Summary
Bu çalışmada, ekspresyon, spesifik shRNA'lar kullanılarak PERK yolunun iki aşağı akış sinyal bileşeninin, sitoprotektif kalsinörin ve pro-apoptotik CHOP'un ifadesi yıkılmıştır. Zıt yönlerde, bunlar endoplazmik retikulum stresinin indüksiyonundan sonra primer kortikal nöronların nörit atrofisine duyarlılığını modüle eder.
Abstract
Herhangi bir stres durumunun neden olduğu endoplazmik retikulum (ER) içinde katlanmamış proteinlerin birikmesi, özel sensörlerin aktivasyonu yoluyla katlanmamış protein tepkisini (UPR) tetikler. UPR önce homeostazı restore etmeye çalışır; ancak hasar devam ederse, sinyal apoptozu indükler.
Sürekli ve çözülmemiş ER stresinin nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok patolojik duruma katkıda bulunduğuna dair kanıtlar artmaktadır. UPR, sitoprotektif ve apoptotik süreçler arasında geçiş yaparak hücre kaderini kontrol ettiğinden, bu geçişi tanımlayan olayları ve modülasyonunda yer alan unsurları anlamak önemlidir.
Son zamanlarda, anormal GM2 ganglioside birikiminin ER Ca2+ içeriğinin tükenmesine neden olduğunu ve bunun da UPR sensörlerinden biri olan PERK'yi (PKR benzeri-ER kinaz) aktive ettiğini gösterdik. Ayrıca, PERK sinyalizasyonu, GM2 birikiminin neden olduğu nörit atrofisine ve apoptozuna katılır. Bu bağlamda, aşağı akış PERK bileşenlerinin ekspresyonunu moleküler olarak modüle etmemize ve böylece nöronların nöritik atrofiye maruz kalma kırılganlığını değiştirmemize izin veren deneysel bir sistem kurduk.
Sıçan kortikal nöronal kültürlerinde kalsinörin (sitoprotektif) ve CHOP (pro-apoptotik) ekspresyonunun knockdown'unu gerçekleştirdik. Hücreler lentivirüs tarafından verilen spesifik shRNA ile enfekte edildi ve daha sonra farklı zamanlarda GM2 ile tedavi edildi, anti-MAP2 (mikrotüp ile ilişkili protein 2) antikoru ile sabitlendi ve immünoboyalandı. Daha sonra, hücre görüntüleri bir floresan mikroskobu kullanılarak kaydedildi ve toplam nörit büyümesi, kamu malı görüntü işleme yazılımı ImageJ kullanılarak değerlendirildi. Bu PERK sinyal bileşenlerinin ekspresyonunun inhibisyonu, ER stresinin neden olduğu nöritik atrofiyi hızlandırmayı veya geciktirmeyi açıkça mümkün kılmıştır.
Bu yaklaşım, nöronların nörit atrofisine karşı savunmasızlığını değerlendirmek için ER stresinin hücre sistemi modellerinde kullanılabilir.
Introduction
Endoplazmik retikulum (ER) stresi, organeldeki protein katlama kapasitesini tehlikeye atan herhangi bir pertürbasyon olarak tanımlanır. Katlanmamış proteinlerin ER lümeni içinde birikmesi, katlanmamış protein yanıtı (UPR) adı verilen bir transdüksiyon kaskad sinyalini aktive eder. Bu karmaşık sinyal yolu üç stres sensörü tarafından düzenlenir: PERK (protein kinaz RNA [PKR] benzeri ER kinaz), IRE1 (inositol gerektiren enzim 1) ve ATF6 (aktif transkripsiyon faktörü 6). Hep birlikte homeostazı restore etmeye çalışır. Ancak stres devam ederse, UPR sonunda apoptoz1 ile hücre ölümünü indükler.
Bir ER transmembran proteini olan PERK, ER stresi üzerine, ökaryotik başlatma faktörü-2 alfanın (eIF2α) fosforilasyonuna yol açarak, küresel protein sentezini ve dolayısıyla ER2'deki protein yükünü azaltır. Bir heterodimer Ca2+ fosfataz olan kalsinörin A/B'nin (CNA/B), PERK'in sitozolik alanını doğrudan bağladığını, oto-fosforilasyonunu arttırdığını ve protein translasyonunun ve hücre canlılığının inhibisyonunu önemli ölçüde arttırdığını gösterdik 3,4. İlginç bir şekilde, CNA / B, memeli beyninde bol miktarda bulunur ve CN'nin A alt biriminin iki izoformunu ayırt eder: α ve β.
Sürekli ER stresi altında, PERK sinyal yolu aktif kalan tek UPR dalıdır, böylece hem hayatta kalma yanlısı hem de apoptotik tepkiye aracılık eder. Kronik fazda, önemli bir aşağı akış olayı, transkripsiyon faktörü olan CHOP'un (CCAAT / arttırıcı bağlayıcı protein homolog protein) indüksiyonudur5. Kronik ER stresi, nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere çok çeşitli patolojik bozukluklara ortak bir katkıda bulunan bir faktör olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir6. UPR'nin hücre ölümü yerine sitoprotektif sinyallemeyi nasıl kolaylaştırabileceğini anlamak önemlidir 7. Bununla birlikte, şu anda bu iki UPR fazı arasındaki geçişi kontrol eden kesin mekanizma hakkında çok az şey bilinmektedir.
Son zamanlarda, kültürlü nöronlarda, ganglioside GM2'nin ER membranlarında biriktiğini ve luminal kalsiyum tükenmesini indüklediğini bulduk. Bu da nörit atrofisi ve apoptoz 8'e aracılık eden PERK sinyallemesini aktive eder. Bu çalışmada, kültürlü nöronlarda GM2 birikimi, ER stresine bağlı nörit atrofisinin bir hücre sistemi modeli olarak kullanılmıştır. Spesifik olarak, iki PERK faktör ifadesi manipüle edilir, CN-Aα ve CHOP, erken / koruyucu olaylar ile kronik / apoptotik bir faz arasındaki geçişi değiştirir. Bunu başarmak için, ilgili genler susturulur; Böylece, primer kortikal nöron kültürleri lentivirüs tarafından verilen spesifik shRNA ile enfekte olur. Western blot analizi, karıştırılmış bir shRNA taşıyan lentivirüs ile enfekte olmuş kontrol hücrelerine kıyasla CN-Aα ve CHOP ekspresyon seviyelerinin önemli ölçüde azaldığını ortaya koymaktadır. Bu tedaviden sonra, nöronlar ekzojen GM2'nin farklı kuluçka sürelerine tabi tutulur, sabit ve anti-mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2) antikoru9 ile immünoboyalıdır. Görüntüler epifloresan mikroskop ile elde edilir. Toplam nörit büyümesi toplam hücre sayısına göre değerlendirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun onaylanmış protokollerini izleyerek gerçekleştirilir. Çalışmanın yürütülmesi için onay, INIMEC-CONICET-UNC Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi (CICUAL) tarafından verilmektedir (Karar numaraları 014/2017 B ve 006/2017 A).
1. Primer sıçan kortikal nöron kültürleri
- E18 Wistar hamile sıçanları, 60 s maruz kalma için% 80 CO 2/20%O2 karışımı ile bir CO2 odasında anestezi yapın ve daha sonra servikal omurları yerinden ederek feda edin.
- Laminer akış başlığında aşağıdaki adımları uygulayın. Ensefalonu, forseps stili # 3 ve düz keskin küçük yaylı makas (Malzeme Tablosu) ile embriyolardan hücre kültürü kaplarında Hanks çözeltisine çıkarın.
- Dokuyu 20x büyüteç altında disseke edin, iki ince uçlu forseps stili #5 kullanarak frontal korteksi meninkslerden ayırın. Frontal korteksi 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve dokuyu kimyasal sindirim için 37 ° C'de 15 dakika boyunca 3-4 mL Tripsin-EDTA (% 0.25) ile inkübe edin.
- Sindirimden sonra, 3-4mL Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) artı% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile seyreltin. Daha sonra Ca 2+/Mg2+ içermeyen Hanks Dengeli Tuz çözeltisi ve santrifüjleme yoluyla% 0.1 glikoz (5 dakika boyunca 3000 g) ile 3 kez yıkayın.
- DMEM artı %10 FCS (Malzeme Tablosu) içinde 1000 μL'lik bir uç kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dokuyu 10 kez mekanik olarak ayrıştırın. Daha sonra homojenatı 1 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj edin, süpernatantı toplayın ve kalan hacmi 1000 μL'ye tamamlayın.
- Hücre kültürü tabakları üzerindeki hücre süspansiyonunu,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 esansiyel bir aminoasit katkı maddesi içeren 2 mL DMEMile 520 hücre / mm2 yoğunlukta plakalayın (bkz. Daha sonra nemlendirilmiş bir ortamda 37 °C'de 2 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Organik madde giderimi ve hücre kültürü kaplarının poli-L-lizin kaplaması
- Cam malzemeyi bir reaksiyon odasına yerleştirerek organik maddeyi çıkarın ve malzemeyi hemen hemen örtmek için% 96 etil alkol ekleyin. Ardından, kahverengimsi-yeşilimsi kabarcıklar görünmeye başlayana kadar% 68 (w / v) nitrik asit damla damla ekleyin. Bu gerçekleştiğinde, kabı kısmen örtün ve patlama durana kadar reaksiyonun devam etmesine izin verin.
NOT: Zararlı gazlara maruz kalmamak için organik maddeyi bir gaz emme kabininin altından çıkarın. - Poli-L-lizin kaplamadan önce, camları steril Mili-Q suyla yaklaşık on kez durulayın. Daha sonra kültür bardaklarını ve tabaklarını kullanmadan önce 4 saat boyunca 0.1 μg / μL poli-L-lizin ile inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bardakları steril Mili-Q suyla yaklaşık on kez durulayın.
- Cam malzemeyi bir reaksiyon odasına yerleştirerek organik maddeyi çıkarın ve malzemeyi hemen hemen örtmek için% 96 etil alkol ekleyin. Ardından, kahverengimsi-yeşilimsi kabarcıklar görünmeye başlayana kadar% 68 (w / v) nitrik asit damla damla ekleyin. Bu gerçekleştiğinde, kabı kısmen örtün ve patlama durana kadar reaksiyonun devam etmesine izin verin.
- Organik madde giderimi ve hücre kültürü kaplarının poli-L-lizin kaplaması
- Nöral hücre farklılaşmasına izin vermek için, serumsuz bir nörobazal ortamın ortamını, serumsuz takviye ile değiştirin (Malzeme Tablosu). Kültürlerini tedaviye kadar% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.
2. Lentivirüs üretimi
NOT: CN-Aα izoformu veya CHOP'un 3'UTR'lerini hedefleyen dizileri ve hedeflemeyen dizileri (karıştırmalar) içeren oligonükleotidler Tablo 1'de listelenmiştir.
- Tavlama için, Tavlama Tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) kullanarak iki tek sarmallı oligonükleotidi eşit molar miktarlarda tamamlayıcı dizilerle karıştırın.
- 95 °C'de 2 dakika ısıtın ve ardından numuneleri ısı bloğundan veya su banyosundan oda sıcaklığında bir tezgaha aktararak yavaşça soğutun. Elde edilen ürünü [kısa saç tokası RNA, (shRNA) yapışkan uçlu] 0.5 μM'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin, alikot edin ve -20 ° C'de saklayın.
- shRNA ekini lentiviral vektör pLKO.3G'ye klonlayın, GFP yeşil floresan işaretleyici olarak. Bunun için, aşağıdakileri steril bir tüpte karıştırarak EcoRI ve PacI kısıtlama enzimleri ile 1 μg vektörü sindirin: 2 μL 10x kısıtlama enzim tamponu (100 mM bis-Tris propan-HCl, pH 6.5, 100 mM MgCl2, 1 mg / mL sığır serum albümini), 1 μL 1 μg / μL pLKO.3G, 0.5 μL 10 U / μL ECoRI, 0.5 μL PacI (10 U / μL) ve 16 μL steril iyonize su.
- Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. Reaksiyonu 37 ° C'de 3-4 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Gece boyunca yapılan sindirimlemeler genellikle gereksizdir ve DNA bozulmasına neden olabilir.
- Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. Reaksiyonu 37 ° C'de 3-4 saat boyunca inkübe edin.
- Ligasyon için, sindirilmiş vektörü karıştırın ve 3: 1'lik bir molar oranında yerleştirin ve 16 ° C'de gece boyunca T4 ligaz ve ligaz tamponu (üretici tarafından sağlanan) ile inkübe edin.
NOT: Bu noktada ligasyon reaksiyonu daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir. - DH5α yetkin hücreleri (Malzeme Tablosu) veya başka bir uygun E. coli suşunu ligasyon reaksiyonu ile aşağıdaki gibi dönüştürün.
- Yetkili E. coli'yi toplam ligasyon reaksiyonu hacmi ile karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde soğutun, 2 dakika boyunca 42 ° C'lik bir banyoya koyun ve ardından 15 dakika boyunca tekrar buz üzerinde soğutun.
- Isı şokuna maruz kalan toplam hacmi 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve daha önce 37 ° C'de tutulan Luria-Bertani (LB) sıvı ortamı ile hacmi 1000 μL'ye tamamlayın. Bakterileri 37 ° C'de 90 dakika boyunca yaklaşık 330 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda çalkalayın.
- Onları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve 900 μL süpernatan atın. Peleti yeniden askıya almak için kalan süpernatantı kullanın. Bakteri süspansiyonunu katı bir ampisilin (100 μg / mL) LB plakası üzerine eşit olarak yayın.
- Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından bakteri büyümesini kontrol edin. Bu noktada, bakteriler 4-5 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- 10 mL LB sıvı ortamı ve ampisilin (100 μg / mL) içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarmak için tek bir koloni seçin. Bakterileri yaklaşık 330 rpm'de 37 ° C'de AÇIK olarak çalkalayın.
- Bakterileri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'de peletlemek için kültürü santrifüj edin, süpernatantı atın ve bakteri peletini koruyun. Bu -20 °C'de saklanabilir.
- Plazmidi, üreticinin talimatlarını izleyerek bakteri peletinden bir DNA saflaştırma kiti ile saflaştırın (Malzeme Tablosu). Aşağıdaki ilişkiyi kullanarak 260 nm'deki absorbansı ölçerek ve seyreltme faktörü ile çarparak DNA konsantrasyonunu hesaplayın: 1.0 = 50 μg / mL saf çift sarmallı (ds) DNA'nın260'ı .
3. Lentivirüs enfeksiyonu
NOT: Lentivirüs üretim prosedürünü Sınıf II laminer akış başlığında uygulayın.
- Transfeksiyondan 24 saat önce, tohum 1-5 × 106 HEK 293 hücrelerini 8 mL büyüme ortamında 100 mm çapında kültür kaplarına koyun ve bunları 37 °C'de,% 5 CO2'de gece boyunca inkübe edin.
- 14 μg pKLO.3G vektörünü spesifik kesici uç, 10,5 μg ambalaj plazmidi psPAX ve 3,5 μg zarf plazmidi pMD2.G (Malzeme Tablosu) ile karıştırın. 45 μL plazmid transfeksiyon reaktifini (Malzeme Tablosu) 700 μL indirgenmiş serum ortamında (Malzeme Tablosu) seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Daha sonra DNA karışımını seyreltilmiş plazmid transfeksiyon reaktifi ile birleştirin, nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Bu arada, taze DMEM için HEK 293 hücre kültürlerinin kültür çanağının ortamını değiştirin (transfeksiyon sırasında% 70 akıcı). Ardından, DNA çözeltisinin tüm hacmini damla damla ekleyin. Yemeği nazikçe sallayın. Transfeksiyondan sonra ortam eklemek/değiştirmek gerekli değildir.
- ShRNA'ların bir floresan mikroskobu kullanılarak GFP floresan tarafından kontrol edilen optimum transdüksiyonlarına ulaşmalarını sağlamak için hücreleri 37 ° C'de, 48 h-72h için% 5 CO 2'de inkübe edin. Daha sonra, ortamı lentivirüs ile toplayın ve 4 ° C'de saklayın.
- 0.45 μm naylon membranlı filtrat viral süpernatant. 1 mL'de akış Aliquot. Ardından, 4 saat boyunca 17.000 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti koruyun. Görünmez peletin kurumasına izin verin ve kuruduktan sonra - 80 ° C'de saklayın.
- Akı sitometrisi ile viral titrasyon gerçekleştirin. 24 delikli plakalarda tohum 4 x 105 HEK 293 hücre ve 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Daha sonra viral parçacıkları 200 μL DMEM kültür ortamında (Malzeme Tablosu) yeniden askıya alın ve her bir kuyucuğa 0.05, 0.02 ve 0.005 μL ekleyin.
- Viral enfeksiyonu 72 saat boyunca inkübe edin, ortamı çıkarın ve 3 dakika boyunca tripsinize edin (% 0.05 tripsin, 1 mL). %10 FCS çözeltisine 1 mL DMEM ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti PBS ile iki kez yıkayın.
- Peleti 100 μL PBS ile yeniden askıya alın ve hücreleri PBS'de 100 μL% 2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. Hücreleri bir akı sitometresi ile analiz edin ve GFP floresan hücrelerinin yüzdesini belirleyin. Aşağıdaki formülü kullanarak viral titrasyonunu hesaplamak için bu verileri toplayın:
Viral Titrasyon
4. Ganglioside GM2 birikimi ve anti-MAP2 antikoru kullanan immünositokimya ile vurgulanan primer nöron kültürleri
- Birincil kortikal nöron kültürlerini (15 gün in vitro) CN-Aα veya CHOP'un 3' UTR'lerini hedef alan spesifik shRNA oligonükleotidlerle enfekte edin ve bunları 1 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: 7-8 günlük primer kortikal nöron kültürleri in vitro olarak da hücreler yüksek nörit büyümesi gösteriyorsa kullanılabilir.- Etanol içinde ganglioside GM2'nin 500 μM stok çözeltisini hazırlayın ve 1 saat boyunca sonikleştirin.
- 2 μM'lik son konsantrasyonda orta kültür yemeklerine GM2 stok çözeltisi ekleyin. 16, 24 ve 48 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe etmeye bırakın.
- Batı leke analizi için hücresel homojenat hazırlamak üzere bazı kültürleri kullanın (antikor spesifikasyonu için Malzeme Tablosuna bakınız).
- 1.4 numaralı adımları izleyin. ve 1.5. ve daha sonra hücreleri PBS'de% 4 PFA ve 120 mM sakkaroz ile 37 ° C'de 20 dakika sabitleyin ve ardından PBS ile yıkayın. Bu prosedürü ıslak bir odadaki kaymayı önleyici bir membran üzerinde gerçekleştirin. Daha sonra, 5 dakika boyunca geçirgenlik çözeltisi (PBS'de% 0.2 Triton X-100) ekleyin ve PBS ile yıkayın.
- Blokaja izin vermek için PBS'de 45 dakika seyreltilmiş% 5 BSA kullanın, daha sonra anti-MAP2 antikoru ile inkübe edin, blokaj çözeltisinde 1:800 seyreltilmiş, gece boyunca 4 ° C'de.
- Kuluçka süresinin sonunda, PBS ile iki kez yıkayın ve 1 saat boyunca ikincil antikor (Malzeme Tablosu) ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve camları sulu bir montaj ortamı kullanarak slaytlara monte edin (Malzeme Tablosu).
5. Nörit atrofi analizi
- CCD kamera ile donatılmış epifloresan ters çevrilmiş mikroskop kullanarak 20x hava lensi (NA 0.8) ile görüntüler elde edin. ImageJ eklentileriyle görüntüleri analiz edin. Bunun için resmi ImageJ'ye yükleyin ve İşlem | Arka planı çıkarın.
- Resme Tıklayın | Ayarlama | Eşik veya şu tuşları yazın: Ctrl (veya Cmd) + Üst Karakter + T. Minimum değerleri ayarlamak için bir pencere açılır ve yol ve soma izlemelerinin ayırt edilebilir olmasını sağlar. İkili resme tıklayın (nöritler ve somalar beyaz renklidir). Bu görüntüde, somonları silmek için serbest seçimi kullanın; seçilen soma bölgesi tekrar siyaha döner.
- İzleri seçin ve Düzenle'ye tıklayın | Seçim | Seçim Oluştur. Seçimin Ctrl (veya Cmd) ve T tuşlarına tıklayarak yatırım getirisini elde edin ve koruyun. Orijinal görüntüyü açın, ardından YG yöneticisi paneline tıklayın ve daha önce elde edilen ait YG'yi seçin. Ardından orijinal resme tıklayın.
- Yatırım getirisi görüntüde izlendikten sonra, Ctrl (veya Cmd) ve M tuşlarını (Analiz Et | Ölçün). Bir pencere açılır; istatistiksel analizi işlemek için ortalama değeri (keyfi birimler a.u.) kopyalayın.
NOT: Değerleri μm olarak elde etmek için, Analiz Et | Ölçeği ayarlayın. Değerleri ayarlamak için bir pencere açılır. Doğru ölçeği eklediğinizden emin olun (Analiz | Set Scale) kullanılan mikroskobun özelliklerine bağlı olarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, iki PERK aşağı akış bileşeninin susturulmasının bir ER gerilim hücresi modelinde UPR'nin geçiş aşamasını etkileyip etkilemediği sorusunu ele alıyoruz. Bunu başarmak için, CN-Aα genini ve CHOP genini, primer nöron hücre kültüründeki her biri için iki spesifik shRNA dizisi (Tablo 1) ile 1 gün10 boyunca susturuyoruz. İfade Batı lekelemesi ile analiz edilir (Şekil 1 ve Şekil 2). Nakavt hücrelerinde ER stres aracılı CN-Aα ve CHOP artışının açık bir inhibisyonu gözlenir, ancak kontrol hücrelerinde (shRNA karıştırmaları) gözlenmez. Bazal CN ekspresyon seviyesinin bu tedavi durumundan etkilenmediği belirtilmelidir.
Ayrıca, GM2 birikimine bağlı ER stresinin nöronal dejenerasyon ile olası bağlantısını, primer nöronal kültürlerin MAP2 immün boyamasını gerçekleştirerek inceliyoruz (Şekil 3 ve Şekil 4).
Nörit atrofisi, toplam hücre sayısına göre toplam nörit büyümesi olarak analiz edilir. Bu, GM2'nin 16-48 saatte inkübasyonu ile ER stresini indükledikten sonra önemli ölçüde artar. İlginç bir şekilde, CN-Aα ekspresyonunun susturulması, GM2-tedavi edilmeyen gruplara göre, özellikle GM2 birikiminin 16 saatinde nörit atrofisini önemli ölçüde arttırır (Şekil 3). Böylece, CN-Aα knockdown, nöronlardaki dejenerasyon süreçlerini hızlandırdı ve UPR'nin erken evresinde CN'nin hayatta kalma yanlısı etkisini doğruladı. Tersine, CHOP knockdown, özellikle 16-24 saatte, kontrollere göre önemli ölçüde azalmış nörit atrofisi ile sonuçlandı (Şekil 4).
Şekil 1. CN-Aα susturma verimliliği için veri analizi. Nakavt, CN-Aα ve GADPH'ye karşı antikor (yükleme kontrolü) kullanılarak Western blot analizi ile değerlendirilir. Primer antikor yakın kızılötesi floresan görüntüleme sistemi ile görselleştirilir. Aşağıdaki sayılar CN-Aα ve GADPH bantları arasındaki göreceli yoğunluk oranını temsil etmektedir. Bu rakam Virgolini, M.J. ve ark.4'ten yeniden yayınlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. CHOP susturma verimliliği için veri analizi. Nakavt, CHOP'a karşı bir antikor ve β aktinine (yükleme kontrolü) karşı bir antikor kullanılarak Western blot analizi ile değerlendirilir. Primer antikor görselleştirilir ve daha sonra veriler Şekil 1'de belirtildiği gibi analiz edilir. Bu rakam Virgolini, M.J. ve ark.4'ten yeniden yayınlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. CN-Aα knockdown hücrelerinde nöritik atrofi görüntülemesi için veri analizi. (Üstte) Kültürlenmiş primer nöronlar GM2 ile yüklenir. MAP2 immünoboyalı hücrelerin temsili görüntüleri kontrol altında ve deneysel koşullar altında gösterilmiştir. Görüntüler, CCD kamera ile donatılmış epifloresan ters çevrilmiş bir mikroskopla kaydedilir. Ölçek çubukları: 150 μm (normal görüntüler), 75 μm (büyütülmüş görüntüler). (Altta) Histogram (ortalama SEM ±), ImagJ eklentileri tarafından analiz edilen toplam hücrelere göre nörit büyümesini temsil eder. * ve ## #: tek yönlü ANOVA'dan kontrol ile karşılaştırma için p 0.0001. Bu rakam Virgolini, M.J. ve ark.4'ten yeniden yayınlanmıştır.
Şekil 4. (Üstte) CHOP susturma hücrelerinde nöritik atrofi görüntüleme için veri analizi. Primer nöron kültürleri Şekil 3'te (üstte) belirtildiği gibi tedavi edilir. (Altta) ##: p≤ 0.001 hariç, Şekil 3'teki (Alt) histogramlar ve istatistiksel gösterimler. Bu rakam Virgolini, M.J. ve ark.4'ten yeniden yayınlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yapıları | Dizi 5' ila 3' shRNA |
| CN-Aα 1 | AATTGCCAGGAATTGGATTCAGTTTCTCGA GAAACTGAATCCAATTCCTCTGGCTTTTTTTAT |
| CN-Aα 2 | AATTCGCCAACCTTAACTCCATCAACTCGAG TTGATGGAGTTAAGGTTGGCGTTTTTTTAT |
| CN-Aα Scrb | AATTGAGTGAATTGTCGCTCTAAGTCTCGAG ACTTAGAGCGACAATTCACTCTTTTTTTAT |
| DOĞRAMA 1 | AATTGGTCCTGTCCTCAGATGAAATCTCGAG ATTTCATCTGAGGACAGGACCTTTTTTTTTAT |
| DOĞRAMA 2 | AATTTGAAGAGAACGAGCGGCTCAACTCGA GTTGAGCCGCTCGTTCTCTTCATTTTTTTAT |
| CHOP Scrb | AATTGAAGAGAGAAAGCGAACAATACTCGAG TATTGTGTGTGCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT |
Tablo 1. pKLG0.3 viral vektörüne eklenen ileri yapı dizileri. Scrb: karıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir nöronal hücre modelinde sağkalımdan apoptotik UPR fazlarına geçişin moleküler modülasyonunu sağlayan deneysel bir sistemi tanımladık.
Nörit atrofisinin doğru bir analizi için, çok, uzun, çok dallı süreçlere sahip birincil nöron kültürlerinin elde edilmesi esastır 9,11. Bu, nöron süreci uzantısının incelenmesini kolaylaştırır ve tedaviler arasındaki net farklılıkların tespit edilmesini sağlar. 7-8 günlük in vitro primer kortikal nöron kültürleri zaten yüksek nörit büyümesi gösteriyorsa, bunların 15 gün in vitro kültürler yerine stresi indüklemek ve sonraki analizleri yapmak için kullanılabileceğini belirtmek önemlidir.
Ayrıca, ER stres aracılı CHOP aşırı ekspresyonunun inhibisyon yüzdesi yaklaşık% 65-70 veya daha yüksek olmalıdır. Önemli olarak, CN-Aα ekspresyon seviyesinin susturulması, bazal seviyesini değiştirmeden sadece ER strese bağlı CN-Aα ekspresyon artışını etkilemelidir. Bu, PERK sinyalleme12,13 ile ilişkili olmayan CN fonksiyonları üzerindeki etkiyi en aza indirmek içindir.
Nörit atrofisi analizi prosedürü ile ilgili olarak, bu makale, nöritlerin izlenmesine yardımcı olan belirli ImageJ eklentilerinden daha az manuel çalışma gerektiren alternatif bir metodoloji sunmaktadır. Genellikle, bunlar süreçlerin her bir nöron için ayrı ayrı izlenmesini gerektirirken, bu makalede izlenen adımlar, 5 ortak erişilebilir ImageJ komutu seti kullanılarak aynı anda birden fazla nöronun süreçlerini izler. Hem eklentiler hem de bu protokol, örnek görüntüdeki tüm işlemlerin değerinin ölçülmesini sağlar.
Daha önce, farmakolojik araçlar veya iskemik süreçler tarafından tetiklenen UPR'nin erken evresinde her yerde bulunan CN için yeni bir sitoprotektif rol göstermiştik 3,4,8. Diğerleri ve biz CHOP ekspresyonunun inhibisyonunun farklı sistemlerde hücre sağkalımı üzerindeki etkisini tanımladık 8,11,14. Burada, bu genlerin herhangi birinin ekspresyonunu manipüle etmenin, nöritik atrofi sürecinin başlangıcını, ters modda modüle edilecek hücresel bir ER stres modelinde modüle etmeyi sağlayan bir metodoloji öneriyoruz.
Bu metodolojinin, ER stresinin farklı hücre sistemi modellerinde nöronların nöritik atrofiye maruz kalma duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabileceğini ve böylece çeşitli nörodejeneratif hastalık modellerinde UPR'nin akut ve kronik fazları arasındaki geçişin moleküler temellerinin anlaşılmasına katkıda bulunabileceğini öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Dr. Gonzalo Quasollo'ya görüntüleme konusundaki paha biçilmez yardımları için ve hücre kültürü teknik desteği için Dr. Andrea Pellegrini'ye teşekkür ederiz.
Bu araştırma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (#RO1AG058778-01A1, UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra arasındaki Alt Ödül Anlaşması No 165148/165147) ve Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Arjantin Ulusal Ajansı'ndan (ANPCyT, PICT 2017 #0618) hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
- Schroder, M., Kaufman, R. J.
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925 (2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170 (2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G.
- Rusnak, F., Mertz, P.
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
