Summary
In der vorliegenden Studie wird die Expression von zwei nachgeschalteten Signalkomponenten des PERK-Signalwegs, dem zytoprotektiven Calcineurin und dem pro-apoptotischen CHOP, unter Verwendung spezifischer shRNAs abgeschaltet. Auf entgegengesetzte Weise modulieren diese die Anfälligkeit primärer kortikaler Neuronen für Neuritenatrophie nach Induktion von endoplasmatischem Retikulumstress.
Abstract
Die Anhäufung von ungefalteten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum (ER), die durch einen Stresszustand verursacht wird, löst die ungefaltete Proteinantwort (UPR) durch die Aktivierung spezialisierter Sensoren aus. UPR versucht zunächst, die Homöostase wiederherzustellen; Wenn der Schaden jedoch anhält, induziert die Signalübertragung Apoptose.
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass anhaltender und ungelöster ER-Stress zu vielen pathologischen Zuständen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen, beiträgt. Da die UPR das Zellschicksal steuert, indem sie zwischen zytoprotektiven und apoptotischen Prozessen wechselt, ist es wichtig, die Ereignisse, die diesen Übergang definieren, sowie die Elemente, die an seiner Modulation beteiligt sind, zu verstehen.
Kürzlich haben wir gezeigt, dass eine abnormale GM2-Gangliosidakkumulation zu einer Erschöpfung des ER Ca2+ -Gehalts führt, was wiederum PERK (PKR-like-ER-Kinase), einen der UPR-Sensoren, aktiviert. Darüber hinaus ist der PERK-Signalweg an der Neuritenatrophie und Apoptose beteiligt, die durch die GM2-Akkumulation induziert wird. In dieser Hinsicht haben wir ein experimentelles System etabliert, das es uns ermöglicht, die Expression von nachgeschalteten PERK-Komponenten molekular zu modulieren und so die Anfälligkeit von Neuronen für eine neuritische Atrophie zu verändern.
Wir führten einen Knockdown der Calcineurin- (zytoprotektiven) und CHOP- (pro-apoptotischen) Expression in kortikalen neuronalen Kulturen von Ratten durch. Die Zellen wurden mit Lentivirus-gelieferter spezifischer shRNA infiziert und dann zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit GM2 behandelt, fixiert und mit Anti-MAP2-Antikörpern (Mikroröhren-assoziiertes Protein 2) immungefärbt. Später wurden Zellbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und das totale Neuritenwachstum mit der gemeinfreien Bildverarbeitungssoftware ImageJ ausgewertet. Die Hemmung der Expression dieser PERK-Signalkomponenten ermöglichte es eindeutig, die durch ER-Stress induzierte neuritische Atrophie entweder zu beschleunigen oder zu verzögern.
Dieser Ansatz könnte in Zellsystemmodellen von ER-Stress verwendet werden, um die Anfälligkeit von Neuronen für Neuritenatrophie zu bewerten.
Introduction
Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) ist definiert als jede Störung, die die Proteinfaltungskapazität in der Organelle beeinträchtigt. Die Anhäufung von ungefalteten Proteinen innerhalb des ER-Lumens aktiviert ein Transduktionskaskadensignal, das als ungefaltete Proteinantwort (UPR) bezeichnet wird. Dieser komplexe Signalweg wird von drei Stresssensoren orchestriert: PERK (Proteinkinase-RNA [PKR]-ähnliche ER-Kinase), IRE1 (Inositol-erforderliches Enzym 1) und ATF6 (aktivierter Transkriptionsfaktor 6). Alle zusammen versuchen, die Homöostase wiederherzustellen. Wenn der Stress jedoch anhält, induziert UPR schließlich den Zelltod durch Apoptose1.
PERK, ein ER-Transmembranprotein, führt bei ER-Stress die Phosphorylierung des eukaryotischen Initiationsfaktor-2 alpha (eIF2α) an, wodurch die globale Proteinsynthese und damit die Proteinbelastung im ER2 reduziert wird. Wir konnten zeigen, dass Calcineurin-A/B (CNA/B), eine Heterodimer-Ca2+-Phosphatase, direkt an die zytosolische Domäne von PERK bindet, ihre Autophosphorylierung erhöht und die Hemmung der Proteintranslation und der Zelllebensfähigkeit signifikant erhöht 3,4. Interessanterweise ist CNA/B im Gehirn von Säugetieren reichlich vorhanden und unterscheidet zwei Isoformen der Untereinheit A von CN: α und β.
Bei anhaltendem ER-Stress ist der PERK-Signalweg der einzige UPR-Zweig, der aktiviert bleibt und somit sowohl die überlebensfördernde als auch die apoptotische Reaktion vermittelt. In der chronischen Phase ist ein wichtiges nachgeschaltetes Ereignis die Induktion des Transkriptionsfaktors CHOP (CCAAT/Enhancer-Bindungsprotein homologes Protein)5. Chronischer ER-Stress wird auch zunehmend als häufiger Faktor für eine Vielzahl von pathologischen Störungen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen, anerkannt6. Es ist wichtig zu verstehen, wie UPR die zytoprotektive Signalübertragung anstelle des Zelltods erleichtern kann 7. Derzeit ist jedoch wenig über den genauen Mechanismus bekannt, der den Übergang zwischen diesen beiden UPR-Phasen steuert.
Kürzlich haben wir herausgefunden, dass sich Gangliosid GM2 in kultivierten Neuronen in ER-Membranen anreichert und einen luminalen Kalziummangel induziert. Dies wiederum aktiviert den PERK-Signalweg, der Neuritenatrophie und Apoptose vermittelt 8. In dieser Studie wird der GM2-Aufbau in kultivierten Neuronen als Zellsystemmodell für die ER-Stress-induzierte Neuritenatrophie verwendet. Konkret werden zwei PERK-Faktor-Ausdrücke manipuliert, CN-Aα und CHOP, die den Übergang zwischen frühen/protektiven Ereignissen und einer chronischen/apoptotischen Phase umschalten. Um dies zu erreichen, werden die jeweiligen Gene zum Schweigen gebracht; Daher werden primäre kortikale Neuronenkulturen mit Lentivirus-gelieferter spezifischer shRNA infiziert. Die Western-Blot-Analyse zeigt eine signifikante Reduktion der CN-Aα- und CHOP-Expressionsniveaus im Vergleich zu den Kontrollzellen, die mit Lentiviren infiziert sind, die eine verschlüsselte shRNA tragen. Nach dieser Behandlung werden die Neuronen unterschiedlichen Inkubationszeiten von exogenem GM2 ausgesetzt, fixiert und immungefärbt mit Anti-Mikrotubuli-assoziiertem Protein 2 (MAP2)-Antikörper9. Die Bilder werden mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Das gesamte Neuritenwachstum wird im Verhältnis zur Gesamtzellzahl bewertet.
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Protocol
Die Tierverfahren werden nach den genehmigten Protokollen des National Institute of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Genehmigung zur Durchführung der Studie wird von der Tierpflege- und Ethikkommission (CICUAL) des INIMEC-CONICET-UNC erteilt (Beschlussnummern 014/2017 B und 006/2017 A).
1. Primäre kortikale Neuronenkulturen der Ratte
- Betäuben Sie trächtige Ratten in einer CO 2 -Kammer mit einer Mischung aus 80% CO 2 / 20% O2 für 60 s Exposition und opfern Sie sie dann durch Luxation der Halswirbel.
- Führen Sie die folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durch. Extrahieren Sie das Enzephalon aus den Embryonen mit einer Pinzette Stil # 3 und einer geraden scharfen kleinen Federschere (Materialtabelle) in Hanks-Lösung in Zellkulturschalen.
- Sezieren Sie das Gewebe unter 20-facher Lupe mit zwei feinen Pinzetten Stil #5 und trennen Sie den frontalen Kortex von den Hirnhäuten. Übertragen Sie den frontalen Kortex in ein konisches 15-ml-Röhrchen und inkubieren Sie das Gewebe mit 3-4 ml Trypsin-EDTA (0,25%) für 15 Minuten bei 37 °C für den chemischen Aufschluss.
- Verdünnen Sie es nach der Verdauung mit 3-4 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) plus 10% fötalem Kälberserum (FCS). Waschen Sie es dann 3 Mal mit Ca 2+/Mg2+ freier Hanks Balanced Salt-Lösung und 0,1% Glucose durch Zentrifugation (3000 g für 5 min).
- Mechanische Dissoziation des Gewebes 10-mal durch Auf- und Abpipettieren mit einer 1000-μl-Spitze in DMEM plus 10% FCS (Table of Materials). Anschließend wird das Homogenat bei 100 x g 1 min lang zentrifugiert, der Überstand aufgefangen und das verbleibende Volumen auf 1000 μl vervollständigt.
- Die Zellsuspension wird auf Zellkulturschalen mit einer Dichte von 520 Zellen/mm2 mit 2 ml DMEM aufgetragen, das 10 % FCS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % eines essentiellen Aminosäurezusatzes enthält (siehe Materialtabelle). Anschließend bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5% CO 2 für2 h inkubieren.
- Entfernung organischer Stoffe und Poly-L-Lysin-Beschichtung von Zellkulturschalen
- Entfernen Sie die organische Substanz, indem Sie das Glasmaterial in eine Reaktionskammer geben und 96% Ethylalkohol hinzufügen, um das Material fast zu bedecken. Dann fügen Sie 68% (w/v) Salpetersäure Tropfen für Tropfen hinzu, bis bräunlich-grünliche Blasen erscheinen. Sobald dies geschieht, decken Sie den Behälter teilweise ab und lassen Sie die Reaktion fortgesetzt werden, bis die Explosion aufhört.
HINWEIS: Entfernen Sie die organischen Stoffe unter einer Gasextraktionskabine, um eine Exposition gegenüber schädlichen Gasen zu vermeiden. - Spülen Sie die Gläser vor der Poly-L-Lysin-Beschichtung etwa zehnmal mit sterilem Mili-Q-Wasser aus. Anschließend werden die Kulturgläser und -schalen vor der Verwendung 4 h lang mit 0,1 μg/μl Poly-L-Lysin inkubiert. Spülen Sie die Gläser nach der Inkubation etwa zehnmal mit sterilem Mili-Q-Wasser aus.
- Entfernen Sie die organische Substanz, indem Sie das Glasmaterial in eine Reaktionskammer geben und 96% Ethylalkohol hinzufügen, um das Material fast zu bedecken. Dann fügen Sie 68% (w/v) Salpetersäure Tropfen für Tropfen hinzu, bis bräunlich-grünliche Blasen erscheinen. Sobald dies geschieht, decken Sie den Behälter teilweise ab und lassen Sie die Reaktion fortgesetzt werden, bis die Explosion aufhört.
- Entfernung organischer Stoffe und Poly-L-Lysin-Beschichtung von Zellkulturschalen
- Um die Differenzierung der Nervenzellen zu ermöglichen, tauschen Sie das Medium mit dem serumfreien Nahrungsergänzungsmittel (Materialtabelle) gegen ein serumfreies neurobasales Medium aus. Die Kulturen werden bis zur Behandlung bei 37 °C mit 5 % CO2 aufbewahrt.
2. Lentivirus-Produktion
ANMERKUNG: Die Oligonukleotide, die die Sequenzen enthalten, die auf die 3'UTRs der CN-Aα-Isoform oder des CHOP abzielen, und mit den Nicht-Targeting-Sequenzen (Scrambles) sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Mischen Sie zum Glühen zwei einzelsträngige Oligonukleotide mit komplementären Sequenzen in gleichen molaren Mengen unter Verwendung von Annealing-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Bei 95 °C 2 min erhitzen und dann langsam abkühlen lassen, indem die Proben aus dem Heizblock oder Wasserbad bei Raumtemperatur auf eine Tischplatte gegeben werden. Das resultierende Produkt [kurze Haarnadel-RNA (shRNA) mit kohäsiven Enden] wird auf eine Endkonzentration von 0,5 μM verdünnt, aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
- Klonen Sie das shRNA-Insert in den lentiviralen Vektor pLKO.3G mit GFP als grün fluoreszierendem Marker. Dazu wird 1 μg Vektor mit EcoRI- und PacI-Restriktionsenzymen aufgeschlossen, indem Folgendes in einem sterilen Röhrchen gemischt wird: 2 μl 10-facher Restriktionsenzympuffer (100 mM Bis-Tris-Propan-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/ml Rinderserumalbumin), 1 μl 1 μg/μl pLKO.3G, 0,5 μl 10 U/μL ECoRI, 0,5 μl PacI (10 U/μl) und 16 μl steriles ionisiertes Wasser.
- Vorsichtig durch Pipettieren mischen. Die Reaktion wird 3-4 h bei 37 °C inkubiert.
HINWEIS: Verdauungen über Nacht sind im Allgemeinen unnötig und können zu einem DNA-Abbau führen.
- Vorsichtig durch Pipettieren mischen. Die Reaktion wird 3-4 h bei 37 °C inkubiert.
- Für die Ligatur wird der verdaute Vektor gemischt und in einem molaren Verhältnis von 3:1 eingefügt und über Nacht bei 16 °C mit der T4-Ligase und dem Ligasepuffer (vom Hersteller bereitgestellt) inkubiert.
ANMERKUNG: Zu diesem Zeitpunkt kann die Ligationsreaktion bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert werden. - Transformieren Sie DH5α-kompetente Zellen (Materialtabelle) oder einen anderen geeigneten E. coli-Stamm mit der Ligationsreaktion wie folgt.
- Mischen Sie kompetente E. coli mit dem Gesamtvolumen der Ligationsreaktion und kühlen Sie es 15 Minuten lang auf Eis, legen Sie es für 2 Minuten in ein 42 °C-Bad und kühlen Sie es dann erneut für 15 Minuten auf Eis.
- Das Gesamtvolumen, das einem Hitzeschock ausgesetzt ist, wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt und das Volumen auf 1000 μl mit flüssigem Luria-Bertani-Medium (LB) vervollständigt, das zuvor bei 37 °C gehalten wurde. Schütteln Sie die Bakterien 90 Minuten lang bei 37 °C in einem Orbitalschüttler bei ca. 330 U/min.
- Zentrifugieren Sie sie bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C und verwerfen Sie 900 μl Überstand. Verwenden Sie den verbleibenden Überstand, um das Pellet wieder zu suspendieren. Verteilen Sie die Bakteriensuspension gleichmäßig auf einer festen Ampicillin-LB-Platte (100 μg/ml).
- Über Nacht bei 37 °C inkubieren, dann das Bakterienwachstum kontrollieren. Zu diesem Zeitpunkt können die Bakterien 4-5 Tage bei 4 °C gelagert werden.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus, um sie in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml flüssigem LB-Medium und Ampicillin (100 μg/ml) zu überführen. Schütteln Sie die Bakterien bei 37 °C bei ca. 330 U/min.
- Zentrifugieren Sie die Kultur, um die Bakterien bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C zu pelletieren, verwerfen Sie den Überstand und konservieren Sie das Bakterienpellet. Diese kann bei -20 °C gelagert werden.
- Reinigen Sie das Plasmid mit einem DNA-Aufreinigungskit aus Bakterienpellets gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle). Berechnen Sie die DNA-Konzentration, indem Sie die Absorption bei 260 nm messen und mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren, wobei die folgende Beziehung verwendet wird: A260 von 1,0 = 50 μg/ml reine Doppelstrang-DNA (ds).
3. Lentivirus-Infektion
HINWEIS: Führen Sie das Lentivirus-Generierungsverfahren in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II durch.
- 24 h vor der Transfektion 1-5 × 106 HEK 293 Zellen in Kulturschalen mit 100 mm Durchmesser in 8 ml Wachstumsmedium säen und über Nacht bei 37 °C, 5%CO2 inkubieren.
- Mischen Sie 14 μg pKLO.3G-Vektor mit spezifischem Insert, 10,5 μg Packplasmid psPAX und 3,5 μg Hüllplasmid pMD2.G (Materialtabelle). 45 μl Plasmid-Transfektionsreagenz (Materialtabelle) werden in 700 μl reduziertem Serummedium (Materialtabelle) verdünnt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Kombinieren Sie dann die DNA-Mischung mit dem verdünnten Plasmid-Transfektionsreagenz, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Währenddessen wird das Medium der Kulturschale von HEK 293 Zellkulturen (70% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion) gegen frisches DMEM ausgetauscht. Fügen Sie dann tropfenweise das gesamte Volumen der DNA-Lösung hinzu. Schaukeln Sie die Schüssel vorsichtig. Es ist nicht notwendig, das Medium nach der Transfektion hinzuzufügen/zu wechseln.
- Inkubation der Zellen bei 37 °C, 5% CO2 für 48 h - 72 h, damit shRNAs ihre optimale Transduktion erreichen können, die durch GFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüft wird. Anschließend das Medium mit Lentivirus auffangen und bei 4 °C lagern.
- Filtrat viraler Überstand mit einer 0,45 μm Nylonmembran. Aliquotieren Sie den Durchfluss in 1 ml. Anschließend wird 4 h lang bei 17.000 x g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf. Unsichtbare Pellets trocknen lassen und nach dem Trocknen bei - 80 °C lagern.
- Führen Sie eine virale Titration durch Flusszytometrie durch. Säen Sie 4 x 105 HEK 293-Zellen in 24-Well-Platten und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 24 h. Anschließend resuspendieren Sie die Viruspartikel in 200 μl DMEM-Kulturmedium (Materialtabelle) und geben Sie 0,05, 0,02 und 0,005 μl in jede Vertiefung.
- Die Virusinfektion 72 h inkubieren, das Medium entfernen und 3 Minuten lang (0,05% Trypsin, 1 ml) trypsinisieren. 1 ml DMEM in 10%iger FCS-Lösung zugeben und bei 500 x g 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit PBS.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit 100 μl PBS und fixieren Sie die Zellen mit 100 μl 2% Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Analysieren Sie die Zellen mit einem Flusszytometer und bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP-Fluoreszenzzellen. Sammeln Sie diese Daten, um die Virustitration mit der folgenden Formel zu berechnen:
Virale Titration
4. Primäre Neuronenkulturen, die mit Gangliosid-GM2-Akkumulation und Immunzytochemie unter Verwendung von Anti-MAP2-Antikörpern gestresst wurden
- Infizieren Sie die primären kortikalen Neuronenkulturen (15 Tage in vitro) mit spezifischen shRNA-Oligonukleotiden, die auf die 3'-UTRs von CN-Aα oder CHOP abzielen, und inkubieren Sie sie 1 Tag lang bei 37 °C mit 5% CO2 .
HINWEIS: Primäre kortikale Neuronenkulturen von 7-8 Tagen in vitro können auch verwendet werden, wenn die Zellen ein hohes Neuritenwachstum aufweisen.- Bereiten Sie eine 500-μM-Stammlösung von Gangliosid GM2 in Ethanol vor und beschallen Sie sie 1 Stunde lang.
- GM2-Stammlösung in einer Endkonzentration von 2 μM in das Medium der Kulturschalen geben und bei 37 °C mit 5 % CO2 für 16, 24 und 48 h inkubieren lassen.
- Verwenden Sie einige Kulturen, um zelluläres Homogenat für die Western-Blot-Analyse herzustellen (die Antikörperspezifikation finden Sie in der Materialtabelle).
- Befolgen Sie die Schritte 1.4. und 1.5. und dann die Zellen mit 4% PFA und 120 mM Saccharose in PBS für 20 min bei 37 °C fixieren und dann mit PBS waschen. Führen Sie diesen Vorgang an einer rutschfesten Membran in einer feuchten Kammer durch. Anschließend 5 min Permeabilisierungslösung (0,2% Triton X-100 in PBS) zugeben und mit PBS waschen.
- Verwenden Sie 5% BSA, verdünnt in PBS für 45 Minuten, um eine Blockierung zu ermöglichen, und inkubieren Sie dann mit Anti-MAP2-Antikörpern, verdünnt 1:800 in Blocklösung, bei 4 °C über Nacht.
- Am Ende der Inkubationszeit zweimal mit PBS waschen und 1 h mit sekundärem Antikörper (Materialtabelle) inkubieren. Anschließend waschen Sie die Zellen mit PBS und montieren Sie die Gläser mit einem wässrigen Einbettmedium (Materialtabelle) auf Objektträger.
5. Analyse der Neuritenatrophie
- Erhalten Sie Bilder mit einem 20-fach Luftobjektiv (NA 0,8) unter Verwendung eines Epifluoreszenz-inversen Mikroskops, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist. Analysieren Sie Bilder mit ImageJ-Plug-ins. Laden Sie dazu das Bild in ImageJ und subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie auf Process | Hintergrund subtrahieren.
- Klicken Sie auf das Bild | Anpassen | Schwellenwert, oder geben Sie die folgenden Tasten ein: Strg (oder Cmd) + Umschalt + T. Es öffnet sich ein Fenster, in dem Sie die Mindestwerte anpassen können, sodass Pfad- und Soma-Verfolgungen unterschieden werden können. Klicken Sie auf das Binärbild (Neuriten und Somas sind weiß gefärbt). Verwenden Sie auf diesem Bild die Freihandauswahl, um Somas zu löschen. Der ausgewählte SOMA-Bereich wird wieder schwarz.
- Wählen Sie Ablaufverfolgungen aus und klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Auswahl erstellen. Ermitteln Sie den ROI, indem Sie auf die Tasten Strg (oder Cmd) und T der Auswahl klicken, und speichern Sie ihn. Öffnen Sie das Originalbild, klicken Sie dann auf das ROI-Manager-Panel und wählen Sie den zugehörigen ROI aus, der zuvor erhalten wurde. Klicken Sie dann auf das Originalbild.
- Sobald der ROI auf dem Bild verfolgt wird, geben Sie die Tasten Strg (oder Cmd) und M (Analysieren | Messen). Ein Fenster öffnet sich; Kopieren Sie den Mittelwert (beliebige Einheiten a.u.), um die statistische Analyse zu verarbeiten.
HINWEIS: Um Werte als μm zu erhalten, klicken Sie auf Analysieren | Legen Sie die Skala fest. Es öffnet sich ein Fenster, in dem Sie Werte einstellen können. Stellen Sie sicher, dass Sie die richtige Skala hinzufügen (Analysieren | Set Scale) in Abhängigkeit von den Eigenschaften des verwendeten Mikroskops.
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Representative Results
Hier gehen wir der Frage nach, ob die Stummschaltung zweier PERK-Downstream-Komponenten die Übergangsphase von UPR in einem ER-Stresszellmodell beeinflusst. Um dies zu erreichen, schalten wir sowohl das CN-Aα-Gen als auch das CHOP-Gen durch jeweils zwei spezifische shRNA-Sequenzen (Tabelle 1) in primärer Neuronenzellkultur für 1 Tag10 zum Schweigen. Die Expression wird mittels Western Blot analysiert (Abbildung 1 und Abbildung 2). Es wird eine deutliche Hemmung des ER-Stress-vermittelten CN-Aα- und CHOP-Anstiegs in Knockdown-Zellen beobachtet, nicht jedoch in Kontrollzellen (shRNA-Scrambles). Es ist zu beachten, dass das basale CN-Expressionsniveau bei dieser Behandlungsbedingung nicht beeinflusst wird.
Wir untersuchen auch den möglichen Zusammenhang zwischen GM2-Akkumulations-induziertem ER-Stress und neuronaler Degeneration, indem wir MAP2-Immunfärbungen von primären neuronalen Kulturen durchführen (Abbildung 3 und Abbildung 4).
Die Neuritenatrophie wird als gesamtes Neuritenwachstum im Verhältnis zur Gesamtzellzahl analysiert. Dieser steigt signifikant an, nachdem ER-Stress durch Inkubation von GM2 nach 16-48 h induziert wurde. Interessanterweise verstärkt die Stummschaltung der CN-Aα-Expression signifikant die Neuritenatrophie, insbesondere nach 16 Stunden GM2-Akkumulation, im Vergleich zu GM2-unbehandelten Gruppen (Abbildung 3). Somit beschleunigte der CN-Aα-Knockdown die Degenerationsprozesse in Neuronen und bestätigte den überlebensfördernden Effekt von CN in der frühen Phase der UPR. Umgekehrt führte der CHOP-Knockdown zu einer signifikant verminderten Neuritenatrophie im Vergleich zu den Kontrollen, insbesondere nach 16-24 Stunden (Abbildung 4).
Abbildung 1. Datenanalyse für die Effizienz der CN-Aα-Schalldämpfer. Der Knockdown wird durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern gegen CN-Aα und GADPH (Belastungskontrolle) bewertet. Der primäre Antikörper wird durch ein Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebungssystem sichtbar gemacht. Die folgenden Zahlen stellen das relative Intensitätsverhältnis zwischen CN-Aα- und GADPH-Bändern dar. Diese Abbildung wurde von Virgolini, M.J. et al.4 neu veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Datenanalyse für die Effizienz der CHOP-Schalldämpfer. Der Knockdown wird durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen CHOP und β Aktin (Belastungskontrolle) bewertet. Der primäre Antikörper wird visualisiert und dann werden die Daten wie in Abbildung 1 dargestellt analysiert. Diese Abbildung wurde von Virgolini, M.J. et al.4 neu veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Datenanalyse für die Bildgebung der neuritischen Atrophie in CN-Aα-Knockdown-Zellen. (Oben) Kultivierte primäre Neuronen sind mit GM2 beladen. Repräsentative Bilder von MAP2-immungefärbten Zellen werden unter Kontroll- und Versuchsbedingungen gezeigt. Die Aufnahmen werden mit einem Epifluoreszenz-inversen Mikroskop aufgenommen, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist. Maßstabsbalken: 150 μm (normale Bilder), 75 μm (vergrößerte Bilder). (Unten) Das Histogramm (Mittelwert ± REM) stellt das Neuritenwachstum in Bezug auf die Gesamtzellen dar, die mit ImagJ-Plug-ins analysiert werden. *** und ## #: p 0,0001 zum Vergleich mit der Kontrolle, aus der Einweg-ANOVA. Diese Abbildung wurde von Virgolini, M.J. et al.4 neu veröffentlicht.
Abbildung 4. (Oben) Datenanalyse für die Bildgebung der neuritischen Atrophie in CHOP-Silencing-Zellen. Primäre Neuronenkulturen werden wie in Abbildung 3 (oben) dargestellt behandelt. (Unten) Histogramme und statistische Notationen wie in Abbildung 3 (unten) außer # #: S≤ 0,001. Diese Abbildung wurde von Virgolini, M.J. et al.4 neu veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Konstrukte | Sequenz 5' bis 3' shRNA |
| CN-Aα 1 | AATTGCCAGGAATTGGATTCAGTTTCTCGA GAAACTGAATCCAATTCCTGGCTTTTTTTAT |
| CN-Aα 2 | AATTCGCCAACCTTAACTCCATCAACTCGAG TTGATGGAGTTAAGGTTGGCGTTTTTTTAT |
| CN-Aα Scrb | AATTGAGTGAATTGTCGCTCTAAGTCTCGAG ACTTAGAGCGACAATTCACTTTTTTTAT |
| HACKEN 1 | AATTGGTCCTGTCCTCAGATGAAATCTCGAG ATTTCATCTGAGGACAGGACCTTTTTTTAT |
| HACKEN 2 | AATTTGAAGAGAACGAGCGGCTCAACTCGA GTTGAGCCGCTCGTTCTCTTCATTTTTAT |
| CHOP Scrb | AATTGAAGAGAGAAAGCGAACAATACTCGAG TATTGTTCGCTCTCTCTCTTTTTTTTTAT |
Tabelle 1. Vorwärtskonstruktsequenzen, die in den viralen Vektor pKLG0.3 eingefügt wurden. Scrb: Scramble.
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Discussion
Wir beschreiben ein experimentelles System, das die molekulare Modulation des Übergangs von der Überlebens- zur apoptotischen UPR-Phase in einem neuronalen Zellmodell ermöglicht.
Für eine korrekte Analyse der Neuritenatrophie ist es wichtig, primäre Neuronenkulturen mit zahlreichen, langen, stark verzweigten Prozessen zu erhalten 9,11. Dies erleichtert die Untersuchung der Erweiterung des Neuronenprozesses, so dass die deutlichen Unterschiede zwischen den Behandlungen erkannt werden können. Es ist wichtig zu beachten, dass, wenn primäre kortikale Neuronenkulturen nach 7-8 Tagen in vitro bereits ein hohes Neuritenwachstum zeigen, diese verwendet werden können, um Stress zu induzieren und die anschließende Analyse durchzuführen, anstatt 15 Tage in vitro Kulturen.
Darüber hinaus sollte der Hemmungsprozentsatz der ER-Stress-vermittelten CHOP-Überexpression etwa 65-70% oder höher betragen. Wichtig ist, dass die Stummschaltung des CN-Aα-Expressionsniveaus nur den durch ER-Stress induzierten CN-Aα-Expressionsanstieg beeinflussen sollte, ohne den basalen Spiegel zu verändern. Dies dient dazu, die Auswirkungen auf CN-Funktionen zu minimieren, die nicht mit der PERK-Signalisierung12,13 verbunden sind.
In Bezug auf das Analyseverfahren der Neuritenatrophie wird in diesem Artikel eine alternative Methodik vorgestellt, die weniger manuelle Arbeit erfordert als spezifische ImageJ-Plug-Ins, die bei der Verfolgung von Neuriten helfen. In der Regel erfordern diese, dass Prozesse für jedes Neuron einzeln verfolgt werden, während die in diesem Artikel verfolgten Schritte die Prozesse mehrerer Neuronen gleichzeitig mit 5 Sätzen von gemeinsam zugänglichen ImageJ-Befehlen verfolgen. Sowohl Plug-Ins als auch dieses Protokoll ermöglichen es, den Wert aller Prozesse im Beispielbild zu quantifizieren.
Wir haben bereits eine neuartige zytoprotektive Rolle für die ubiquitäre CN in der frühen Phase der UPR gezeigt, die entweder durch pharmakologische Werkzeuge oder ischämische Prozesse ausgelöst wird 3,4,8. Andere und wir beschrieben den Einfluss der Hemmung der CHOP-Expression auf das Zellüberleben in verschiedenen Systemen 8,11,14. Hier schlagen wir eine Methodik vor, bei der die Manipulation der Expression eines dieser Gene es ermöglicht, den Beginn des neuritischen Atrophieprozesses in einem zellulären Modell des ER-Stresses entgegen zu modulieren, um im entgegengesetzten Modus moduliert zu werden.
Wir stellen uns vor, dass diese Methodik verwendet werden kann, um die Anfälligkeit von Neuronen für eine neuritische Atrophie in verschiedenen Zellsystemmodellen von ER-Stress zu bewerten und so zum Verständnis der molekularen Grundlagen des Übergangs zwischen akuten und chronischen Phasen der UPR in verschiedenen neurodegenerativen Krankheitsmodellen beizutragen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Gonzalo Quasollo für seine unschätzbare Hilfe bei der Bildgebung und Dr. Andrea Pellegrini für die technische Unterstützung der Zellkultur.
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse von: dem National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 zwischen UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) und von der National Agency of Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentinien (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
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- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
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