Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

תיוג קוולנטי עם דיתילפירוקרבונט לחקר מבנה חלבון מסדר גבוה יותר על ידי ספקטרומטריית מסה

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

ההליכים הניסיוניים לביצוע תיוג קוולנטי מבוסס diethylpyrocarbonate עם זיהוי ספקטרומטרי מסה מתוארים. Diethylpyrocarbonate הוא פשוט מעורבב עם חלבון או חלבון קומפלקס של עניין, המוביל לשינוי של שאריות חומצות אמינו נגיש ממס. ניתן לזהות את השאריות ששונו לאחר עיכול פרוטאוליטי וניתוח כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה.

Abstract

אפיון המבנה הגבוה יותר של החלבון חיוני להבנת תפקידו. ספקטרומטריית מסה (MS) התפתחה ככלי רב עוצמה למטרה זו, במיוחד עבור מערכות חלבון שקשה ללמוד בשיטות מסורתיות. כדי לחקור מבנה של חלבון על ידי טרשת נפוצה, תגובות כימיות ספציפיות מבוצעות בתמיסה המקודדת את המידע המבני של החלבון לתוך המסה שלו. גישה יעילה במיוחד היא להשתמש ריאגנטים כי covalently לשנות ממס נגיש חומצת אמינו שרשראות בצד. תגובות אלה מובילות לעליות מסה שניתן לבצע בהן לוקליזציה עם רזולוציה ברמת השאריות בשילוב עם עיכול פרוטאוליטי וספקטרומטריית מסה דו-מושבית. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים הקשורים לשימוש diethylpyrocarbonate (DEPC) כמו מגיב תיוג covalent יחד עם זיהוי טרשת נפוצה. DEPC היא מולקולה אלקטרופילית מאוד המסוגלת לתייג עד 30% מהשאריות בחלבון הממוצע, ובכך לספק רזולוציה מבנית מצוינת. DEPC שימש בהצלחה יחד עם טרשת נפוצה כדי להשיג מידע מבני עבור חלבונים חד תחומיים קטנים, כגון β2-microglobulin, לחלבונים רב תחומיים גדולים, כגון נוגדנים חד שבטיים.

Introduction

חלבונים הם ביומולקולות חיוניות כמעט בכל תהליך פיזיולוגי. מגוון הפונקציות שחלבונים מבצעים אפשרי בגלל המבנים שהם מאמצים והאינטראקציות שיש להם עם ביומולקולות אחרות. כדי להבין את תפקוד החלבון ברמה עמוקה יותר, יש צורך בכלים ביוכימיים וביופיזיים כדי להבהיר את התכונות המבניות החשובות הללו ואת האינטראקציות. באופן מסורתי, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגניים וספקטרוסקופיה מגנטית גרעינית (NMR) סיפקו את הפרטים האטומיים הרצויים כדי לחשוף את מבנה החלבון. עם זאת, מערכות חלבון רבות לא ניתן לחקור על ידי טכניקות אלה בגלל התנהגות התגבשות ירודה, זמינות חלבון מוגבלת, הטרוגניות מדגם מוגזם, או מגבלות משקל מולקולרי. כתוצאה מכך, נוצרו שיטות ניתוח חדשות יותר המתגברות על מגבלות אלה. בין הטכניקות המתעוררות שיכולות לספק מידע מבני חלבון הוא ספקטרומטריית מסה.

ספקטרומטריית מסה (MS) מודדת את יחס המסה לטעינה (m/z) של מולקולה, ולכן יש להשיג מידע מבני ברמה גבוהה יותר על ידי קידוד המידע המבני הרצוי למסת החלבון. פותחו מספר גישות לקידוד מידע זה, כולל חילופי מימן-דיטריום (HDX)1,2,3,4, הצלבה כימית (XL)5,6, ו תיוג covalent (CL)7,8,9,10. ב- HDX, עמוד השדרה אמיד מימן מוחלפים על ידי דיטריומים קצת יותר מסיביים בשיעורים התלויים בנגישות ממס ובהיקף מליטה H. ניתן לאתר את היקף ה-HDX על ידי עיכול מהיר של החלבון לרסיסי פפטיד לפני ההפרדה והמדודה של שברים אלה על ידי ספקטרומטר המסה או על ידי ניתוק החלבון בניסוי מלמעלה למטה. קביעת שער החליפין מספקת תובנה נוספת לגבי דינמיקת החלבון. HDX הוכיחה את עצמה ככלי רב ערך לאפיון מבנה החלבון למרות האתגרים הקשורים להחלפת גב והצורך בציוד מיוחד כדי למקסם את הרבייה. ב- XL-MS, חלבונים מגיבים עם ריאגנטים דו-תפקודיים המקשרים באופן קוולנטי שרשראות צד סמוכות לשאריות בתוך חלבון נתון או בין שני חלבונים. בעשותו כן, XL-MS יכול לספק אילוצי מרחק שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין את מבנה החלבון. אזורי החלבון המקושרים זה לזה יכולים להיות מזוהים על ידי עיכול פרוטאוליטי ואחריו ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS. בעוד XL-MS הוא כלי רב תכליתי ששימש לחקר מגוון מתחמי חלבון, כולל בתוך תאים, זיהוי של מוצרי XL הוא מאתגר ודורש תוכנה מיוחדת.

CL-MS התפתח לאחרונה ככלי משלים ולעיתים אלטרנטיבי מבוסס טרשת נפוצה לחקר מבנה החלבון והאינטראקציות. ב- CL-MS, קומפלקס חלבונים או חלבונים משתנה בקובאליות עם מגיב מונו-פונקציונלי שיכול להגיב עם שרשראות צד חשופות ממס(איור 1). על ידי השוואת היקף השינוי של קומפלקס חלבון או חלבון בתנאים שונים, ניתן לחשוף שינויי קונפורמציה, אתרי קשירה וממשקי חלבון-חלבון. לאחר תגובת CL, מידע ספציפי לאתר, לעתים קרובות ברמת חומצת אמינו אחת, ניתן להשיג באמצעות זרימות עבודה פרוטאומיות טיפוסיות מלמטה למעלה שבהן חלבונים מתעכלים באופן פרוטאוליטי, שברי פפטיד מופרדים על ידי LC, ואתרים מותאמים מזוהים באמצעות טנדם MS (MS / MS). ההיסטוריה העשירה של הכימיה הביו-מצויגת הפכה ריאגנטים רבים לזמינים לניסויי CL-MS. ריאגנטים CL מתחלקים לשתי קטגוריות כלליות: (i) ספציפי ו-(ii) לא ספציפי. ריאגנטים ספציפיים מגיבים עם קבוצה פונקציונלית אחת (למשל, אמינים חינם)8,10 והם קלים ליישום, אך הם נוטים לספק מידע מבני מוגבל. ריאגנטים לא ספציפיים מגיבים עם מגוון רחב של שרשראות צד, אך לעתים קרובות דורשים ציוד מיוחד כגון לייזרים או מקורות synchrotron לייצר מינים אלה תגובתי מאוד. הידרוקסיל רדיקלים הם ריאגנט לא ספציפי הנפוץ ביותר, לאחר מיושם טביעת רגל רדיקלית הידרוקסיל (HRF)7,11,12,13 ניסויים לחקור מגוון רחב של חלבונים ותסביך חלבון תחת מגוון רחב של תנאים.

קבוצת המחקר שלנו השתמשה בהצלחה בריאגנט אחר יחסית לא ספציפי בשם diethylpyrocarbonate (DEPC) כדי לחקור מבנה חלבון ואינטראקציות בהקשר של ניסויים CL-MS14,15,16,17,18,19,20 , 21,22,23,24,25. DEPC מציעה את הפשטות של ריאגנטים תיוג ספציפיים (כלומר, אין צורך בציוד מיוחד כדי לבצע את התגובות), תוך תגובה עם עד 30% של חומצות אמינו בחלבון הממוצע. כריאגנט אלקטרופילי מאוד, DEPC מסוגל להגיב עם N-terminus ואת שרשראות הצד הנוקליופילי של ציסטאין, היסטידין, ליצין, טירוסין, סרין, ושאריות threonine. בדרך כלל, מוצר יחיד של תגובות אלה נוצר, וכתוצאה מכך עלייה המונית של 72.02 Da. סוג אחד זה של המוצר מנוגד ל-55 מוצרים שונים שניתן לייצר כאשר חלבונים מגיבים עם הידרוקסיל רדיקלים7. כימיה פשוטה כזו מאפשרת זיהוי של אתרים מסומנים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לשימוש CL-MS מבוסס DEPC ללמוד מבנה חלבון ואינטראקציות. מתוארים פרטים הקשורים להכנת ריאגנטים, תגובות של חלבון DEPC, תנאי עיכול חלבונים, פרמטרי LC-MS ו- MS/MS וניתוח נתונים. אנו גם מדגימים את התועלת של תיוג DEPC על ידי מתן תוצאות לדוגמה מאינטראקציות חלבון-מתכת, חלבון-ליגנד וחלבון-חלבון, כמו גם חלבונים העוברים שינויים מבניים בעת החימום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חלבונים ריאגנטים

הערה: פרוטוקול זה כולל זרימת עבודה לדוגמה לתיוג חלבון עם DEPC. תנאים מסוימים וריכוזי ריאגנט המפורטים עשויים להשתנות בהתאם לחלבון המועדף.

  1. הכינו את כל הפתרונות ריאגנטים בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
  2. הכינו תמיסת חלבון של הריכוז הרצוי, בדרך כלל בטווח של עשרות מיקרומטר, במאגר חומצה פרופאנסולפונית (MOPS) של 10 מ"מ 3-(N-מורפולינו) ב- pH 7.4. לחלופין, הכינו פתרון חלבון קיים להחלפת חיץ ב- 10 mM pH 7.4 MOPS אם המדגם מכיל מאגר נוקליאופילי שיהיה תגובתי עם DEPC. מאגרים אחרים (למשל, מלוחים מאגר פוספט) ניתן להשתמש גם, כל עוד אין להם קבוצות פונקציונליות נוקליאופילית.
  3. הכן פתרון DEPC 100 מ"מ באצטוניטריל יבש (ACN) על ידי pipetting 1.45 μL של המניה 6.9 M DEPC פתרון לתוך 98.55 μL של ACN.
    הערה: אין קבוצה אחת של ריכוזים שיעבדו עם כל חלבון, אם כי ניתן להעריך את הריכוזים האופטימליים על סמך מספר שאריות שלו ושל Lys23. לדוגמה, עם 50 μL של 50 μM β2-microglobulin פתרון, להגיב על החלבון עם 0.2 μL של DEPC 100 מ"מ עבור ריכוז DEPC הסופי של 200 μM (שווה 4x ריכוז החלבון) כדי להבטיח את היחס הטוחן הרצוי באמצעות דוגמה כללית זו (טבלה 1). תיוג DEPC הוא תגובת סדרשני, כך ששינוי ריכוז החלבון או ה- DEPC בתערובת התגובה ישנה את קצב התיוג.
  4. הכן 1 M imidazole פתרון על ידי שקילה 10 מ ג של imidazole והתמוססות ב 146.9 μL של מים ברמה HPLC.

2. תיוג קוולנטי של חלבון שלם

  1. הגדר טמפרטורת אמבט מים ל 37 מעלות צלזיוס ולחכות לאמבטיה כדי להגיע לטמפרטורה יציבה.
    הערה: ריכוזים ונפחים של ריאגנטים עבור פרוטוקול תיוג לדוגמה ניתן למצוא בטבלה 1.
  2. בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, מערבבים מאגר MOPS ותמיסת חלבון בכמויות המופיעות בטבלה 1.
  3. לחלבון ולחוצץ מוסיפים 0.2 μL של פתרון DEPC, מקפידים לערבב כראוי את הפתרון שנוצר, ולאחר מכן מניחים את הצינור המכיל את תערובת התגובה לאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
    הערה: נפח ACN הוסיף לא יעלה על 1% מנפח התגובה הכולל כדי למנוע הפרעה של מבנה החלבון במהלך תגובת התיוג. זמן התגובה תלוי המשתמש, אם כי תגובה של דקה אחת בתנאים לדוגמה ממזערת את ההארבל ואת ההידרו ליזה הפוטנציאלית של DEPC14.
  4. לאחר 1 דקה, להסיר את הצינור המכיל את תערובת התגובה מאמבט המים להרוות את התגובה עם 1 μL של פתרון 1 M imidazole כדי לטהר את DEPC unreacted הנותרים.
    הערה: הריכוז הסופי של imidazole בתערובת התגובה צריך שווה 50x הריכוז של DEPC בתערובת התגובה. פעולה זו תבטיח כי DEPC שנותר לא מנוטרל הוא נוקה.

3. הכנת תקציר חלבונים עבור LC-MS מלמטה למעלה

הערה: בחר תנאי עיכול נוחים לחלבון המעניין. צעדים נפוצים כרוכים בהפחתת החלבון והפחתתו של כל קשר דיסולפידי.

  1. פותחים את החלבון על ידי הוספת מגיב נפרש מתאים לתערובת התגובה.
    הערה: סוכנים נפוצים כוללים ACN, אוריאה, ו guanidine הידרוכלוריד (GuHCl).
  2. הכן פתרונות של Tris(2-carboxyethyl)פוספין (TCEP) ו iodoacetamide (IAM) על ידי שקילה 5 מ"ג של כל אחד והפסתם בצינורות microcentrifuge חדשים ב 174.4 ו 270.3 μL של 10 mM pH 7.4 MOPS מאגר, בהתאמה, עבור הפחתת ו alkylation צעדים.
  3. להפחית קשרים disulfide על ידי הוספת 2 μL של TCEP 100 מ"מ (ריכוז סופי של 2 מ"מ בתערובת תגובה) פתרון לתערובת התגובה ולהגיב במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הריכוז הסופי של TCEP צריך להיות שווה פי 40 מריכוז החלבון לכל קשר דיסולפיד הקיים בתמיסה.
  4. אלקילאט הפחית ציסטאינים עם 4 μL של פתרון IAM 100 מ"מ (ריכוז סופי של 4 מ"מ בתערובת תגובה) במשך 30 דקות בחושך. IAM רגיש לאור ויתפרק תחת אור ישיר.
    הערה: הריכוז הסופי של IAM בתמיסה צריך להיות כפול הריכוז המשמש TCEP, או 80x ריכוז החלבון לכל קשר דיסולפיד.
  5. לעכל את החלבון עם אנזים מתאים כגון טריפסין או chymotrypsin. יחס אנזימים של 10:1 לעיכול של 3 שעות ב-37°C עם אנזים משותק בקצב רועד של 300 משיכות/דקה מספיק בדרך כלל לחלבונים עם תווית DEPC. ראה דיון.
  6. לאחר העיכול, להפריד את האנזים משותק מן הפפטידים מתעכל על ידי צנטריפוגה ב 12,000 סל"ד במשך 5 דקות.
  7. לנתח את המדגם מיד על ידי LC-MS / MS או פלאש להקפיא את המדגם עם חנקן נוזלי כדי למזער את השפלה מדגם ואובדן תווית. אחסן את הדגימות שהוקפאו בהבזק ב- < -20 °C עד מוכן לניתוח LC-MS/ MS.

4. ניתוח LC-MS/MS

הערה: ניתן להשתמש בפרמטרים סטנדרטיים של LC-MS/MS עבור פרוטאומיקה מלמטה למעלה כדי לזהות אתרים המסומנים בתווית על שברי הפפטיד הפרוטאוליטיים. דוגמה כללית מתוארת להלן.

  1. הפרד את הפפטידים בעלי התווית DEPC באמצעות שלב נייח C18 הפוך. השתמש בשלב נייד טיפוסי של LC של שני ממיסים: (A) מים + 0.1% חומצה פורמית ו- (B) ACN + 0.1% חומצה פורמית באמצעות שיפוע (למשל, איור 2) כדי להשיג את ההפרדה הטובה ביותר של פפטידים.
    הערה: ניתן למטב את זמן ההפרדה בהתבסס על מורכבות הדגימה, וקצב זרימת הפאזה הנייד תלוי באם נעשה שימוש בנימים או בננו LC.
  2. השתמש בספקטרומטר מסה המסוגל לבצע LC-MS ו- MS/MS מקוון כדי לזהות אתרי שינוי DEPC בפפטיד. בניסויים שלנו, השתמשנו בהצלחה במספר סוגים של ספקטרומטרים של מסה. כל ספקטרומטר מסה המסוגל לבצע באופן אוטומטי MS / MS של פפטידים רבים במהלך ניתוח LC-MS צריך להיות מתאים. הפרמטרים הרלוונטיים של MS כוללים: מתח מקור ESI = -4000 V עבור ESI רגיל; -2000 V עבור nanospray; רזולוציית אורביטראפ = 60,000; משך אי-הכללה דינאמי = 30 שניות; סוג הפעלה של MS/MS: CID, ETD או שניהם; טווח סריקה המונית = 200-2,000; בקרת הגברה אוטומטית = 4.0E5 (MS1 ב- Orbitrap) ו- 5.0E4 (MS2 במלכודת יון מרובע ליניארי).
  3. טען והזרק את דגימת החלבון המתעכלת המסומנת במערכת LC והתחל את רכישת LC-MS/MS. אם הדגימה הוקפאה, הפשר לפני הניתוח. להסיט את קולחים LC לפסולת במשך 5 הדקות הראשונות, כדי למנוע מלחים מוגזמים מלהיכנס למקור ESI.
    הערה: לולאת הזרקת μL 5 מנוצלת בדרך כלל, ומאפשרת הזרקה של כ -2.5 מיקרוגרם חלבון ל- LC-MS / MS. הדבר תלוי בתנאי הטעינה של ה- LC כדי לא לסתום את מזרק הדגימה.

5. ניתוח נתונים

  1. זהה אתרי תוויות DEPC וכמת אזורי שיא פפטיד באמצעות תוכנה מתאימה עבור ספקטרומטר המסה המשמש.
  2. כלול תוספת DEPC (72.02 Da) ו carbamidomethylation (57.02 Da) כשינויים משתנים. פרמטרי חיפוש נוספים עבור ניתוח MS/MS הם כדלקמן: מחשוף מרבי שלא נענו = 3; סוגי יון קטע = b ו- y; סובלנות m/z מבשר = 10 עמודים לדקה (ערך זה צריך להיות גבוה יותר אם נעשה שימוש בספקטרומטר מסה של מלכודת יון מרובע); סטיית קטע m/z = 0.5 Da (ערך זה צריך להיות נמוך יותר אם ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה משמש לסריקת יון מוצר); טעינת קודמן = 1-4.
    הערה: לאלגוריתמים שונים לחיפוש מסדי נתונים יש מערכות ניקוד שונות, ורבים מהם עלולים להתקשות בזיהוי פפטידים ששונו על-ידי DEPC מכיוון שרמות השינוי יכולות להיות נמוכות. התאמת חיתוך הציון עשויה להיות נחוצה כדי לזהות יותר פפטידים שכותרתו. אם כן, יש להשתמש בחקירה ידנית של נתוני MS/MS כדי לאמת פפטידים בעלי ניקוד נמוך. המכפלה של הידרוליזה של תווית DEPC אינה כלולה בחיפוש הנתונים מכיוון שה- DEPC שעבר הידרוליזה אינו מגיב עוד כלפי שרשראות צד נוקליאופיליות.
  3. קבעו אחוזי שינוי ברמת השאריות בעזרת אזורי השיא הכרומטוגרפיים של הגרסאות שהשתנו ולא שונו של הפפטידים.
    הערה: כל פפטיד המכיל את שאריות הריבית שהשתנו חייב להילקח בחשבון וכל מצבי החיוב הכלולים חייבים להיות נוכחים בכל הדגימות שנמדדו. פפטידים בעלי יעילות יינון שונה ו eluting בזמנים שונים גורם ערך זה להיות מידה יחסית ולא מוחלטת של שינוי של אתר מסוים.
    Equation 1
    כאשרA i,z מייצג אזור שיא של כל פפטיד נתון (i) המכיל את שאריות העניין ושוקל את כל מצבי הטעינה שזוהו (z).
  4. קבע אם שינוי תיוג בין פקד למדגם ניסיוני הוא משמעותי באמצעות הערכה סטטיסטית. שלוש מדידות משכפלות עבור כל מדגם הן אופייניות, ובדיקות t מנוצלות בדרך כלל עם מרווחי בר-סמך של 95 או 99%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זיהוי אתרי שינוי ואחוזי שינוי של DEPC
תוספת המונית עקב תיוג קוולנטי ניתן למדוד ב (א) חלבון שלם ו (ב) רמות פפטיד8,9. ברמה ללא פגע, התפלגות של מיני חלבון עם מספר שונה של תוויות ניתן לקבל מניתוח ישיר או LC-MS של דגימות חלבון שכותרתו. כדי להשיג מידע מבני ברזולוציה גבוהה יותר (כלומר, נתוני תיוג ספציפיים לאתר), יש לבצע מדידות ברמת הפפטיד. לאחר שלבי התיוג והמרה, החלבונים המסומנים מסומנים כפופים לניתוח פרוטאומי מלמטה למעלה (כלומר, הפחתת דיסולפידים, אלקילציה, עיכול פרוטאוליטי ו- LC-MS/MS). איור 3 מראה כיצד האתרים המסומנים בתוויות DEPC מזוהים ורמות השינוי שלהם מחושבות עבור ניסוי DEPC CL-MS בחלבון β-2 מיקרוגלובולין (β2m)21. MS/MS משמש לרצף הפפטידים המסומנים בתווית ולאתר במדויק את האתרים המסומנים בתוויות DEPC שלהם, בעוד שאחוזי השינוי מחושבים מאזורי השיא היחסיים שלהם בכרומטוגרמות יון שחולצו (ראו איור 3A).

מיפוי משטח חלבון באמצעות DEPC CL-MS
בגלל הקשר בין טופולוגיית החלבון לבין שיעור התיוג, DEPC שימשה לחקר שינויים במבנה החלבון בסדר גבוה יותר (HOS) ולזיהוי אתרי אינטראקציה עם חלבונים8,9. דוגמה לכך היא ההשפעה של כריכת Cu(II) על המבנה של β2m. ניתן למדוד מקדמי קצב שינוי DEPC של שברי פפטיד מ- β2m ו- Cu(II) מאוגדים β2m (b2m-Cu)(טבלה 2)על ידי ריכוזי DEPC משתנים ויצירת חלקות קינטיות מסדר שני14,24. תגובת DEPC של שאריות ב β2m-Cu חושף שינויים משמעותיים קצב תיוג עבור His31, Ser33, ו Thr4, בעוד אתרים אחרים, כולל שאריות שונות שלו, הם סטטיסטית ללא שינוי. נתונים אלה עולים בקנה אחד עם העובדה כי His31, אבל לא שאריות אחרות שלו ב β2m, קושר Cu גורם לשינויים מבניים ליד His31 (כלומר, Ser33) וליד N-terminus (כלומר, Thr4)(איור 4)14,26,27.

DEPC CL-MS לזיהוי שינויים ב- HOS
תיוג DEPC עם זיהוי טרשת נפוצה הוא גם כלי רב ערך לאפיון שינויים HOS חלבונים, אשר יש השלכות חשובות על טיפולי חלבון, אשר כיום פלח הצמיחה המהירה ביותר של שוק התרופות28. DEPC CL יכול לזהות אזורי חלבון ספציפיים העוברים שינויים מבניים על מתח תרמי חמצוני18. לאחר β2m נחשף ללחץ חום, שאריות רבות שעוברות ירידה משמעותית בהיקפי התיוג (N-terminus, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) מקובצים בצד אחד של החלבון, דבר המצביע על כך שאזור זה של החלבון עובר שינוי קונפורמי או אולי מתווך צבירה (איור 5A). בנוסף לשאריות אלה, לאחר שהחלבון נחשף ללחץ חמצוני, שאריות אחרות עם ירידה בתיוג (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) יוצרות אשכול על פנים אחרות של החלבון, מה שמצביע על כך שהשינויים הקונפורמטיביים הנגרמים על ידי חמצון מתרחשים במקום אחר (איור 5B). עבודה אחרת מהקבוצה שלנו הראתה גם כי DEPC CL-MS יכול לזהות ולזהות אתרים של שינויים קונפורמיים בתעודות נוגדנים חד שבטיות הדגיש חום20.

DEPC CL-MS לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון
ניתן לקבל תובנות לגבי אתרי אינטראקציה בין חלבונים לחלבון וממשקי צבירה לחלבונים היוצרים עמילואיד באמצעות תיוג DEPC גםכן 9. ירידות ברמות השינוי של שאריות על היווצרות אוליגומר יכול לחשוף את ממשקי האיגוד. DEPC CL-MS שימש לאפיון אוליגומרים עמילואיד מראש של β2m, שהוא החלבון היוצר עמילואיד עמילואידוזיס הקשורותלדיאליזה 29, לאחר ייזום היווצרות עמילואיד עם Cu(II)15,16,26. השוואת תגובתיות DEPC של מונומר β2m עם דימר β2m עמילואיד מראש שנוצר 2 שעות לאחר הוספת Cu(II) מראה כי תשעה שאריות לעבור ירידה תיוג בעוד שש שאריות לעבור שום שינוי או עליות קלות תיוג (איור 6A). לאחר מיפוי שינויים אלה על β2m, ברור מיד כי ממשק דימר כרוך ABED β גיליונות של מונומרים β2m (איור 6B)15.

DEPC CL-MS לחקר כריכת חלבון-ליגנד
קשירה ליגנד לחלבונים מובילה לירידה בנגישות הממס של שאריות המקיימים אינטראקציה עם הליגנד, ו- CL-MS מבוסס DEPC יכול לשמש לזיהוי אתרי קשירה ליגנד בחלבונים. לדוגמה, אתרי האיגוד של epigallocatechin-3-gallate (EGCG) על β2m בתנאים להרכיב עמילואיד ניתן לזהות על ידי ירידות משמעותיות תיוג DEPC בשאריות קבור על ידי איגוד EGCG. בנוכחות ECGC, ל-Lys6 ול-Lys91 יש אחוזי שינוי נמוכים יותר של DEPC (איור 7),ושאריות אלה מקובצות באזור אחד של החלבון, מה שמצביע על הגנה על שאריות עקב קשירה של ליגנד. N-terminus, Thr4, ו His31, בינתיים, עוברים עליות בהיקפי תיוג (איור 7), אשר מעידים על שינויים מבניים הנגרמים על ידי ECGC ומציעים כי אתרי מחייב Cu(II) על β2m (N-terminus ו His31)14,30,31 עלול להיות משובש כתוצאה מחייבת ECGC32. בנוסף, האתרים מחייבים של שני מעכבי מולקולה קטנה אחרים של היווצרות עמילואיד β2m, ריפאמיצין SV ו דוקסיציקלין, זוהו באמצעות CL-MS19. במחקר זה, עם זאת, תוצאות תיוג DEPC לבד לא היו מספיק כדי למפות את אתרי האיגוד עם רזולוציה מבנית מספקת. תוצאות משלושה ריאגנטים שונים CL, כלומר DEPC, BD, ו 1-אתיל-3-(3-(דימתילאמינו)propyl)carbodiimide - גליצין אתיל אסתר (EDC / GEE) זוג היו נחוצים כדי לאתר טוב יותר את אתרי הכריכה19.

שיפור הרזולוציה המבנית והפחתת ערבול התוויות
למרות שתיוג DEPC גורם להיווצרות של איגרת חוב קוולנטית, אובדן תווית עקב הידרוליזה יכול להתרחש, במיוחד עבור שאריות Ser, Thr ו- Tyr (איור 8). אובדן תווית ניתן למזער על ידי הפחתת הזמן בין תגובת CL DEPC וניתוח LC-MS באמצעות עיכול פרוטאוליטי קצר (למשל, עיכול 2 שעות עם אנזימים משותקים) ולא עיכול לילה. עיכול מהיר תוצאה של מדידת שאריות מותאמות יותר, מה שמגדיל את כמות המידע המבני של החלבון. לדוגמה, עיכול של 2 שעות עם chymotrypsin משותק מוביל באופן עקבי לזיהוי של שאריות נוספות ששונו על ידי DEPC ב- β2m (איור 9)17. עם עיכול לילה על 75% של Ser, Thr, Tyr, שלו, ו Lys שאריות ב β2m מזוהים, אבל כאשר הזמן בין תיוג LC-MS מצטמצם באמצעות עיכול 2 שעות, 95% של שאריות אלה ב β2m מזוהים. רוב השאריות שזה עתה זוהו הן שאריות טיר ות'אר הנוטות להידרוליזה.

במהלך העבודה שלנו עם DEPC, שמנו לב כי בחלבונים מסוימים, Cys שאריות כי מאג"ח disulfide מותאמים על ידי DEPC, למרות הקשרים disulfide הם שלמים במהלך תגובות תיוג DEPC. תיוג כזה של שאריות Cys מתרחש מכיוון שתיולים בחינם יכולים להגיב עם שאריות אחרות ששונו בתמיסה (איור 10), מה שמוביל למה שמכונה "ערבוב תוויות" כאשר קבוצת קרבתוקסי מועברת לשאריות Cys. ערבול תוויות מקטין את רמות השינוי בשאריות אחרות ומספק מידע מבני שגוי על חלבונים. כדי למנוע ערבוב תווית, thiols Cys חינם חייב להיות alkylated מלא מיד לאחר הפחתת דיסולפיד33.

Figure 1
איור 1: ספקטרומטריית מסה-תיוג קוולנטית (CL-MS). מגיב חד תכליתי משמש לשינוי חומצות אמינו נגישות ממס וניתן להשתמש בו כדי לספק מידע ספציפי לאתר על שינויים קונפורמיים או ממשקי אינטראקציה בחלבונים (התמונה העליונה לעומת התחתונה). החלבון שעבר שינוי מתעכל באופן פרוטאוליטי, והפפטידים הנובעים מכך מנותחים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית (LC) בשילוב עם טרשת נפוצה וטנדם MS (MS/MS). הדמות הותאמה מ- Limpikirati, P., ליו, T., Vachet, R. W. Covalent תיוג-מסה ספקטרומטריה לחקר מבנה החלבון ואינטראקציות. שיטות 144, 79-93 (2018). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אמצעי אחסון בשימוש (μL) ריכוז בתמיסה (μM)
חלבון (100 מיקרומטר, MOPS) 50 50
MOPS (10 מטר, עמ' 7.4) 48.8 לא/א
DEPC (100 מ"מ) 0.2 200 (=4x[חלבון])
אימידזולה (1 מ') 1 10,000 (=50x[DEPC])
סה"כ נפח 100

שולחן 1. פרוטוקול תיוג כללי של DEPC.

Figure 2
איור 2. דוגמה מעבר צבע LC להפרדת פפטידים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 המחשה של אופן הזיהוי של אתרים המסומנים בתוויות DEPC ורמות השינוי שלהם מחושבות. לאחר תיוג DEPC ועיכול פרוטאוליטי, (A) ניתוח LC-MS של החלבון המתעכל מבוצע. אזורי שיא של (B) ללא תווית ו- (C) עם תווית פפטידים בכרומטוגרמה משמשים לחישוב אחוז התיוג. במהלך LC-MS, פפטידים נתונים CID MS / MS. ספקטרום מסה טנדם של (D) ללא תווית ו (E) &( F) פפטידים שכותרתו המתקבלים בזמני שמירה ספציפיים משמשים לריצוף פפטיד וזיהוי של אתרים שכותרתו DEPC. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שאריות b2 מ' b2m-Cu
ת'ר4 0.082 ± 0.004 0.052 ± 0.009
ה-13 שלו 0.041 ± 0.003 0.033 ± 0.005
ה-31 שלו 0.010 ± 0.001 0.003 ± 0.001
Ser33 0.010 ± 0.002 0.004 ± 0.001
ה-51 שלו 0.036 ± 0.003 0.030 ± 0.004
Ser88 0.029 ± 0.007 0.020 ± 0.006

טבלה 2 מקדמי קצב שינוי DEPC ספציפיים לאתר (k, M-1s-1) עבור b2m בהיעדרו ובנוכחותו של Cu(II).

Figure 4
איור 4 באמצעות DEPC CL-MS כדי לקבוע את ההשפעה של כריכת Cu(II) על המבנה של β2m: (A) מיפוי משטח חלבון של השאריות עם ירידה משמעותית בשיעורי תיוג DEPC (כחול), המציין שינויים בנגישות הממס שלהם על כריכת Cu(II), ואלה ללא שינויים משמעותיים בקצב התיוג (מגנטה) (קוד הצטרפות PDB 1JNJ). (ב) דוגמה למזימות קינטיות מסדר שני ספציפיות לאתר של התגובה של β2m עם ריכוזים שונים של DEPC בנוכחות ובהיעדר Cu(II). ניתן לקבל את מקדם קצב התיוג (k) משיפוע החלקה הקינטית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 תוצאות תיוג Covalent עבור הדגיש לעומת β2m מקורי: (A) עומס חום - חימום ב 75 °C (75 °F) עבור 24 שעות ו (B) מתח חמצוני - עם 3% H2O2 עבור 24 שעות. שינויים משמעותיים באחוזי השינוי מוצגים בכחול (ירידה בתיוג) ואדום (עלייה בתיוג) בעוד שאריות ללא שינויי תיוג משמעותיים מוצגות בירוק חיוור (קוד הצטרפות PDB 1JNJ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 שימוש ב- DEPC CL-MS כדי לקבוע את הממשק העמים יותר עבור עמילואיד עמום מראש של β2m: (A) סיכום של שינויים ברמת השינוי DEPC עבור שאריות ששונו במונומר (כלומר, t = 0) ו- dimer 2 שעות לאחר הוספת Cu(II). שאריות עם ירידה משמעותית בהיקף התיוג מסומנות בכוכבית (*). (ב) תוצאות תיוג Covalent ממופה על המבנה β2m. שאריות עם תיוג מופחת מוצגות בכחול ושאריות ללא שינויים או עליות קלות בתיוג מוצגות באדום (קוד הצטרפות PDB 1LDS). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7 תוצאות תיוג קוולנטי עבור b2m מאוגד EGCG לעומת b2m לא מאוגד. אחוזי השינוי של DEPC מוצגים עבור השאריות המוצגות. הבדלים מובהקים סטטיסטית באחוז התיוג הקוולנטי מסומנים בכוכבית (*). עליות בתווית על כריכת ECGC מוצגות באדום בעוד ירידות מוצגות בכחול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8 תגובות תיוג covalent DEPC (החלפת acyl נוקליאופילית) ואובדן תווית (הידרוליזה של שאריות carbethoxylated) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 9
איור 9 מיפוי אתרי השינוי הנמדדים על β2m. (א) אתרים מסומנים לאחר עיכול לילה קונבנציונלי, ו-(ב) מסומן אתרים לאחר עיכול 2 שעות עם chymotrypsin משותק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10 מנגנון השערה של ערבוב תווית DEPC (לכידת Cys של carbethoxylated שלו) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים
יש לשקול מספר נקודות לגבי תכנון ניסיוני כדי להבטיח תוצאות תיוג אמינות. ראשית, כדי למקסם את תיוג החלבון, יש צורך להימנע מאגרים עם קבוצות נוקליאופיליות חזקות (למשל, טריס) כי הם יכולים להגיב עם DEPC ולהוריד את היקף התיוג. זה גם מתקבל על הדעת כי מאגרים כאלה יכולים להגיב עם שאריות שכותרתו, גרימת הסרת התווית ולכן אובדן מידע מבני. אנו ממליצים על MOPS כמאגר, אך גם מלוחים עם מאגר פוספט פועלים. שנית, dithiothreitol יש להימנע להפחתת אג"ח disulfide כי thiols חינם ריאגנט זה יכול להגיב עם שאריות שכותרתו ולהסיר את השינוי DEPC. זו אותה כימיה היא הסיבה שזה חיוני אלקילאט מופחת disulfides כי Cys חינם יכול לגרום תווית תוך חלבון ערבול33. שלישית, שלב האימידזול (פרוטוקול שלב 2.4) הוא קריטי לעצירת תגובת התיוג כך שכל DEPC שנותר אינו מסוגל להמשיך להגיב עם החלבון.

חשוב גם להעריך כי תגובת תיוג DEPC היא סדר שני, כלומר שינוי ריכוז החלבון או DEPC ישפיע על היקף התיוג. מצאנו באופן אמפירי כי 4:1 DEPC:יחס ריכוז החלבון הוא ערך סביר כאשר החלבון יש ריכוז של 10 של טווח μM, כפי שהוא נוטה למנוע כל שינויים מבניים הנגרמת על ידיתיוג 14. עם זאת, יחס הריכוז האופטימלי DEPC:protein תלוי בחלבון כמו גם תלוי ריכוז, וחלבונים מסוימים דורשים יחס גבוה יותר כדי להשיג תיוג מספיק. ניתן להעריך את ריכוז DEPC האופטימלי כדי למזער את ההפרעה המבנית של תיוג חלבון נתון ממספר שאריות ממס נגיש שלו Lys23.

כדי למנוע שונות בהיקפים תיוג עקב השפלה ריאגנטית לאורך זמן, השליטה ואת התגובות הניסיוניות צריך להתבצע באופן אידיאלי באותו יום. DEPC עובר הידרוליזה מהירה כאשר נחשף למים יהיה להשפיל במהלך אחסון גם כן, כך תרגול מעבדה טוב וטיפול ריאגנט הם המפתח. כאשר אינו בשימוש, יש לאחסן את בקבוק מלאי DEPC במייבש.

שינויים ופתרון בעיות
מכיוון ש- DEPC CL היא תגובה מבוקרת קינטית, קצב התיוג, ובכך רמת השינוי, נשלטים על ידי ריכוזי חלבון ריאגנטים, זמן תיוג וטמפרטורה. כפי שצוין לעיל, לעתים קרובות DEPC CL מבוצעת במשך דקה אחת ב 37 °C (69 °F) עם DEPC ליחס טוחנת חלבון של 4 עד 1. ביחס טוחן זה (4x), חלבונים ניתן לתייג בבטחה ללא הפרעות מבניות14. DEPC:יחסי טוחנת חלבון כי הם גדולים מ 4 ניתן להשתמש עבור חלבונים מסוימים, ולא מפתיע ריכוזי DEPC גבוה יותר לגרום תיוג נרחב יותר ומידע מבני יותר. הדרך הבטוחה ביותר להשתמש בריכוזי DEPC גבוהים יותר ללא מבנה מפריע היא ליצור חלקות תגובת מינון שבהן התגובה של שברי פרוטאוליטי של חלבון נמדדת כפונקציה של ריכוז DEPC (ראה איור 4B)14,24. עם זאת, גישה זו עשויה לגזול זמן רב, שכן היא דורשת מדידות מרובות. לאחרונה, הוכחנו כי ריכוז DEPC אופטימלי יכול להיות מוערך עבור חלבון נתון מהמספר ו SASA של שאריות שלו ליס בחלבוןזה 23. בעבודה האחרונה, יש לנו גם הציע דרכים חלופיות כדי להעריך כי מבנה החלבון אינו מוטרד במהלך CL9,24.

עיכול פרוטאוליטי הוא גם צעד חשוב ב- DEPC CL-MS, שכן הפפטידים הנוצרים מאפשרים להתאים מידע מבני לאחר ניתוח LC-MS/MS. באופן כללי, פרוטאזות סרין כגון טריפסין ו chymotrypsin יעילים לעיכול חלבון. טריפסין משמש יותר בשל יעילות המחשוף שלה וספציפיות בצד C-מסוף של Lys ושאריות ארג. עם זאת, טריפסין בדרך כלל אינו מבקע לאחר שאריות Lys שכותרתו DEPC, גרימת מחשוף שלא נענו בשאריות Lys שכותרתו שיכול לפעמים לסבך ניתוח נתונים. הפעילות של chymotrypsin, אשר מחשוף לאחר שאריות הידרופוביות מגושם, בדרך כלל אינו מושפע תיוג DEPC, אבל אנזים זה יש יעילות מחשוף נמוך יותר וספציפיות מאשר טריפסין. בנוסף, עבור חלבונים עם שאריות הידרופוביות רבות, chymotrypsin יכול ליצור מספר שברי פפטיד קצרים שיכולים להיות קשים בנפרד ולזהות בתנאי LC-MS סטנדרטיים.

ניתוחי LC-ESI-MS/MS של תקציר חלבונים דורשים אלקטרוספריה יציבה כדי להשיג תוצאות חצי-קטגוריות אמינות. נימי ננו LC הם פלטפורמות הפרדה נפוץ שבו הפרדה יעילה ניתן להשיג עם כמויות קטנות של חלבון. עם זאת, מניסיוננו, LC נימי מספק מידע כמותי אמין יותר (כלומר, רמות שינוי) מאשר ננו LC בגלל כמויות מדגם גבוהות יותר המשמשים. עבור חלבונים גדולים המתעכלים למספר רב של פפטידים מסומנים וחסרי תווית, coelution של פפטידים עם הידרופוביות דומה עלול לקרות. במקרים אלה, יש להשתמש במעברי צבע ארוכים יותר של LC להפרדות צבע טובות יותר.

MS/MS מהיר ויעיל חשוב לכיסוי רצף טוב ולזיהוי אתר תוויות. ספקטרומטרים המוניים עם מלכודות יון מרובע הם מכשירים מצוינים למטרה זו. בדרך כלל, CID היא שיטה נפוצה ויעילה מאוד עבור דיסוציאציה פפטיד; עם זאת, ראינו מקרים של DEPC תווית ערבול במהלך CID של יוני פפטיד שכותרתו, וכתוצאה מכך עמימות תיוג זהות האתר34. במקרים נדירים אלה, ETD מספק מידע אמין יותר. כתוצאה מכך, אם אפשר, לסירוגין בין שתי טכניקות הדיסוציאציה יכול להיות מועיל. מכיוון ש- DEPC יכול לתייג סוגים רבים ושונים של שאריות, מקובל שנוצרים isomers של קטע פפטיד נתון השונים בשרשרת הצדדית שהשתנתה. פעמים רבות, אלה isomers פפטיד יכול להיות מופרדים על ידי LC, למרות שהם נוטים elute בזמנים דומים מאוד. יש לקחת בחשבון סבירות זו בעת הגדרת זמני אי-הכללה של MS/MS במהלך ניתוחים אוטומטיים של LC-MS/MS. בדרך כלל, יש להשתמש בזמני אי-הכללה קצרים מהרגיל.

מגבלות
בעוד DEPC CL-MS הוא מועיל מאוד לחקר מבנה החלבון ואינטראקציות, התקדמות משמעותית נעשתה כדי לטפל במגוון רחב של מערכות חלבון, כמה מגבלות של טכניקה זו להישאר. אם תנאי התיוג אינם ממוטבים היטב (למשל, שימוש בריכוז גבוה מדי של DEPC), תיוג יתר יכול להטריד את מבנה החלבון ולהוביל למידע מבני לא מדויק14,23,24. בנוסף, הדיוק והדיוק של רמות השינוי הנמדד מושפע ממספר גורמים, כולל אובדן תווית אם הדגימות יושבות זמן רב מדי לפני ניתוח LC-MS ושגיאות בשלבי התיוג הכימי. עקביות בכל שלב ניסיוני חשובה לתוצאות אמינות. אחת הבעיות המאתגרות יותר המשויכות כיום ל- CL-MS מבוסס DEPC היא תוכנת ניתוח נתונים. תוכניות ניתוח נתונים זמינות אינן ממוטבות לזיהוי מוצלח של פפטידים עם אחוזי שינוי נמוכים (למשל, < 1%). כתוצאה מכך, פיתחנו והשתמשנו בתוכנה מיוחדת כדי לאפשר פפטידים עם רמות שינוי נמוכות להיות מזוהה בקלות18.

למרות DEPC CL-MS יכול לספק רזולוציה מבנית חלבון מתון, מבנה תלת-ממדי מפורט לא ניתן להשיג מטכניקת התיוג. לאחרונה פותחו כמה כלי חיזוי מבניים המבוססים על נתוניתיוג 35,36. עם זאת, התפתחויות נוספות נדרשות כדי לשלב באופן אופטימלי תוצאות תיוג DEPC עם מידול חישובי לחיזוי מבנה החלבון.

משמעות בהשוואה לשיטות חלופיות
הרזולוציה המבנית האפשרית עם CL-MS מבוסס DEPC היא מתונה בהשוואה לטכניקות כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או NMR, ולכן הכי מתאים להשוות את הטכניקה לגישות HDX-MS, XL-MS ו- CL-MS אחרות, או טביעת רגל. כפי שהוזכר בהקדמה, CL-MS הוא משלים HDX-MS כי זה מספק מידע על שרשראות הצד של שאריות בחלבון, ואילו HDX-MS מדווח על מבנה עמוד השדרה ודינמיקה. המשלימות מאפשרת להשתמש בשתי הטכניקות יחד כדי להשיג מידע מבני נוסף, כפי שהוכח על ידי מספר קבוצות37,38,39,40,41. רעיון עולה הרלוונטי CL-MS מבוסס DEPC הוא המידע הסינרגטי הזמין כאשר הוא משמש בשילוב עם HDX-MS22. בשל מסגרות הזמן של התיוג המשויכות לשתי הטכניקות, CL-MS מבוסס DEPC יכול לעתים קרובות להבהיר עמימות עם אזורי חלבון העוברים ירידה ב- HDX. ירידה ב- HDX יכולה לנבוע מנגישות ממס מופחתת עקב דינמיקת חלבון מחייבת או מופחתת. תגובות DEPC הן מטבען 2-3 סדרי גודל איטיים יותר מתגובות HDX, ולכן תיוג DEPC אינו מושפע במידה רבה על ידי שינויים בדינמיקה של חלבונים כל עוד הם אינם מלווים בשינויים בנגישות ממס.

ל- CL-MS יש כמה יתרונות על פני ניסויי HDX-MS בכך שהתווית נאבקת ואובדן התוויות הם מינימליים בעת נקיטת אמצעי זהירות מתאימים. בניסויים HDX, אובדן תווית או חילופי גב הוא תכונה סטנדרטית של הטכניקה, עיכול מהיר והפרדות LC ב pH נמוך הם ניסיונות למזער את הבעיה. עם זאת, חשוב להכיר בכך שבעיית ההחלפה האחורית מאוזנת על-ידי המספר הגבוה יותר של אתרים המסומנים בתווית הנמדדים בדרך כלל ב- HDX-MS. ערבוב תיוג הוא בעיה גדולה יותר ב- HDX-MS מכיוון שמידע שגוי יושג לאחר מכן, ולכן יש למטב את תנאי הניתוח כדי למזער דאגה זו.

XL-MS ו- CL-MS יש יתרונות דומים לגבי אובדן תווית ערבול, כמו שניהם כרוכים היווצרות של קשר covalent כי הוא חזק מספיק כדי להישאר במהלך העיכול וניתוחים LC-MS. רצף וזיהוי של פפטידים מקושרים, לעומת זאת, הוא מאתגר יותר מאשר פפטידים שכותרתו covalently, הדורשים שימוש בתוכנות מיוחדות. אחד היתרונות המרכזיים שיש ל-XL-MS על-פני CL-MS הוא היכולת שלו לספק אילוצי מרחק, שיכולים להיות בעלי ערך בעת חיזוי או צמצום של מבני חלבון אפשריים. נתוני CL-MS שימשו כדי להקל על חיזוי מבנה החלבון36,42,43, אך אזור זה דורש עבודה רבה יותר כדי לממש את הפוטנציאל שלו במלואו.

בהשוואה לשיטות CL-MS אחרות, כולל אלה המשתמשות במריאגנטים ספציפיים או לא ספציפיים לתיוג, ל- DEPC יש כמה יתרונות וחסרונות. כמו שיטות המשתמשות ריאגנטים ספציפיים חומצת אמינו, תיוג DEPC הוא פשוט; יש להוסיף את הריאגנט רק למדגם העניין. פשטות זו מנוגדת לשיטות כגון חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) או HRF מבוסס סינכרוטרון הדורשים מקורות אור מתוחכמים כדי לייצר רדיקלים הידרוקסיל. שלא כמו שיטות המשתמשות ריאגנטים ספציפיים, DEPC יכול תווית שש חומצות אמינו שונות N-terminus, המאפשר לו לספק רזולוציה מבנית גבוהה יותר. עם זאת, מספר השאריות שניתן לתייג על-ידי DEPC קטן מהמספר שניתן לחמצן על-ידי רדיקלים הידרוקסיל, כך שהרזולוציה המבנית הניתנת להשגה על-ידי CL-MS מבוסס DEPC נמוכה יותר. אחת ההשלכות המעשיות של פחות שאריות להיות מתויג על ידי DEPC היא כי באמצעות ריאגנט לפעמים אינו מספק את כל המידע המבני הרצוי, ולכן זה יכול להפיק תועלת משימוש בשילוב עם ריאגנטים תיוג אחרים. לאחרונה הדגמנו את הערך של שימוש DEPC יחד עם זוג ריאגנט 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)/גליצין אתיל אתר (GEE), אשר יכול תווית גלוטמט ושאריות אספרטט19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מכירים בתמיכת המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת גרנט R01 GM075092. ספקטרומטר מסת פיוז'ן Thermo Orbitrap המשמש לרכישת חלק מהנתונים המתוארים כאן נרכש בכספים ממענק המכונים הלאומיים לבריאות S10OD010645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Tags

כימיה גיליון 172 ספקטרומטריית מסה תיוג קוולנטי מבנה חלבון מסדר גבוה יותר קומפלקסים של חלבון-ליגנד מתחמי חלבונים דיתיל-פירובונט שטח פנים נגיש לממס
תיוג קוולנטי עם דיתילפירוקרבונט לחקר מבנה חלבון מסדר גבוה יותר על ידי ספקטרומטריית מסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, … More

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter