Summary
I denne studien blir uttrykket slått ned av to nedstrøms signalkomponenter i PERK-banen, det cytoprotektive kalsineurinet og det pro-apoptotiske CHOP, ved å bruke spesifikke shRNAer. På motsatte måter modulerer disse følsomheten til primære kortikale nevroner for neurittatrofi etter induksjon av endoplasmatisk retikulumstress.
Abstract
Akkumuleringen av utfoldede proteiner i endoplasmatisk retikulum (ER), forårsaket av en hvilken som helst stresstilstand, utløser den utfoldede proteinresponsen (UPR) gjennom aktivering av spesialiserte sensorer. UPR forsøker først å gjenopprette homeostase; Men hvis skaden vedvarer, induserer signaleringen apoptose.
Det er økende bevis på at vedvarende og uløst ER-stress bidrar til mange patologiske tilstander, inkludert nevrodegenerative sykdommer. Fordi UPR kontrollerer celleskjebnen ved å bytte mellom cytoprotektive og apoptotiske prosesser, er det viktig å forstå hendelsene som definerer denne overgangen, samt elementene som er involvert i moduleringen.
Nylig demonstrerte vi at unormal GM2 gangliosidakkumulering forårsaker uttømming av ER Ca2+ innhold, som igjen aktiverer PERK (PKR-lignende ER-kinase), en av UPR-sensorene. Videre deltar PERK-signalering i nevrittatrofi og apoptose indusert av GM2-akkumulering. I denne forbindelse har vi etablert et eksperimentelt system som gjør at vi molekylært kan modulere uttrykket av nedstrøms PERK-komponenter og dermed endre sårbarheten til nevroner for å gjennomgå neurittisk atrofi.
Vi utførte knockdown av kalsinevrin (cytobeskyttende) og CHOP (pro-apoptotisk) uttrykk i kortikale nevronkulturer hos rotter. Cellene ble infisert med lentivirus-levert spesifikt shRNA og deretter behandlet med GM2 på forskjellige tidspunkter, fiksert og immunfarget med anti-MAP2 (mikrorør-assosiert protein 2) antistoff. Senere ble cellebilder registrert ved hjelp av et fluorescensmikroskop og total nevrittutvekst ble evaluert ved hjelp av bildebehandlingsprogramvaren ImageJ. Inhiberingen av ekspresjonen av disse PERK-signalkomponentene gjorde det klart mulig å enten akselerere eller forsinke den nevrittiske atrofien indusert av ER-stress.
Denne tilnærmingen kan brukes i cellesystemmodeller av ER-stress for å evaluere sårbarheten til nevroner for neurittatrofi.
Introduction
Endoplasmatisk retikulum (ER) stress er definert som enhver forstyrrelse som kompromitterer proteinfoldingskapasiteten i organellen. Akkumuleringen av ufoldede proteiner i ER-lumen aktiverer et transduksjonskaskadesignal kalt den ufoldede proteinresponsen (UPR). Denne komplekse signalveien er orkestrert av tre stresssensorer: PERK (proteinkinase RNA [PKR]-lignende ER-kinase), IRE1 (inositol-krevende enzym 1) og ATF6 (aktivert transkripsjonsfaktor 6). Alle sammen forsøker å gjenopprette homeostase. Men hvis stresset vedvarer, induserer UPR til slutt celledød ved apoptose1.
PERK, et ER-transmembranprotein, ved ER-stress, leder fosforyleringen av eukaryot initieringsfaktor-2 alfa (eIF2a), og reduserer global proteinsyntese og dermed proteinbelastning i ER2. Vi viste at kalsineurin A / B (CNA / B), en heterodimer Ca2+ fosfatase, binder direkte det cytosoliske domenet til PERK, øker autofosforyleringen og øker signifikant inhiberingen av proteinoversettelse og celle levedyktighet 3,4. Interessant nok er CNA / B rikelig i pattedyrhjernen, og skiller to isoformer av underenheten A av CN: α og β.
Under vedvarende ER-stress er PERK-signalveien den eneste UPR-grenen som forblir aktivert, og formidler dermed både pro-overlevelse og apoptotisk respons. I kronisk fase er en stor nedstrøms hendelse induksjon av transkripsjonsfaktoren, CHOP (CCAAT / enhancer binding protein homologt protein)5. Kronisk ER-stress blir også i økende grad anerkjent som en felles bidragsyter til et omfattende spekter av patologiske lidelser, inkludert nevrodegenerative sykdommer6. Det er viktig å forstå hvordan UPR kan legge til rette for cytoprotektiv signalering i stedet for celledød 7. Imidlertid er det foreløpig lite kjent om den nøyaktige mekanismen som styrer overgangen mellom disse to UPR-fasene.
Nylig fant vi at gangliosid GM2 akkumuleres i ER-membraner i dyrkede nevroner og induserer luminal kalsiumuttømming. Dette aktiverer igjen PERK-signalering, som medierer nevrittatrofi og apoptose 8. I denne studien brukes GM2-oppbyggingen i dyrkede nevroner som en cellesystemmodell for ER-stressindusert nevrittatrofi. Spesifikt manipuleres to PERK-faktoruttrykk, CN-Aα og CHOP, som bytter overgangen mellom tidlige/beskyttende hendelser og en kronisk/apoptotisk fase. For å oppnå dette blir de respektive genene stilnet; Dermed er primære kortikale nevronkulturer infisert med lentivirus-levert spesifikt shRNA. Western blot-analyse avslører en signifikant reduksjon av CN-Aα- og CHOP-uttrykksnivåer sammenlignet med kontrollcellene, som er infisert med lentivirus som bærer et kryptert shRNA. Etter denne behandlingen blir nevroner utsatt for forskjellige inkubasjonstider av eksogent GM2, fast og immunfarget med anti-mikrotubuli assosiert protein 2 (MAP2) antistoff9. Bilder oppnås med et epifluorescensmikroskop. Den totale nevrittutveksten vurderes i forhold til totalt celleantall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprosedyrene utføres etter godkjente protokoller fra National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Godkjenning for å gjennomføre studien er gitt av Animal Care and Ethics Committee (CICUAL) av INIMEC-CONICET-UNC (resolusjonsnummer 014/2017 B og 006/2017 A).
1. Primære kortikale nevronkulturer hos rotter
- Bedøv E18 Wistar gravide rotter i et CO 2 -kammer med en blanding av 80% CO 2 / 20% O2 for 60 s eksponering og ofre deretter ved å forskyve livmorhvirvelene.
- Utfør følgende trinn i en avtrekkshette med laminær luftstrøm. Trekk ut encephalon fra embryoene med en tangstil # 3 og rett skarp liten fjærsaks (materialfortegnelse) til Hanks-løsning i cellekulturretter.
- Dissekere vevet under 20x forstørrelsesglass, ved hjelp av to fin-tipped tang stil # 5, skille frontal cortex fra hjernehinnene. Overfør frontal cortex til et 15 ml konisk rør og inkuber vevet med 3-4 ml Trypsin-EDTA (0,25%) i 15 minutter, ved 37 ° C for kjemisk fordøyelse.
- Etter fordøyelsen, fortynn den med 3-4 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) pluss 10% føtal kalveserum (FCS). Vask den deretter 3 ganger med Ca 2+/Mg2+ fri Hanks balansert saltoppløsning og 0,1% glukose ved sentrifugering (3000 g i 5 minutter).
- Dissosiere vevet mekanisk 10 ganger ved å pipettere opp og ned med en 1000 μL-spiss, i DMEM pluss 10 % FCS (materialfortegnelse). Deretter sentrifugerer homogenatet ved 100 x g i 1 min, samler supernatanten og fullfører gjenværende volum til 1000 μL.
- Plate cellesuspensjonen på cellekulturfat med en tetthet på 520 celle/mm 2 med2 ml DMEM inneholdende 10 % FCS, 1 % penicillin/streptomycin og 1 % av et essensielt aminosyreadditiv (se materialfortegnelse). Inkuber deretter ved 37 °C i et fuktet miljø med 5 % CO 2 i2 timer.
- Fjerning av organisk materiale og poly-L-lysinbelegg av cellekulturretter
- Fjern det organiske materialet ved å plassere glassmaterialet i et reaksjonskammer og tilsett 96% etylalkohol til omtrent dekke materialet. Tilsett deretter 68% (w / v) salpetersyre dråpe for dråpe til brungrønne bobler begynner å vises. Når dette skjer, delvis dekke beholderen og la reaksjonen fortsette til eksplosjonen opphører.
MERK: Fjern det organiske materialet under en gassutvinningshin for å unngå eksponering for skadelige gasser. - Før poly-L-lysinbelegg, skyll brillene med sterilt Mili-Q-vann omtrent ti ganger. Inkuber deretter kulturglassene og tallerkenene med 0,1 μg / μL poly-L-lysin i 4 timer før du bruker dem. Etter inkubering, skyll brillene med sterilt Mili-Q-vann omtrent ti ganger.
- Fjern det organiske materialet ved å plassere glassmaterialet i et reaksjonskammer og tilsett 96% etylalkohol til omtrent dekke materialet. Tilsett deretter 68% (w / v) salpetersyre dråpe for dråpe til brungrønne bobler begynner å vises. Når dette skjer, delvis dekke beholderen og la reaksjonen fortsette til eksplosjonen opphører.
- Fjerning av organisk materiale og poly-L-lysinbelegg av cellekulturretter
- For å tillate nevralcelledifferensiering, bytt medium for et serumfritt nevrobasalt medium, med serumfritt tilskudd (materialfortegnelse). Dyrkning skal holdes ved 37 °C med 5 % CO2 inntil behandling.
2. Lentivirus produksjon
MERK: Oligonukleotidene som inneholder sekvensene rettet mot 3'UTR av enten CN-Aα-isoformen eller CHOP og med ikke-målrettingssekvensene (scrambles) er oppført i tabell 1.
- For glødning, bland to enkeltstrengede oligonukleotider med komplementære sekvenser i like molare mengder, ved bruk av glødebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Varm opp ved 95 °C i 2 minutter og avkjøl deretter sakte ved å overføre prøver fra varmeblokken eller vannbadet til en benk ved romtemperatur. Fortynn det resulterende produktet [kort hårnåls-RNA, (shRNA) med kohesive ender] til en endelig konsentrasjon på 0,5 μM, alikot dem og oppbevar ved -20 °C.
- Klon shRNA-innsatsen i lentiviral vektor pLKO.3G, med GFP som en grønn fluorescerende markør. For dette, fordøy 1 μg vektor med EcoRI- og PacI-restriksjonsenzymer ved å blande følgende i et sterilt rør: 2 μL 10x restriksjonsenzymbuffer (100 mM bis-Tris propan-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/ml bovint serumalbumin), 1 μL av 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μL 10 E/μL ECoRI, 0,5 μL PacI (10 U/μL) og 16 μL sterilt ionisert vann.
- Bland forsiktig ved pipettering. Inkuber reaksjonen i 3-4 timer ved 37 °C.
MERK: Fordøyelse over natten er generelt unødvendig og kan føre til DNA-nedbrytning.
- Bland forsiktig ved pipettering. Inkuber reaksjonen i 3-4 timer ved 37 °C.
- For ligering, bland den fordøyde vektoren og sett inn i et molforhold på 3: 1 og inkuber den med T4-ligasen og ligasebufferen (levert av produsenten) over natten ved 16 ° C.
MERK: På dette tidspunktet kan ligeringsreaksjonen oppbevares ved 4 °C inntil videre bruk. - Transformer DH5α kompetente celler (materialfortegnelse) eller en annen egnet E. coli-stamme med ligeringsreaksjonen som følger.
- Bland kompetent E. coli med det totale volumet av ligeringsreaksjon og avkjøl det på is i 15 minutter, legg det i et 42 ° C bad i 2 minutter og kjøl det deretter på is igjen i 15 minutter.
- Overfør det totale volumet som utsettes for varmesjokk til et 15 ml rør og fullfør volumet til 1000 μL med Luria-Bertani (LB) flytende medium som tidligere har blitt opprettholdt ved 37 °C. Rist bakteriene i 90 minutter ved 37 °C i en orbital shaker ved ca. 330 o / min.
- Sentrifuger dem ved 5000 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast 900 mikroliter supernatant. Bruk den gjenværende supernatanten til å resuspendere pelleten. Fordel bakteriesuspensjonen jevnt over en solid ampicillin (100 μg / ml) LB-plate.
- Inkuber ved 37 °C over natten, og sjekk deretter bakterieveksten. På dette tidspunktet kan bakteriene oppbevares ved 4 °C i 4-5 dager.
- Velg en enkelt koloni som skal overføres til et 50 ml rør med 10 ml LB flytende medium og ampicillin (100 μg / ml). Rist bakteriene PÅ ved 37 °C ved ca. 330 o / min.
- Sentrifuger kulturen for å pelletere bakteriene ved 5000 x g i 5 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og konserver bakteriepelleten. Denne kan oppbevares ved -20 °C.
- Rens plasmidet med et DNA-rensesett fra bakteriepellet i henhold til produsentens instruksjoner (materialfortegnelse). Beregn DNA-konsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 260 nm og multiplisere med fortynningsfaktoren, ved å bruke følgende forhold: A260 av 1,0 = 50 μg / ml ren dobbeltstreng (ds) DNA.
3. Lentivirusinfeksjon
MERK: Utfør prosedyren for lentivirusgenerering i en klasse II laminær avtrekkshette.
- 24 timer før transfeksjon, frø 1-5 × 106 HEK 293 celler i 100 mm diameter kulturretter i 8 ml vekstmedium og inkuber dem ved 37 °C, 5% CO2 over natten.
- Bland 14 μg pKLO.3G-vektor med spesifikk innsats, 10,5 μg pakkeplasmid psPAX og 3,5 μg konvoluttplasmid pMD2.G (materialfortegnelse). Fortynn 45 μL plasmidtransfeksjonsreagens (materialfortegnelse) i 700 mikrol redusert serummedium (materialfortegnelse) og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Kombiner deretter DNA-blandingen med det fortynnede plasmidtransfeksjonsreagenset, bland forsiktig og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
- I mellomtiden, endre for fersk DMEM mediet av kulturparabolen av HEK 293 cellekulturer (70% sammenflytende på tidspunktet for transfeksjon). Deretter legger du til hele volumet av DNA-løsningen dråpe for dråpe. Rock retten forsiktig. Det er ikke nødvendig å legge til / endre medium etter transfeksjon.
- Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i 48 timer - 72 timer for å tillate shRNA å nå sin optimale transduksjon kontrollert av GFP-fluorescens ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Deretter samles mediet med lentivirus og oppbevares ved 4 °C.
- Filtrat viral supernatant med en 0,45 μm nylonmembran. Aliquot gjennomstrømningen i 1 ml. Deretter sentrifuge ved 17.000 x g i 4 timer. Kast supernatanten og konserver pelleten. La usynlig pellet tørke, og oppbevares ved - 80 °C når den er tørket.
- Utfør viral titrering ved hjelp av flukscytometri. Frø 4 x 105 HEK 293 celler i 24-brønnsplater og ruges ved 37 °C i 24 timer. Deretter resuspenderer virale partikler i 200 μL DMEM kulturmedium (Table of Materials) og tilsett 0,05, 0,02 og 0,005 μL til hver brønn.
- Inkuber virusinfeksjon i 72 timer, fjern medium og trypsiniser (0,05% trypsin, 1 ml) i 3 minutter. Tilsett 1 ml DMEM i 10 % FCS-oppløsning og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter. Kast supernatanten og vask pelleten to ganger med PBS.
- Resuspender pelleten med 100 μL PBS og fikser cellene med 100 μL 2% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Analyser cellene med et flusscytometer og bestem prosentandelen av GFP-fluorescerende celler. Samle inn disse dataene for å beregne viral titrering ved hjelp av følgende formel:
Viral titrering
4. Primære nevronkulturer stresset med gangliosid GM2-akkumulering og immuncytokjemi ved bruk av anti-MAP2-antistoff
- Infiser de primære kortikale nevronkulturene (15 dager in vitro) med spesifikke shRNA-oligonukleotider rettet mot 3' UTR av enten CN-Aα eller CHOP og inkuber dem ved 37 ° C med 5% CO2 i 1 dag.
MERK: Primære kortikale nevronkulturer på 7-8 dager in vitro kan også brukes hvis cellene viser høy nevrittvekst.- Forbered en 500 μM stamløsning av gangliosid GM2 i etanol og sonicate den i 1 time.
- Tilsett GM2-stamløsningen til kulturskålmediet ved en endelig konsentrasjon på 2 μM. La inkubere ved 37 °C med 5 % CO2 i 16, 24 og 48 timer.
- Bruk noen kulturer til å forberede cellulært homogenat for western blot-analyse (for antistoffspesifikasjon, se materialfortegnelsen).
- Følg trinn 1.4. og 1.5. og fikser deretter cellene med 4% PFA og 120 mM sukrose i PBS i 20 minutter ved 37 ° C, og vask den deretter med PBS. Utfør denne prosedyren på en glidende membran i et vått kammer. Etterpå tilsettes permeabiliseringsløsning (0,2% Triton X-100 i PBS) i 5 minutter og vask med PBS.
- Bruk 5 % BSA fortynnet i PBS i 45 minutter for å tillate blokkering, inkuber deretter med anti-MAP2-antistoff, fortynnet 1:800 i blokkeringsoppløsning, ved 4 °C over natten.
- På slutten av inkubasjonstiden, vask to ganger med PBS og inkuber med sekundært antistoff (materialfortegnelse) i 1 time. Vask deretter cellene med PBS og monter brillene på lysbilder ved hjelp av et vandig monteringsmedium (materialfortegnelse).
5. Neurittatrofi analyse
- Ta bilder med en 20x luftlinse (NA 0.8) ved hjelp av et epifluorescensinvertert mikroskop utstyrt med et CCD-kamera. Analyser bilder med plugin-moduler for ImageJ. For dette, last bildet til ImageJ og trekk fra bakgrunnen ved å klikke på Prosess | Trekk fra bakgrunn.
- Klikk på bildet | Justere | Terskel eller skriv inn følgende taster: Ctrl (eller Cmd) + Shift + T. Et vindu åpnes for å justere minimumsverdier, slik at bane- og somasporinger kan skilles. Klikk på det binære bildet (nevritter og somas er hvite). På dette bildet, bruk frihåndsvalg for å slette somas; Det valgte Soma-området blir svart igjen.
- Velg spor og klikk Rediger | Utvalg | Opprett markering. Få avkastningen ved å klikke Ctrl (eller Cmd) og T-tastene for valget og bevare det. Åpne det opprinnelige bildet, klikk deretter på ROI manager-panelet og velg tilhørende avkastning, tidligere oppnådd. Klikk deretter på det opprinnelige bildet.
- Når avkastningssporene på bildet, skriver du inn Ctrl (eller Cmd) og M-tastene (Analyser | Tiltak). Et vindu åpnes; Kopier middelverdien (vilkårlige enheter a.u.) for å behandle statistisk analyse.
MERK: For å få verdier som μm, klikk på Analyser | Angi skala. Et vindu dukker opp åpent for å angi verdier. Pass på at du legger til riktig skala (Analyser | Set Scale) avhengig av egenskapene til mikroskopet som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her tar vi opp spørsmålet om deaktivering av to PERK nedstrømskomponenter påvirker overgangsfasen av UPR i en ER-stresscellemodell. For å oppnå dette slår vi av CN-Aα-genet så vel som CHOP-genet med to spesifikke shRNA-sekvenser for hver (tabell 1) i primær nevroncellekultur i 1 dag10. Uttrykket analyseres ved vestlig blotting (figur 1 og figur 2). En klar hemming observeres av ER stressmediert CN-Aα og CHOP økning i knockdown-celler, men ikke i kontrollceller (shRNA scrambles). Det bør bemerkes at det basale CN-uttrykksnivået ikke påvirkes av denne behandlingstilstanden.
Vi undersøker også den mulige koblingen av GM2-akkumuleringsindusert ER-stress med nevrondegenerasjon ved å utføre MAP2-immunfarging av primære nevronkulturer (figur 3 og figur 4).
Neurittatrofi analyseres som total nevrittutvekst i forhold til totalt cellenummer. Dette øker betydelig etter indusering av ER-stress ved inkubasjon av GM2 ved 16-48 timer. Interessant nok øker deaktivering av CN-Aα-ekspresjon signifikant neurittatrofi, spesielt ved 16 timer GM2-akkumulering, i forhold til GM2-ubehandlede grupper (figur 3). Dermed akselererte CN-Aα knockdown degenerasjonsprosessene i nevroner, og bekreftet pro-overlevelseseffekten av CN i den tidlige fasen av UPR. Omvendt resulterte CHOP knockdown i signifikant redusert nevrittatrofi i forhold til kontrollene, spesielt ved 16-24 timer (figur 4).
Figur 1. Dataanalyse for CN-Aα-deaktiveringseffektivitet. Knockdown evalueres ved Western blot-analyse ved bruk av antistoff mot CN-Aα og GADPH (lastkontroll). Det primære antistoffet visualiseres av nær-infrarødt fluorescensavbildningssystem. Tallene nedenfor representerer relativt intensitetsforhold mellom CN-Aα- og GADPH-bånd. Denne figuren er republisert fra Virgolini, M.J. et al.4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Dataanalyse for CHOP-deaktiveringseffektivitet. Knockdown evalueres ved Western blot-analyse ved bruk av antistoff mot CHOP og β aktin (lastkontroll). Det primære antistoffet visualiseres og deretter analyseres dataene som angitt i figur 1. Denne figuren er republisert fra Virgolini, M.J. et al.4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Dataanalyse for neuritisk atrofiavbildning i CN-Aα knockdown-celler. (Øverst) Kultiverte primære nevroner er lastet med GM2. Representative bilder av MAP2 immunfargede celler er vist under kontroll og eksperimentelle forhold. Bildene tas opp med et epifluorescens-invertert mikroskop utstyrt med et CCD-kamera. Skalastenger: 150 μm (vanlige bilder), 75 μm (forstørrede bilder). (Nederst) Histogram (gjennomsnittlig ± SEM) representerer nevrittutvekst med hensyn til totale celler, analysert av ImagJ-plugin-moduler. ** * og ## #: p 0.0001 for sammenligning med kontrollen, fra enveis ANOVA. Denne figuren er republisert fra Virgolini, M.J. et al.4.
Figur 4. (Øverst) Dataanalyse for nevrittisk atrofiavbildning i CHOP-inaktiveringsceller. Primære nevronkulturer behandles som angitt i figur 3 (øverst). (Nederst) Histogrammer og statistiske notasjoner som i figur 3 (nederst) unntatt # #: s≤ 0,001. Denne figuren er republisert fra Virgolini, M.J. et al.4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Konstruerer | Sekvens 5 'til 3' shRNA |
| CN-Aα 1 | AATTGCCAGGAATTGGATTCAGTCTCGA GAAACTGAATCCAATTCCTGGCTTTTTTTAT |
| CN-Aα 2 | AATTCGCCAACCTTAACTCCATCAACTCGAG TTGATGGAGTTAAGGTTGGCGTTTTTTTAT |
| CN-Aα Scrb | AATTGAGTGAATTGTCGCTCTAAGTCTCTCGAG ACTTAGAGCGACAATTCACTCTTTTTTTAT |
| HAKK 1 | AATTGGTCCTGTCCTCAGATGAAATCTCGAG ATTTCATCTGAGGACAGGACCTTTTTTTAT |
| HAKK 2 | AATTTGAAGAGAACGAGCGGCTCAACTCGA GTTGAGCCGCTCGTTCTCTTCATTTTTTTAT |
| CHOP Scrb | AATTGAAGAGAGAAAGCGAACAATACTCGAG TATTGTTCGCTTTCTCTCTTCTTTTTTTAT |
Tabell 1. Fremoverkonstruksjonssekvenser satt inn i pKLG0.3 viral vektor. Scrb: rykke ut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver et eksperimentelt system som muliggjør molekylær modulering av overgangen fra overlevelse til apoptotiske UPR-faser i en nevroncellemodell.
For en riktig analyse av nevrittatrofi er det viktig å oppnå primære nevronkulturer med mange, lange, høyt forgrenede prosesser 9,11. Dette letter undersøkelsen av forlengelse av nevronprosessen, slik at de klare forskjellene mellom behandlingene kan oppdages. Det er viktig å merke seg at hvis primære kortikale nevronkulturer ved 7-8 dager in vitro allerede viser høy neurittutvekst, kan disse brukes til å indusere stress og utføre den påfølgende analysen, i stedet for 15 dager in vitro-kulturer.
Videre bør inhiberingsprosenten av ER-stressmediert CHOP-overuttrykk være omtrent 65-70% eller høyere. Det er viktig at deaktivering av CN-Aα-ekspresjonsnivået bare påvirker ER-stressindusert CN-Aα-ekspresjonsøkning uten å endre basalnivået. Dette er for å minimere virkningen på CN-funksjoner som ikke er forbundet med PERK-signalering12,13.
Med hensyn til analyseprosedyren for nevritatrofi, presenterer denne artikkelen en alternativ metodikk som krever mindre manuelt arbeid enn spesifikke ImageJ-plugin-moduler som bidrar til å spore nevritter. Vanligvis krever disse at prosesser spores individuelt for hvert nevron, mens trinnene som følges i denne artikkelen sporer prosessene til flere nevroner samtidig ved hjelp av 5 sett med felles tilgjengelige ImageJ-kommandoer. Både plugin-moduler og denne protokollen gjør det mulig å kvantifisere verdien av alle prosessene i prøvebildet.
Vi har tidligere demonstrert en ny cytoprotektiv rolle for allestedsnærværende CN i den tidlige fasen av UPR, utløst enten av farmakologiske verktøy eller iskemiske prosesser 3,4,8. Andre, og vi beskrev virkningen av hemming av CHOP-uttrykk på celleoverlevelse i forskjellige systemer 8,11,14. Her foreslår vi en metodikk der manipulering av uttrykket av noen av disse genene gjør det mulig å motsette modulere begynnelsen av neuritisk atrofi-prosessen i en cellulær modell av ER-stress som skal moduleres i motsatt modus.
Vi ser for oss at denne metoden kan brukes til å evaluere nevroners følsomhet for å gjennomgå neuritisk atrofi i forskjellige cellesystemmodeller av ER-stress og dermed bidra til å forstå molekylære baser av overgangen mellom akutte og kroniske faser av UPR i ulike neurodegenerative sykdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Gonzalo Quasollo for hans uvurderlige hjelp med bildebehandling og Dr. Andrea Pellegrini for teknisk støtte innen cellekultur.
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra: National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 mellom UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) og fra National Agency of Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
- Schroder, M., Kaufman, R. J.
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925 (2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170 (2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G.
- Rusnak, F., Mertz, P.
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
