Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन उच्च-आदेश संरचना का अध्ययन करने के लिए डायथिलपाइरोकार्बोनेट के साथ सहसंयोजक लेबलिंग

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ डाइथिलपाइरोकार्बोनेट आधारित सहसंयोजक लेबलिंग करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। डायथिलपिरोकार्बोनेट को बस प्रोटीन या प्रोटीन कॉम्प्लेक्स ऑफ इंटरेस्ट के साथ मिलाया जाता है, जिससे सॉल्वेंट सुलभ अमीनो एसिड अवशेषों में संशोधन होता है। प्रोटियोलिटिक पाचन और तरल क्रोमेटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद संशोधित अवशेषों की पहचान की जा सकती है ।

Abstract

प्रोटीन की उच्च क्रम संरचना की विशेषता इसके कार्य को समझने के लिए आवश्यक है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) इस उद्देश्य के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है, विशेष रूप से प्रोटीन सिस्टम के लिए जो पारंपरिक तरीकों से अध्ययन करना मुश्किल है। एमएस द्वारा प्रोटीन की संरचना का अध्ययन करने के लिए, विशिष्ट रासायनिक प्रतिक्रियाएं समाधान में की जाती हैं जो प्रोटीन की संरचनात्मक जानकारी को अपने द्रव्यमान में एन्कोड करती हैं। एक विशेष रूप से प्रभावी दृष्टिकोण अभिकर्मकों का उपयोग करना है जो सॉल्वेंट सुलभ अमीनो एसिड साइड चेन को सहसंयोजक रूप से संशोधित करते हैं। इन प्रतिक्रियाओं से बड़े पैमाने पर वृद्धि होती है जिसे प्रोटियोलिटिक पाचन और मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त होने पर अवशेष स्तर के संकल्प के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता है। यहां, हम एमएस डिटेक्शन के साथ मिलकर एक सहसंयोजक लेबलिंग रीएजेंट के रूप में डायथाइलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) के उपयोग से जुड़े प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। डीईपीसी एक अत्यधिक इलेक्ट्रोफिलिक अणु है जो औसत प्रोटीन में अवशेषों के 30% तक लेबलिंग करने में सक्षम है, जिससे उत्कृष्ट संरचनात्मक संकल्प प्रदान किया जाता है। डीईपीसी का उपयोग एमएस के साथ मिलकर एक-बड़े बहु-डोमेन प्रोटीन जैसे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जैसे छोटे एकल-डोमेन प्रोटीन, जैसे 2-माइक्रोग्लोबुलिन के लिए संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।

Introduction

प्रोटीन लगभग हर शारीरिक प्रक्रिया में आवश्यक जैव अणु हैं। प्रोटीन प्रदर्शन करने वाले कार्यों की विविधता उनके द्वारा अपनाए जाने वाली संरचनाओं और अन्य जैव अणुओं के साथ होने वाली बातचीत के कारण संभव है। प्रोटीन फ़ंक्शन को गहरे स्तर पर समझने के लिए, इन महत्वपूर्ण संरचनात्मक विशेषताओं और बातचीत को स्पष्ट करने के लिए जैव रासायनिक और जैव भौतिक उपकरणों की आवश्यकता होती है। परंपरागत रूप से, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी ने प्रोटीन संरचना को प्रकट करने के लिए वांछित परमाणु स्तर का विस्तार प्रदान किया है। हालांकि, खराब क्रिस्टलीकरण व्यवहार, सीमित प्रोटीन उपलब्धता, अत्यधिक नमूना विषमता, या आणविक वजन सीमाओं के कारण इन तकनीकों द्वारा कई प्रोटीन प्रणालियों से पूछताछ नहीं की जा सकती है। नतीजतन, नए विश्लेषण तरीके उभरे हैं जो इन सीमाओं को दूर करते हैं। उभरती तकनीकों में से जो प्रोटीन संरचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) एक अणु के मास-टू-चार्ज (एम/जेड) अनुपात को मापता है, इसलिए प्रोटीन के द्रव्यमान में वांछित संरचनात्मक जानकारी को एन्कोडिंग करके प्रोटीन उच्च-क्रम संरचनात्मक जानकारी प्राप्त की जानी चाहिए। इस जानकारी को एन्कोड करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, जिनमें हाइड्रोजन-ड्यूटेरियमएक्सचेंज (एचडीएक्स)1,2,3,4,रासायनिक क्रॉसलिंकिंग (एक्सएल)5,6,और सहसंयोजक लेबलिंग (सीएल)7,8,9,10शामिल हैं। एचडीएक्स में, रीढ़ की हड्डी के अमेद हाइड्रोजन को दरों पर थोड़ा अधिक बड़े पैमाने पर ड्यूटेरियम द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है जो विलायक पहुंच और एच-बॉन्डिंग सीमा पर निर्भर करता है। एचडीएक्स की सीमा को प्रोटीन को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा इन टुकड़ों को अलग करने और मापने से पहले पेप्टाइड टुकड़ों में तेजी से पचाने या ऊपर-नीचे प्रयोग में प्रोटीन को अलग करके स्थानीयकृत किया जा सकता है। विनिमय की दर का निर्धारण प्रोटीन गतिशीलता में और अधिक जानकारी प्रदान करता है। एचडीएक्स बैक एक्सचेंज से जुड़ी चुनौतियों और प्रजनन क्षमता को अधिकतम करने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बावजूद प्रोटीन संरचना की विशेषता के लिए एक मूल्यवान उपकरण साबित हुआ है। एक्सएल-एमएस में, प्रोटीन को द्वि-कार्यात्मक अभिकर्मकों के साथ प्रतिक्रिया दी जाती है जो किसी दिए गए प्रोटीन के भीतर या दो प्रोटीन के बीच आसन्न अवशेष पक्ष श्रृंखलाओं को सहसंयोजक रूप से जोड़ते हैं। ऐसा करने में, एक्सएल-एमएस दूरी की बाधाएं प्रदान कर सकता है जिसका उपयोग प्रोटीन संरचना की विशेषता के लिए किया जा सकता है। प्रोटीन के क्षेत्र जो क्रॉस-लिंक्ड होते हैं, उनकी पहचान प्रोटियोलिटिक पाचन द्वारा की जा सकती है जिसके बाद तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) -एमएस विश्लेषण किया जाता है। जबकि एक्सएल-एमएस एक बहुमुखी उपकरण है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिसमें अंदर की कोशिकाएं शामिल हैं, एक्सएल उत्पादों की पहचान चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए विशेष सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है।

सीएल-एमएस हाल ही में प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक पूरक और कभी-कभी वैकल्पिक एमएस-आधारित उपकरण के रूप में उभरा है। सीएल-एमएस में, एक प्रोटीन या प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को मोनो-फंक्शनल रिएजेंट के साथ सहसंबद्ध रूप से संशोधित किया जाता है जो सॉल्वेंट-एक्सपोज्ड साइड चेन(चित्रा 1)के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है। विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन या प्रोटीन परिसर की संशोधन सीमा की तुलना करके, संरचना परिवर्तन, बाध्यकारी साइटों, और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरफेस से पता चला जा सकता है। सीएल प्रतिक्रिया के बाद, साइट-विशिष्ट जानकारी, अक्सर एकल अमीनो-एसिड स्तर पर, विशिष्ट बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है जिसमें प्रोटीन प्रोटेओलिटिकल रूप से पचाए जाते हैं, पेप्टाइड टुकड़े एलसी द्वारा अलग किए जाते हैं, और संशोधित साइटों को मिलकर एमएस (एमएस/एमएस) का उपयोग करके पहचाना जाता है। बायोकोन्जुगेट रसायन शास्त्र के समृद्ध इतिहास ने सीएल-एमएस प्रयोगों के लिए कई अभिकर् तार उपलब्ध कराए हैं। सीएल रिएजेंट दो सामान्य श्रेणियों में आते हैं: (i) विशिष्ट और (ii) गैर-विशिष्ट। विशिष्ट अभिकर्दक एक कार्यात्मक समूह (जैसे, मुफ्त अमीन)8,10 के साथ प्रतिक्रिया करते हैं और लागू करने में आसान होते हैं, लेकिन वे सीमित संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। गैर-विशिष्ट अभिकर्दक साइड चेन की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, लेकिन अक्सर इन अत्यधिक प्रतिक्रियाशील प्रजातियों का उत्पादन करने के लिए लेजर या सिंक्रोट्रॉन स्रोतों जैसे विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले गैर-विशिष्ट अभिकर्मक हैं, जो विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए हाइड्रोक्सिल रेडिकल फुटप्रिंटिंग (एचआरएफ)7,11,12,13 प्रयोगों में लागू किए गए हैं।

हमारे शोध समूह ने सीएल-एमएस प्रयोगों14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,23,24, 25के संदर्भ में प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए डायथाइलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) नामक एक और अपेक्षाकृत गैर-विशिष्ट अभिवाक का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। डीईपीसी विशिष्ट लेबलिंग अभिकर् ती की सादगी प्रदान करता है (यानी, प्रतिक्रियाओं को करने के लिए कोई विशेष उपकरण आवश्यक नहीं है), जबकि औसत प्रोटीन में 30% अमीनो एसिड के साथ प्रतिक्रिया करता है। एक अत्यधिक इलेक्ट्रोफिलिक रिएजेंट के रूप में, डीईपीसी एन-टर्मिनस और सिस्टीन, हिस्टिडीन, लिसाइन, टायरोसिन, सेरीन और थ्रेओनिन अवशेषों की न्यूक्लियोफिलिक साइड चेन के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम है। आमतौर पर, इन प्रतिक्रियाओं का एक भी उत्पाद उत्पन्न होता है, जिसके परिणामस्वरूप 72.02 डीए की बड़े पैमाने पर वृद्धि होती है। यह एक प्रकार का उत्पाद 55 तक विभिन्न उत्पादों के विपरीत है, जिनका उत्पादन तब किया जा सकता है जब प्रोटीन हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स7के साथ प्रतिक्रिया करता है। इस तरह के सरल रसायन चिह्नित साइटों की पहचान की सुविधा प्रदान करता है।

यहां, हम प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए डीईपीसी-आधारित सीएल-एमएस का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। अभिकर्षक तैयारी, डीईपीसी-प्रोटीन प्रतिक्रियाओं, प्रोटीन पाचन की स्थिति, एलसी-एमएस और एमएस/एमएस मापदंडों और डेटा विश्लेषण से जुड़े विवरणों का वर्णन किया गया है । हम प्रोटीन-धातु, प्रोटीन-लिगांड, और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के साथ-साथ हीटिंग पर संरचनात्मक परिवर्तनों के दौर से गुजर रहे प्रोटीन से उदाहरण परिणाम प्रदान करके डीईपीसी लेबलिंग की उपयोगिता को भी प्रदर्शित करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. प्रोटीन और अभिकर् ता तैयार करने

नोट: इस प्रोटोकॉल में डीईपीसी के साथ प्रोटीन लेबलिंग के लिए एक उदाहरण कार्यप्रवाह शामिल है। सूचीबद्ध कुछ शर्तें और अभिकर्ण सांद्रता पसंद के प्रोटीन के आधार पर भिन्न हो सकती है।

  1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सभी रीएजेंट समाधान तैयार करें।
  2. पीएच 7.4 पर 10 एमएम 3-(एन-मॉर्फोलिनो) प्रोपेन्सल्फोनिक एसिड (एमओपीएस) बफर में, आमतौर पर दसियों माइक्रोन की सीमा में वांछित एकाग्रता का प्रोटीन समाधान तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, 10 mm पीएच 7.4 एमओपीएस में एक बफर-एक्सचेंज मौजूदा प्रोटीन समाधान तैयार करें यदि नमूने में एक न्यूकोफिलिक बफर होता है जो डीईपीसी के साथ प्रतिक्रियाशील होगा। अन्य बफ़र्स (जैसे, फॉस्फेट बफर नमकीन) का भी उपयोग किया जा सकता है, जब तक कि उनके पास न्यूक्लियोफिलिक कार्यात्मक समूह नहीं हैं।
  3. एसीएन के 98.55 माइक्रोन में स्टॉक 6.9 एम डीईपीसी समाधान के 1.45 माइक्रोन को पाइपिंग करके ड्राई एसीटोनिट्रिल (एसीएन) में 100 एमएम डीईपीसी समाधान तैयार करें।
    नोट: सांद्रता का कोई एक सेट नहीं है जो हर प्रोटीन के साथ काम करेगा, हालांकि इष्टतम सांद्रता का अनुमान 23 कोउनकेऔर Lys अवशेषों की संख्या के आधार पर लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, 50 माइक्रोल के 50 माइक्रोल के साथ, इस सामान्य उदाहरण (तालिका 1) का उपयोग करके वांछित मोलर अनुपात सुनिश्चित करने के लिए 200 माइक्रोन एमईपीसी (प्रोटीन एकाग्रता के बराबर) की अंतिम डीईपीसी एकाग्रता के लिए 100 mM DEPC के0.2माइक्रोन के साथ प्रोटीन प्रतिक्रिया करते हैं। डीईपीसी लेबलिंग एक2 ऑर्डर प्रतिक्रिया है, इसलिए प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रोटीन या डीईपीसी की एकाग्रता बदलने से लेबलिंग दर बदल जाएगी।
  4. 10 मिलीग्राम इमिडाजोल का वजन करके और एचपीएलसी-ग्रेड पानी के 146.9 माइक्रोन में भंग करके 1 एम इमिडाजोल समाधान तैयार करें।

2. बरकरार प्रोटीन की सहसंयोजक लेबलिंग

  1. पानी स्नान तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और स्नान के लिए स्थिर तापमान तक पहुंचने की प्रतीक्षा करें।
    नोट: एक उदाहरण लेबलिंग प्रोटोकॉल के लिए रीएजेंट सांद्रता और वॉल्यूम तालिका 1में पाए जा सकते हैं।
  2. एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में, टेबल 1में सूचीबद्ध वॉल्यूम में एमओपी बफर और प्रोटीन समाधान मिलाएं।
  3. प्रोटीन और बफर के लिए डीईपीसी समाधान का 0.2 माइक्रोन जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप समाधान को ठीक से मिलाना सुनिश्चित करें, और फिर प्रतिक्रिया मिश्रण वाले ट्यूब को 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें।
    नोट: लेबलिंग प्रतिक्रिया के दौरान प्रोटीन की संरचना के क्षोभ से बचने के लिए एनईएन जोड़े गए की मात्रा कुल प्रतिक्रिया मात्रा के 1% से अधिक नहीं होनी चाहिए। प्रतिक्रिया समय उपयोगकर्ता पर निर्भर है, हालांकि उदाहरण की स्थिति के तहत 1 मिनट की प्रतिक्रिया ओवरलैपेबलिंग और डीईपीसी14की संभावित हाइड्रोलिसिस को कम करती है।
  4. 1 मिनट के बाद, पानी के स्नान से प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त ट्यूब को हटा दें और शेष अप्रतिक्रियाकृत डीईपीसी को साफ करने के लिए 1 एम इमिडाजोल समाधान के 1 माइक्रोन के साथ प्रतिक्रिया को बुझाएं।
    नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण में इमिडाजोल की अंतिम एकाग्रता प्रतिक्रिया मिश्रण में डीईपीसी की एकाग्रता 50x के बराबर होनी चाहिए। इससे यह सुनिश्चित होगा कि शेष अप्राप्त डीईपीसी की सफाई की जाए ।

3. बॉटम-अप एलसी-एमएस के लिए प्रोटीन डाइजेस्ट की तैयारी

नोट: पाचन की स्थिति है कि ब्याज के प्रोटीन के लिए उत्तरदायी है चुनें । सामान्य कदमों में प्रोटीन का खुलासा करना और किसी भी डिसल्फाइड बांड को कम करना और एल्किलेट करना शामिल है।

  1. प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए एक उपयुक्त खुलासा अभिकर् चर जोड़कर प्रोटीन को प्रकट करें।
    नोट: आम खुलासा एजेंटों ACN, यूरिया, और guanidine हाइड्रोक्लोराइड (GuHCl) शामिल हैं ।
  2. ट्रिस (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन (टीएमईपी) और इओडोएस्टाटामाइड (आईएएम) के समाधान तैयार करें, जिसका वजन 5 मिलीग्राम है और उन्हें 174.4 और 270.3μl में 10 m M पीएच 7.4 एमओपी बफर में क्रमशः नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में भंग किया गया है।
  3. प्रतिक्रिया मिश्रण के समाधान और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए 100 mM TCEP (प्रतिक्रिया मिश्रण में 2 mm की अंतिम एकाग्रता) के 2 माइक्रोन जोड़कर disulfide बांड को कम करें।
    नोट: टीएमईपी की अंतिम एकाग्रता समाधान में मौजूद 40x प्रोटीन एकाग्रता प्रति डिसल्फाइड बॉन्ड के बराबर होनी चाहिए।
  4. एल्किलेट ने अंधेरे में 30 मिनट के लिए 100 mM IAM समाधान (प्रतिक्रिया मिश्रण में 4 mm की अंतिम एकाग्रता) के 4 माइक्रोन के साथ साइस्टीन को कम किया। आईएएम प्रकाश-संवेदनशील है और प्रत्यक्ष प्रकाश के तहत विघटित होगा।
    नोट: समाधान में आईएएम की अंतिम एकाग्रता टीएमईपी के लिए उपयोग की जाने वाली एकाग्रता से दोगुनी होनी चाहिए, या प्रति डिफाइड बॉन्ड प्रोटीन एकाग्रता 80x होनी चाहिए।
  5. एक उपयुक्त एंजाइम जैसे ट्राइप्सिन या काइमोट्रीप्सिन के साथ प्रोटीन को पचाएं। एक 10:1 प्रोटीन: ३०० स्ट्रोक/मिन की मिलाते हुए दर पर स्थिर एंजाइम के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के पाचन के लिए एंजाइम अनुपात आमतौर पर DEPC लेबल प्रोटीन के लिए पर्याप्त है । चर्चा देखें।
  6. पाचन के बाद, 5 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र द्वारा पचाए गए पेप्टाइड्स से स्थिर एंजाइम को अलग करें।
  7. नमूना क्षरण और लेबल हानि को कम करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ नमूने को फ्लैश-फ्रीज करके तुरंत नमूना का विश्लेषण करें। एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए तैयार होने तक फ्लैश-फ्रोजन नमूनों को <-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।

4. एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण

नोट: बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स के लिए स्टैंडर्ड एलसी-एमएस/एमएस पैरामीटर का उपयोग प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड टुकड़ों पर लेबल साइटों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है । एक सामान्य उदाहरण नीचे उल्लिखित है।

  1. एक उलट चरण C18 स्थिर चरण का उपयोग कर DEPC लेबल पेप्टाइड्स अलग । पेप्टाइड्स के सर्वश्रेष्ठ पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए एक ढाल (उदाहरण के लिए, चित्र 2) का उपयोग करके दो सॉल्वैंट्स के एक विशिष्ट एलसी मोबाइल चरण का उपयोग करें: (ए) पानी + 0.1% फार्मिक एसिड और (बी) एसीएन + 0.1%फोर्मिक एसिड का उपयोग करके।
    नोट: नमूना जटिलता के आधार पर पृथक्करण समय को अनुकूलित किया जा सकता है, और मोबाइल चरण प्रवाह दर इस बात पर निर्भर करती है कि केशिका या नैनो एलसी का उपयोग किया जाता है या नहीं।
  2. पेप्टाइड पर डीईपीसी संशोधन साइटों की पहचान करने के लिए ऑन-लाइन एलसी-एमएस और एमएस/एमएस करने में सक्षम एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें । हमारे प्रयोगों में, हमने कई प्रकार के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। एलसी-एमएस विश्लेषण के दौरान कई पेप्टाइड्स के एमएस/एमएस को स्वचालित रूप से करने में सक्षम कोई भी मास स्पेक्ट्रोमीटर उपयुक्त होना चाहिए । प्रासंगिक एमएस मापदंडों में शामिल हैं: नियमित ईएसआई के लिए ईएसआई स्रोत वोल्टेज = -4000 V; नैनोस्प्रे के लिए -2000 V; ऑर्बिटरैप संकल्प = 60,000; गतिशील बहिष्कार अवधि = 30 एस; एमएस/एमएस एक्टिवेशन प्रकार: सीआईडी, ईटीडी, या दोनों; मास स्कैन रेंज = 200-2,000; स्वचालित लाभ नियंत्रण = 4.0E5 (ऑर्बिटरैप में एमएस1) और 5.0E4 (रैखिक क्वाड्रपोल आयन जाल में एमएस2)।
  3. एलसी प्रणाली में पचा, लेबल प्रोटीन नमूना लोड और इंजेक्ट और एलसी-एमएस/एमएस अधिग्रहण शुरू करते हैं । यदि नमूना फ्लैश-फ्रोजन किया गया है, तो विश्लेषण से पहले गल गया है। ईएसआई स्रोत में अत्यधिक लवण से बचने के लिए पहले 5 मिनट के लिए एलसी प्रवाह को कचरे में डायवर्ट करें।
    नोट: एक 5 μL इंजेक्शन पाश आम तौर पर उपयोग किया जाता है, एलसी एमएस/एमएस के लिए प्रोटीन के लगभग २.५ माइक्रोग्राम के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है । यह एलसी की लोडिंग शर्तों पर निर्भर करता है कि नमूना इंजेक्टर को रोकना नहीं है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. डीईपीसी लेबल साइटों की पहचान करें और उपयोग किए जाने वाले मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पेप्टाइड पीक क्षेत्रों की मात्रा निर्धारित करें।
  2. परिवर्तनीय संशोधनों के रूप में डीईपीसी अतिरिक्त (72.02 डीए) और कार्बामिडोमेथाइलेशन (57.02 डीए) शामिल करें। एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए अतिरिक्त खोज पैरामीटर इस प्रकार हैं: अधिकतम चूक गए दरार = 3; टुकड़ा आयन प्रकार = बी और वाई; अग्रदूत m/z सहिष्णुता = 10 पीपीएम (यदि क्वाड्रपोल आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग किया जाता है तो यह मूल्य अधिक होना चाहिए); टुकड़ा m/z सहिष्णुता = 0.5 डीए (यदि उत्पाद आयन स्कैन के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग किया जाता है तो यह मूल्य कम होना चाहिए); अग्रदूत शुल्क = 1-4।
    नोट: विभिन्न डेटाबेस खोज एल्गोरिदम में अलग-अलग स्कोरिंग सिस्टम होते हैं, और कई को डीईपीसी-संशोधित पेप्टाइड्स की पहचान करने में कठिनाई हो सकती है क्योंकि संशोधन का स्तर कम हो सकता है। अधिक लेबल पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए स्कोर कटऑफ को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। यदि हां, तो एमएस/एमएस डेटा की मैन्युअल पूछताछ का उपयोग कम स्कोरिंग पेप्टाइड्स को सत्यापित करने के लिए किया जाना चाहिए । डीईपीसी लेबल के हाइड्रोलिसिस का उत्पाद खोज डेटा में शामिल नहीं है क्योंकि हाइड्रोलिज्ड डीईपीसी अब न्यूक्लियोफिलिक साइड चेन की ओर प्रतिक्रियाशील नहीं है।
  3. पेप्टाइड्स के संशोधित और असंशोधित संस्करणों के क्रोमेग्राफिक पीक क्षेत्रों का उपयोग करके अवशेष-स्तर संशोधन प्रतिशत निर्धारित करें।
    नोट: ब्याज के संशोधित अवशेषों वाले किसी भी पेप्टाइड पर विचार किया जाना चाहिए और सभी चार्ज राज्य जो शामिल हैं, सभी मापा नमूनों में मौजूद होना चाहिए । पेप्टाइड्स जिनमें अलग-अलग आयनीकरण क्षमता होती है और अलग-अलग समय पर एल्यूटिंग होता है, इस मूल्य को किसी विशिष्ट साइट के संशोधन के पूर्ण उपाय के बजाय एक सापेक्ष होने का कारण बनता है।
    Equation 1
    जहां एआई, जेड किसी भी पेप्टाइड (i) के पीक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें ब्याज के अवशेष होते हैं और सभी पता लगाया चार्ज राज्यों (z) पर विचार करता है।
  4. यह निर्धारित करें कि सांख्यिकीय मूल्यांकन का उपयोग करके नियंत्रण और प्रायोगिक नमूने के बीच लेबलिंग परिवर्तन महत्वपूर्ण है या नहीं। प्रत्येक नमूने के लिए तीन दोहराने माप विशिष्ट है, और टी परीक्षण सबसे अधिक ९५ या ९९% विश्वास अंतराल के साथ उपयोग किया जाता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

डीईपीसी संशोधन साइटों और संशोधन प्रतिशत की पहचान करना
सहसंयोजक लेबलिंग के कारण बड़े पैमाने पर इसके अलावा (क) अक्षुण्ण प्रोटीन और (ख) पेप्टाइड स्तर8, 9पर मापा जासकताहै । बरकरार स्तर पर, लेबल की विभिन्न संख्याओं के साथ प्रोटीन प्रजातियों का वितरण लेबल प्रोटीन नमूनों के प्रत्यक्ष विश्लेषण या एलसी-एमएस से प्राप्त किया जा सकता है। उच्च रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक जानकारी (यानी, साइट-विशिष्ट लेबलिंग डेटा) प्राप्त करने के लिए, माप पेप्टाइड स्तर पर किया जाना चाहिए। लेबलिंग और शमन चरणों के बाद, लेबल किए गए प्रोटीन को बॉटम-अप प्रोटेओमिक विश्लेषण (यानी, डिसल्फाइड कमी, एल्किलेशन, प्रोटियोलिटिक पाचन, और एलसी-एमएस/एमएस) के अधीन किया जाता है। चित्रा 3 से पता चलता है कि डीईपीसी लेबल वाली साइटों की पहचान कैसे की जाती है और उनके संशोधन स्तरों की गणना डीईपीसी सीएल-एमएस प्रयोग के लिए प्रोटीन β-2-माइक्रोग्लोबुलिन (2m)21पर की जाती है । एमएस/एमएस का उपयोग लेबल वाले पेप्टाइड्स को अनुक्रमित करने और उनके डीईपीसी लेबल वाली साइटों को इंगित करने के लिए किया जाता है, जबकि संशोधन प्रतिशत की गणना निकाले गए आयन क्रोमाकोग्राम (चित्रा 3 एदेखें) में उनके सापेक्ष शिखर क्षेत्रों से की जाती है।

डीईपीसी सीएल-एमएस का उपयोग करके प्रोटीन सतह मानचित्रण
प्रोटीन टोपोलॉजी और लेबलिंग दर के बीच संबंधों के कारण, डीईपीसी का उपयोग प्रोटीन उच्च-क्रम संरचना (एचओएस) में परिवर्तनों का अध्ययन करने और प्रोटीन इंटरैक्शन साइटों8,9की पहचान करने के लिए किया गया है। एक उदाहरण सीयू (II) का प्रभाव है जो 2m की संरचना पर बाध्यकारी है। डीईपीसी संशोधन दर अनबाउंड 2m और सीयू (II) से पेप्टाइड टुकड़ों के गुणांक-बाध्य 2m (b2m-Cu) को डीईपीसी सांद्रता को अलग करके और दूसरे क्रम के गतिजभूखंडों को 14, 24उत्पन्न करके(तालिका2)मापा जा सकता है । 2m-Cu में अवशेषों की डीईपीसी प्रतिक्रियाशीलता His31, Ser33, और Thr4 के लिए महत्वपूर्ण लेबलिंग दर परिवर्तन का पता चलता है, जबकि विभिन्न अपने अवशेषों सहित अन्य साइटों, सांख्यिकीय अपरिवर्तित हैं । ये आंकड़े इस तथ्य के अनुरूप हैं कि His31, लेकिन अन्य नहीं 2m में अपने अवशेषों, Cu बांधता है जिससे His31 (यानी, Ser33) के पास संरचनात्मक परिवर्तन होते हैं और एन-टर्मिनस (यानी, Thr4)(चित्र 4)14,26,27के पास ।

HOS में परिवर्तन की पहचान करने के लिए डीईपीसी सीएल-एमएस
एमएस डिटेक्शन के साथ डीईपीसी लेबलिंग प्रोटीन में एचओएस परिवर्तनों की विशेषता के लिए एक मूल्यवान उपकरण भी है, जिसमें प्रोटीन चिकित्सा विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं, जो वर्तमान में दवा बाजार28का सबसे तेजी से बढ़ता खंड है। डीईपीसी सीएल उन विशिष्ट प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान कर सकता है जो थर्मल और ऑक्सीडेटिव तनाव18पर संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरते हैं । 2m गर्मी के तनाव के संपर्क में आने के बाद, कई अवशेष जो लेबलिंग सीमाओं (एन-टर्मिनस, सेर28, हि31, सेर33, सेर55, सेर57, Lys58) में महत्वपूर्ण कमी से गुजरते हैं, यह सुझाव देते हैं कि प्रोटीन का यह क्षेत्र एक संरचना परिवर्तन या संभवतः मीडियाटेस एकत्रीकरण(चित्रा 5A)से गुजरता है। इन अवशेषों के अलावा, प्रोटीन ऑक्सीडेटिव तनाव के संपर्क में आने के बाद, लेबलिंग में कमी के साथ अन्य अवशेष (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) प्रोटीन के एक और चेहरे पर एक क्लस्टर बनाते हैं, जो यह दर्शाता है कि ऑक्सीकरण-प्रेरित अनुरूप परिवर्तन कहीं और होते हैं(चित्रा 5B)। हमारे समूह के अन्य कार्य से यह भी पता चला है कि डीईपीसी सीएल-एमएस गर्मी-तनावग्रस्त मोनोक्लोनल एंटीबॉडी थेराप्यूटिक्स20में अनुरूप परिवर्तनों की साइटों का पता लगा सकता है और उनकी पहचान कर सकता है ।

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए डीईपीसी सीएल-एमएस
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन साइटों में अंतर्दृष्टि और एमिलॉयड बनाने वाले प्रोटीन के लिए एकत्रीकरण इंटरफेस डीईपीसी लेबलिंग के साथ-साथ9का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। अल्पाभ गठन पर अवशेषों के संशोधन के स्तर में कमी बाध्यकारी इंटरफेस प्रकट कर सकते हैं। डीईपीसी सीएल-एमएस का उपयोग 2 मीटर के प्री-एमिलॉयड ओलिगोमर की विशेषता के लिए किया गया था, जो क्यू (II)15, 16,26के साथ एमिलॉयड गठन शुरू करने के बाद डायलिसिस से संबंधित एमिलॉयडोसिस29में एमिलॉयड बनाने वाला प्रोटीन है। सीयू (II) जोड़ने के बाद 2 घंटे का गठन करने वाले प्री-एमिलॉयड 2m डिमर के साथ डीईपीसी मोनोमर की तुलना करने से पता चलता है कि नौ अवशेष लेबलिंग में कमी से गुजरते हैं जबकि छह अवशेष लेबलिंग(चित्रा 6A)में कोई परिवर्तन या मामूली वृद्धि से गुजरते हैं। 2m पर इन परिवर्तनों का मानचित्रण करने पर, यह तुरंत स्पष्ट है कि डिमर इंटरफ़ेस में 2m मोनोमर(चित्रा 6B)15के एबीईडी β-शीट शामिल हैं।

डीईपीसी सीएल-एमएस प्रोटीन-लिगांड बाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए
लिगांड प्रोटीन के लिए बाध्यकारी अवशेषों की विलायक पहुंच में कमी आती है जो लिगांड के साथ बातचीत करते हैं, और डीईपीसी-आधारित सीएल-एमएस का उपयोग प्रोटीन पर लिगांड-बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एमिलॉयड बनाने की स्थितियों के तहत ए2एम पर एपिगलोकेटचिन-3-गैलेट (ईजीसीजी) की बाध्यकारी साइटों की पहचान ईजीसीजी बाइंडिंग द्वारा दफन अवशेषों पर डीईपीसी लेबलिंग में महत्वपूर्ण कमी से की जा सकती है। ईसीजीसी की उपस्थिति में, Lys6 और Lys91 में कम डीईपीसी संशोधन प्रतिशत(चित्रा 7) होताहै, और इन अवशेषों को प्रोटीन के एक क्षेत्र में संकुलित किया जाता है, जो लिगांड बाध्यकारी के कारण अवशेषों की सुरक्षा का संकेत देता है। एन-टर्मिनस, Thr4, और His31, इस बीच, लेबलिंग सीमाओं में वृद्धि सेगुजरना (चित्रा 7),जो ईसीजीसी प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तनों का संकेत कर रहे है और सुझाव है कि सीयू (द्वितीय) पर बाध्यकारी साइटों 2m (एन-टर्मिनस)14,30,31 ईसीजीसी बाध्यकारी32के परिणामस्वरूप बाधित हो सकता है । इसके अलावा, सीएल-एमएस19का उपयोग करके 2 मीटर एमिलॉयड गठन, रिफामाइसिन एसवी और डॉक्सीसाइक्लिन के अन्य दो छोटे अणु अवरोधकों के बाध्यकारी स्थलों की पहचान की गई है । इस अध्ययन में, हालांकि, अकेले DEPC लेबलिंग से परिणाम पर्याप्त संरचनात्मक संकल्प के साथ बाध्यकारी साइटों को मैप करने के लिए पर्याप्त नहीं थे । तीन अलग-अलग सीएल रिएजेंट्स, नामत डीईपीसी, बीडी, और 1-एथिल-3-(3-(डाइमेथाइलमिनो) प्रोपिल) कार्बोडिसाइड-ग्लाइसिन एथिल एस्टर (ईडीसी/जीई) जोड़ी के परिणाम बाध्यकारी साइटों को बेहतर ढंग से इंगित करने के लिए आवश्यक थे19।

संरचनात्मक संकल्प में सुधार और लेबल पांव मार को कम करने
हालांकि DEPC लेबलिंग एक सहसंयोजक बांड के गठन का कारण बनता है, हाइड्रोलिसिस के कारण लेबल नुकसान हो सकता है, विशेष रूप से सेर, Thr, और Tyr अवशेषों के लिए(चित्रा 8)। लेबल हानि को रात भर के पाचन के बजाय शॉर्ट प्रोटियोलिटिक पाचन (जैसे, स्थिर एंजाइमों के साथ 2 एच पाचन) का उपयोग करके डीईपीसी सीएल प्रतिक्रिया और एलसी-एमएस विश्लेषण के बीच समय को कम करके कम किया जा सकता है। तेजी से पाचन के परिणामस्वरूप अधिक संशोधित अवशेषों को मापा जाता है, जिससे प्रोटीन संरचनात्मक जानकारी की मात्रा बढ़ ती है। उदाहरण के लिए, स्थिर कामोट्रीप्सिन के साथ 2 घंटे का पाचन लगातार 2m(चित्र 9)17में अधिक डीईपीसी-संशोधित अवशेषों की पहचान की ओर जाता है। ए2एम में सेर, थ्र, टायर, उसके और Lys अवशेषों के बारे में 75% के बारे में रात भर पाचन के साथ, लेकिन जब लेबलिंग और एलसी-एमएस के बीच का समय 2 एच पाचन का उपयोग करके कम हो जाता है, तो 2m में इन अवशेषों का 95% पता लगाया जाता है। नए पाए गए संशोधित अवशेषों में से अधिकांश टायर और थ्र अवशेष हैं जो हाइड्रोलिसिस से ग्रस्त हैं।

DEPC के साथ हमारे काम के दौरान, हमने देखा है कि कुछ प्रोटीन में, Cys अवशेषों कि disulfide बांड से DEPC द्वारा संशोधित कर रहे हैं, भले ही disulfide बांड DEPC लेबलिंग प्रतिक्रियाओं के दौरान बरकरार हैं । सीवाईएसएस अवशेषों की ऐसी लेबलिंग इसलिए होती है क्योंकि मुफ्त थिओल्स समाधान(चित्रा 10)में अन्य संशोधित अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, जिससे तथाकथित "लेबल पांव मार" होता है क्योंकि कार्बेथॉक्सी समूह को सीवाई अवशेषों में स्थानांतरित कर दिया जाता है। लेबल पांव मार अन्य अवशेषों पर संशोधन के स्तर को कम कर देता है और गलत प्रोटीन संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है। लेबल पांव मार से बचने के लिए, मुक्त Cys thiols पूरी तरह से disulfide कमी३३के बाद सही alkylated होना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1:सहसंयोजक लेबलिंग-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीएल-एमएस)। सॉल्वेंट सुलभ अमीनो एसिड को संशोधित करने के लिए एक मोनोफंक्शनल रिएजेंट का उपयोग किया जाता है और इसका उपयोग प्रोटीन (ऊपर बनाम नीचे छवि) में अनुरूप परिवर्तन या इंटरैक्शन इंटरफेस के बारे में साइट-विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। संशोधित प्रोटीन को प्रोटियोलिटिकली रूप से पचाया जाता है, और परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स का विश्लेषण एमएस और टैंडेम एमएस (एमएस/एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) द्वारा किया जाता है। चित्रा को प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए लिम्पिकिराटी, पी, लियू, टी, वाशे, आर डब्ल्यू सहसंयोजक लेबलिंग-मास स्पेक्ट्रोमेट्री से अनुकूलित किया गया है । विधियां 144,79-93 (2018)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वॉल्यूम प्रयुक्त (μL) समाधान में एकाग्रता (μM)
प्रोटीन (100 माइक्रोन, एमओपी) 50 50
एमओपी (10 mM, पीएच 7.4) 48.8 n/a
डीईपीसी (100 mM) 0.2 200 (=4x [प्रोटीन])
इमिडाजोल (1 एम) 1 10,000 (= 50x [DEPC])
कुल वॉल्यूम 100

तालिका 1. जनरल डीईपीसी लेबलिंग प्रोटोकॉल।

Figure 2
चित्रा 2। पेप्टाइड्स के पृथक्करण के लिए उदाहरण एलसी ढाल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
अंक 3 डीईपीसी लेबल की साइटों की पहचान कैसे की जाती है और उनके संशोधन स्तरों की गणना की जाती है। डीईपीसी लेबलिंग और प्रोटियोलिटिक पाचन के बाद, पचा प्रोटीन का (ए) एलसी-एमएस विश्लेषण किया जाता है। क्रोमेटोग्राम में (बी) अवेलेबल और (सी) लेबल वाले पेप्टाइड्स के पीक क्षेत्रों का उपयोग लेबलिंग प्रतिशत की गणना करने के लिए किया जाता है। एलसी-एमएस के दौरान पेप्टाइड्स का उपयोग सीआईडी एमएस/एमएस टैंडेम मास स्पेक्ट्रा ऑफ (डी) अवेलेबल और (ई) और (एफ) लेबल वाले पेप्टाइड अनुक्रमण और डीईपीसी लेबल वाली साइटों की पहचान के लिए किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

शेष b2m b2m-Cu
Thr4 0.082 ± 0.004 0.052 ± 0.009
हस13 0.041 ± 0.003 0.033 ± 0.005
ह his31 0.010 ± 0.001 0.003 ± 0.001
सेर33 0.010 ± 0.002 0.004 ± 0.001
हि51 0.036 ± 0.003 0.030 ± 0.004
सेर88 0.029 ± 0.007 0.020 ± 0.006

तालिका 2 सीयू (II) की अनुपस्थिति और उपस्थिति में बी2एम के लिएसाइट-विशिष्टडीईपीसी संशोधन दर गुणांक (k, M-1 एस -1)।

Figure 4
अंक 4 डीईपीसी सीएल-एमएस का उपयोग करने के लिए Cu (II) के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए 12m की संरचना पर बाध्यकारी: (ए) डीईपीसी लेबलिंग दरों (ब्लू) में महत्वपूर्ण कमी के साथ अवशेषों की प्रोटीन सतह मानचित्रण, सीयू (II) बाध्यकारी पर उनकी विलायक पहुंच में परिवर्तन का संकेत देता है, और लेबलिंग दर (मैजेंटा) (पीडीबी परिग्रहण कोड 1JNJ) में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं है। (ख) सीयू (II) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में डीईपीसी की विभिन्न सांद्रता के साथ 2m की प्रतिक्रिया के उदाहरण साइट-विशिष्ट दूसरे आदेश गतिज भूखंड। लेबलिंग दर गुणांक (कश्मीर) गतिज भूखंड की ढलान से प्राप्त किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
अंक 5 तनावग्रस्त बनाम देशी 12m के लिए सहसंयोजक लेबलिंग परिणाम: (ए) हीट स्ट्रेस - 24 घंटे के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग और (बी) ऑक्सीडेटिव तनाव -24घंटे के लिए 3% एच 2 O2 के साथ। संशोधन प्रतिशत में महत्वपूर्ण परिवर्तन नीले (लेबलिंग में कमी) और लाल (लेबलिंग में वृद्धि) में दिखाए जाते हैं, जबकि कोई महत्वपूर्ण लेबलिंग परिवर्तन वाले अवशेष हल्के हरे (पीडीबी परिग्रहण कोड 1JNJ) में दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
अंक 6 डीईपीसी सीएल-एमएस का उपयोग करने के लिए 12m के पूर्व-एमिलॉयड डिमर के लिए डिमर इंटरफेस का निर्धारण करने के लिए: (ए) मोनोमर में संशोधित अवशेषों के लिए डीईपीसी संशोधन स्तर परिवर्तन का सारांश (यानी, टी = 0) और सीयू (II) जोड़ने के बाद डिमर 2 घंटे। लेबलिंग सीमा में महत्वपूर्ण कमी वाले अवशेषों को एक तारांकन (*) द्वारा दर्शाया जाता है। (ख) सहसंयोजक लेबलिंग परिणाम 12m संरचना पर मैप किया गया है । कम लेबलिंग वाले अवशेष नीले रंग में दिखाए जाते हैं और लेबलिंग में कोई परिवर्तन या मामूली वृद्धि के साथ अवशेषों को लाल (पीडीबी परिग्रहण कोड 1LDS) में दिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
अंक 7 ईजीसीजी-बाउंड बनाम अनबाउंड बी2एम के लिए सहसंयोजक लेबलिंग परिणाम। प्रदर्शित अवशेषों के लिए डीईपीसी संशोधन प्रतिशत दिखाए जाते हैं। सहसंयोजक लेबलिंग प्रतिशत में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर एक तारक (*) द्वारा दर्शाया जाता है। ईसीजीसी बाध्यकारी पर लेबलिंग में वृद्धि लाल रंग में दिखाई जाती है जबकि कम होती है नीले रंग में दिखाया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
अंक 8 डीईपीसी सहसंयोजक लेबलिंग प्रतिक्रियाएं (न्यूक्लियोफिलिक एसील प्रतिस्थापन) और लेबल हानि (कार्बेथोक्सीलेटेड अवशेषों का हाइड्रोलिसिस) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
अंक 9 2m पर मापा संशोधन साइटों का मानचित्रण। (क) पारंपरिक रात भर पाचन के बाद लेबल साइटों, और (ख) स्थिर chymotrypsin के साथ एक 2 घंटे पाचन के बाद साइटों लेबल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
अंक 10 DEPC लेबल पांव मार के परिकल्पना तंत्र (Carbethoxylated अपने के Cys कब्जा) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

महत्वपूर्ण कदम
विश्वसनीय लेबलिंग परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन के बारे में कई बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, प्रोटीन लेबलिंग को अधिकतम करने के लिए, दृढ़ता से न्यूक्लियोफिलिक समूहों (जैसे, ट्रिस) के साथ बफ़र्स से बचना आवश्यक है क्योंकि वे डीईपीसी के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और लेबलिंग की सीमा को कम कर सकते हैं। यह भी बोधगम्य है कि इस तरह के बफ़र्स लेबल अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, लेबल को हटाने के कारण और इसलिए संरचनात्मक जानकारी की हानि । हम एक बफर के रूप में MOPS की सलाह देते हैं, लेकिन फॉस्फेट बफर नमकीन काम करता है के रूप में अच्छी तरह से । दूसरा, डिइयोथरेटोल को डिसल्फाइड बांड में कमी के लिए टाला जाना चाहिए क्योंकि इस अभिवावक में मुफ्त थिओल लेबल अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और डीईपीसी संशोधन को हटा सकते हैं। यही रसायन इसलिए आवश्यक है कि कम डिसल्फाइड को एल्किलेट किया जाए क्योंकि मुक्त सीवाईज अंतर-प्रोटीन लेबल33को मार सकता है। तीसरा, इमिडाजोल (प्रोटोकॉल चरण 2.4) के साथ बुझाना कदम लेबलिंग प्रतिक्रिया को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि कोई भी शेष डीईपीसी प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया जारी रखने में असमर्थ हो।

यह भी सराहना करते है कि DEPC लेबलिंग प्रतिक्रिया 2 आदेश है महत्वपूर्ण है,जिसका अर्थ है कि या तो प्रोटीन या DEPC एकाग्रता बदलने लेबलिंग की सीमा को प्रभावित करेगा । हमने अनुभवजन्य रूप से पाया है कि 4:1 डीईपीसी: प्रोटीन एकाग्रता अनुपात एक उचित मूल्य है जब प्रोटीन में 10 के μM रेंज में एकाग्रता होती है, क्योंकि यह किसी भी लेबलिंग-प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तन14से बचने की आदत है। हालांकि, इष्टतम DEPC: प्रोटीन एकाग्रता अनुपात प्रोटीन पर निर्भर है और साथ ही एकाग्रता पर निर्भर है, और कुछ प्रोटीन पर्याप्त लेबलिंग प्राप्त करने के लिए उच्च अनुपात की आवश्यकता है । किसी दिए गए प्रोटीन को लेबल करने के संरचनात्मक क्षोभ को कम करने के लिए इष्टतम डीईपीसी एकाग्रता का अनुमान सॉल्वेंट सुलभ उनके और Lys अवशेषों की संख्या सेलगायाजा सकता है ।

समय के साथ अभिकर्षक क्षरण के कारण लेबलिंग सीमा में परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, नियंत्रण और प्रयोगात्मक प्रतिक्रियाओं को आदर्श रूप से उसी दिन किया जाना चाहिए। DEPC तेजी से हाइड्रोलिसिस से गुजरता है जब पानी के संपर्क में है और भंडारण के दौरान नीचा के रूप में अच्छी तरह से होगा, तो अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास और अभिकर् प हैंडलिंग कुंजी हैं । उपयोग में नहीं होने पर, डीईपीसी स्टॉक बोतल को एक डिसिकेटर में संग्रहीत किया जाना चाहिए।

संशोधन और समस्या निवारण
क्योंकि डीईपीसी सीएल एक गतिजिक रूप से नियंत्रित प्रतिक्रिया है, लेबलिंग दर, और इस प्रकार संशोधन स्तर, प्रोटीन और अभिकर्मक सांद्रता, लेबलिंग समय और तापमान द्वारा नियंत्रित किया जाता है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, अक्सर डीईपीसी सीएल 4 से 1 के प्रोटीन मोलर अनुपात के लिए डीईपीसी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए किया जाता है। इस मोलर अनुपात (4x) पर, प्रोटीन को संरचनात्मक क्षोभ14के बिना सुरक्षित रूप से लेबल किया जा सकता है। DEPC: प्रोटीन मोलर अनुपात है कि 4 से अधिक कर रहे है कुछ प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और आश्चर्यजनक रूप से उच्च DEPC सांद्रता अधिक व्यापक लेबलिंग और अधिक संरचनात्मक जानकारी में परिणाम नहीं है । संरचना को परेशान किए बिना उच्च डीईपीसी सांद्रता का उपयोग करने का सबसे सुरक्षित तरीका खुराक-प्रतिक्रिया भूखंड उत्पन्न करना है जिसमें प्रोटीन के प्रोटियोलिटिक टुकड़ों की प्रतिक्रिया को डीईपीसी एकाग्रता के एक समारोह के रूप में मापा जाता है (चित्रा 4Bदेखें)14,24। हालांकि, यह दृष्टिकोण समय लेने वाला हो सकता है, क्योंकि इसके लिए कई मापों की आवश्यकता होती है। हाल ही में, हमने यह प्रदशत किया कि इष्टतम डीईपीसी एकाग्रता का अनुमान उस प्रोटीन23में उनके और Lys अवशेषों की संख्या और एसएसए से दिए गए प्रोटीन के लिए किया जा सकता है । हाल के कार्य में, हमने यह आकलन करने के लिए वैकल्पिक तरीके भी सुझाए हैं कि सीएल9,24के दौरान प्रोटीन की संरचना बेफिक्र नहीं है ।

प्रोटियोलिटिक पाचन भी डीईपीसी सीएल-एमएस में एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि पेप्टाइड्स जो उत्पन्न होते हैं, एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के बाद संरचनात्मक जानकारी को स्थानीयकृत करने की अनुमति देते हैं। सामान्य तौर पर, सेरीन प्रोटीज जैसे ट्राइप्सिन और काइमोट्रीप्सिन प्रोटीन पाचन के लिए प्रभावी होते हैं। ट्रिप्सिन का उपयोग आमतौर पर Lys और Arg अवशेषों के सी-टर्मिनल पक्ष में अपनी दरार दक्षता और विशिष्टता के कारण किया जाता है। हालांकि, ट्रिप्सिन आमतौर पर डीईपीसी-लेबल Lys अवशेषों के बाद क्लीव नहीं करता है, जिससे लेबल किए गए Lys अवशेषों पर दरार आ जाती है जो कभी-कभी डेटा विश्लेषण को जटिल बना सकती है। काइमोट्रीप्सिन की गतिविधि, जो भारी हाइड्रोफोबिक अवशेषों के बाद क्लीव्स करती है, आमतौर पर डीईपीसी लेबलिंग से प्रभावित नहीं होती है, लेकिन इस एंजाइम में ट्राइप्सिन की तुलना में कम दरार दक्षता और विशिष्टता होती है। इसके अलावा, कई हाइड्रोफोबिक अवशेषों वाले प्रोटीन के लिए, काइमोट्रीप्सिन कई छोटे पेप्टाइड टुकड़े उत्पन्न कर सकता है जो अलग हो सकते हैं और मानक एलसी-एमएस स्थितियों के तहत पता लगा सकते हैं।

प्रोटीन डाइजेस्ट के एलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए विश्वसनीय अर्धकांतुर परिणाम प्राप्त करने के लिए एक स्थिर इलेक्ट्रोस्प्रे की आवश्यकता होती है । केशिली और नैनो एलसी का उपयोग आमतौर पर पृथक्करण प्लेटफार्मों का किया जाता है जहां प्रोटीन की छोटी मात्रा के साथ कुशल पृथक्करण प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, हमारे अनुभव में, केशिका एलसी उपयोग की जाने वाली उच्च नमूना मात्रा के कारण नैनो एलसी की तुलना में अधिक विश्वसनीय मात्रात्मक जानकारी (यानी संशोधन स्तर) प्रदान करती है। बड़े प्रोटीन के लिए जो बड़ी संख्या में लेबल और अवेलेबल पेप्टाइड्स में पचा जाते हैं, समान हाइड्रोफोबिकिटी के साथ पेप्टाइड्स का कोल्यूशन हो सकता है। इन मामलों में, बेहतर अलगाव के लिए अब एलसी ढाल का उपयोग किया जाना चाहिए।

तेज और कुशल एमएस/एमएस अच्छे अनुक्रम कवरेज और लेबल साइट पहचान के लिए महत्वपूर्ण है । क्वाड्रपोल आयन ट्रैप के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर इस उद्देश्य के लिए उत्कृष्ट उपकरण हैं। आम तौर पर, सीआईडी पेप्टाइड डिससोसिएशन के लिए एक आम और अत्यधिक प्रभावी तरीका है; हालांकि, हम लेबल पेप्टाइड आयनों की सीआईडी के दौरान पांव मार DEPC लेबल के मामलों को देखा है, लेबलिंग साइट पहचान34में अस्पष्टता में जिसके परिणामस्वरूप . इन कुछ दुर्लभ मामलों में, ईटीडी जानकारी प्रदान करता है जो अधिक विश्वसनीय है। नतीजतन, यदि संभव हो, तो दोनों वियोजन तकनीकों के बीच बारी-बारी से सहायक हो सकते हैं। क्योंकि डीईपीसी कई अलग-अलग अवशेषों को लेबल कर सकता है, यह आम है कि दिए गए पेप्टाइड टुकड़े के आइसोमर उत्पन्न होते हैं जो संशोधित साइड चेन में भिन्न होते हैं। कई बार, इन पेप्टाइड आइसोमर्स को एलसी द्वारा अलग किया जा सकता है, हालांकि वे बहुत ही समय में एल्यूट करते हैं। स्वचालित एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के दौरान एमएस/एमएस अपवर्जन समय की स्थापना करते समय इस संभावना पर विचार किया जाना चाहिए । आमतौर पर, सामान्य अपवर्जन समय से कम का उपयोग किया जाना चाहिए।

सीमाओं
जबकि डीईपीसी सीएल-एमएस प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए काफी फायदेमंद है, और प्रोटीन प्रणालियों की एक विस्तृत विविधता को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति की गई है, इस तकनीक की कुछ सीमाएं बनी हुई हैं। यदि लेबलिंग की स्थिति अच्छी तरह से अनुकूलित नहीं है (उदाहरण के लिए, डीईपीसी की बहुत अधिक एकाग्रता का उपयोग करके), लेबलिंग पर प्रोटीन संरचना को परेशान किया जा सकता है और परिणामस्वरूप गलत संरचनात्मक जानकारी14,23,24हो सकती है। इसके अलावा, सटीकता और मापा संशोधन के स्तर की परिशुद्धता लेबल हानि सहित कई कारकों से प्रभावित है, अगर नमूने एलसी एमएस विश्लेषण और रासायनिक लेबलिंग कदम में त्रुटियों से पहले बहुत लंबे समय बैठते हैं । प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण में निरंतरता विश्वसनीय परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान में डीईपीसी-आधारित सीएल-एमएस से जुड़े अधिक चुनौतीपूर्ण मुद्दों में से एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर है। कम संशोधन प्रतिशत (उदाहरण के लिए, < 1%) के साथ पेप्टाइड्स की सफलतापूर्वक पहचान करने के लिए आसानी से उपलब्ध डेटा विश्लेषण कार्यक्रमों को अनुकूलित नहीं किया जाता है। नतीजतन, हमने कम संशोधन स्तर वाले पेप्टाइड्स को आसानी से पहचानने के लिए18को सक्षम करने के लिए विशेष सॉफ्टवेयर विकसित और उपयोग किया है।

हालांकि डीईपीसी सीएल-एमएस मध्यम प्रोटीन संरचनात्मक संकल्प प्रदान कर सकता है, लेबलिंग तकनीक से एक विस्तृत 3 डी संरचना प्राप्त नहीं की जा सकती है। हाल ही में, लेबलिंग डेटा पर आधारित कुछ संरचनात्मक भविष्यवाणी उपकरण35,36विकसित किए गए हैं। हालांकि, प्रोटीन संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए कंप्यूटेशनल मॉडलिंग के साथ डीईपीसी लेबलिंग परिणामों को बेहतर ढंग से शामिल करने के लिए अधिक विकास की आवश्यकता होती है।

वैकल्पिक तरीकों की तुलना में महत्व
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर जैसी तकनीकों की तुलना में डीईपीसी-आधारित सीएल-एमएस के साथ संभव संरचनात्मक संकल्प मध्यम है, इसलिए तकनीक की तुलना एचडीएक्स-एमएस, एक्सएल-एमएस और अन्य सीएल-एमएस, या पदचिह्निंग, दृष्टिकोण से करना सबसे उपयुक्त है। जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया था, सीएल-एमएस एचडीएक्स-एमएस के पूरक हैं क्योंकि यह प्रोटीन में अवशेषों की साइड चेन के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जबकि रीढ़ की संरचना और गतिशीलता पर एचडीएक्स-एमएस रिपोर्ट करता है। यह पूरकता अधिक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए दो तकनीकों का एक साथ उपयोग करने की अनुमति देती है, जैसा कि कई समूहों37, 38,39,40, 41द्वारा दिखाया गया है। डीईपीसी-आधारित सीएल-एमएस के लिए प्रासंगिक एक उभरता हुआ विचार सहक्रियात्मक जानकारी है जो एचडीएक्स-एमएस22के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने पर उपलब्ध है। दो तकनीकों से जुड़े लेबलिंग समय-सीमा के कारण, डीईपीसी-आधारित सीएल-एमएस अक्सर प्रोटीन क्षेत्रों के साथ अस्पष्टता को स्पष्ट कर सकता है जो एचडीएक्स को कम करते हैं। कम एचडीएक्स बाध्यकारी या कम प्रोटीन गतिशीलता के कारण या तो कम विलायक पहुंच से उत्पन्न हो सकता है। डीईपीसी प्रतिक्रियाएं एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं की तुलना में तीव्रता के स्वाभाविक रूप से 2-3 आदेश हैं, इसलिए डीईपीसी लेबलिंग प्रोटीन गतिशीलता में परिवर्तन से काफी हद तक अप्रभावित है जब तक कि वे विलायक पहुंच में परिवर्तन के साथ नहीं हैं।

सीएल-एमएस के एचडीएक्स-एमएस प्रयोगों पर कुछ फायदे हैं कि उचित सावधानियां बरतने पर लेबल पांव मार और लेबल हानि कम होती है। HDX प्रयोगों में, लेबल हानि या बैक-एक्सचेंज तकनीक की एक मानक विशेषता है, और कम पीएच पर तेजी से पाचन और एलसी अलगाव इस समस्या को कम करने के प्रयास हैं। हालांकि, यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि बैक एक्सचेंज इश्यू लेबल साइटों की उच्च संख्या से प्रतिसंतुलित है जो आमतौर पर एचडीएक्स-एमएस में मापा जाता है। लेबलिंग पांव मार HDX-MS में एक बड़ी समस्या है क्योंकि गलत जानकारी तो प्राप्त किया जाएगा, तो विश्लेषण शर्तों को इस चिंता को कम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

एक्सएल-एमएस और सीएल-एमएस के पास लेबल हानि और पांव मार के संबंध में समान फायदे हैं, क्योंकि दोनों में एक सहसंयोजक बंधन का गठन शामिल है जो पाचन और एलसी-एमएस विश्लेषण के दौरान बने रहने के लिए पर्याप्त मजबूत है। हालांकि, क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स की अनुक्रमण और पहचान, विशेष सॉफ्टवेयर के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो सहसंयोजक लेबल वाले पेप्टाइड्स की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण है। एक प्रमुख लाभ है कि XL-MS सीएल-एमएस पर है अपनी दूरी की कमी है, जो मूल्यवान हो सकता है जब भविष्यवाणी या नीचे संभव प्रोटीन संरचनाओं को संकुचित प्रदान करने की क्षमता है । सीएल-एमएस डेटा का उपयोगप्रोटीन संरचना भविष्यवाणी36,42, 43की सुविधा के लिए किया गया है, लेकिन इस क्षेत्र को पूरीतरहसे अपनी क्षमता तक पहुंचने के लिए अधिक काम की आवश्यकता है।

अन्य सीएल-एमएस विधियों की तुलना में, जिनमें विशिष्ट या गैर-विशिष्ट लेबलिंग अभिकर् ताओं का उपयोग किया जाता है, तो डीईपीसी के कुछ फायदे और नुकसान होते हैं। अमीनो एसिड विशिष्ट अभिकर् तारों का उपयोग करने वाले तरीकों की तरह, डीईपीसी लेबलिंग सीधी है; अभिवाक केवल ब्याज के नमूने में जोड़ने की जरूरत है। यह सादगी प्रोटीन (एफओपी) या सिंक्रोट्रॉन आधारित एचआरएफ के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण जैसे तरीकों के विपरीत है जिन्हें हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स का उत्पादन करने के लिए परिष्कृत प्रकाश स्रोतों की आवश्यकता होती है। विशिष्ट अभिकर् ती का उपयोग करने वाले तरीकों के विपरीत, डीईपीसी छह अलग-अलग अमीनो एसिड और एन-टर्मिनस को लेबल कर सकता है, जिससे यह उच्च संरचनात्मक संकल्प प्रदान करने में सक्षम हो जाता है। हालांकि, डीईपीसी द्वारा लेबल किए जा सकने वाले अवशेषों की संख्या उस संख्या से कम है जिसे हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स द्वारा ऑक्सीकृत किया जा सकता है, इसलिए डीईपीसी-आधारित सीएल-एमएस द्वारा प्राप्य संरचनात्मक संकल्प कम है। कम अवशेषों का एक व्यावहारिक असर DEPC द्वारा लेबल किया जा रहा है कि अभिकर्षक का उपयोग कर कई बार सभी वांछित संरचनात्मक जानकारी प्रदान नहीं करता है, और इसलिए यह अंय लेबलिंग अभिकरोटा के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा से लाभ उठा सकते हैं । हमने हाल ही में डीईपीसी का उपयोग करने के मूल्य का प्रदर्शन किया है, जिसमें 1-एथिल-3-(3-डाइमेथाइलमिनोप्रोपिल) कार्बोडिसाइड (ईडीसी)/ग्लाइसिन एथिल ईथर (जीई) है, जो ग्लूटामेट और एस्पार्टेट अवशेषोंको 19लेबल कर सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक अनुदान R01 GM075092 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH) से समर्थन स्वीकार करते हैं । यहां वर्णित कुछ डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले थर्मो ऑर्बिटरप फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमीटर को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान S10OD010645 से धन के साथ अधिग्रहीत किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Tags

रसायन विज्ञान अंक 172 मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहसंयोजक लेबलिंग प्रोटीन उच्च क्रम संरचना प्रोटीन-लिगामेंट कॉम्प्लेक्स प्रोटीन कॉम्प्लेक्स डायथिलपिरोकार्बोनेट सॉल्वेंट-सुलभ सतह क्षेत्र
मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन उच्च-आदेश संरचना का अध्ययन करने के लिए डायथिलपाइरोकार्बोनेट के साथ सहसंयोजक लेबलिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, … More

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter