Summary

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging для изучения миграции клеток к органу Корти

Published: December 04, 2020
doi:

Summary

В этом исследовании мы представляем метод визуализации в режиме реального времени с использованием конфокальной микроскопии для наблюдения за клетками, двигамися в направлении поврежденных тканей путем инкубации ex vivo с кохлеарным эпителием, содержащим орган Корти.

Abstract

Для изучения влияния мезенхимальных стволовых клеток (MSC) на регенерацию клеток и лечение, этот метод отслеживает миграцию MSC и морфологические изменения после совместной культуры с кохлеарной эпителием. Орган Корти был обездвижен на пластиковой крышке, нажав на часть мембраны Рейсснера, генерируемую во время вскрытия. MSCs ограничивается стеклянный цилиндр мигрировали в сторону кохлеарного эпителия, когда цилиндр был удален. Их преобладающая локализация наблюдалась в модиоле органа Корти, выровненном в направлении, аналогичном нервному. Тем не менее, некоторые MSCs были локализованы в области лимбуса и показали горизонтально удлиненной формы. Кроме того, миграция в область волосяных клеток была увеличена, и морфология MSCs изменилась на различные формы после лечения канамицина. В заключение, результаты этого исследования показывают, что кокультура MSCs с кохлеарной эпителия будет полезна для развития терапии через трансплантацию клеток и для исследований регенерации клеток, которые могут изучить различные условия и факторы.

Introduction

Потеря слуха может происходить врожденно или может быть вызвана постепенно несколькими факторами, включая старение, наркотики и шум. Потеря слуха часто трудно лечить, потому что это очень сложно восстановить нарушенную функцию, как только волосковых клеток, ответственных за слух повреждены1. По данным Всемирной организации здравоохранения, 461 миллион человек во всем мире, по оценкам, имеют потерю слуха, что составляет 6,1% населения мира. Из тех, кто с потерей слуха, 93% взрослых, и 7% детей.

Был предпринят ряд подходов к лечению потери слуха; в частности, перспективным методом лечения стал подход к регенерации с использованием MSC. Когда ткань повреждена, MSCs естественно выпущены в кровеносную систему и мигрируют к месту ушиба где они выделяет различные молекулы для того чтобы сформировать микроокноронику которая способствуетрегенерации 2. Следовательно, важно разработать метод лечения поврежденных тканей путем миграции внешне имплантированных MSCs к целевым органам и их последующей секрециимолекул,которые вызывают мощную иммунную регуляцию, ангиогенез и анти-апоптоз для повышения восстановления поврежденной функцииклеток 3,4,5.

Процесс самонаведения, в котором MSCs мигрируют в поврежденные ткани может быть наиболее важным препятствием для преодоления. MSCs имеют системный механизм самонаведения с последовательными шагами привязывания / прокатки, активации, ареста, трансмиграции / диапедез, имиграция 6,7,8. В настоящее время предпринимаются усилия по выявлению путей совершенствования этих шагов. Различные стратегии, в том числе генетическая модификация, инженерия поверхности клеток, в пробирке грунтовки, и магнитное руководство,были протестированы 6,7. Кроме того, было предпринято несколько попыток содействовать защите и регенерации слуховых волосковых клеток путем самонаведения MSCs к месту повреждения улитки. Тем не менее, отслеживание MSCs in vivo является трудоемким и трудоемким и требует высокоспециализированныхнавыков 9.

Для решения этой проблемы был разработан метод наблюдения за самонаведением MSC в улитке через промежуточную конфокаловую микроскопию, которая фотографирует миграцию клеток в течениенескольких часов (рисунок 1). Он был разработан в начале 20-говека и в последнее время стал мощным инструментом для изучения миграции конкретных клеток.

Figure 1
Рисунок 1: Графический абстрактный. (A) После того, как расчлененный орган Корти прилипает на пластиковой крышке с использованием типсов, крышки помещаются на 35-мм стеклянное дно конфокальной микроскопической тарелки, и (B) стеклянный цилиндр расположен. (C) После заполнения внутренней части стеклянного цилиндра со средним, (D) GFP помечены MSCs со средним добавляются тщательно за пределами цилиндра. (E) После инкубации на ночь, (F) стеклянный цилиндр удаляется, и изображения принимаются с конфокального микроскопа. Аббревиатуры: GFP – зеленый флуоресцентный белок; MSCs и мезенхимальные стволовые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Protocol

Все протоколы исследований с участием мышей МЦР были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Yonsei в Медицинском колледже Вонджу. Эксперименты проводились в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации. В этом про?…

Representative Results

Миграция MSC в трехмерном режиме была оценена системой Transwell или традиционным методом заживления ран для наблюдения за миграцией в двухмерном (2D) режиме11. Орган Корти является сложной структурой, состоящей из различных клеток, таких как клетки Boettcher, клетки …

Discussion

Тщательно изучена трансплантация MSC в поврежденные участки для содействия регенерации поврежденных клеток, и терапевтический эффект очевиден. Трансплантация и последующая дифференциация MSCs, как сообщается, восстановить слух у крыс с потерей слуха, вызванной 3-нитропропионовой<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана научно-исследовательскими грантами (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) от Национального исследовательского фонда (NRF) Кореи и Исследовательского фонда Халлымского университета.

Materials

10X PBS Buffer GenDEPOT P2100-104
4% Formalin T&I BPP-9004
Ampicillin sigma  A5354-10ml
BSA sigma  A4503-100G
confocal dish SPL 200350
confocal microscope  ZEISS LSM800
coverslip SPL 20009
DMEM/F12 Gibco 10565-018
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher scientific 16140071
Fluorsheild with DAPI sigma  F6057
Forcep Dumont 0508-L5-P0
HBSS Thermo Fisher scientific 14065056
HEPES Thermo Fisher scientific 15630080
N2 supplement Gibco 17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent abcam ab176759
Stage Top Incubator TOKAI HIT WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP cyagen MUBMX-01101
Triton X-100 sigma  T8787

References

  1. Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
  2. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  3. Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
  4. Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
  5. Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
  6. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  7. Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
  8. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  9. Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
  10. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  11. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
  12. Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
  13. Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
  14. Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
  15. Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
  16. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
  17. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  18. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).

Play Video

Cite This Article
Park, J., Lee, S. H., Park, D. J., Seo, Y. J., Kim, S. K. In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti. J. Vis. Exp. (166), e61947, doi:10.3791/61947 (2020).

View Video