Summary
質量分析検出を用いてジエチルピロカーボネートベースの共有標識を行うための実験的手順について説明する。ジエチルピロカーボネートは、単に目的のタンパク質またはタンパク質複合体と混合され、溶媒にアクセス可能なアミノ酸残基の修飾につながる。修飾残基は、タンパク質分解と液体クロマトグラフィー/質量分析分析の後に同定することができる。
Abstract
タンパク質の高次構造を特徴付けて、その機能を理解するためには不可欠です。質量分析(MS)は、特に従来の方法では研究が困難なタンパク質系に対して、この目的のための強力なツールとして登場しました。MSによるタンパク質の構造を研究するために、タンパク質の構造情報をその質量にコードする溶液中で特定の化学反応が行われます。特に効果的なアプローチの1つは、溶媒のアクセス可能なアミノ酸側鎖を共有的に修飾する試薬を使用することです。これらの反応は、タンパク質分解性消化およびタンデム質量分析と組み合わせると残留レベルの分解能に局在化できる質量増加を招く。ここでは、MS検出と共に共有標識試薬としてのジエチルピロカーボネート(DEPC)の使用に関連するプロトコルについて説明する。DEPCは、平均タンパク質中の残基の30%まで標識することができる高い電気電子分子であり、それにより優れた構造分解能を提供する。DEPCはMSと共に、β2-ミクログロブリンなどの小さな単一ドメインタンパク質の構造情報をモノクローナル抗体などの大きな多ドメインタンパク質に対して得るのに成功しています。
Introduction
タンパク質は、事実上すべての生理学的プロセスにおいて不可欠な生体分子です。タンパク質が採用する構造と他の生体分子との相互作用のために、タンパク質が果たす様々な機能が可能です。タンパク質の機能を深く理解するためには、これらの重要な構造特徴と相互作用を解明するために生化学的および生物物理学的ツールが必要です。従来、X線結晶学、極低温電子顕微鏡、核磁気共鳴(NMR)分光法は、タンパク質構造を明らかにするために所望の原子レベルの詳細を提供してきました。しかし、結晶化の挙動、タンパク質の入手可能性の制限、過剰なサンプルの不均一性、分子量の制限など、これらの手法では、多数のタンパク質システムを問い合せることはできません。その結果、これらの制限を克服する新しい分析方法が登場しました。タンパク質の構造情報を提供できる新たな技術の中には、質量分析があります。
質量分析(MS)は分子の質量電荷(m/z)比を測定するため、所望の構造情報をタンパク質の質量にコードすることにより、タンパク質の高次構造情報を取得する必要があります。この情報をコード化するためのいくつかのアプローチは、水素重水素交換(HDX)1、2、3、4、化学架橋(XL)5、6、および共有結合標識(CL)7、8、9、10を含む開発された。HDXでは、溶媒の入手可能性とH結合の範囲に依存する速度でわずかに大きい重水素によって、骨格アミド水素が交換されます。HDXの範囲は、タンパク質をペプチド断片に素早く消化してから、質量分析計でこれらの断片を分離して測定するか、またはトップダウン実験でタンパク質を解離することによって局在化することができる。交換速度を決定することで、タンパク質のダイナミクスに関するさらなる洞察が得られます。HDXは、バック交換に伴う課題や、再現性を最大限に高める特殊な機器の必要性にも関わらず、タンパク質構造を特徴付けるための貴重なツールであることが証明されています。XL-MSでは、タンパク質は、特定のタンパク質内または2つのタンパク質間で隣接する残基側鎖を共有結合する二機能性試薬と反応する。その際、XL-MSは、タンパク質構造を特徴付けるために使用できる距離制約を提供することができます。架橋されたタンパク質の領域は、タンパク質分解消化と続く液体クロマトグラフィー(LC)-MS分析によって同定することができる。XL-MSは、細胞内を含む様々なタンパク質複合体を研究するために使用されてきた汎用性の高いツールですが、XL製品の同定は困難であり、特殊なソフトウェアが必要です。
CL-MSは、タンパク質の構造と相互作用を研究するための補完的で、時には代替MSベースのツールとして最近登場しました。CL-MSにおいて、タンパク質またはタンパク質複合体は、溶媒暴露側鎖と反応し得る単一機能試薬で共有修飾される(図1)。異なる条件下でタンパク質またはタンパク質複合体の修飾範囲を比較することにより、立体構造変化、結合部位、およびタンパク質-タンパク質のインターフェースが明らかになる。CL反応後、部位特異的情報は、多くの場合、単一アミノ酸レベルで、タンパク質がタンパク質分解され、ペプチド断片がLCによって分離され、改変部位がタンデムMS(MS/MS)を使用して同定される典型的なボトムアッププロテオミクスワークフローを使用して得ることができる。バイオコンジュゲート化学の豊富な歴史により、CL-MS実験に数多くの試薬が利用可能になりました。CL試薬は、(i)特異的および(ii)非特異的の2つの一般的なカテゴリーに分類される。特定の試薬は、単一の官能基(例えば、遊離アミン)8、10と反応し、実装が容易であるが、それらは限られた構造情報を提供する傾向がある。非特異的試薬は、広範囲の側鎖と反応しますが、多くの場合、これらの反応性の高い種を生成するためにレーザーやシンクロトロン源などの特殊な機器が必要です。ヒドロキシルラジカルは、最も一般的に使用される非特異的試薬であり、ヒドロキシルラジカルフットプリント(HRF)7、11、12、13実験を行い、様々な条件下で幅広いタンパク質およびタンパク質複合体を研究した。
我々の研究グループは、CL-MS実験14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25の文脈におけるタンパク質構造および相互作用を研究するために、ジエチルピロカーボネート(DEPC)と呼ばれる別の比較的非特異的な試薬を使用することに成功した。DEPCは、特定の標識試薬のシンプルさを提供し(すなわち、反応を行うために特別な装置は必要ありません)、一方で、平均タンパク質中のアミノ酸の最大30%と反応します。高い電気反応試薬として、DEPCはシステイン、ヒスチジン、リジン、チロシン、セリン、スレオニン残基のN末端および求核側鎖と反応することができる。典型的には、これらの反応の単一の産物が生成され、結果として72.02Daの質量増加が生じる。この単一タイプの製品は、タンパク質がヒドロキシルラジカルと反応するときに生成することができる最大55種類の製品と対比する7。このような単純な化学は、標識された部位の同定を容易にする。
ここでは、DEPCベースのCL-MSを用いてタンパク質の構造と相互作用を研究するためのプロトコルを提供します。試薬調製、DEPC-タンパク質反応、タンパク質消化条件、LC-MSおよびMS/MSパラメータ、およびデータ分析に関連する詳細が記載されています。また、タンパク質-金属、タンパクリガンド、タンパク質-タンパク質相互作用、加熱時に構造変化を起こしているタンパク質の結果の例を提供することで、DEPC標識の有用性を実証します。
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Protocol
1. タンパク質および試薬の調製
注: このプロトコルには、DEPC でタンパク質を標識するワークフローの例が含まれています。一部の条件および試薬濃度は、選択したタンパク質に基づいて異なる場合があります。
- 1.5 mLマイクロ遠心チューブですべての試薬溶液を調製します。
- pH 7.4で所望の濃度のタンパク質溶液を、通常は数十μMの範囲で10 mM 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)緩衝液で調製します。あるいは、サンプルにDEPCで反応性となる求核バッファーが含まれている場合は、10 mM pH 7.4 MOPS でバッファー交換既存のタンパク質溶液を調製します。他の緩衝剤(例えば、リン酸緩衝食塩基)も、求核性官能基を有しないものであれば使用することができる。
- 1.45 μLのストック6.9 M DEPC溶液をACNの98.55 μLにピペット処理して、乾燥アセトニトリル(ACN)に100 mM DEPC溶液を調製します。
注:すべてのタンパク質で動作する濃度のセットはありませんが、最適な濃度は、HisとLys残基の数に基づいて推定することができます23.例えば、50μM β2マイクログロブリン溶液の50μLで、100mM DEPCの0.2 μLでタンパク質を反応させて、最終的なDEPC濃度200μM(4倍のタンパク質濃度に等しい)を用いて、この一般的な例を用いて所望のモル比を確保する(表1)。DEPC標識は2次 反応であるため、反応混合物中のタンパク質またはDEPCの濃度を変化させると、標識速度が変化する。 - 10 mgのイミダゾールを計量し、146.9 μLのHPLC級水に溶解して、1 Mイミダゾール溶液を調製します。
2. インタクトタンパク質のコバレント標識
- 水浴温度を37°Cに設定し、お風呂が安定した温度に達するのを待ちます。
注: 例示のラベル付けプロトコルの試薬濃度と容積は 、表 1に記載されています。 - 新しいマイクロ遠心管で、 表1に記載されているボリュームにMOPSバッファーとタンパク質溶液を混ぜ合わせる。
- タンパク質とバッファーに、DEPC溶液の0.2 μLを加え、得られた溶液を適切に混合し、その後、反応混合物を含むチューブを37°Cの水浴に1分間入れます。
注:ACNの添加量は、標識反応中にタンパク質の構造が摂動するのを避けるために、全反応量の1%を超えてはならない。反応時間はユーザまでであり、例条件下での1分間の反応は、DEPC14の過剰標識および電位加水分解を最小限に抑える。 - 1分後、水浴から反応混合物を含むチューブを取り出し、1Mイミダゾール溶液の1μLで反応を焼き付け、残りの未反応DEPCを清掃する。
注:反応混合物中のイミダゾールの最終濃度は、反応混合物中のDEPCの濃度の50倍に等しくする必要があります。これにより、残りの未反応 DEPC が清掃されます。
3. ボトムアップLC-MS用タンパク質消化の調製
注: 目的のタンパク質に適した消化条件を選択してください。一般的なステップは、タンパク質を展開し、任意の二硫化物結合を減少させ、アルキル化することを含む。
- 反応混合物に適当な展開試薬を加えてタンパク質を展開する。
注:一般的な展開剤には、ACN、尿素、グアニジン塩酸塩(GuHCl)が含まれます。 - トリス(2-カルボクセチル)ホスフィン(TCEP)とヨウオアセトアミド(IAM)の溶液をそれぞれ5mgの計量し、10mM pH 7.4 MOPSバッファーの174.4および270.3 μLの新しいマイクロ遠心チューブに溶解して、還元およびアルキリエーションステップの手順を調製します。
- 反応混合物に2μLの100 mM TCEP(反応混合物中の2mMの最終濃度)溶液を加え、室温で3分間反応させることにより、二硫化結合を低減します。
注: TCEP の最終的な濃度は、溶液中に存在する二硫化物結合あたりのタンパク質濃度の 40 倍に等しいはずです。 - アルキル酸は、100 mMのIAM溶液(反応混合物中の4 mMの最終濃度)を暗い中で30分間4μLで減少させたシステインを減少させた。IAMは光に敏感で、直接光の下で分解します。
注: 溶液中の IAM の最終的な濃度は、TCEP に使用される濃度の 2 倍、つまり、200% の結合あたりのタンパク質濃度の 80 倍である必要があります。 - トリプシンやキモトリプシンなどの適切な酵素でタンパク質を消化します。300ストローク/分の揺れ速度で固定化酵素を用いた37°Cでの3時間消化に対する10:1タンパク質:酵素比は、通常、DEPC標識タンパク質に十分である。「ディスカッション」を参照してください。
- 消化後、消化したペプチドから固定化した酵素を12,000rpmで5分間遠心分離して分離する。
- サンプルをLC-MS/MSで直ちに分析するか、液体窒素でサンプルをフラッシュフリーズして、サンプルの劣化とラベルの損失を最小限に抑えます。フラッシュ冷凍サンプルは、LC-MS/MS分析の準備ができるまで、< -20 °Cで保管してください。
4. LC-MS/MS分析
注: ボトムアッププロテオミクスの標準 LC-MS/MS パラメータを使用して、タンパク質分解ペプチドフラグメント上の標識部位を同定することができます。一般的な例を以下に示します。
- 逆相C18定常相を用いてDEPC標識ペプチドを分離する。典型的なLC移動相の2つの溶媒を使用する:(A)水+0.1%のギ酸および(B)ACN+0.1%のギ酸を使用して、勾配(例えば、 図2)を使用してペプチドの最良の分離を達成する。
注:分離時間はサンプルの複雑さに基づいて最適化することができ、移動相流量は毛細管またはナノLCが使用されているかどうかによって異なります。 - オンラインLC-MSおよびMS/MSを行うことができる質量分析計を使用して、ペプチド上のDEPC修飾部位を同定する。我々の実験では、質量分析計のいくつかのタイプを使用することに成功しました。LC-MS分析の過程で多くのペプチドのMS/MSを自動的に実行できる質量分析計は、適切であるべきです。関連するMSパラメータには、ESIソース電圧= -4000 V(通常のESI用)が含まれます。ナノスプレー用-2000 V;軌道上解像度 = 60,000;動的除外期間 = 30 s;MS/MS アクティベーション タイプ: CID、ETD、またはその両方。質量スキャン範囲 = 200-2,000;自動ゲイン制御 = 4.0E5 (オービトラップの MS1)および 5.0E4 (線形四重極イオントラップの MS2)
- 消化された標識タンパク質サンプルをLCシステムにロードして注入し、LC-MS/MSの取得を開始します。サンプルがフラッシュ凍結されている場合は、分析前に解凍します。過度の塩がESI源に入るのを避けるために、LCの排水を最初の5分間無駄にします。
注意:5 μLの注入ループは一般に利用され、およそ2.5 μgのタンパク質をLC-MS/MSに注入することを可能にします。これは、サンプルインジェクタを詰まらせないように、LCの負荷条件に依存する。
5. データ分析
- 使用する質量分析計に適したソフトウェアを使用して、DEPCラベル部位を特定し、ペプチドピーク領域を定量化します。
- DEPC添加(72.02 Da)およびカルバミドメチル化(57.02 Da)を可変的な変更として含める。MS/MS 分析の追加の検索パラメーターは次のとおりです: 最大切断を逃した = 3;フラグメントイオンタイプ = bおよびy;前駆体 m/z 許容値 = 10 ppm (四重極イオントラップ質量分析計を使用する場合、この値は高くなる必要があります)。フラグメント m/z 許容値 = 0.5 Da (製品イオンスキャンに高解像度の質量分析計を使用する場合、この値は低くなる必要があります)。前駆体電荷 = 1-4.
注: 異なるデータベース検索アルゴリズムは、異なるスコアリングシステムを持っており、多くは、変更レベルが低い可能性があるため、DEPC修飾ペプチドを識別することが困難な場合があります。スコアカットオフを調整することは、より多くの標識ペプチドを同定するために必要である場合がある。その場合は、MS/MSデータの手動による問い合わせを使用して、低スコアペプチドを検証する必要があります。加水分解されたDEPCが求核側鎖に対して反応性を持たなくなったため、DEPCラベルの加水分解の産物はデータ検索に含まれない。 - ペプチドの修飾および未改変バージョンのクロマトグラフィーピーク領域を使用して、残基レベルの改変率を決定します。
注: 対象の修飾残基を含むペプチドは考慮する必要があり、含まれるすべての電荷状態は、すべての測定サンプルに存在する必要があります。異なるイオン化効率を有し、異なる時間に溶出するペプチドは、この値が特定の部位の修飾の絶対的尺度ではなく相対的なものである。
ここで、A,zは 、対象の残基を含む任意のペプチド(i)のピーク面積を表し、すべての検出された電荷状態(z)を考慮します。 - 統計的評価を使用して、コントロールと実験サンプルの間のラベリングの変化が有意かどうかを判断します。各サンプルの3つの反復測定が典型的であり、t検定は95または99%の信頼区間で最も一般的に利用される。
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Representative Results
DEPC 変更サイトと変更率の特定
共有結合標識による質量付加は、(a)インタクトタンパク質及び(b)ペプチドレベル8,9で測定することができる。無傷レベルでは、標識数の異なるタンパク質種の分布を、直接分析またはLC-MSの標識タンパク質サンプルから得ることができます。より高い分解能構造情報(すなわち、部位特異的標識データ)を得るためには、測定はペプチドレベルで行わなければならない。標識および焼入段階の後、標識されたタンパク質はボトムアッププロテオーム分析(すなわち、ジスルフィド還元、アルキル化、タンパク質分解、およびLC-MS/MS)に供される。図3は、DEPC標識部位が同定され、それらの修飾レベルがタンパク質β−2-ミクログロブリン(β2m)21に対するDEPC CL-MS実験に対して計算される方法を示す。MS/MSは、標識されたペプチドを配列し、DEPC標識部位を特定するために使用され、改変率は抽出されたイオンクロマトグラムの相対的なピーク領域から計算されます(図3Aを参照)。
DEPC CL-MSを用いたタンパク質表面マッピング
タンパク質トポロジーと標識率の関係のために、DEPCはタンパク質の高次構造(HOS)の変化を研究し、タンパク質相互作用部位8,9を同定するために用いられてきた。その一例が、β2mの構造に対するCu(II)結合の効果です。非結合β2mおよびCu(II)結合β2m(b2m−Cu)からのペプチド断片のDEPC修飾率係数は、DEPC濃度を変化させ、2次運動プロット14,24を生成することによって測定することができる(表2)。β2m-Cuの残基のDEPC反応性は、His31、Ser33、およびThr4の有意な標識率変化を明らかにし、異なるHis残基を含む他の部位は統計的に変化しない。これらのデータは、His31は、他のβ2mの残基ではなく、His31(すなわち、Ser33)の近傍およびN末語(すなわち、Thr4)の近傍(図4)14、26、27の近くで構造変化を引き起こすCuと結合するという事実と一致している。
HOS の変更を識別するための DEPC CL-MS
MS検出によるDEPC標識は、HOSのタンパク質変化を特徴付けるための貴重なツールでもあり、これは現在、医薬品市場28の中で最も急速に成長しているセグメントであるタンパク質治療薬にとって重要な意味を持つ。DEPC CLは、熱および酸化ストレス18の際に構造変化を起こす特定のタンパク質領域を同定できる。β2mが熱ストレスにさらされた後、標識範囲の有意な減少を受ける多くの残基(N末端、Ser28、His31、Ser33、Ser55、Ser57、Lys58)がタンパク質の片側に集積し、タンパク質のこの領域がコンフォメーション変化またはおそらくメディア凝集を受けることを示唆している(図5A)。これらの残基に加えて、タンパク質が酸化ストレスにさらされた後、標識の減少を伴う他の残基(Ser11,His13,Lys19,Lys41,Lys94)は、他の面のタンパク質上にクラスターを形成し、酸化誘導構造変化が他の場所で起こることを示す(図5B)。我々のグループからの他の研究はまた、DEPC CL-MSが検出し、熱ストレスモノクローナル抗体治療20の立体構造変化の部位を同定できることを示している。
DEPC CL-MSはタンパク質とタンパク質の相互作用を研究する
アミロイド形成タンパク質のタンパク質相互作用部位および凝集インターフェースに関する洞察は、DEPC標識を用いて得ることができる。オリゴマー形成時の残基の修飾レベルの低下は、結合インターフェースを明らかにすることができる。DEPC CL-MSは、Cu(II)15,16,26でアミロイド形成を始めた後、透析関連アミロイド症29においてアミロイドを形成するタンパク質であるβ2mのアミロイド前オリゴマーを特徴付けるために使用された。β2mモノマーのDEPC反応性をCu(II)を添加した後に2時間形成されたアミロイドβ2m前ダイマーと比較すると、9個の残基が標識の減少を受け、6つの残基は標識の変化またはわずかな増加を受けがないことを示している(図6A)。これらの変化をβ2m上でマッピングした後、ダイマー界面がβ2mモノマーのABED βシートを含むのは直ちに明らかである(図6B)15。
DEPC CL-MSはタンパク質-リガンド結合を研究する
タンパク質へのリガンド結合は、リガンドと相互作用する残基の溶媒のアクセス可能性の低下をもたらし、DEPCベースのCL-MSを使用してタンパク質上のリガンド結合部位を同定することができる。例えば、アミロイド形成条件下でβ2m上のエピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)の結合部位は、EGCG結合によって埋没した残基におけるDEPC標識の有意な減少によって同定することができる。ECGCの存在下では、Lys6およびLys91はDEPC修飾率が低く(図7)、これらの残基はタンパク質の1つの領域に集結し、リガンド結合による残基保護を示す。一方、N末語、Thr4、およびHis31は、ECGCによる構造変化を示す標識範囲の増加を受け、β2m(N末語およびHis31)14、30、31のCu(II)結合部位がECGC結合32の結果として破壊される可能性があることを示唆している。また、β2mアミロイド形成の他の2つの低分子阻害剤の結合部位は、リファマイシンSVおよびドキシサイクリン、CL-MS19を用いて同定されている。しかし、本研究では、DEPC標識だけで結果が十分な構造分解能を有する結合部位をマッピングするには不十分であった。3種類のCL試薬、すなわちDEPC、BD、および1-エチル-3-(ジメチルアミノ)プロピル)カルボジイミド-グリシンエチルエステル(EDC/GEE)ペアの結果は、結合部位19をより正確に特定するために必要であった。
構造分解能の向上とラベルスクランブリングの削減
DEPC標識は共有結合の形成を引き起こしますが、加水分解によるラベル損失は特にSer、Thr、Tyr残基に対して起こり得る(図8)。標識損失は、一晩の消化ではなく、短時間のタンパク質分解酵素(例えば、固定化酵素による2時間の消化)を用いてDEPC CL反応とLC-MS分析の間の時間を短縮することによって最小限に抑えることができます。高速消化により、より多くの修飾残基が測定され、タンパク質の構造情報の量が増加します。例えば、固定化されたキモトリプシンを用いた2時間の消化は、β2m(図9)17におけるより多くのDEPC修飾残基の同定を一貫して導く。β2mのSer、Thr、Tyr、His、およびLys残基の約75%の一晩消化を用いて検出されるが、2時間消化を用いて標識とLC-MSの間の時間が短縮されると、β2m中の残基の95%が検出される。新たに検出された改変残基のほとんどは、加水分解を起こしやすいTyrおよびThr残基である。
DEPCとの研究の過程で、一部のタンパク質では、DEPC標識反応中に二硫化結合がそのままであるにもかかわらず、二硫化結合からのCys残基がDEPCによって修飾されている点に気付いた。このようなCys残基の標識は、遊離チオールが溶液中の他の修飾残基(図10)と反応し得るため、カルベスオキシ基がCys残基に転化されるにつれていわゆる「標識スクランブル」を招くため生じる。標識スクランブルは他の残基での修飾レベルを減少させ、不正確なタンパク質構造情報を提供する。ラベルスクランブルを避けるために、遊離Cysチオールは、ジスルフィド還元33の直後に完全にアルキル化されなければならない。
図1:共有ラベル質量分析(CL-MS)単一機能試薬は、溶媒にアクセス可能なアミノ酸を修飾するために使用され、タンパク質における立体構造の変化または相互作用の相互作用に関する部位固有の情報を提供するために使用することができる(上と下のイメージ)。修飾タンパク質はタンパク質分解的に消化され、得られたペプチドはMSおよびタンデムMS(MS/MS)と組み合わせて液体クロマトグラフィー(LC)によって分析されます。図は、リンピキラティ、P.、劉、T.、バシェ、R.W.共有ラベル質量分析からタンパク質構造と相互作用を研究するために適応されています。メソッド 144、79-93 (2018)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 使用されるボリューム(μL) | 溶液中の濃度(μM) | |
| タンパク質(100 μM、MOPS) | 50 | 50 |
| モップ (10 mM、 pH 7.4) | 48.8 | 該当する |
| デPC (100 mM) | 0.2 | 200 (=4x[タンパク質]) |
| イミダゾール (1 M) | 1 | 10,000 (=50x[DEPC]) |
| 総ボリューム | 100 |
表 1. 一般的な DEPC ラベルプロトコル。
図 2.ペプチドの分離のためのLC勾配例。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3 DEPC ラベル付きサイトを識別し、それらの修正レベルを計算する方法の図。DEPC標識およびタンパク質分解消化後、(A)消化されたタンパク質のLC-MS分析が行われる。クロマトグラムにおける(B)標識なし及び(C)標識ペプチドのピーク領域は、標識率を計算するために使用される。LC-MSの間、ペプチドはCID MS/MS.タンデム質量スペクトルを非標識化し、(E)および(F)特異的な保持時に得られた標識ペプチドの質量スペクトルを、ペプチドシーケンシングおよびDEPC標識部位の同定に使用される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 残り | b2m | b2m-Cu |
| Thr4 | 0.082 ± 0.004 | 0.052 ± 0.009 |
| His13 | 0.041 ± 0.003 | 0.033 ± 0.005 |
| His31 | 0.010 ± 0.001 | 0.003 ± 0.001 |
| セル33 | 0.010 ± 0.002 | 0.004 ± 0.001 |
| His51 | 0.036 ± 0.003 | 0.030 ± 0.004 |
| セル88 | 0.029 ± 0.007 | 0.020 ± 0.006 |
表 2Cu(II)の不在と存在下でのb2mに対するサイト固有のDEPC修飾率係数(k,M-1s-1)。
図 4 DEPC CL-MSを用いて、β2mの構造に対するCu(II)結合の影響を決定する:(A)DEPC標識率(青)の有意な減少を有する残基のタンパク質表面マッピング、Cu(II)結合時の溶媒のアクセス可能性の変化、および標識率(マゼンタ)に有意な変化を有しないもの(PDBアクセオンコード1JNJ)。(B)例えば、Cu(II)の存在下および不在中のDEPCの異なる濃度とのβ2mの反応の部位特異的な2次運動プロット。標識率係数(k)は、運動プロットの傾きから得ることができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5ストレス対天然β2mの共有結合標識結果:(A)熱ストレス- 24時間の75°Cで加熱し、(B)酸化ストレス -3%H2O2で24時間。修飾パーセンテージの有意な変化は青(標識の減少)と赤色(標識の増加)で示され、有意な標識変化のない残基は淡い緑色(PDB加盟コード1JNJ)で示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6DEPC CL-MSを用いて、β2mのアミロイド前ダイマーのダイマー界面を決定する:(A)モノマー中の改変残基に対するDEPC修飾レベルの変化の概要(すなわち、t=0)およびCu(II)を加えた後のダイマー2時間。標識範囲が著しい減少する残基は、アスタリスク (*) で示されます。(B)β2m構造上にマッピングされた共有ラベル化結果。標識が減少した残基は青色で示され、標識の変化やわずかな増加のない残基は赤で示されます(PDB加盟コード1LDS)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7 EGCG バインド対非バインド b2m の共有ラベルの結果。表示された残基に対するDEPC修飾率が示されている。共有ラベルの割合の統計的に有意な差は、アスタリスク(*)で示されます。ECGC結合時の標識の増加は赤で示され、減少は青色で示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8DEPC共有標識反応(求核アシル置換)および標識損失(カルベトキシ化残基の加水分解)は 、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9 β2m上の測定された改質部位のマッピング。(A)従来の一晩消化後の標識部位、および(B)固定化キモトリプシンによる2時間消化後の標識部位。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 10DEPCラベルスクランブル(カーベトキシル化Hisのサイキャプチャ)の仮説メカニズムは、 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
重要なステップ
実験計画に関するいくつかの点を考慮して、信頼性の高いラベル作成結果を確保する必要があります。まず、タンパク質標識を最大化するためには、DEPCと反応して標識の程度を低下させることができるため、強い求核基(例えば、Tris)を有する緩衝液を避ける必要がある。また、このようなバッファーが標識残基と反応し、ラベルの除去を引き起こし、したがって構造情報の損失を引き起こす可能性もあります。MOPS はバッファとして推奨しますが、リン酸緩衝生理食塩分も同様に機能します。第二に、ジチオスレイトールは、この試薬中の遊離チオールが標識残基と反応し、DEPC修飾を除去することができるので、ジスルフィド結合の減少のために避けるべきである。この同じ化学は、遊離Cysがタンパク質内標識スクランブル33を引き起こす可能性があるため、ジスルフィドをアルキル化することが不可欠である理由である。第三に、イミダゾール(プロトコルステップ2.4)を用いたクエンチステップは、残りのDEPCがタンパク質と反応し続けることができないように標識反応を停止するために重要である。
また、DEPC標識反応が2番目のオーダーであることを理解することも重要であり、タンパク質またはDEPC濃度のいずれかを変更すると、標識の程度に影響を与えることを意味します。我々は、4:1 DEPC:タンパク質濃度比が、タンパク質が10のμM範囲に濃度を有する場合に妥当な値であることを実証的に発見した。しかし、最適なDEPC:タンパク質濃度比は、タンパク質依存性と濃度依存性を備えており、タンパク質によっては十分な標識を達成するために高い比率が必要です。所定のタンパク質の標識の構造摂動を最小限に抑えるための最適なDEPC濃度は、可利用性の溶媒の数から推定することができる彼およびLys残基23。
時間の経過に伴う試薬の劣化による標識の程度の変動を避けるために、制御および実験的反応は理想的には同じ日に行われるべきである。DEPCは、水にさらされると急速な加水分解を受け、貯蔵中も劣化するため、ラボ実習と試薬の取り扱いが重要です。使用しない場合は、DEPCストックボトルはデシケータに保管する必要があります。
変更とトラブルシューティング
DEPC CLは、キネチカルに制御された反応であるため、標識速度、並びに修飾レベルは、タンパク質および試薬濃度、標識時間、および温度によって制御される。上記に示されるように、DEPC CLは、DEPC対タンパク質モル比が4〜1の37°Cで1分間行われることが多い。このモル比(4x)では、タンパク質は構造的摂動14を伴わずに安全に標識することができる。DEPC:4より大きいタンパク質モル比は、一部のタンパク質に使用することができ、そして驚くほど高いDEPC濃度は、より広範な標識とより多くの構造情報をもたらす。摂動構造を伴わない高いDEPC濃度を使用する最も安全な方法は、タンパク質のタンパク質分解断片の反応性をDEPC濃度の関数として測定する用量応答プロットを生成することです(図4B)14,24を参照してください。 ただし、この方法は複数の測定を必要とするため、時間がかかる場合があります。最近、そのタンパク質23中のHisおよびLys残基の数およびSASAから所定のタンパク質に対して最適なDEPC濃度を推定できることを実証した。最近の研究では、CL9,24の間にタンパク質の構造が摂動されないことを評価する別の方法も提案している。
生成されるペプチドは、LC-MS/MS分析後に構造情報を局地化することを可能にするため、タンパク質分解酵素消化はDEPC CL-MSの重要なステップでもあります。一般に、トリプシンやキモトリプシンなどのセリンプロテアーゼは、タンパク質消化に有効です。トリプシンは、LysおよびArg残基のC末端側における切断効率および特異性のためにより一般的に使用される。しかし、トリプシンは通常、DEPC標識Lys残基の後に切断せず、データ分析を複雑にする可能性のあるラベル付きLys残基で切断を逃す原因となる。嵩高い疎水性残基の後に切断するキモトリプシンの活性は、典型的にはDEPC標識の影響を受けませんが、この酵素はトリプシンよりも切断効率と特異性が低い。さらに、多数の疎水性残基を有するタンパク質に対して、キモトリプシンは、標準的なLC-MS条件下で分離して検出することが困難ないくつかの短いペプチド断片を生成することができる。
タンパク質のLC-ESI-MS/MS分析では、信頼性の高い半定量的な結果を得るために安定したエレクトロスプレーが必要です。毛細管およびナノLCは、少量のタンパク質で効率的な分離を得ることができる分離プラットフォームとして一般的に使用されています。しかし、我々の経験では、キャピラリーLCは、使用されるサンプル量が多いため、ナノLCよりも信頼性の高い定量情報(すなわち、修正レベル)を提供します。大量の標識ペプチドおよび標識されていないペプチドに消化される大きなタンパク質の場合、同じような疎水性を有するペプチドの溶結が起こり得る。このような場合、より良い分離のために長い LC 勾配を使用する必要があります。
高速かつ効率的な MS/MS は、良好なシーケンス カバレッジとラベル サイトの識別に重要です。四重極イオントラップを備えた質量分析計は、この目的のための優れた機器です。一般的に、CIDはペプチド解離のための一般的かつ非常に効果的な方法です。しかしながら、標識されたペプチドイオンのCID中にDEPC標識スクランブルが行われた場合を観察し、標識部位アイデンティティ34において曖昧性を生じる。このようなややまれなケースでは、ETDはより信頼性の高い情報を提供します。したがって、可能であれば、両方の解離技術を交互に使用すると便利です。DEPCは多くの異なるタイプの残基を標識することができるので、修飾された側鎖で異なる特定のペプチド断片の異性体が生成されるのが一般的である。多くの場合、これらのペプチド異性体はLCによって分離され得るが、それらは非常に類似した時期に溶出する傾向がある。自動 LC-MS/MS 分析中に MS/MS 除外時間を設定する場合は、この可能性を考慮する必要があります。通常、通常の除外時間よりも短い時間を使用する必要があります。
制限
DEPC CL-MSはタンパク質の構造と相互作用を研究するのに非常に有益であり、多種多様なタンパク質系に対処するために大きな進歩が見られましたが、この技術のいくつかの制限が残っています。標識条件が十分に最適化されていない場合(例えば、DEPCの濃度が高すぎる場合)、オーバー標識はタンパク質構造を乱し、不正確な構造情報14、23、24をもたらす。さらに、測定された修正レベルの精度と精度は、LC-MS 分析の前にサンプルが長く座っている場合のラベル損失や化学標識ステップのエラーなど、いくつかの要因によって影響を受けます。各実験ステップの一貫性は、信頼性の高い結果を得るには重要です。現在 DEPC ベースの CL-MS に関連する、より困難な問題の 1 つに、データ分析ソフトウェアがあります。容易に入手可能なデータ分析プログラムは、低修飾率(例えば、1%<)のペプチドを正常に同定するために最適化されていません。その結果、我々は、18を容易に識別するために、低修飾レベルのペプチドを可能にする特殊なソフトウェアを開発し、使用しました。
DEPC CL-MSは適度なタンパク質構造分解能を提供できますが、標識技術から詳細な3D構造を得ることはできません。最近、ラベリングデータに基づく構造予測ツールの一部が35,36に開発されました。しかし、DEPC標識結果を計算モデリングと組み合せ、タンパク質構造を予測するためには、より多くの開発が必要です。
代替方法と比較した意義
DEPCベースのCL-MSで可能な構造分解能は、X線結晶学やNMRなどの技術と比較すると中程度であるため、この技術をHDX-MS、XL-MS、およびその他のCL-MS(フットプリント)アプローチと比較するのが最も適切です。導入で述べたように、CL-MSはタンパク質中の残基の側鎖に関する情報を提供するのに対し、HDX-MSは骨格構造とダイナミクスに関する報告を行うため、HDX-MSと相補的である。この相補性により、いくつかのグループ37、38、39、40、41によって示されているように、2つの技術を一緒に使用してより多くの構造情報を得ることができます。DEPC ベースの CL-MS に関連する新しいアイデアは、HDX-MS22と組み合わせて使用されるときに利用できる相乗的な情報です。2つの技術に関連する標識タイムフレームのために、DEPCベースのCL-MSは、HDXが減少したタンパク質領域とのあいまいさを明確にすることが多い。HDXの減少は、結合またはタンパク質のダイナミクスの低下による溶媒のアクセシビリティの低下のいずれかから生じる可能性があります。DEPC反応は本質的にHDX反応よりも2〜3桁遅いので、DEPC標識は溶媒のアクセシビリティの変化を伴わない限り、タンパク質ダイナミクスの変化の影響をほとんど受けません。
CL-MSは、適切な予防措置を講じるとラベルスクランブリングとラベルロスが最小限であるという点で、HDX-MS実験に対していくつかの利点があります。HDX実験では、ラベル損失またはバックエクスチェンジが技術の標準的な特徴であり、低pHでの速い消化およびLC分離はこの問題を最小限に抑えようと試みている。ただし、バック交換の問題は、通常 HDX-MS で測定されるラベル付きサイトの数が多いほど相殺されることを認識することが重要です。間違った情報が得られるため、HDX-MSではラベリングスクランブリングが大きな問題となるため、この懸念を最小限に抑えるために解析条件を最適化する必要があります。
XL-MSとCL-MSは、両方とも消化およびLC-MS分析中に残るのに十分な堅牢性を有する共有結合の形成を伴うため、ラベル損失とスクランブルに関して同様の利点を有する。しかし、架橋ペプチドのシーケンシングと同定は、共有標識ペプチドよりも困難であり、特殊なソフトウェアを使用する必要があります。XL-MSがCL-MSを超える主な利点の1つは、可能なタンパク質構造を予測または絞り込むときに価値のある距離制約を提供できることです。CL-MSデータはタンパク質構造予測36、42、43を容易にするために使用されてきたが、この領域は、その可能性を完全に達成するために、より多くの作業を必要とします。
特定または非特異的な標識試薬を使用するものを含む他のCL-MS法と比較すると、DEPCはいくつかの利点と欠点を有する。アミノ酸特異的試薬を使用する方法と同様に、DEPC標識は簡単です。試薬は、目的のサンプルに追加する必要があります。このシンプルさは、タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)やシンクロトロンベースのHRF、ヒドロキシルラジカルを生成するために高度な光源を必要とする方法とは対照的です。特定の試薬を使用する方法とは異なり、DEPCは6つの異なるアミノ酸とN末語を標識することができ、より高い構造分解能を提供することができます。しかしながら、DEPCによって標識できる残基数はヒドロキシルラジカルで酸化できる数より少ないので、DEPC系CL-MSで得られる構造分解能は低い。DEPCによって標識される残基の数が少ないことの1つの実用的な影響は、試薬を使用しても必要な構造情報がすべて得られないことがあり、他の標識試薬と組み合わせて使用されることから利益を得ることができるということです。我々は最近、グルタミン酸およびアスパラギン酸残基を標識することができる試薬対1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)/グリシンエチルエーテル(GEE)と共にDEPCを使用することの価値を実証した。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、グラントR01 GM075092の下で国立衛生研究所(NIH)からの支援を認めている。ここで説明したデータの一部を取得するために使用されるサーモオービトラップ核質量分析計は、国立衛生研究所の助成金S10OD010645からの資金で取得されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
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