In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging для изучения миграции клеток к органу Корти

Summary

В этом исследовании мы представляем метод визуализации в режиме реального времени с использованием конфокальной микроскопии для наблюдения за клетками, двигамися в направлении поврежденных тканей путем инкубации ex vivo с кохлеарным эпителием, содержащим орган Корти.

Abstract

Для изучения влияния мезенхимальных стволовых клеток (MSC) на регенерацию клеток и лечение, этот метод отслеживает миграцию MSC и морфологические изменения после совместной культуры с кохлеарной эпителием. Орган Корти был обездвижен на пластиковой крышке, нажав на часть мембраны Рейсснера, генерируемую во время вскрытия. MSCs ограничивается стеклянный цилиндр мигрировали в сторону кохлеарного эпителия, когда цилиндр был удален. Их преобладающая локализация наблюдалась в модиоле органа Корти, выровненном в направлении, аналогичном нервному. Тем не менее, некоторые MSCs были локализованы в области лимбуса и показали горизонтально удлиненной формы. Кроме того, миграция в область волосяных клеток была увеличена, и морфология MSCs изменилась на различные формы после лечения канамицина. В заключение, результаты этого исследования показывают, что кокультура MSCs с кохлеарной эпителия будет полезна для развития терапии через трансплантацию клеток и для исследований регенерации клеток, которые могут изучить различные условия и факторы.

Introduction

Потеря слуха может происходить врожденно или может быть вызвана постепенно несколькими факторами, включая старение, наркотики и шум. Потеря слуха часто трудно лечить, потому что это очень сложно восстановить нарушенную функцию, как только волосковых клеток, ответственных за слух повреждены¹. По данным Всемирной организации здравоохранения, 461 миллион человек во всем мире, по оценкам, имеют потерю слуха, что составляет 6,1% населения мира. Из тех, кто с потерей слуха, 93% взрослых, и 7% детей.

Был предпринят ряд подходов к лечению потери слуха; в частности, перспективным методом лечения стал подход к регенерации с использованием MSC. Когда ткань повреждена, MSCs естественно выпущены в кровеносную систему и мигрируют к месту ушиба где они выделяет различные молекулы для того чтобы сформировать микроокноронику которая способствует^{регенерации 2.} Следовательно, важно разработать метод лечения поврежденных тканей путем миграции внешне имплантированных MSCs к целевым органам и их последующей секреции^{молекул,}которые вызывают мощную иммунную регуляцию, ангиогенез и анти-апоптоз для повышения восстановления поврежденной функции^{клеток 3},^4,5.

Процесс самонаведения, в котором MSCs мигрируют в поврежденные ткани может быть наиболее важным препятствием для преодоления. MSCs имеют системный механизм самонаведения с последовательными шагами привязывания / прокатки, активации, ареста, трансмиграции / диапедез, и^{миграция 6,7,8}. В настоящее время предпринимаются усилия по выявлению путей совершенствования этих шагов. Различные стратегии, в том числе генетическая модификация, инженерия поверхности клеток, в пробирке грунтовки, и магнитное руководство,^{были протестированы 6,7}. Кроме того, было предпринято несколько попыток содействовать защите и регенерации слуховых волосковых клеток путем самонаведения MSCs к месту повреждения улитки. Тем не менее, отслеживание MSCs in vivo является трудоемким и трудоемким и требует высокоспециализированных^{навыков 9.}

Для решения этой проблемы был разработан метод наблюдения за самонаведением MSC в улитке через промежуточную конфокаловую микроскопию, которая фотографирует миграцию клеток в течениенескольких часов (рисунок 1). Он был разработан в начале 20-го^века и в последнее время стал мощным инструментом для изучения миграции конкретных клеток.

Рисунок 1: Графический абстрактный. (A) После того, как расчлененный орган Корти прилипает на пластиковой крышке с использованием типсов, крышки помещаются на 35-мм стеклянное дно конфокальной микроскопической тарелки, и (B) стеклянный цилиндр расположен. (C) После заполнения внутренней части стеклянного цилиндра со средним, (D) GFP помечены MSCs со средним добавляются тщательно за пределами цилиндра. (E) После инкубации на ночь, (F) стеклянный цилиндр удаляется, и изображения принимаются с конфокального микроскопа. Аббревиатуры: GFP – зеленый флуоресцентный белок; MSCs и мезенхимальные стволовые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Protocol

Все протоколы исследований с участием мышей МЦР были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Yonsei в Медицинском колледже Вонджу. Эксперименты проводились в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации. В этом про?…

Representative Results

Миграция MSC в трехмерном режиме была оценена системой Transwell или традиционным методом заживления ран для наблюдения за миграцией в двухмерном (2D) режиме11. Орган Корти является сложной структурой, состоящей из различных клеток, таких как клетки Boettcher, клетки …

Discussion

Тщательно изучена трансплантация MSC в поврежденные участки для содействия регенерации поврежденных клеток, и терапевтический эффект очевиден. Трансплантация и последующая дифференциация MSCs, как сообщается, восстановить слух у крыс с потерей слуха, вызванной 3-нитропропионовой<sup class="x…

Materials

10X PBS Buffer	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalin	T&I	BPP-9004
Ampicillin	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
confocal dish	SPL	200350
confocal microscope	ZEISS	LSM800
coverslip	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher scientific	16140071
Fluorsheild with DAPI	sigma	F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher scientific	14065056
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630080
N2 supplement	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent	abcam	ab176759
Stage Top Incubator	TOKAI HIT	WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787