Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kovalent merking med Diethylpyrokarbonat for å studere protein høyere orden struktur ved massespektrometri

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

De eksperimentelle prosedyrene for å utføre dietylpyrokarbonatbasert kovalentmerking med massespektrometrisk deteksjon er beskrevet. Diethylpyrokarbonat blandes ganske enkelt med protein- eller proteinkomplekset av interesse, noe som fører til modifikasjon av løsningsmiddel tilgjengelige aminosyrerester. De modifiserte rester kan identifiseres etter proteolytisk fordøyelse og flytende kromatografi / massespektrometrianalyse.

Abstract

Karakterisering av proteinets høyere ordens struktur er avgjørende for å forstå funksjonen. Massespektrometri (MS) har dukket opp som et kraftig verktøy for dette formålet, spesielt for proteinsystemer som er vanskelige å studere ved tradisjonelle metoder. For å studere et proteins struktur ved MS, utføres spesifikke kjemiske reaksjoner i løsning som koder et proteins strukturelle informasjon inn i massen. En spesielt effektiv tilnærming er å bruke reagenser som kovalent modifiserer løsningsmiddeltilgjengelige aminosyresidekjeder. Disse reaksjonene fører til masseøkninger som kan lokaliseres med oppløsning på restnivå når de kombineres med proteolytisk fordøyelse og tandemmassespektrometri. Her beskriver vi protokollene knyttet til bruk av dietylpyrokarbonat (DEPC) som et kovalent merkingsreagens sammen med MS-deteksjon. DEPC er et svært elektrofilt molekyl som er i stand til å merke opptil 30% av rester i det gjennomsnittlige proteinet, og gir dermed utmerket strukturell oppløsning. DEPC har blitt brukt sammen med MS for å få strukturell informasjon for små enkeltdomeneproteiner, for eksempel β2-mikroglobulin, til store multidomenproteiner, for eksempel monoklonale antistoffer.

Introduction

Proteiner er essensielle biomolekyler i nesten alle fysiologiske prosesser. Mangfoldet av funksjoner som proteiner utfører er mulig på grunn av strukturene de vedtar og interaksjonene de har med andre biomolekyler. For å forstå proteinfunksjonen på et dypere nivå er det nødvendig med biokjemiske og biofysiske verktøy for å belyse disse viktige strukturelle egenskapene og interaksjonene. Tradisjonelt har røntgenkrystallografi, kryogen elektronmikroskopi og kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi gitt ønsket atomnivådetaljer for å avsløre proteinstruktur. Imidlertid kan mange proteinsystemer ikke forhøres av disse teknikkene på grunn av dårlig krystalliseringsadferd, begrenset proteintilgjengelighet, overdreven prøve heterogenitet eller molekylvektbegrensninger. Følgelig har det oppstått nyere analysemetoder som overvinner disse begrensningene. Blant de fremvoksende teknikkene som kan gi proteinstrukturinformasjon er massespektrometri.

Massespektrometri (MS) måler et molekyls masse-til-lading (m / z) forhold, så protein høyere orden strukturell informasjon må oppnås ved å kode ønsket strukturell informasjon inn i massen av proteinet. Flere tilnærminger for å kode denne informasjonen er utviklet, inkludert hydrogen-deuterium utveksling (HDX)1,2,3,4, kjemisk krysskobling (XL)5,6og kovalente merking (CL)7,8,9,10. I HDX utveksles ryggraden blant hydrogener av litt mer massive deuterier til priser som er avhengige av løsningsmiddeltilgjengelighet og H-bindingsutbredelse. Omfanget av HDX kan lokaliseres ved raskt å fordøye proteinet i peptidfragmenter før du skiller og måler disse fragmentene av massespektrometeret eller ved å dissosiere proteinet i et ovenfra og ned-eksperiment. Å bestemme valutakursen gir ytterligere innsikt i proteindynamikk. HDX har vist seg å være et verdifullt verktøy for å karakterisere proteinstruktur til tross for utfordringer knyttet til ryggutveksling og behovet for spesialisert utstyr for å maksimere reproduserbarheten. I XL-MS reageres proteiner med bifunksjonelle reagenser som kovalent forbinder tilstøtende rester av sidekjeder i et gitt protein eller mellom to proteiner. Ved å gjøre dette kan XL-MS gi avstandsbegrensninger som kan brukes til å karakterisere proteinstruktur. Områdene av proteinet som er kryssbundet kan identifiseres ved proteolytisk fordøyelse etterfulgt av flytende kromatografi (LC)-MS-analyse. Mens XL-MS er et allsidig verktøy som har blitt brukt til å studere en rekke proteinkomplekser, inkludert inneceller, er identifisering av XL-produktene utfordrende og krever spesialisert programvare.

