Efficient Exploration of Phenotype Microarray Kinetics. PLoS ONE. 7 (4), 34846 (2012).
  23. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes-a 2019 update. Nucleic Acids Research. 48 (1), 445-453 (2020).
  24. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Ishiguro-Watanabe, M., Tanabe, M. KEGG: integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Research. , (2020).
  25. Lopez, D., Casero, D., Cokus, S. J., Merchant, S. S., Pellegrini, M. Algal Functional Annotation Tool: a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data. BMC Bioinformatics. 12 (1), 282 (2011).
  26. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 46, 633-639 (2018).
  27. Sahoo, S., et al. dEMBF v2. 0: An Updated Database of Enzymes for Microalgal Biofuel Feedstock. Plant and Cell Physiology. 61 (5), 1019-1024 (2020).
  28. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 14 (3), 639-702 (2019).
  29. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 1, (2019).
  30. Orth, J. D., Thiele, I., Palsson, B. Ø What is flux balance analysis. Nature Biotechnology. 28 (3), 245 (2010).
  31. Ebrahim, A., Lerman, J. A., Palsson, B. O., Hyduke, D. R. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python. BMC Systems Biology. 7 (1), 74 (2013).
  32. Bölling, C., Fiehn, O. Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation. Plant Physiology. 139 (4), 1995-2005 (2005).
  33. Harris, E. H. The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. (2009).
  34. Goodstein, D. M., et al. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Research. 40, 1178-1186 (2012).
  35. Ghamsari, L., et al. Genome-wide functional annotation and structural verification of metabolic ORFeome of Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 12 (1), 4 (2011).
  36. Manichaikul, A., et al. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods. 6 (8), 589-592 (2009).
  37. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 32, 115-119 (2004).
  38. Consortium, T. U. Activities at the universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Research. 42 (11), 7486-7486 (2014).
  39. Horton, P., et al. PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Research. 35, suppl_2 585-587 (2007).
  40. Becker, S. A., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature Protocols. 2 (3), 727-738 (2007).
  41. Schellenberger, J., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature Protocols. 6 (9), 1290 (2011).
  42. Varma, A., Boesch, B. W., Palsson, B. O. Stoichiometric interpretation of Escherichia coli glucose catabolism under various oxygenation rates. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2465-2473 (1993).
  43. Nelson, D. R., et al. The genome and phenome of the green alga Chloroidium sp. UTEX 3007 reveal adaptive traits for desert acclimatization. eLife. , 25783 (2017).
  44. Chaiboonchoe, A., et al. Systems level analysis of the Chlamydomonas reinhardtii metabolic network reveals variability in evolutionary co-conservation. Molecular BioSystems. 12 (8), 2394-2407 (2016).
  45. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), 518 (2011).
  46. Rajendran, A., Hu, B. Mycoalgae biofilm: development of a novel platform technology using algae and fungal cultures. Biotechnology for Biofuels. 9 (1), 112 (2016).
  47. Hu, H., et al. Effect of cultivation mode on the production of docosahexaenoic acid by Tisochrysis lutea. AMB Express. 8 (1), 50 (2018).
  48. Bumbak, F., Cook, S., Zachleder, V., Hauser, S., Kovar, K. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations. Applied Microbiology and Biotechnology. 91 (1), 31 (2011).
  49. Fu, W., et al. Sugar-stimulated CO2 sequestration by the green microalga Chlorella vulgaris. Science of the Total Environment. 654, 275-283 (2019).
  50. Roth, M. S., et al. Regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga Chromochloris zofingiensis. The Plant Cell. , (2019).
  51. Villanova, V., et al. Investigating mixotrophic metabolism in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1728), 20160404 (2017).
  52. Cerón-García, M., et al. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on fructose and glycerol in fed-batch and semi-continuous modes. Bioresource Technology. 147, 569-576 (2013).
  53. Tuchman, N. C., Schollett, M. A., Rier, S. T., Geddes, P. Advances in Algal Biology: A Commemoration of the Work of Rex Lowe. , Springer. 167-177 (2006).

Tags

Biologi Microalgae Chlamydomonas reinhardtii fænotype microarray flux balance analyse metaboliske netværk genopbygning metaboliske model raffinement
Høj-gennemløb metabolisk profilering for model raffinementer af mikroalger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alzahmi, A., Daakour, S., El Assal,… More

Alzahmi, A., Daakour, S., El Assal, D. C., Dohai, B. S., Chaiboonchoe, A., Fu, W., Nelson, D. R., Mystikou, A., Salehi-Ashtiani, K. High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae. J. Vis. Exp. (178), e61913, doi:10.3791/61913 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter