Summary
I den aktuella studien slås uttrycket ner av två nedströms signalkomponenter i PERK-vägen, det cytoprotektiva kalcineurinet och det pro-apoptotiska CHOP, genom att använda specifika shRNA. På motsatta sätt modulerar dessa känsligheten hos primära kortikala neuroner för neuritatrofi efter induktion av endoplasmatisk retikulumstress.
Abstract
Uppsamlingen av veckade proteiner inom endoplasmatisk retikulum (ER), orsakad av något stresstillstånd, utlöser det veckade proteinsvaret (UPR) genom aktivering av specialiserade sensorer. UPR försöker först återställa homeostas; Men om skadan kvarstår inducerar signaleringen apoptos.
Det finns ökande bevis för att ihållande och olöst ER-stress bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Eftersom UPR styr cellens öde genom att växla mellan cytoprotektiva och apoptotiska processer är det viktigt att förstå de händelser som definierar denna övergång, liksom de element som är involverade i dess modulering.
Nyligen visade vi att onormal GM2-gangliosidackumulering orsakar utarmning av ER Ca2+ -innehåll, vilket i sin tur aktiverar PERK (PKR-liknande-ER-kinas), en av UPR-sensorerna. Vidare deltar PERK-signalering i neuritatrofi och apoptos inducerad av GM2-ackumulering. I detta avseende har vi etablerat ett experimentellt system som gör det möjligt för oss att molekylärt modulera uttrycket av nedströms PERK-komponenter och därmed ändra sårbarheten hos neuroner för att genomgå neuritisk atrofi.
Vi utförde knockdown av kalcineurin (cytoprotektiva) och CHOP (pro-apoptotiska) uttryck i råtta kortikala neuronala kulturer. Celler infekterades med lentivirus-levererat specifikt shRNA och behandlades sedan med GM2 vid olika tidpunkter, fixerade och immunfärgade med anti-MAP2 (mikrorörassocierat protein 2) antikropp. Senare togs cellbilder med hjälp av ett fluorescensmikroskop och den totala neuritutväxten utvärderades med hjälp av public domain-bildbehandlingsprogrammet ImageJ. Hämningen av uttrycket av dessa PERK-signalkomponenter gjorde det tydligt möjligt att antingen accelerera eller fördröja den neuritiska atrofi som induceras av ER-stress.
Detta tillvägagångssätt kan användas i cellsystemmodeller av ER-stress för att utvärdera neurons sårbarhet för neuritatrofi.
Introduction
Endoplasmatisk retikulum (ER) stress definieras som varje störning som äventyrar proteinveckningskapaciteten i organellen. Ansamlingen av veckade proteiner i ER-lumen aktiverar en transduktionskaskadesignal som kallas det veckade proteinsvaret (UPR). Denna komplexa signalväg orkestreras av tre stresssensorer: PERK (proteinkinas RNA [PKR]-liknande ER-kinas), IRE1 (inositol-krävande enzym 1) och ATF6 (aktiverad transkriptionsfaktor 6). Alla tillsammans försöker återställa homeostas. Men om stress kvarstår, inducerar UPR så småningom celldöd genom apoptos1.
PERK, ett ER-transmembranprotein, leder vid ER-stress fosforyleringen av eukaryot initieringsfaktor-2 alfa (eIF2α), vilket minskar den globala proteinsyntesen och därmed proteinbelastningen i ER2. Vi visade att kalcineurin A/B (CNA/B), en heterodimer Ca2+ fosfatas, direkt binder den cytosoliska domänen hos PERK, vilket ökar dess autofosforylering och signifikant förbättrar hämningen av proteintranslation och cellviabilitet 3,4. Intressant nog är CNA / B rikligt i däggdjurshjärnan och skiljer två isoformer av underenhet A i CN: α och β.
Under ihållande ER-stress är PERK-signalvägen den enda UPR-grenen som förblir aktiverad, vilket förmedlar både överlevnads- och det apoptotiska svaret. I den kroniska fasen är en viktig händelse nedströms induktionen av transkriptionsfaktorn, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologus protein)5. Kronisk ER-stress erkänns också alltmer som en vanlig bidragsgivare till ett omfattande spektrum av patologiska störningar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar6. Det är viktigt att förstå hur UPR kan underlätta cytoprotektiv signalering istället för celldöd 7. För närvarande är dock lite känt om den exakta mekanismen som styr övergången mellan dessa två UPR-faser.
Nyligen fann vi att gangliosid GM2 ackumuleras i ER-membran i odlade neuroner och inducerar luminal kalciumutarmning. Detta aktiverar i sin tur PERK-signalering, som förmedlar neuritatrofi och apoptos 8. I denna studie används GM2-uppbyggnaden i odlade neuroner som en cellsystemmodell av ER-stressinducerad neuritatrofi. Specifikt manipuleras två PERK-faktoruttryck, CN-Aα och CHOP, som växlar övergången mellan tidiga/skyddande händelser och en kronisk/apoptotisk fas. För att uppnå detta tystas respektive gener; Således infekteras primära kortikala neuronkulturer med lentivirus-levererat specifikt shRNA. Western blot-analys avslöjar en signifikant minskning av CN-Aα- och CHOP-uttrycksnivåer jämfört med kontrollcellerna, som är infekterade med lentivirus som bär ett krypterat shRNA. Efter denna behandling utsätts neuroner för olika inkubationstider av exogen GM2, fixerad och immunfärgad med anti-mikrotubuliassocierat protein 2 (MAP2) antikropp9. Bilder erhålls med ett epifluorescensmikroskop. Den totala neuritutväxten utvärderas i förhållande till det totala cellantalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöken utförs enligt godkända protokoll från National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Godkännande att genomföra studien beviljas av djurvårds- och etikkommittén (CICUAL) vid INIMEC-CONICET-UNC (beslut nr 014/2017 B och 006/2017 A).
1. Primära råtta kortikala neuronkulturer
- Bedöva E18 Wistar gravida råttor i en CO 2-kammare med en blandning av 80% CO2/20%O2 för 60 s exponering och offra sedan genom att förskjuta livmoderhalsen.
- Utför följande steg i en laminär flödeshuv. Extrahera encephalon från embryon med en pincett stil # 3 och rak skarp liten fjädersax (materialtabell) till Hanks lösning i cellodlingsrätter.
- Dissekera vävnaden under 20x förstoringsglas, med hjälp av två finspetsade pincett stil # 5, som skiljer frontal cortex från hjärnhinnorna. Överför frontala cortex till ett 15 ml koniskt rör och inkubera vävnaden med 3-4 ml trypsin-EDTA (0,25%) i 15 min, vid 37 ° C för kemisk nedbrytning.
- Efter matsmältningen, späd den med 3-4 ml Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) plus 10% fosterkalvserum (FCS). Tvätta den sedan 3 gånger med Ca 2+/Mg,2+ fri Hanks Balanced Salt-lösning och0,1 % glukos genom centrifugering (3000 g i 5 min).
- Dissociera vävnaden mekaniskt 10 gånger genom pipettering upp och ner med en 1000 μL spets, i DMEM plus 10% FCS (Table of Materials). Centrifugera sedan homogenatet vid 100 x g i 1 minut, samla upp supernatanten och slutför den återstående volymen till 1000 μl.
- Platta cellsuspensionen på cellodlingsskålar med en densitet av 520 cell/mm 2 med2 ml DMEM innehållande 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin och 1% av en essentiell aminosyratillsats (se materialtabell). Inkubera sedan vid 37 °C i en fuktad miljö med 5 %CO2 i 2 timmar.
- Avlägsnande av organiskt material och poly-L-lysinbeläggning av cellodlingsskålar
- Ta bort det organiska materialet genom att placera glasmaterialet i en reaktionskammare och tillsätt 96% etylalkohol för att nästan täcka materialet. Tillsätt sedan 68% (w / v) salpetersyra droppe för droppe tills brungrönaktiga bubblor börjar dyka upp. När detta händer, täck behållaren delvis och låt reaktionen fortsätta tills explosionen upphör.
OBS: Ta bort det organiska materialet under en gasutsugningshytt för att undvika exponering för skadliga gaser. - Innan poly-L-lysinbeläggning, skölj glasögonen med sterilt Mili-Q-vatten cirka tio gånger. Inkubera sedan odlingsglasen och skålarna med 0,1 μg/μL poly-L-lysin i 4 timmar innan de används. Efter inkubation, skölj glasögonen med sterilt Mili-Q-vatten cirka tio gånger.
- Ta bort det organiska materialet genom att placera glasmaterialet i en reaktionskammare och tillsätt 96% etylalkohol för att nästan täcka materialet. Tillsätt sedan 68% (w / v) salpetersyra droppe för droppe tills brungrönaktiga bubblor börjar dyka upp. När detta händer, täck behållaren delvis och låt reaktionen fortsätta tills explosionen upphör.
- Avlägsnande av organiskt material och poly-L-lysinbeläggning av cellodlingsskålar
- För att tillåta neural celldifferentiering, byt medium för ett serumfritt neurobasalt medium, med det serumfria tillskottet (Table of Materials). Håll kulturerna vid 37 °C med 5 %CO2 fram till behandling.
2. Lentivirus produktion
Anmärkning: De oligonukleotider som innehåller sekvenser riktade mot 3'UTR:erna för antingen CN-Aα-isoformen eller CHOP och med icke-målinriktade sekvenser (scrambles) förtecknas i tabell 1.
- För glödgning, blanda två enkelsträngade oligonukleotider med komplementära sekvenser i lika stora mängder, med användning av glödgningsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Värm vid 95 °C i 2 minuter och låt sedan svalna långsamt genom att överföra proverna från värmeblocket eller vattenbadet till en bänkskiva vid rumstemperatur. Späd den resulterande produkten [kort hårnåls-RNA, (shRNA) med sammanhängande ändar] till en slutlig koncentration på 0,5 μM, alikvotera dem och lagra vid -20 °C.
- Klona shRNA-insatsen i lentiviral vektor pLKO.3G, med GFP som en grön fluorescerande markör. För detta, smält 1 μg vektor med EcoRI- och PacI-restriktionsenzymer genom att blanda följande i ett sterilt rör: 2 μL 10x restriktionsenzymbuffert (100 mM bis-Tris propan-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/ml bovint serumalbumin), 1 μL 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μL 10 E/μL ECoRI, 0,5 μL PacI (10 E/μL) och 16 μL sterilt joniserat vatten.
- Blanda försiktigt genom pipettering. Inkubera reaktionen i 3-4 timmar vid 37 °C.
OBS: Nattliga matsmältningar är i allmänhet onödiga och kan leda till DNA-nedbrytning.
- Blanda försiktigt genom pipettering. Inkubera reaktionen i 3-4 timmar vid 37 °C.
- För ligering blandas den rötade vektorn och sätts in i molförhållandet 3:1 och inkuberas med T4-ligas- och ligasbufferten (tillhandahålls av tillverkaren) över natten vid 16 °C.
OBS: Vid denna tidpunkt kan ligeringsreaktionen förvaras vid 4 °C tills den används ytterligare. - Transformera DH5α-kompetenta celler (materialtabell) eller annan lämplig E. coli-stam med ligeringsreaktionen enligt följande.
- Blanda kompetent E. coli med den totala volymen ligeringsreaktion och kyl den på is i 15 minuter, placera den i ett bad på 42 °C i 2 minuter och kyl den sedan på is igen i 15 minuter.
- Överför den totala volymen som utsätts för värmechock till ett 15 ml rör och slutför volymen till 1000 μl med Luria-Bertani (LB) flytande medium som tidigare har hållits vid 37 °C. Skaka bakterierna i 90 minuter vid 37 °C i orbitalskakapparat vid ca 330 varv/min.
- Centrifugera dem vid 5 000 x g i 5 min vid 4 °C och kassera 900 μl supernatant. Använd återstående supernatant för att återsuspendera pelleten. Sprid bakteriesuspensionen jämnt över en fast ampicillin (100 μg/ml) LB-platta.
- Inkubera vid 37 °C över natten och kontrollera sedan bakterietillväxten. Vid denna tidpunkt kan bakterierna lagras vid 4 °C i 4-5 dagar.
- Välj en enda koloni för att överföra till ett 50 ml rör med 10 ml LB flytande medium och ampicillin (100 μg / ml). Skaka bakterierna ON vid 37 °C vid ca 330 rpm.
- Centrifugera kulturen så att bakterierna pelleteras vid 5 000 x g i 5 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten och bevara bakteriepelleten. Detta kan förvaras vid -20 °C.
- Rengör plasmiden med en DNA-reningssats från bakteriepelleten enligt tillverkarens instruktioner (Materialförteckning). Beräkna DNA-koncentrationen genom att mäta absorbansen vid 260 nm och multiplicera med utspädningsfaktorn med hjälp av följande förhållande: A260 med 1,0 = 50 μg/ml dubbelsträngat (ds) rent dubbelsträngat (ds) DNA.
3. Lentivirusinfektion
OBS: Utför linsvirusgenereringsproceduren i en klass II laminär flödeshuv.
- 24 timmar före transfektion, frö 1-5 × 106 HEK 293 celler till 100 mm odlingsskålar i diameter i 8 ml odlingsmedium och inkubera dem vid 37 °C, 5%CO2 över natten.
- Blanda 14 μg pKLO.3G-vektor med specifik insats, 10,5 μg förpackningsplasmid psPAX och 3,5 μg höljeplasmid pMD2.G (materialtabell). Späd 45 μl plasmidtransfektionsreagens (materialtabell) i 700 μl reducerat serummedium (materialtabell) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Kombinera sedan DNA-blandningen med det utspädda plasmidtransfektionsreagenset, blanda försiktigt och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Under tiden, byt för färskt DMEM mediet för odlingsskålen för HEK 293-cellkulturer (70% sammanflytande vid transfektion). Tillsätt sedan hela volymen av DNA-lösningen droppe för droppe. Gunga skålen försiktigt. Det är inte nödvändigt att lägga till/byta medium efter transfektion.
- Inkubera cellerna vid 37 °C, 5% CO2 i 48h-72 h så att shRNA kan nå sin optimala transduktion kontrollerad med GFP-fluorescens med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Samla sedan upp mediet med lentivirus och förvara vid 4 °C.
- Filtrat viral supernatant med ett 0,45 μm nylonmembran. Alikvot genomströmningen i 1 ml. Centrifugera sedan vid 17 000 x g i 4 timmar. Kassera supernatanten och spara pelleten. Låt den osynliga pelleten torka och förvara vid - 80 °C när den torkat.
- Utför viral titrering genom flödescytometri. Ympa 4 x 105 HEK 293 celler i plattor med 24 brunnar och inkubera vid 37 °C i 24 timmar. Resuspendera sedan viruspartiklarna i 200 μL DMEM-odlingsmedium (Table of Materials) och tillsätt 0,05, 0,02 och 0,005 μL till varje brunn.
- Inkubera virusinfektion i 72 timmar, ta bort medium och trypsinisera (0,05% trypsin, 1 ml) i 3 min. Tillsätt 1 ml DMEM i 10% FCS-lösning och centrifugera vid 500 x g i 5 min. Kassera supernatanten och tvätta pelleten två gånger med PBS.
- Resuspendera pelleten med 100 μL PBS och fixera cellerna med 100 μL 2% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Analysera cellerna med en flödescytometer och bestäm andelen GFP-fluorescerande celler. Samla in dessa data för att beräkna viral titrering med följande formel:
Viral titrering
4. Primära neuronkulturer stressade med gangliosid GM2-ackumulering och immunocytokemi med användning av anti-MAP2-antikropp
- Infektera de primära kortikala neuronkulturerna (15 dagar in vitro) med specifika shRNA-oligonukleotider riktade mot 3'-UTR:erna i antingen CN-Aα eller CHOP och inkubera dem vid 37 °C med 5 %CO2 under 1 dag.
OBS: Primära kortikala neuronkulturer på 7-8 dagar in vitro kan också användas om cellerna visar hög neurittillväxt.- Förbered en 500 μM stamlösning av gangliosid GM2 i etanol och sonikera den i 1 timme.
- Tillsätt GM2-stamlösning till odlingsskålmediet vid en slutlig koncentration på 2 μM. Låt inkubera vid 37 °C med 5 %CO2 i 16, 24 och 48 timmar.
- Använd vissa kulturer för att bereda cellulärt homogenat för western blot-analys (för antikroppsspecifikation, se materialtabellen).
- Följ steg 1.4. och 1.5. och fixera sedan cellerna med 4% PFA och 120 mM sackaros i PBS i 20 minuter vid 37 °C och tvätta dem sedan med PBS. Utför denna procedur på ett halkskyddande membran i en våt kammare. Tillsätt sedan permeabiliseringslösning (0,2% Triton X-100 i PBS) i 5 minuter och tvätta med PBS.
- Använd 5% BSA utspädd i PBS i 45 minuter för att tillåta blockering, inkubera sedan med anti-MAP2-antikropp, utspädd 1:800 i blockerande lösning, vid 4 °C över natten.
- Vid slutet av inkubationstiden, tvätta två gånger med PBS och inkubera med sekundär antikropp (materialtabell) i 1 h. Tvätta sedan cellerna med PBS och montera glasögonen på objektglas med ett vattenhaltigt monteringsmedium (Table of Materials).
5. Neuritatrofi analys
- Ta bilder med en 20x luftlins (NA 0,8) med hjälp av ett epifluorescensinverterat mikroskop utrustat med en CCD-kamera. Analysera bilder med ImageJ-plugin-program. För detta, ladda bilden till ImageJ och subtrahera bakgrunden genom att klicka på Process | Subtrahera bakgrund.
- Klicka på bilden | Justera | Tröskelvärde eller skriv följande tangenter: Ctrl (eller Cmd) + Skift + T. Ett fönster öppnas för att justera minimivärdena, så att sökväg och soma-spårning kan urskiljas. Klicka på den binära bilden (neuriter och somas är vitfärgade). På den här bilden använder du frihandsmarkering för att ta bort somas; Det markerade SOMA-området blir svart igen.
- Markera spårningar och klicka på Redigera | Urval | Skapa markering. Få ROI genom att klicka ctrl (eller Cmd) och T tangenter för markeringen och spara den. Öppna originalbilden, klicka sedan på ROI-hanteringspanelen och välj tillhörande ROI, som tidigare erhållits. Klicka sedan på originalbilden.
- När ROI spåras på bilden skriver du Ctrl (eller Cmd) och M-tangenterna (Analysera | Mäta). Ett fönster öppnas; Kopiera medelvärdet (godtyckliga enheter a.u.) för att bearbeta statistisk analys.
OBS: För att få värden som μm, klicka på Analysera | Ställ in skala. Ett fönster dyker upp för att ställa in värden. Se till att lägga till rätt skala (Analysera | Ställ in skala) beroende på egenskaperna hos det använda mikroskopet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här tar vi upp frågan om huruvida tystning av två PERK nedströms komponenter påverkar övergångsfasen av UPR i en ER-stresscellmodell. För att uppnå detta tystar vi CN-Aα-genen såväl som CHOP-genen med två specifika shRNA-sekvenser för varje (tabell 1) i primär neuroncellodling under 1 dag10. Uttrycket analyseras av Western blotting (figur 1 och figur 2). En tydlig hämning observeras av ER-stressmedierad CN-Aα- och CHOP-ökning i knockdown-celler, men inte i kontrollceller (shRNA-scrambles). Det bör noteras att den basala CN-uttrycksnivån inte påverkas av detta behandlingstillstånd.
Vi undersöker också den möjliga kopplingen mellan GM2-ackumuleringsinducerad ER-stress och neuronal degeneration genom att utföra MAP2-immunfärgning av primära neuronala kulturer (figur 3 och figur 4).
Neuritatrofi analyseras som total neuritutväxt i förhållande till det totala cellantalet. Detta ökar signifikant efter inducering av ER-stress genom inkubation av GM2 vid 16-48 timmar. Intressant nog ökar tystningen av CN-Aα-uttryck signifikant neuritatrofi, särskilt vid 16 timmars GM2-ackumulering, i förhållande till GM2-obehandlade grupper (figur 3). Således påskyndade CN-Aα-knockdown degenerationsprocesserna i neuroner, vilket bekräftar överlevnadseffekten av CN under den tidiga fasen av UPR. Omvänt resulterade CHOP-knockdown i signifikant minskad neuritatrofi jämfört med kontroller, särskilt vid 16-24 timmar (figur 4).
Figur 1. Dataanalys för CN-Aα-ljuddämpningseffektivitet. Knockdown utvärderas genom Western blot-analys med antikroppar mot CN-Aα och GADPH (laddningskontroll). Den primära antikroppen visualiseras genom nära infrarött fluorescensbildsystem. Siffrorna nedan representerar det relativa intensitetsförhållandet mellan CN-Aα- och GADPH-banden. Denna siffra har publicerats på nytt från Virgolini, M.J. et al.4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Dataanalys för CHOP-ljuddämpningseffektivitet. Knockdown utvärderas genom Western blot-analys med hjälp av en antikropp mot CHOP och β aktin (laddningskontroll). Den primära antikroppen visualiseras och sedan analyseras data enligt figur 1. Denna siffra har publicerats på nytt från Virgolini, M.J. et al.4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Dataanalys för neuritisk atrofiavbildning i CN-Aα-knockdown-celler. (Överst) Odlade primära neuroner laddas med GM2. Representativa bilder av MAP2 immunfärgade celler visas under kontroll och experimentella förhållanden. Bilderna spelas in med ett epifluorescensinverterat mikroskop utrustat med en CCD-kamera. Skalstreck: 150 μm (vanliga bilder), 75 μm (förstorade bilder). (Nederst) Histogram (medelvärde ± SEM) representerar neuritutväxt med avseende på totala celler, analyserade med ImagJ-plugin-program. ** * och ## #: p 0,0001 för jämförelse med kontrollen, från enkelriktad ANOVA. Denna siffra har publicerats på nytt från Virgolini, M.J. et al.4.
Figur 4. (Överst) Dataanalys för neuritisk atrofiavbildning i CHOP-ljuddämpande celler. Primära neuronkulturer behandlas enligt figur 3 (överst). (Nederst) Histogram och statistiska noteringar som i figur 3 (nederst) utom # #: s≤ 0,001. Denna siffra har publicerats på nytt från Virgolini, M.J. et al.4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Konstruktioner | Sekvens 5' till 3' shRNA |
| KN-Aα 1 Annonser | AATTGCCAGGAATTGGATTCAGTTTCTCGA GAAACTGAATCCAATTCCTGGCTTTTTTTAT |
| CN-Aα 2 | AATTCGCCAACCTTAACTCCATCAACTCGAG TTGATGGAGTTAAGGTTGGCGTTTTTTTAT |
| CN-Aα Scrb | AATTGAGTGAATTGTCGCTCTAAGTCTCGAG ACTTAGAGCGACAATTCACTCTTTTTTTAT |
| HACKA 1 | AATTGGTCCTGTCCTCAGATGAGAAATCTCGAG ATTTCATCTGAGGACAGGACCTTTTTTTAT |
| HACKA 2 | AATTTGAAGAGAACGAGCGGCTCAACTCGA GTTGAGCCGCTCGTTCTCTTTTTTTTTTAT |
| CHOP Scrb | AATTGAAGAGAGAAAGCGAACAATACTCGAG TATTGTTCGCTTTCTCTCTCTTTTTTTTTAT |
Tabell 1. Framåtriktade konstruktionssekvenser infogade i pKLG0.3 viral vektor. Scrb: klättra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver ett experimentellt system som möjliggör molekylär modulering av övergången från överlevnad till apoptotiska UPR-faser i en neuronal cellmodell.
För en korrekt analys av neuritatrofi är det viktigt att erhålla primära neuronkulturer med många, långa, mycket grenade processer 9,11. Detta underlättar undersökningen av neuronprocessförlängning, vilket gör att de tydliga skillnaderna mellan behandlingar kan detekteras. Det är viktigt att notera att om primära kortikala neuronkulturer vid 7-8 dagar in vitro redan visar hög neuritutväxt, kan dessa användas för att inducera stress och utföra den efterföljande analysen istället för 15 dagar in vitro-kulturer.
Dessutom bör hämningsprocenten för ER-stressmedierat CHOP-överuttryck vara cirka 65-70% eller högre. Viktigt är att nedtystning av CN-Aα-uttrycksnivån endast bör påverka ER-stressinducerad CN-Aα-uttrycksökning utan att ändra dess basalnivå. Detta för att minimera påverkan på CN-funktioner som inte är associerade med PERK signalering12,13.
När det gäller neuritatrofianalysproceduren presenterar detta dokument en alternativ metod som kräver mindre manuellt arbete än specifika ImageJ-plugin-program som hjälper till att spåra neuriter. Vanligtvis kräver dessa att processer spåras individuellt för varje neuron, medan stegen som följs i detta dokument spårar processerna hos flera neuroner samtidigt med hjälp av 5 uppsättningar vanliga tillgängliga ImageJ-kommandon. Både plug-ins och detta protokoll gör det möjligt att kvantifiera värdet av alla processer i exempelbilden.
Vi har tidigare demonstrerat en ny cytoprotektiv roll för det allestädes närvarande CN i den tidiga fasen av UPR, utlöst antingen av farmakologiska verktyg eller ischemiska processer 3,4,8. Andra och vi beskrev effekten av hämningen av CHOP-uttryck på cellöverlevnad i olika system 8,11,14. Här föreslår vi en metod där manipulering av uttrycket av någon av dessa gener gör det möjligt att motsatt modulera början av den neuritiska atrofiprocessen i en cellulär modell av ER-stress som ska moduleras i motsatt läge.
Vi ser framför oss att denna metodik kan användas för att utvärdera känsligheten hos neuroner för att genomgå neuritisk atrofi i olika cellsystemmodeller av ER-stress och därmed bidra till att förstå de molekylära baserna för övergången mellan akuta och kroniska faser av UPR i olika neurodegenerativa sjukdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Gonzalo Quasollo för hans ovärderliga hjälp med bildbehandling och Dr. Andrea Pellegrini för teknisk support för cellodling.
Denna forskning stöddes av bidrag från: National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 mellan UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) och från National Agency of Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
- Schroder, M., Kaufman, R. J.
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925 (2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170 (2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G.
- Rusnak, F., Mertz, P.
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