CL-MS har nylig dukket opp som et komplementært og noen ganger alternativt MS-basert verktøy for å studere proteinstruktur og interaksjoner. I CL-MS er et protein- eller proteinkompleks kovalent modifisert med et monofunksjonelt reagens som kan reagere med løsningsmiddelutsatte sidekjeder (figur 1). Ved å sammenligne modifikasjonsutbredelsene til et protein- eller proteinkompleks under forskjellige forhold, kan konformasjonsendringer, bindingssteder og proteinproteingrensesnitt avsløres. Etter CL-reaksjonen kan stedsspesifikk informasjon, ofte på enkelt aminosyrenivå, oppnås ved hjelp av typiske proteomiske arbeidsflyter for bunn opp der proteiner fordøyes proteolytisk, peptidfragmenter skilles av LC, og modifiserte steder identifiseres ved hjelp av tandem MS (MS / MS). Den rike historien om biokonjugatkjemi har gjort mange reagenser tilgjengelige for CL-MS-eksperimenter. CL-reagenser faller inn i to generelle kategorier: (i) spesifikke og (ii) ikke-spesifikke. Spesifikke reagenser reagerer med en enkelt funksjonell gruppe (f.eks. frie aminer)8,10 og er enkle å implementere, men de har en tendens til å gi begrenset strukturell informasjon. Ikke-spesifikke reagenser reagerer med et bredt spekter av sidekjeder, men krever ofte spesialisert utstyr som lasere eller synkrotronkilder for å produsere disse svært reaktive artene. Hydroksylradikaler er det mest brukte ikke-spesifikke reagenset, etter å ha blitt brukt i hydroksylradikale fotavtrykk (HRF)7,11,12,13 eksperimenter for å studere et bredt spekter av proteiner og proteinkomplekser under en rekke forhold.

Vår forskningsgruppe har vellykket brukt en annen relativt ikke-spesifikk reagens kalt diethylpyrokarbonat (DEPC) for å studere proteinstruktur og interaksjoner i sammenheng med CL-MS-eksperimenter14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC tilbyr enkelheten til spesifikke merkingsreagenser (dvs. ingen spesialisert utstyr er nødvendig for å utføre reaksjonene), mens du reagerer med opptil 30% av aminosyrene i det gjennomsnittlige proteinet. Som et svært elektrofilt reagens er DEPC i stand til å reagere med N-terminus og nukleofile sidekjeder av cystein, histidin, lysin, tyrosin, serin og treoninrester. Vanligvis genereres et enkelt produkt av disse reaksjonene, noe som resulterer i en masseøkning på 72,02 Da. Denne enkle typen produkt står i kontrast til de opptil 55 forskjellige produktene som kan produseres når proteiner reagerer med hydroksylradikaler7. Slik enkel kjemi letter identifisering av merkede steder.

Her tilbyr vi protokoller for bruk av DEPC-basert CL-MS for å studere proteinstruktur og interaksjoner. Detaljer knyttet til reagenspreparat, DEPC-proteinreaksjoner, protein fordøyelsestilstander, LC-MS og MS / MS parametere, og dataanalyse er beskrevet. Vi demonstrerer også nytten av DEPC-merking ved å gi eksempelresultater fra proteinmetall-, protein-ligand- og proteinproteininteraksjoner samt proteiner som gjennomgår strukturelle endringer ved oppvarming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein- og reagenspreparat

MERK: Denne protokollen inneholder et eksempel på en arbeidsflyt for merking av et protein med DEPC. Noen forhold og reagenskonsentrasjoner som er oppført, kan variere avhengig av hvor mange typer valg.

  1. Forbered alle reagensløsninger i 1,5 ml mikrosenterrør.
  2. Forbered en proteinløsning av ønsket konsentrasjon, vanligvis i området titalls μM, i en 10 mM 3-(N-morpholino)propansulfonsyre (MOPS) buffer ved pH 7,4. Alternativt kan du klargjøre en bufferutveksling av eksisterende proteinløsning i 10 mM pH 7,4 MOPS hvis prøven inneholder en nukleofil buffer som vil være reaktiv med DEPC. Andre buffere (f.eks. fosfatbufret saltvann) kan også brukes, så lenge de ikke har nukleofile funksjonelle grupper.
  3. Forbered en 100 mM DEPC-løsning i tørr acetonitril (ACN) ved å pipettere 1,45 μL av lageret 6,9 M DEPC-oppløsning i 98,55 μL av ACN.
    MERK: Det er ingen sett med konsentrasjoner som vil fungere med hvert protein, selv om de optimale konsentrasjonene kan estimeres basert på antall Hans- og Lys-rester23. For eksempel, med 50 μL av en 50 μM β2-mikroglobulinoppløsning, reager proteinet med 0,2 μL av 100 mM DEPC for en endelig DEPC-konsentrasjon på 200 μM (lik 4x proteinkonsentrasjonen) for å sikre ønsket molarforhold ved hjelp av dette generelle eksemplet (Tabell 1). DEPC-merking er en2.-ordens reaksjon, så endring av enten konsentrasjonen av protein eller DEPC i reaksjonsblandingen vil endre merkehastigheten.
  4. Forbered 1 M imidazoloppløsning ved å veie ut 10 mg imidazol og oppløsning i 146,9 μL HPLC-vann.

2. Kovalent merking av intakt protein

  1. Sett vannbadtemperaturen til 37 °C og vent til badekaret når en stabil temperatur.
    MERK: Reagenskonsentrasjoner og volumer for et eksempel på merkingsprotokoll finnes i tabell 1.
  2. Bland MOPS-buffer og proteinoppløsning i volumer som er oppført i tabell 1i et nytt mikrosenterrør.
  3. Til proteinet og bufferen tilsett 0,2 μL av DEPC-løsningen, sørg for å blande den resulterende løsningen riktig, og plasser deretter røret som inneholder reaksjonsblandingen i 37 °C vannbadet i 1 minutt.
    MERK: Volumet av ACN tilsatt bør ikke overstige 1% av det totale reaksjonsvolumet for å unngå perturbasjon av proteinets struktur under etikettreaksjonen. Reaksjonstid er opp til brukeren, selv om en 1 minutt reaksjon under eksempelforholdene minimerer overlabeling og potensiell hydrolyse av DEPC14.
  4. Etter 1 minutt, fjern røret som inneholder reaksjonsblandingen fra vannbadet og slukk reaksjonen med 1 μL av 1 M imidazoloppløsningen for å scavenge den gjenværende ikke-utførte DEPC.
    MERK: Den endelige konsentrasjonen av imidazol i reaksjonsblandingen skal tilsvare 50 ganger konsentrasjonen av DEPC i reaksjonsblandingen. Dette vil sikre at gjenværende ikke-vedtatt DEPC er scavenged.

