Summary
I denne undersøgelse slås ekspressionen ned af to nedstrøms signalkomponenter i PERK-vejen, det cytobeskyttende calcineurin og det pro-apoptotiske CHOP, ved hjælp af specifikke shRNA'er. På modsatte måder modulerer disse følsomheden af primære kortikale neuroner til neuritatrofi efter induktion af endoplasmatisk retikulumstress.
Abstract
Akkumuleringen af ufoldede proteiner i det endoplasmatiske retikulum (ER), forårsaget af enhver stresstilstand, udløser det ufoldede proteinrespons (UPR) gennem aktivering af specialiserede sensorer. UPR forsøger først at genoprette homeostase; Men hvis skaden fortsætter, inducerer signaleringen apoptose.
Der er stigende tegn på, at vedvarende og uløst ER-stress bidrager til mange patologiske tilstande, herunder neurodegenerative sygdomme. Fordi UPR styrer celleskæbnen ved at skifte mellem cytobeskyttende og apoptotiske processer, er det vigtigt at forstå de begivenheder, der definerer denne overgang, såvel som de elementer, der er involveret i dens modulering.
For nylig demonstrerede vi, at unormal GM2-gangliosidakkumulering forårsager udtømning af ER Ca2+ -indhold, hvilket igen aktiverer PERK (PKR-lignende-ER-kinase), en af UPR-sensorerne. Desuden deltager PERK-signalering i neuritatrofi og apoptose induceret af GM2-akkumulering. I denne henseende har vi etableret et eksperimentelt system, der giver os mulighed for molekylært at modulere ekspressionen af nedstrøms PERK-komponenter og dermed ændre neuronernes sårbarhed til at gennemgå neuritisk atrofi.
Vi udførte knockdown af calcineurin (cytoprotektiv) og CHOP (pro-apoptotisk) ekspression i rottekortikale neuronale kulturer. Celler blev inficeret med lentivirus-leveret specifikt shRNA og derefter behandlet med GM2 på forskellige tidspunkter, fikseret og immunfarvet med anti-MAP2 (mikrorørassocieret protein 2) antistof. Senere blev cellebilleder optaget ved hjælp af et fluorescensmikroskop, og total neuritudvækst blev evalueret ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren ImageJ i det offentlige domæne. Inhiberingen af ekspression af disse PERK-signalkomponenter gjorde det klart muligt enten at accelerere eller forsinke den neuritiske atrofi induceret af ER-stress.
Denne tilgang kan anvendes i cellesystemmodeller af ER-stress til at evaluere neuronernes sårbarhed over for neurotatrofi.
Introduction
Endoplasmatisk retikulum (ER) stress defineres som enhver forstyrrelse, der kompromitterer proteinfoldningskapaciteten i organellen. Akkumuleringen af ufoldede proteiner i ER-lumen aktiverer et transduktionskaskadesignal kaldet det ufoldede proteinrespons (UPR). Denne komplekse signalvej er orkestreret af tre stresssensorer: PERK (proteinkinase RNA [PKR]-lignende ER-kinase), IRE1 (inositol-krævende enzym 1) og ATF6 (aktiveret transkriptionsfaktor 6). Alt sammen forsøger at genoprette homeostase. Men hvis stress vedvarer, inducerer UPR til sidst celledød ved apoptose1.
PERK, et ER-transmembranprotein, fører efter ER-stress phosphoryleringen af eukaryot initieringsfaktor-2 alfa (eIF2α), hvilket reducerer den globale proteinsyntese og dermed proteinbelastningen i ER2. Vi demonstrerede, at calcineurin A/B (CNA/B), en heterodimer Ca2+ phosphatase, direkte binder PERK's cytosoliske domæne, øger dets autophosphorylering og signifikant forbedrer hæmningen af proteintranslation og cellelevedygtighed 3,4. Interessant nok er CNA / B rigeligt i pattedyrhjernen og skelner mellem to isoformer af underenheden A i CN: α og β.
Under vedvarende ER-stress er PERK-signalvejen den eneste UPR-gren, der forbliver aktiveret, hvilket medierer både pro-overlevelse og apoptotisk respons. I den kroniske fase er en vigtig downstream-begivenhed induktionen af transkriptionsfaktoren, CHOP (CCAAT/enhancer-bindende protein homologt protein)5. Kronisk ER-stress anerkendes også i stigende grad som en fælles bidragyder til en lang række patologiske lidelser, herunder neurodegenerative sygdomme6. Det er vigtigt at forstå, hvordan UPR kan lette cytobeskyttende signalering i stedet for celledød 7. På nuværende tidspunkt ved man imidlertid kun lidt om den nøjagtige mekanisme, der styrer overgangen mellem disse to UPR-faser.
For nylig fandt vi, at gangliosid GM2 akkumuleres i ER-membraner i dyrkede neuroner og inducerer luminal calciumudtømning. Dette aktiverer igen PERK-signalering, som medierer neuritatrofi og apoptose 8. I denne undersøgelse anvendes GM2-opbygningen i dyrkede neuroner som en cellesystemmodel af ER-stressinduceret neuritatrofi. Specifikt manipuleres to PERK-faktorudtryk, CN-Aα og CHOP, som skifter overgangen mellem tidlige / beskyttende begivenheder og en kronisk / apoptotisk fase. For at opnå dette bringes de respektive gener til tavshed; således er primære kortikale neuronkulturer inficeret med lentivirus-leveret specifikt shRNA. Western blot-analyse afslører en signifikant reduktion af CN-Aα- og CHOP-ekspressionsniveauer sammenlignet med kontrolcellerne, som er inficeret med lentivirus, der bærer et krypteret shRNA. Efter denne behandling udsættes neuroner for forskellige inkubationstider for eksogen GM2, fikseret og immunfarvet med anti-mikrotubulusassocieret protein 2 (MAP2) antistof9. Billeder opnås med et epifluorescensmikroskop. Den samlede neuritudvækst evalueres i forhold til det samlede celleantal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøgene udføres i henhold til godkendte protokoller fra National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Godkendelse til gennemførelse af undersøgelsen gives af Animal Care and Ethics Committee (CICUAL) under INIMEC-CONICET-UNC (Resolution nr. 014/2017 B og 006/2017 A).
1. Primære rottekortikale neuronkulturer
- Bedøv E18 Wistar drægtige rotter i et CO 2 kammer med en blanding af 80% CO 2/20% O2 i 60 s eksponering og derefter ofre derefter ved at dislokere halshvirvlerne.
- Udfør følgende trin i en laminar flowhætte. Uddrag encephalon fra embryonerne med en tang stil # 3 og lige skarpe små fjedersaks (materialebord) til Hanks-opløsning i cellekulturskåle.
- Disseker vævet under 20x forstørrelsesglas ved hjælp af to finspidsede tang stil #5, der adskiller frontal cortex fra meninges. Overfør frontal cortex til et 15 ml konisk rør og inkuber vævet med 3-4 ml trypsin-EDTA (0,25%) i 15 minutter ved 37 ° C til kemisk fordøjelse.
- Efter fordøjelsen fortyndes det med 3-4 ml af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) plus 10% føtalt kalveserum (FCS). Derefter vaskes det 3 gange med Ca 2+/Mg2+ fri Hanks Balanced Salt-opløsning og 0,1% glucose ved centrifugering (3000 g i 5 min).
- Vævet adskilles mekanisk 10 gange ved pipettering op og ned ved hjælp af en 1000 μL spids i DMEM plus 10% FCS (Table of Materials). Derefter centrifugeres homogenatet ved 100 x g i 1 min., supernatanten opsamles, og det resterende rumfang færdiggøres til 1000 μl.
- Cellesuspensionen plades på cellekulturskåle med en densitet på 520 celle/mm2 med 2 ml DMEM indeholdende 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin og 1% af et essentielt aminosyreadditiv (se materialetabel). Derefter inkuberes ved 37 °C i et befugtet miljø med 5% CO 2 i2 timer.
- Fjernelse af organisk stof og poly-L-lysinbelægning af cellekulturskåle
- Fjern det organiske stof ved at placere glasmaterialet i et reaktionskammer og tilsæt 96% ethylalkohol for næsten at dække materialet. Derefter tilsættes 68% (w / v) salpetersyre dråbe for dråbe, indtil brunlig-grønlige bobler begynder at dukke op. Når dette sker, skal du dække beholderen delvist og lade reaktionen fortsætte, indtil eksplosionen ophører.
BEMÆRK: Fjern det organiske stof under en gasekstraktionskabine for at undgå udsættelse for skadelige gasser. - Før poly-L-lysinbelægning skylles brillerne med sterilt Mili-Q-vand cirka ti gange. Derefter inkuberes kulturglassene og fade med 0,1 μg/μL poly-L-lysin i 4 timer, før de anvendes. Efter inkubation skylles brillerne med sterilt Mili-Q-vand ca. ti gange.
- Fjern det organiske stof ved at placere glasmaterialet i et reaktionskammer og tilsæt 96% ethylalkohol for næsten at dække materialet. Derefter tilsættes 68% (w / v) salpetersyre dråbe for dråbe, indtil brunlig-grønlige bobler begynder at dukke op. Når dette sker, skal du dække beholderen delvist og lade reaktionen fortsætte, indtil eksplosionen ophører.
- Fjernelse af organisk stof og poly-L-lysinbelægning af cellekulturskåle
- For at tillade neural celledifferentiering skal du ændre mediet til et serumfrit neurobasalt medium med det serumfrie supplement (materialetabel). Opbevar kulturer ved 37 °C med 5% CO2 indtil behandling.
2. Lentivirus produktion
BEMÆRK: De oligonukleotider, der indeholder sekvenserne rettet mod 3'UTR'erne i enten CN-Aα-isoformen eller CHOP og med ikke-målretningssekvenserne (scrambles), er anført i tabel 1.
- Til udglødning blandes to enkeltstrengede oligonukleotider med komplementære sekvenser i lige molære mængder ved anvendelse af Annealing Buffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Der opvarmes til 95 °C i 2 minutter, og afkøles derefter langsomt ved at overføre prøver fra varmeblokken eller vandbadet til en bordplade ved stuetemperatur. Det resulterende produkt fortyndes [kort hårnåle-RNA, (shRNA) med sammenhængende ender] til en slutkoncentration på 0,5 μM, alikvote dem og opbevares ved -20 °C.
- Klon shRNA-indsatsen i lentiviral vektor pLKO.3G med GFP som en grøn fluorescerende markør. Til dette fordøjes 1 μg vektor med EcoRI- og PaCi-restriktionsenzymer ved at blande følgende i et sterilt rør: 2 μL 10x restriktionsenzymbuffer (100 mM bis-Tris-propan-HCl, pH 6,5, 100 mMMgCl2, 1 mg/ml bovint serumalbumin), 1 μL 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μL 10 E/μL ECoRI, 0,5 μL PacI (10 U / μL) og 16 μL sterilt ioniseret vand.
- Bland forsigtigt ved pipettering. Reaktionen inkuberes i 3-4 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Fordøjelser natten over er generelt unødvendige og kan resultere i DNA-nedbrydning.
- Bland forsigtigt ved pipettering. Reaktionen inkuberes i 3-4 timer ved 37 °C.
- Til ligering blandes den fordøjede vektor og indsættes i et molært forhold på 3:1 og inkuberes med T4-ligase- og ligasebufferen (leveret af producenten) natten over ved 16 °C.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan ligationsreaktionen opbevares ved 4 °C indtil yderligere brug. - Transformér DH5a-kompetente celler (materialetabel) eller en anden egnet E. coli-stamme med ligeringsreaktionen som følger.
- Bland kompetent E. coli med det totale volumen af ligeringsreaktion og afkøl det på is i 15 minutter, læg det i et 42 ° C bad i 2 minutter og afkøl det derefter på is igen i 15 minutter.
- Det samlede volumen, der udsættes for varmechok, overføres til et 15 ml rør, og rumfanget færdiggøres til 1000 μL med Luria-Bertani (LB) flydende medium, der tidligere har været holdt på 37 °C. Bakterierne rystes i 90 minutter ved 37 °C i en orbitalryster ved ca. 330 o/min.
- De centrifugeres ved 5.000 x g i 5 minutter ved 4 °C og 900 μl supernatant kasseres. Den resterende supernatant anvendes til at genopslæmme pelletpelletten. Spred bakteriesuspensionen jævnt over en fast ampicillin (100 μg/ml) LB-plade.
- Der inkuberes ved 37 °C natten over, og bakterievæksten kontrolleres derefter. På dette tidspunkt kan bakterierne opbevares ved 4 °C i 4-5 dage.
- Vælg en enkelt koloni, der skal overføres til et 50 ml rør med 10 ml LB flydende medium og ampicillin (100 μg / ml). Ryst bakterierne ON ved 37 °C ved ca. 330 omdr./min.
- Centrifuger kulturen for at pelletere bakterierne ved 5.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, kassér supernatanten og konserver bakteriepelleten. Dette kan opbevares ved -20 °C.
- Rens plasmidet med et DNA-oprensningssæt fra bakteriepiller efter producentens anvisninger (materialetabel). DNA-koncentrationen beregnes ved at måle absorbansen ved 260 nm og multiplicere med fortyndingsfaktoren ved hjælp af følgende forhold: A260 af 1,0 = 50 μg/ml rent dobbeltstrenget (ds) DNA.
3. Lentivirusinfektion
BEMÆRK: Udfør lentivirusgenereringsproceduren i en klasse II laminær strømningshætte.
- 24 timer før transfektion, frø 1-5 × 106 HEK 293 celler i 100 mm diameter kulturskåle i 8 ml vækstmedium og inkuber dem ved 37 ° C, 5% CO2 natten over.
- Bland 14 μg pKLO.3G-vektor med specifik indsats, 10,5 μg pakningsplasmid psPAX og 3,5 μg konvolutplasmid pMD2.G (materialetabel). 45 μL plasmidtransfektionsreagens (materialefortegnelse) fortyndes i 700 μl reduceret serummedie (materialetabel) og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter kombineres DNA-blandingen med det fortyndede plasmidtransfektionsreagens, blandes forsigtigt og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
- I mellemtiden ændres til frisk DMEM mediet for kulturskålen af HEK 293 cellekulturer (70% sammenflydende på transfektionstidspunktet). Derefter tilsættes hele volumenet af DNA-opløsningen dråbe for dråbe. Rock skålen forsigtigt. Det er ikke nødvendigt at tilføje/skifte medie efter transfektion.
- Inkuber cellerne ved 37 °C, 5% CO2 i 48 timer- 72 timer for at tillade shRNA'er at nå deres optimale transduktion kontrolleret af GFP-fluorescens ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Derefter opsamles substratet med lentivirus og opbevares ved 4 °C.
- Filtrat viral supernatant med en 0,45 μm nylonmembran. Aliquot gennemstrømningen i 1 ml. Derefter centrifugeres ved 17.000 x g i 4 timer. Supernatanten kasseres, og pelletpen bevares. Lad usynlig pellet tørre, og opbevar ved - 80 °C, når den er tørret.
- Udfør viral titrering ved fluxcytometri. Der sås 4 x 105 HEK 293-celler i plader med 24 brønde og inkuberes ved 37 °C i 24 timer. Derefter resuspenderes de virale partikler i 200 μL DMEM-kulturmedium (materialetabel) og tilsættes 0,05, 0,02 og 0,005 μL til hvert hul.
- Inkuber virusinfektion i 72 timer, fjern medium og trypsinize (0,05% trypsin, 1 ml) i 3 minutter. Tilsæt 1 ml DMEM i 10% FCS-opløsning og centrifuger ved 500 x g i 5 min. Supernatanten kasseres og pellets vaskes to gange med PBS.
- Resuspender pellet med 100 μL PBS og fastgør cellerne med 100 μL 2% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Analyser cellerne med et fluxcytometer og bestem procentdelen af GFP fluorescerende celler. Saml disse data for at beregne viral titrering ved hjælp af følgende formel:
Viral titrering
4. Primære neuronkulturer stresset med gangliosid GM2-akkumulering og immuncytokemi ved anvendelse af anti-MAP2-antistof
- Inficere de primære kortikale neuronkulturer (15 dage in vitro) med specifikke shRNA-oligonukleotider rettet mod de 3' UTR af enten CN-Aα eller CHOP og inkubere dem ved 37 °C med 5% CO2 i 1 dag.
BEMÆRK: Primære kortikale neuronkulturer på 7-8 dage in vitro kan også anvendes, hvis cellerne viser høj neuritvækst.- Forbered en 500 μM stamopløsning af gangliosid GM2 i ethanol og soniker den i 1 time.
- Der tilsættes GM2-stamopløsning til dyrkningsskålene ved en slutkoncentration på 2 μM. Der inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 16, 24 og 48 timer.
- Brug nogle kulturer til at forberede cellulært homogenat til western blot-analyse (for antistofspecifikation, se materialetabellen).
- Følg trin 1.4. og 1.5. og fiks derefter cellerne med 4% PFA og 120 mM saccharose i PBS i 20 minutter ved 37 °C, og vask det derefter med PBS. Udfør denne procedure på en skridsikker membran i et vådt kammer. Derefter tilsættes permeabiliseringsopløsning (0,2% Triton X-100 i PBS) i 5 minutter og vaskes med PBS.
- Der anvendes 5 % BSA fortyndet i PBS i 45 minutter for at tillade blokering, hvorefter der inkuberes med anti-MAP2-antistof, fortyndet 1:800 i blokerende opløsning, ved 4 °C natten over.
- Ved afslutningen af inkubationstiden vaskes to gange med PBS og inkuberes med sekundært antistof (materialetabel) i 1 time. Derefter vaskes cellerne med PBS og monteres brillerne på dias ved hjælp af et vandigt monteringsmedium (Table of Materials).
5. Neurit atrofi analyse
- Tag billeder med en 20x luftlinse (NA 0,8) ved hjælp af et epifluorescensinverteret mikroskop udstyret med et CCD-kamera. Analysér billeder med ImageJ-plugins. For dette skal du indlæse billedet til ImageJ og trække baggrunden ved at klikke på Process | Træk baggrund fra.
- Klik på Billede | Juster | Tærskel eller skriv følgende taster: Ctrl (eller Cmd) + Skift + T. Et vindue åbnes for at justere minimumsværdier, så sti- og soma-spor kan skelnes. Klik på det binære billede (neuritter og somas er hvidfarvede). På dette billede skal du bruge frihåndsvalg til at slette somas; Det valgte Soma-område bliver sort igen.
- Vælg sporinger, og klik på Rediger | Udvælgelse | Opret markering. Få ROI ved at klikke på Ctrl (eller Cmd) og T tasterne for markeringen, og bevar den. Åbn det originale billede, klik derefter på ROI-managerpanelet, og vælg det tilhørende ROI, der tidligere er opnået. Klik derefter på det originale billede.
- Når ROI spores på billedet, skal du skrive Ctrl (eller Cmd) og M taster (Analysér | Foranstaltning). Et vindue dukker op; Kopier middelværdien (vilkårlige enheder AU) for at behandle statistisk analyse.
BEMÆRK: For at få værdier som μm skal du klikke på Analysér | Indstil skala. Et vindue dukker op åbent for at indstille værdier. Sørg for at tilføje den korrekte skala (Analysér | Indstil skala) afhængigt af egenskaberne ved det anvendte mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her behandler vi spørgsmålet om, hvorvidt hæmning af to PERK-downstream-komponenter påvirker overgangsfasen af UPR i en ER-stresscellemodel. For at opnå dette dæmper vi CN-Aα-genet såvel som CHOP-genet ved to specifikke shRNA-sekvenser for hver (tabel 1) i primær neuroncellekultur i 1 dag10. Udtrykket analyseres ved Western blotting (figur 1 og figur 2). Der observeres en klar hæmning af ER-stressmedieret CN-Aα og CHOP-stigning i knockdown-celler, men ikke i kontrolceller (shRNA-scrambles). Det skal bemærkes, at det basale CN-ekspressionsniveau ikke påvirkes af denne behandlingstilstand.
Vi undersøger også den mulige forbindelse mellem GM2-akkumuleringsinduceret ER-stress og neuronal degeneration ved at udføre MAP2-immunfarvning af primære neuronale kulturer (figur 3 og figur 4).
Neuritatrofi analyseres som total neuritudvækst i forhold til det samlede celleantal. Dette øges signifikant efter inducering af ER-stress ved inkubation af GM2 ved 16-48 timer. Interessant nok forbedrer hæmning af CN-Aα-ekspression signifikant neuritatrofi, især ved 16 timers GM2-akkumulering i forhold til GM2-ubehandlede grupper (figur 3). Således accelererede CN-Aα knockdown degenerationsprocesserne i neuroner og bekræftede CN's pro-overlevelseseffekt i den tidlige fase af UPR. Omvendt resulterede CHOP-knockdown i signifikant nedsat neuritatrofi i forhold til kontrollerne, specifikt ved 16-24 timer (figur 4).
Figur 1. Dataanalyse for CN-Aα-hæmningseffektivitet. Knockdown evalueres ved Western blot-analyse ved hjælp af antistof mod CN-Aα og GADPH (belastningskontrol). Det primære antistof visualiseres af nær-infrarød fluorescens billeddannelsessystem. Tallene nedenfor repræsenterer det relative intensitetsforhold mellem CN-Aα- og GADPH-båndene. Denne figur er blevet genudgivet fra Virgolini, M.J. et al.4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Dataanalyse for CHOP hæmningseffektivitet. Knockdown evalueres ved Western blot-analyse ved hjælp af et antistof mod CHOP og β actin (belastningskontrol). Det primære antistof visualiseres, og derefter analyseres dataene som angivet i figur 1. Denne figur er blevet genudgivet fra Virgolini, M.J. et al.4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Dataanalyse til neurotisk atrofibilleddannelse i CN-Aα knockdown-celler. (Øverst) Dyrkede primære neuroner er fyldt med GM2. Repræsentative billeder af MAP2 immunfarvede celler vises under kontrol- og eksperimentelle betingelser. Billeder optages med et epifluorescens-inverteret mikroskop udstyret med et CCD-kamera. Skalabjælker: 150 μm (almindelige billeder), 75 μm (forstørrede billeder). (Nederst) Histogram (gennemsnit ± SEM) repræsenterer neuritudvækst i forhold til samlede celler, analyseret af ImagJ-plug-ins. ** * og ## #: p 0,0001 til sammenligning med kontrollen, fra envejs ANOVA. Denne figur er blevet genudgivet fra Virgolini, M.J. et al.4.
Figur 4. (Øverst) Dataanalyse til neurotisk atrofibilleddannelse i CHOP-hæmningsceller. Primære neuronkulturer behandles som angivet i figur 3 (øverst). (Nederst) Histogrammer og statistiske notationer som i figur 3 (nederst) undtagen # #: s≤ 0,001. Denne figur er blevet genudgivet fra Virgolini, M.J. et al.4. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Konstruktioner | Sekvens 5' til 3' shRNA |
| KN-Aα 1 | AATTGCCAGGAATTGGATTCAGTTTCTCGA GAAACTGAATCCAATTCCTGGCTTTTTTTAT |
| KN-Aα 2 | AATTCGCCAACCTTAACTCCATCAACTCGAG TTGATGGAGTTAAGGTTGGCGTTTTTTTTTAT |
| CN-Aα Scrb | AATTGAGTGAATTGTCGCTCTAAGTCTCGAG ACTTAGAGCGACAATTCACTCTTTTTTTTTAT |
| CHOP 1 | AATTGGTCCTGTCCTCAGATGAAATCTCGAG ATTTCATCTGAGGACAGGACCTTTTTTTTTAT |
| CHOP 2 | AATTTGAAGAGAACGAGCGGCTCAACTCGA GTTGAGCCGCTCGTTCTCTTCATTTTTTTAT |
| CHOP Scrb | AATTGAAGAGAGAAAGCGAACAATACTCGAG TATTGTTCGCTTTCTCTCTTTTTTTTTAT |
Tabel 1. Fremadrettede konstruktionssekvenser indsat til pKLG0.3 viral vektor. Scrb: scramble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver et eksperimentelt system, der muliggør molekylær modulering af overgangen fra overlevelse til apoptotiske UPR-faser i en neuronal cellemodel.
For en korrekt analyse af neuritatrofi er det vigtigt at opnå primære neuronkulturer med talrige, lange, stærkt forgrenede processer 9,11. Dette letter undersøgelsen af neuronprocesforlængelse, hvilket gør det muligt at detektere de klare forskelle mellem behandlingerne. Det er vigtigt at bemærke, at hvis primære kortikale neuronkulturer ved 7-8 dage in vitro allerede viser høj neuritudvækst, kan disse bruges til at fremkalde stress og udføre den efterfølgende analyse i stedet for 15 dage in vitro-kulturer.
Desuden bør hæmningsprocenten for ER-stressmedieret CHOP-overekspression være ca. 65-70% eller højere. Det er vigtigt, at hæmning af CN-Aα-ekspressionsniveauet kun påvirker stigningen i ER-stressinduceret CN-Aα-ekspression uden at ændre basalniveauet. Dette er for at minimere påvirkningen af CN-funktioner, der ikke er forbundet med PERK-signalering12,13.
Med hensyn til neuritatrofianalyseproceduren præsenterer dette papir en alternativ metode, der kræver mindre manuelt arbejde end specifikke ImageJ-plug-ins, der hjælper med at spore neuritter. Almindeligvis kræver disse, at processer spores individuelt for hver neuron, mens trinene i dette papir sporer processerne for flere neuroner på én gang ved hjælp af 5 sæt fælles tilgængelige ImageJ-kommandoer. Både plug-ins og denne protokol gør det muligt at kvantificere værdien af alle processerne i eksempelbilledet.
Vi har tidligere demonstreret en ny cytobeskyttende rolle for den allestedsnærværende CN i den tidlige fase af UPR, udløst enten af farmakologiske værktøjer eller iskæmiske processer 3,4,8. Andre og vi beskrev virkningen af hæmning af CHOP-ekspression på celleoverlevelse i forskellige systemer 8,11,14. Her foreslår vi en metode, hvor manipulation af ekspressionen af et af disse gener gør det muligt at modsætte sig modulere begyndelsen af den neuritiske atrofiproces i en cellulær model af ER-stress, der skal moduleres i den modsatte tilstand.
Vi forestiller os, at denne metode kan bruges til at evaluere neuroners modtagelighed for at gennemgå neuritisk atrofi i forskellige cellesystemmodeller af ER-stress og dermed bidrage til at forstå de molekylære baser for overgangen mellem akutte og kroniske faser af UPR i forskellige neurodegenerative sygdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Gonzalo Quasollo for hans uvurderlige hjælp med billeddannelse og Dr. Andrea Pellegrini for teknisk support til cellekultur.
Denne forskning blev støttet af tilskud fra: National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, undertildelingsaftale nr. 165148/165147 mellem UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) og fra National Agency of Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
- Schroder, M., Kaufman, R. J.
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925 (2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170 (2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G.
- Rusnak, F., Mertz, P.
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