3. Tilberedning av proteinfordøyelse for nedenfra-og-opp LC-MS

MERK: Velg fordøyelsesbetingelser som er mottagelige for proteinet av interesse. Vanlige trinn innebærer å utfolde proteinet og redusere og alkylere eventuelle disulfidbindinger.

  1. Brett ut proteinet ved å legge til et passende utfoldende reagens til reaksjonsblandingen.
    MERK: Vanlige utfoldelsesmidler inkluderer ACN, urea og guanidinhydroklorid (GuHCl).
  2. Forbered løsninger av Tris(2-karboksyetyl)fosfin (TCEP) og iodoacetamid (IAM) ved å veie ut 5 mg av hver og oppløse dem i nye mikrocentrifuge rør i henholdsvis 174.4 og 270.3 μL av 10 mM pH 7.4 MOPS buffer, henholdsvis for reduksjon og alkyleringstrinn.
  3. Reduser disulfidbindinger ved å tilsette 2 μL av 100 mM TCEP (endelig konsentrasjon på 2 mM i reaksjonsblanding) løsning på reaksjonsblandingen og reagere i 3 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Den endelige konsentrasjonen av TCEP skal tilsvare 40 ganger proteinkonsentrasjonen per disulfidbinding som finnes i oppløsningen.
  4. Alkylat reduserte cysteiner med 4 μL av 100 mM IAM-løsningen (endelig konsentrasjon på 4 mM i reaksjonsblanding) i 30 minutter i mørket. IAM er lysfølsom og brytes ned under direkte lys.
    MERK: Den endelige konsentrasjonen av IAM i oppløsning bør være dobbelt så stor konsentrasjon som brukes til TCEP, eller 80 ganger proteinkonsentrasjonen per disulfidbinding.
  5. Fordøye proteinet med et passende enzym som trypsin eller chymotrypsin. Et 10:1 protein:enzymforhold for en 3-timers fordøyelse ved 37 °C med immobilisert enzym med en ristingshastighet på 300 slag/min er vanligvis tilstrekkelig for DEPC-merkede proteiner. Se Diskusjon.
  6. Etter fordøyelsen, skille det immobiliserte enzymet fra de fordøyde peptidene ved sentrifugering ved 12.000 rpm i 5 minutter.
  7. Analyser prøven umiddelbart med LC-MS/MS eller flash-frys prøven med flytende nitrogen for å minimere prøveforringelse og etiketttap. Oppbevar de flashfroste prøvene ved < -20 °C til de er klare for LC-MS/MS-analyse.

4. LC-MS/MS-analyse

MERK: Standard LC-MS/MS-parametere for oppblåst proteomikk kan brukes til å identifisere merkede steder på de proteolytiske peptidfragmentene. Et generelt eksempel er beskrevet nedenfor.

  1. Skill de DEPC-merkede peptidene ved hjelp av en omvendt fase C18 stasjonær fase. Bruk en typisk LC-mobilfase med to løsemidler: (A) vann + 0,1 % maursyre og (B) ACN + 0,1 % maursyre ved hjelp av en gradient (f.eks. figur 2) for å oppnå best mulig separasjon av peptider.
    MERK: Separasjonstiden kan optimaliseres basert på prøvekompleksitet, og mobil fasestrømningshastighet avhenger av om kapillær eller nano LC brukes.
  2. Bruk et massespektrometer som kan utføre online LC-MS og MS/MS for å identifisere DEPC-modifikasjonssteder på peptidet. I våre eksperimenter har vi med hell brukt flere typer massespektrometre. Ethvert massespektrometer som automatisk kan utføre MS/MS av mange peptider i løpet av en LC-MS-analyse, bør være egnet. Relevante MS-parametere inkluderer: ESI-kildespenning = -4000 V for vanlig ESI; -2000 V for nanospray; Orbitrap-oppløsning = 60 000; Varighet for dynamisk utelukkelse = 30 s; MS/MS-aktiveringstype: CID, ETD eller begge deler; Masseskanningsområde = 200-2000; Automatisk forsterkningskontroll = 4,0E5 (MS1 i Orbitrap) og 5,0E4 (MS2 i lineær quadrupole ionfelle).
  3. Last inn og injiser den fordøyde, merkede proteinprøven i LC-systemet og start oppkjøpet av LC-MS/MS. Hvis prøven har blitt flash-frossen, tine før analyse. Avlede LC-avløpet til avfall de første 5 minuttene for å unngå at for mye salt kommer inn i ESI-kilden.
    MERK: En 5 μL injeksjonssløyfe brukes vanligvis, noe som muliggjør injeksjon av ca. 2,5 μg protein til LC-MS/MS. Dette avhenger av lasteforholdene til LC for ikke å tette prøveinjektoren.

5. Dataanalyse

  1. Identifiser DEPC-etikettområder og kvantifiser peptidtoppområder ved hjelp av passende programvare for massespektrometeret som brukes.
  2. Inkluder DEPC addisjon (72.02 Da) og carbamidomethylation (57.02 Da) som variable modifikasjoner. Flere søkeparametere for MS/MS-analysen er som følger: Maksimalt antall tapte spaltinger = 3; Fragmentiontyper = b og y; Forløper m/z toleranse = 10 ppm (denne verdien bør være høyere hvis en quadrupole ion felle massespektrometer brukes); Fragment m/z toleranse = 0,5 Da (denne verdien bør være lavere hvis et massespektrometer med høy oppløsning brukes til en produktionskanning); Forløperavgift = 1-4.
    MERK: Ulike algoritmer for databasesøk har forskjellige poengsystemer, og mange kan ha problemer med å identifisere DEPC-modifiserte peptider fordi endringsnivåene kan være lave. Justering av poengsumkuttet kan være nødvendig for å identifisere mer merkede peptider. I så fall bør manuell avhør av MS/MS-dataene brukes til å verifisere peptider med lav poengsum. Produktet av hydrolysen til DEPC-etiketten er ikke inkludert i datasøket fordi den hydrolyserte DEPC ikke lenger er reaktiv mot nukleofile sidekjeder.
  3. Bestem restnivåmodifikasjonsprosenter ved hjelp av kromatografiske toppområder i de modifiserte og umodifiserte versjonene av peptidene.
    MERK: Ethvert peptid som inneholder de modifiserte rester av interesse må vurderes, og alle ladetilstander som er inkludert må være til stede i alle de målte prøvene. Peptider som har forskjellig ioniseringseffektivitet og eluting på forskjellige tidspunkter, fører til at denne verdien er et relativt snarere enn absolutt mål på modifikasjonen av et bestemt nettsted.
    Equation 1
    der Ai,z representerer toppområdet til et gitt peptid (i) som inneholder rester av interesse og vurderer alle oppdagede ladetilstander (z).
  4. Finn ut om en merkeendring mellom en kontroll og et eksperimentelt utvalg er signifikant ved hjelp av statistisk evaluering. Tre replikeringsmålinger for hver prøve er typiske, og t-tester brukes oftest med konfidensintervaller på 95 eller 99 %.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifisere depc-endringsområder og endringsprosenter
Massetilsetning på grunn av kovalente merking kan måles ved (a) intakt protein og (b) peptidnivåer8,9. På intakt nivå kan en fordeling av proteinarter med forskjellig antall etiketter fås fra direkte analyse eller LC-MS av merkede proteinprøver. For å få strukturell informasjon med høyere oppløsning (dvs. stedsspesifikke merkingsdata), må det utføres målinger på peptidnivå. Etter merkings- og slukketrinnene blir de merkede proteinene utsatt for proteomisk analyse nedenfra og opp (dvs. reduksjon av disulfid, alkylering, proteolytisk fordøyelse og LC-MS/MS). Figur 3 viser hvordan de DEPC-merkede områdene identifiseres og deres modifikasjonsnivåer beregnes for et DEPC CL-MS-eksperiment på proteinet β-2-mikroglobulin (β2m)21. MS/MS brukes til å sekvensere de merkede peptidene og finne de DEPC-merkede områdene, mens endringsprosenter beregnes fra de relative toppområdene i utpakkede ionkromatogrammer (se figur 3A).

Proteinoverflatekartlegging ved hjelp av DEPC CL-MS
På grunn av forholdet mellom proteintopologi og merkingshastighet har DEPC blitt brukt til å studere endringer i protein høyere ordens struktur (HOS) og identifisere proteininteraksjonssteder8,9. Et eksempel er effekten av Cu (II) binding på strukturen av β2m. DEPC modifikasjonshastighetskoeffisienter av peptidfragmenter fra ubundet β2m og Cu (II)-bundet β2m (b2m-Cu) kan måles (Tabell 2) ved å variere DEPC-konsentrasjoner og generere andreordens kinetiske tomter14,24. DEPC-reaktivitet av rester i β2m-Cu avslører betydelige merkefrekvensendringer for His31, Ser33 og Thr4, mens andre steder, inkludert forskjellige Hans rester, er statistisk uendret. Disse dataene er i samsvar med det faktum at His31, men ikke andre Hans rester i β2m, binder Cu forårsaker strukturelle endringer nær His31 (dvs. Ser33) og nær N-terminus (dvs. Thr4) (Figur 4)14,26,27.

DEPC CL-MS for å identifisere endringer i HOS
DEPC-merking med MS-deteksjon er også et verdifullt verktøy for å karakterisere HOS-endringer i proteiner, noe som har viktige implikasjoner for proteinterapeutiske stoffer, som for tiden er det raskest voksende segmentet av det farmasøytiske markedet28. DEPC CL kan identifisere spesifikke proteinregioner som gjennomgår strukturelle endringer på termisk og oksidativt stress18. Etter at β2m er utsatt for varmestress, er mange rester som gjennomgår betydelige reduksjoner i merkingsutbredelser (N-terminus, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) gruppert på den ene siden av proteinet, noe som tyder på at denne regionen av proteinet gjennomgår en konformasjonsendring eller muligens formidler aggregering (Figur 5A). I tillegg til disse rester, etter at proteinet er utsatt for oksidativt stress, danner andre rester med en reduksjon i merking (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) en klynge på et annet ansikt av proteinet, noe som indikerer at oksidasjonsinduserte konformasjonsendringer forekommer andre steder (Figur 5B). Annet arbeid fra vår gruppe har også vist at DEPC CL-MS kan oppdage og identifisere steder for konformasjonsendringer i varmestresset monoklonale antistoffterapeutiske20.

DEPC CL-MS for å studere proteinproteininteraksjoner
Innsikt i proteinprotein interaksjonssteder og aggregeringsgrensesnitt for amyloiddannende proteiner kan oppnås ved hjelp av DEPC-merking samt9. Reduksjoner i modifikasjonsnivåene av rester ved oligomerdannelse kan avsløre bindingsgrensesnittene. DEPC CL-MS ble brukt til å karakterisere pre-amyloid oligomerer av β2m, som er proteinet som danner amyloider i dialyserelatert amyloidose29, etter å ha startet amyloiddannelse med Cu (II)15,16,26. Sammenligning av DEPC-reaktivitet av β2m-monomeren med pre-amyloid β2m dimer som dannes 2 timer etter tilsetning Cu(II) viser at ni rester gjennomgår reduksjon i merking mens seks rester ikke gjennomgår noen endring eller liten økning i merking (Figur 6A). Ved kartlegging av disse endringene på β2m, er det umiddelbart tydelig at dimmergrensesnittet involverer ABED-β ark med β2m monomerer (Figur 6B)15.

DEPC CL-MS for å studere protein-ligand binding
Ligandbinding til proteiner fører til reduksjon i løsningsmiddeltilgjengeligheten av rester som samhandler med liganden, og DEPC-basert CL-MS kan brukes til å identifisere ligandbindende steder på proteiner. For eksempel kan bindingsstedene for epigallocatechin-3-gallate (EGCG) på β2m under amyloiddannende forhold identifiseres ved betydelige reduksjoner i DEPC-merking ved rester begravet av EGCG-binding. I nærvær av EKG, Lys6 og Lys91 har lavere DEPC modifikasjon prosenter (Figur 7), og disse rester er gruppert i en region av proteinet, noe som indikerer rester beskyttelse på grunn av ligand binding. N-terminus, Thr4 og His31 gjennomgår i mellomtiden økninger i merkeutstrekninger (figur 7), som indikerer EKG-induserte strukturelle endringer og antyder at Cu(II) bindingsstedene på β2m (N-terminus og His31)14,30,31 kan bli forstyrret som følge av EKG-binding32. I tillegg er bindingsstedene til de to andre småmolekylhemmerne av β2m amyloiddannelse, rifamycin SV og doxycyklin identifisert ved hjelp av CL-MS19. I denne studien var imidlertid resultater fra DEPC-merking alene ikke nok til å kartlegge bindingsstedene med tilstrekkelig strukturell oppløsning. Resultater fra tre forskjellige CL-reagenser, nemlig DEPC, BD og 1-etyl-3-(3-(dimethylamino)profyl)karbodiimid - glycin etyl ester (EDC / GEE) par var nødvendig for å bedre finne bindingsstedene19.

Forbedre strukturell oppløsning og redusere merkings scrambling
Selv om DEPC-merking forårsaker dannelse av en kovalent binding, kan etiketttap på grunn av hydrolyse forekomme, spesielt for Ser-, Thr- og Tyr-rester (figur 8). Etiketttap kan minimeres ved å redusere tiden mellom DEPC CL-reaksjon og LC-MS-analyse ved hjelp av korte proteolytiske fordøyelser (f.eks. 2 h fordøyelse med immobiliserte enzymer) i stedet for fordøyelser over natten. Raske fordøyelser resulterer i at mer modifiserte rester måles, noe som øker mengden proteinstrukturelt informasjon. For eksempel fører en 2 h fordøyelse med immobilisert chymotrypsin konsekvent til identifisering av flere DEPC-modifiserte rester i β2m (Figur 9)17. Med en fordøyelse over natten oppdages ca 75% av Ser, Thr, Tyr, His og Lys rester i β2m, men når tiden mellom merking og LC-MS reduseres ved hjelp av en 2 h fordøyelse, oppdages 95% av disse rester i β2m. De fleste av de nylig påviste modifiserte rester er Tyr og Thr rester som er utsatt for hydrolyse.

I løpet av vårt arbeid med DEPC har vi lagt merke til at i noen proteiner rester Cys at fra disulfidbindinger er modifisert av DEPC, selv om disulfidbindingene er intakte under DEPC-merkingsreaksjonene. Slike merking av Cys rester oppstår fordi frie tioler kan reagere med andre modifiserte rester i løsning (Figur 10), noe som fører til såkalt "label scrambling" som carbethoxy gruppen overføres til Cys rester. Etikett scrambling reduserer modifikasjonsnivåene ved andre rester og gir feil proteinstrukturinformasjon. For å unngå merking av scrambling, må de frie Cys-tiolene være fullstendig alkylert rett etter disulfidreduksjon33.

Figure 1
Figur 1: Kovalent merking-massespektrometri (CL-MS). Et monofunksjonelt reagens brukes til å modifisere løsemiddel tilgjengelige aminosyrer og kan brukes til å gi stedsspesifikk informasjon om konformasjonsendringer eller interaksjonsgrensesnitt i proteiner (topp vs. bunnbilde). Det modifiserte proteinet fordøyes proteolytisk, og de resulterende peptidene analyseres ved flytende kromatografi (LC) i forbindelse med MS og tandem MS (MS/MS). Figuren er tilpasset fra Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometry for å studere proteinstruktur og interaksjoner. Metoder 144, 79-93 (2018). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Brukt volum (μL) Konsentrasjon i oppløsning (μM)
Protein (100 μM, MOPS) 50 50
MOPS (10 mM, pH 7,4) 48.8 N/a
DEPC (100 mM) 0.2 200 (=4x[protein])
Imidazol (1 M) 1 10 000 (=50x[DEPC])
Totalt volum 100

Tabell 1. Generell DEPC-merkingsprotokoll.

Figure 2
Figur 2. Eksempel på LC-gradient for separasjon av peptider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Illustrasjon av hvordan DEPC-merkede områder identifiseres og endringsnivåene beregnes. Etter DEPC-merking og proteolytisk fordøyelse utføres (A) LC-MS-analyse av det fordøyde proteinet. Toppområder med (B) umerkede og (C) merkede peptider i et kromatogram brukes til å beregne etikettprosenten. Under LC-MS blir peptider utsatt for CID MS/MS. Tandemmassespektra av (D) umerket og (E) &F) merkede peptider oppnådd på bestemte oppbevaringstider brukes til peptidsekvensering og identifisering av DEPC-merkede steder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Rester b2m b2m-Cu
Thr4 0,082 ± 0,004 0,052 ± 0,009
His13 0,041 ± 0,003 0,033 ± 0,005
His31 0,010 ± 0,001 0,003 ± 0,001
Ser33 0,010 ± 0,002 0,004 ± 0,001
His51 0,036 ± 0,003 0,030 ± 0,004
Ser88 0,029 ± 0,007 0,020 ± 0,006

Tabell 2 Stedsspesifikke DEPC-modifikasjonshastighetskoeffisienter (k, M-1s-1) for b2m i fravær og tilstedeværelse av Cu(II).

Figure 4
Figur 4 Bruke DEPC CL-MS til å bestemme effekten av Cu(II) binding på strukturen av β2m: (A) Protein overflatekartlegging av rester med betydelige reduksjoner i DEPC merking priser (blå), indikerer endringer i deres løsningsmiddel tilgjengelighet ved Cu (II) binding, og de uten vesentlige endringer i merking rate (magenta) (PDB tiltredelseskode 1JNJ). (B) Eksempel stedsspesifikke andreordens kinetiske plott av reaksjonen av β2m med forskjellige konsentrasjoner av DEPC i nærvær og fravær av Cu (II). Merkingshastighetskoeffisienten (k) kan fås fra skråningen av kinetisk tomt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5 Kovalente merkingsresultater for stresset vs. innfødt β2m: (A) Varmespenning - oppvarming ved 75 °C i 24 timer og (B) oksidativt stress - med 3% H2O2 i 24 timer. Betydelige endringer i modifikasjonsprosenter vises i blått (reduksjon i merking) og rødt (økning i merking) mens rester uten vesentlige merkingsendringer vises i lysegrønn (PDB-tiltredelseskode 1JNJ). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6 Bruke DEPC CL-MS til å bestemme dimmergrensesnittet for pre-amyloid dimer av β2m: (A) Sammendrag av DEPC modifikasjonsnivå endringer for modifiserte rester i monomeren (dvs. t = 0) og dimer 2 h etter å ha lagt til Cu (II). Rester med betydelige reduksjoner i merkingsutbredelse er betegnet med en stjerne (*). (B) Kovalente merkingsresultater kartlagt på β2m-strukturen. Rester med redusert merking vises i blått og rester uten endringer eller små økninger i merking vises i rødt (PDB-tiltredelseskode 1LDS). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7 Kovalente merkingsresultater for EGCG-bundet kontra ubundet b2m. Depc-endringsprosentene vises for de viste rester. Statistisk signifikante forskjeller i den kovalente merkingsprosenten er betegnet med en stjerne (*). Økning i merking på EKG-binding vises i rødt mens reduksjoner vises i blått. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8 DEPC kovalente merkingsreaksjoner (nukleofil akylerstatning) og etiketttap (hydrolyse av karbetokrylaterte rester) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9 Kartlegging av de målte modifikasjonsstedene på β2m. (A) Merkede steder etter konvensjonell fordøyelse over natten, og (B) merkede steder etter en 2 timers fordøyelse med immobilisert chymotrypsin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10 Hypotetisk mekanisme av DEPC etiketten scrambling (Cys fangst av carbethoxylated Hans) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn
Flere punkter om eksperimentell design bør vurderes for å sikre pålitelige merkingsresultater. For det første, for å maksimere proteinmerking, er det nødvendig å unngå buffere med sterkt nukleofile grupper (f.eks. Tris) fordi de kan reagere med DEPC og redusere omfanget av merking. Det kan også tenkes at slike buffere kan reagere med merkede rester, noe som forårsaker fjerning av etiketten og dermed tap av strukturell informasjon. Vi anbefaler MOPS som buffer, men fosfatbufret saltvann fungerer også. For det andre bør dithiothreitol unngås for reduksjon av disulfidbindinger fordi de frie tiolene i dette reagenset kan reagere med merkede rester og fjerne DEPC-modifikasjonen. Den samme kjemien er grunnen til at det er viktig å alkylere reduserte disulfider fordi frie Cys kan forårsake intraproteinetikett scrambling33. For det tredje er slukketrinnet med imidazol (protokoll trinn 2.4) avgjørende for å stoppe merkingsreaksjonen slik at gjenværende DEPC ikke kan fortsette å reagere med proteinet.

Det er også viktig å sette pris på at DEPC-merkingsreaksjonen er2. Vi har empirisk funnet ut at et 4: 1 DEPC: proteinkonsentrasjonsforhold er en rimelig verdi når proteinet har en konsentrasjon på 10-tallet av μM-området, da det har en tendens til å unngå merkingsinduserte strukturelle endringer14. Imidlertid er det optimale DEPC: proteinkonsentrasjonsforholdet proteinavhengig så vel som konsentrasjonsavhengig, og noen proteiner krever høyere forhold for å oppnå tilstrekkelig merking. Den optimale DEPC-konsentrasjonen for å minimere den strukturelle perturbasjonen av merking av et gitt protein kan estimeres ut fra antall løsningsmidler tilgjengelig Hans og Lys rester23.

For å unngå variasjon i merkeutstrekninger på grunn av reagensforringelse over tid, bør kontrollen og eksperimentelle reaksjoner ideelt sett utføres på samme dag. DEPC gjennomgår rask hydrolyse når de utsettes for vann og vil forringes under lagring også, så god laboratoriepraksis og reagenshåndtering er nøkkelen. Når den ikke er i bruk, skal DEPC-lagerflasken oppbevares i en tørkeapparat.

Endringer og feilsøking
Fordi DEPC CL er en kinetisk kontrollert reaksjon, kontrolleres merkehastigheten, og dermed modifikasjonsnivået, av protein- og reagenskonsentrasjoner, merketid og temperatur. Som angitt ovenfor utføres ofte DEPC CL i 1 minutt ved 37 °C med et DEPC- til proteinmolarforhold på 4 til 1. Ved dette molarforholdet (4x) kan proteiner trygt merkes uten strukturelle perturbasjoner14. DEPC: Proteinmolarforhold som er større enn 4, kan brukes til noen proteiner, og ikke overraskende høyere DEPC-konsentrasjoner resulterer i mer omfattende merking og mer strukturell informasjon. Den sikreste måten å bruke høyere DEPC-konsentrasjoner uten perturbing struktur er å generere dose-respons tomter der reaktivitet av et protein proteolytiske fragmenter måles som en funksjon av DEPC konsentrasjon (se figur 4B)14,24. Denne tilnærmingen kan imidlertid være tidkrevende, da den krever flere målinger. Nylig demonstrerte vi at den optimale DEPC-konsentrasjonen kan estimeres for et gitt protein fra antall og SASA av Hans og Lys rester i detproteinet 23. I nyere arbeid har vi også foreslått alternative måter å vurdere at et proteinstruktur ikke blir forstyrret under CL9,24.

Proteolytisk fordøyelse er også et viktig skritt i DEPC CL-MS, da peptidene som genereres tillater en å lokalisere strukturell informasjon etter LC-MS / MS-analyse. Generelt er serinproteaser som trypsin og chymotrypsin effektive for protein fordøyelse. Trypsin er mer vanlig brukt på grunn av sin spalting effektivitet og spesifisitet på C-terminalsiden av Lys og Arg rester. Imidlertid cleave trypsin vanligvis ikke etter DEPC-merkede Lys rester, forårsaker savnet spalting på merkede Lys rester som noen ganger kan komplisere dataanalyse. Aktiviteten til chymotrypsin, som cleaves etter store hydrofobe rester, påvirkes vanligvis ikke av DEPC-merking, men dette enzymet har lavere spaltingseffektivitet og spesifisitet enn trypsin. I tillegg, for proteiner med mange hydrofobe rester, kan chymotrypsin generere flere korte peptidfragmenter som kan være vanskelige å skille og oppdage under standard LC-MS-forhold.

LC-ESI-MS/MS-analyser av proteinfordøyder krever en stabil elektrospray for å oppnå pålitelige halvkantede resultater. Kapillær og nano LC er ofte brukte separasjonsplattformer der effektiv separasjon kan oppnås med små mengder protein. Men etter vår erfaring gir kapillær LC mer pålitelig kvantitativ informasjon (dvs. modifikasjonsnivåer) enn nano LC på grunn av de høyere utvalgsmengdene som brukes. For store proteiner som fordøyes til et stort antall merkede og umerkede peptider, kan koelusjon av peptider med lignende hydrofobiskhet skje. I disse tilfellene bør lengre LC-gradienter brukes til bedre separasjoner.

Rask og effektiv MS/MS er viktig for god sekvensdekning og identifikasjon av etikettområde. Massespektrometre med quadrupole ionfeller er gode instrumenter for dette formålet. Generelt er CID en vanlig og svært effektiv metode for peptiddissosiasjon; Vi har imidlertid observert tilfeller av DEPC-etikett scrambling under CID av merkede peptidioner, noe som resulterer i tvetydighet i merking av nettstedets identitet34. I disse noe sjeldne tilfellene gir ETD informasjon som er mer pålitelig. Følgelig, om mulig, kan det være nyttig å veksle mellom begge dissosiasjonsteknikker. Fordi DEPC kan merke mange forskjellige resttyper, er det vanlig at isomerer av et gitt peptidfragment genereres som er forskjellige i sidekjeden som er modifisert. Mange ganger kan disse peptid isomers skilles av LC, selv om de har en tendens til å elute på svært like tider. Denne sannsynligheten bør vurderes ved angivelse av MS/MS-utelatelsestider under automatiserte LC-MS/MS-analyser. Vanligvis bør kortere enn vanlig utelatelsestid brukes.

Begrensninger
Mens DEPC CL-MS er enormt gunstig for å studere proteinstruktur og interaksjoner, og det er gjort betydelige fremskritt for å adressere et bredt spekter av proteinsystemer, forblir noen begrensninger i denne teknikken. Hvis merkeforholdene ikke er godt optimalisert (f.eks. ved å bruke for høy konsentrasjon av DEPC), kan overmerking perturb proteinstrukturen og resultere i unøyaktig strukturell informasjon14,23,24. I tillegg påvirkes nøyaktigheten og presisjonen til de målte modifikasjonsnivåene av flere faktorer, inkludert etiketttap hvis prøvene sitter for lenge før LC-MS-analyse og feil i de kjemiske merkingstrinnene. Konsistens i hvert eksperimentelt trinn er viktig for pålitelige resultater. Et av de mer utfordrende problemene som for tiden er knyttet til DEPC-basert CL-MS, er programvare for dataanalyse. Lett tilgjengelige dataanalyseprogrammer er ikke optimalisert for å kunne identifisere peptider med lave modifikasjonsprosenter (f.eks. < 1%). Følgelig har vi utviklet og brukt spesialisert programvare for å gjøre det mulig å identifisere peptider med lave modifikasjonsnivåerlett identifisert 18.

Selv om DEPC CL-MS kan gi moderat proteinstrukturelt oppløsning, kan ikke en detaljert 3D-struktur fås fra merkingsteknikken. Nylig er noen strukturelle prediksjonsverktøy basert på merkingsdata utviklet35,36. Imidlertid er det nødvendig med flere utviklinger for å optimalt innlemme DEPC-merkingsresultater med beregningsmodellering for å forutsi proteinstruktur.

Betydning sammenlignet med alternative metoder
Den strukturelle oppløsningen som er mulig med DEPC-basert CL-MS er moderat sammenlignet med teknikker som røntgenkrystallografi eller NMR, så det er mest hensiktsmessig å sammenligne teknikken med HDX-MS, XL-MS og andre CL-MS, eller fotavtrykk, tilnærminger. Som nevnt i introduksjonen, er CL-MS komplementær til HDX-MS fordi den gir informasjon om sidekjedene av rester i et protein, mens HDX-MS rapporterer om ryggradsstruktur og dynamikk. Denne komplementariteten gjør at de to teknikkene kan brukes sammen for å få mer strukturell informasjon, som vist av flere grupper37,38,39,40,41. En ny idé som er relevant for DEPC-basert CL-MS, er den synergistiske informasjonen som er tilgjengelig når den brukes sammen med HDX-MS22. På grunn av merketidsrammene knyttet til de to teknikkene, kan DEPC-basert CL-MS ofte avklare tvetydighet med proteinregioner som gjennomgår redusert HDX. Redusert HDX kan oppstå enten ved redusert tilgjengelighet av løsemidler på grunn av binding eller redusert proteindynamikk. DEPC-reaksjoner er iboende 2-3 størrelsesordener langsommere enn HDX-reaksjoner, så DEPC-merking påvirkes i stor grad ikke av endringer i proteindynamikken så lenge de ikke ledsages av endringer i løsningsmiddeltilgjengelighet.

CL-MS har noen fordeler i forhold til HDX-MS-eksperimenter ved at etikett scrambling og etiketttap er minimale når passende forholdsregler tas. I HDX-eksperimenter er etiketttap eller tilbakeutveksling en standardfunksjon i teknikken, og raske fordøyelser og LC-separasjoner ved lav pH er forsøk på å minimere dette problemet. Det er imidlertid viktig å erkjenne at back exchange-problemet motvirkes av det høyere antallet merkede nettsteder som vanligvis måles i HDX-MS. Merking av scrambling er et større problem i HDX-MS fordi feil informasjon da vil bli innhentet, så analysebetingelser må optimaliseres for å minimere dette problemet.

XL-MS og CL-MS har lignende fordeler med hensyn til etiketttap og scrambling, da begge involverer dannelsen av en kovalente binding som er robust nok til å forbli under fordøyelsen og LC-MS-analyser. Sekvensering og identifisering av krysskoblede peptider er imidlertid mer utfordrende enn for kovalente peptider, som krever bruk av spesialisert programvare. En viktig fordel som XL-MS har over CL-MS er dens evne til å gi avstandsbegrensninger, noe som kan være verdifullt når man forutsier eller innsnevrer mulige proteinstrukturer. CL-MS-data har blitt brukt til å lette proteinstrukturprediksjon36,42,43, men dette området krever mer arbeid for å nå sitt potensial fullt ut.

Sammenlignet med andre CL-MS-metoder, inkludert de som bruker spesifikke eller ikke-spesifikke merkingsreagenser, har DEPC noen fordeler og ulemper. Som metoder som bruker aminosyrespesifikke reagenser, er DEPC-merking grei; reagenset trenger bare å legges til utvalget av interesse. Denne enkelheten står i kontrast til metoder som rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) eller synkrotronbasert HRF som krever sofistikerte lyskilder for å produsere hydroksylradikaler. I motsetning til metoder som bruker spesifikke reagenser, kan DEPC merke seks forskjellige aminosyrer og N-terminus, slik at den kan gi høyere strukturell oppløsning. Antallet rester som kan merkes av DEPC er imidlertid færre enn antallet som kan oksideres av hydroksylradikaler, slik at den strukturelle oppløsningen som kan oppnås ved DEPC-basert CL-MS, er lavere. En praktisk forgrening av færre rester som merkes av DEPC er at bruk av reagenset noen ganger ikke gir all ønsket strukturell informasjon, og at den kan dra nytte av å bli brukt sammen med andre merkingsreagenser. Vi har nylig demonstrert verdien av å bruke DEPC sammen med reagensparet 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC)/glycin etyl eter (GEE), som kan merke glutamat og aspartatrester19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner støtte fra National Institutes of Health (NIH) under Grant R01 GM075092. Thermo Orbitrap Fusion massespektrometer som brukes til å skaffe noen av dataene som er beskrevet her, ble anskaffet med midler fra National Institutes of Health grant S10OD010645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Tags

Kjemi Utgave 172 Massespektrometri kovalente merking protein høyere ordensstruktur protein-ligandkomplekser proteinkomplekser dietylpyrokarbonat løsningsmiddeltilgjengelig overflateareal
Kovalent merking med Diethylpyrokarbonat for å studere protein høyere orden struktur ved massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, … More

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter