Summary
介绍了在质谱检测中进行基于二乙基碳酸酯的共价贴标的实验程序。二甲基碳酸酯只是与感兴趣的蛋白质或蛋白质复合物混合，导致溶剂可获取氨基酸残留物的修饰。经蛋白解消化和液相色谱/质谱分析后，可识别修改后的残留物。
Abstract
描述蛋白质的更高阶结构对于理解其功能至关重要。质谱仪（MS）已成为这一目的的有力工具，尤其是对于传统方法难以研究的蛋白质系统。为了研究MS的蛋白质结构，在将蛋白质的结构信息编码到蛋白质质量的溶液中执行特定的化学反应。一个特别有效的方法是使用可共效地修改溶剂可访问氨基酸侧链的试剂。这些反应导致质量增加，当与蛋白解消化和串联质谱法相结合时，可以用残留水平分辨率进行局部化。在这里，我们描述与使用二乙基碳酸酯 （DEPC） 作为共价标记试剂以及 MS 检测相关的协议。DEPC 是一种高度电亲的分子，能够标记平均蛋白质中高达 30% 的残留物，从而提供出色的结构分辨率。DEPC 已与 MS 一起成功用于获取小单域蛋白质（如 β2 微球蛋白）到大型多域蛋白（如单克隆抗体）的结构信息。
Introduction
蛋白质是几乎所有生理过程中必不可少的生物分子。蛋白质所执行的各种功能是可能的，因为它们采用的结构和它们与其他生物分子的相互作用。为了更深入地了解蛋白质的功能，需要生化和生物物理工具来阐明这些重要的结构特征和相互作用。传统上，X射线晶体学、低温电子显微镜和核磁共振（NMR）光谱学为揭示蛋白质结构提供了所需的原子级细节。然而，由于结晶行为不良、蛋白质可用性有限、样品异质性过大或分子重量限制，许多蛋白质系统无法通过这些技术进行审问。因此，出现了克服这些限制的较新的分析方法。提供蛋白质结构信息的新兴技术包括质谱法。
质谱测量 （MS） 测量分子的质量对电荷 （m/z） 比率，因此必须通过将所需的结构信息编码到蛋白质的质量中来获取蛋白质高阶结构信息。已开发出几种编码这些信息的方法，包括氢-铀交换（HDX）1、2、3、4、化学交联（XL）5、6和共价标签（CL）7、8、9、10。在HDX中，骨干氢气的交换量略大，取决于溶剂的可及性和H-粘结程度。HDX的范围可以通过快速消化蛋白质到肽碎片，然后通过质谱仪分离和测量这些片段，或通过自上而下的实验分离蛋白质来本地化。确定汇率有助于进一步深入了解蛋白质动态。HDX 已被证明是一个有价值的工具，用于描述蛋白质结构，尽管与背部交换相关的挑战和需要专门设备，以最大限度地提高可重复性。在 XL-MS 中，蛋白质与双功能试剂发生反应，双功能试剂可共价地将给定蛋白质内或两种蛋白质之间的相邻残留侧链连接起来。这样，XL-MS 可以提供可用于描述蛋白质结构的距离限制。蛋白质相互连接的区域可以通过蛋白质分析消化和液相色谱（LC）-MS分析来识别。虽然 XL-MS 是一种多功能工具，用于研究各种蛋白质复合物（包括细胞内部），但 XL 产品的识别具有挑战性，需要专门的软件。
CL-MS最近已成为一种补充性的，有时是替代基于MS的工具，研究蛋白质结构和相互作用。在CL-MS中，蛋白质或蛋白质复合物与单功能试剂共效修改，可与溶剂暴露的侧链（图1）做出反应。通过比较不同条件下蛋白质或蛋白质复合物的修改范围，可以揭示出构象变化、结合位点和蛋白质-蛋白质接口。CL反应后，通常位于单一氨基酸水平的站点特定信息可以通过典型的自下而上的蛋白质组学工作流程获得，其中蛋白质被蛋白质蛋白解消化，肽片段由LC分离，并且使用串联MS（MS/MS）识别修改后的位点。丰富的生物结合化学历史为CL-MS实验提供了许多试剂。CL 试剂分为两个一般类别：（一） 特定和 （ii） 非特定。特定试剂与单个功能组（如免费胺）8、10反应，易于实现，但往往提供有限的结构信息。非特异性试剂与各种侧链发生反应，但通常需要激光或同步加速器源等专门设备才能产生这些高度反应的物种。羟基基是最常用的非特异性试剂，已应用于羟基基足迹（HRF）7、11、12、13实验，研究各种条件下的各种蛋白质和蛋白质复合物。
我们的研究小组在CL-MS实验14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25的背景下，成功地使用了另一种相对非特异性试剂，称为二乙基碳酸酯（DEPC）来研究蛋白质结构和相互作用。DEPC 提供特定标签试剂的简单性（即无需任何专门设备来执行反应），同时对普通蛋白质中高达 30% 的氨基酸做出反应。作为一种高度电效试剂，DEPC 能够与 N 端和西施泰因、西斯蒂丁、赖氨酸、酪氨酸、血清和三氨酸残留物的核亲侧链做出反应。通常，产生这些反应的单个产品，导致质量增加 72.02 Da。这种单一类型的产品与多达55种不同的产品形成对比，当蛋白质与羟基反应时，这些产品可以产生7种。这种简单的化学成分有助于识别标记的地点。
在这里，我们提供使用基于DEPC的CL-MS来研究蛋白质结构和相互作用的协议。详细介绍了与试剂制备、DEPC-蛋白质反应、蛋白质消化条件、LC-MS 和 MS/MS 参数以及数据分析相关的详细信息。我们还通过提供蛋白质金属、蛋白质-脂和蛋白质-蛋白质相互作用以及加热后发生结构变化的蛋白质提供示例结果，来证明DEPC标签的效用。
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Protocol
1. 蛋白质和试剂制剂
注：此协议包括一个用 DEPC 标记蛋白质的示例工作流。列出的某些条件和试剂浓度可能因所选蛋白质而异。
- 在 1.5 mL 微中福格管中准备所有试剂解决方案。
- 在pH 7.4的10mM 3-（N-莫索利诺）丙烷磺酸（MOPS）缓冲器中，准备一种所需的浓度蛋白质溶液，通常在数十微米范围内。或者，如果样品中含有与DEPC有反应的核嗜血缓冲液，则用10mm pH 7.4 MOPS制备缓冲交换现有蛋白质溶液。其他缓冲剂（如磷酸盐缓冲盐水）也可以使用，只要它们没有核嗜血功能组。
- 通过将库存 6.9 M DEPC 溶液中的 1.45 μL 管道输送到 ACN 的 98.55 μL 中，在干乙酰氨基三酯 （ACN） 中准备 100 mM DEPC 解决方案。
注：没有一组浓度可以与每种蛋白质配合使用，但最佳浓度可以根据他和Lys残留物23的数量来估算。例如，使用 50μM β2-微球蛋白溶液中的 50 μL，使用 100 mM DEPC 的 0.2 μL 对蛋白质做出反应，最终 DEPC 浓度为 200 μM（相当于蛋白质浓度的 4 倍），以确保使用此通用示例（表 1）所需的摩尔比。DEPC 标签是一种二 阶反应，因此改变反应混合物中蛋白质或 DEPC 的浓度将更改标签速率。 - 通过称出 10 毫克的伊米达佐尔并在 146.9 μL 的 HPLC 级水中溶解，准备 1 M imidazole 溶液。
2. 完整蛋白质的共价标签
- 将水浴温度设置为 37 °C，等待浴缸达到稳定的温度。
注：试剂浓度和体积的示例标记协议可以在 表 1中找到。 - 在一个新的微中量管中，将MOPS缓冲器和蛋白质溶液混合在 表1中列出的体积中。
- 在蛋白质和缓冲区中加入 0.2μL 的 DEPC 溶液，确保将生成的溶液正确混合，然后将含有反应混合物的管子放入 37 °C 水浴中 1 分钟。
注意：添加的 ACN 体积不应超过总反应量的 1%，以避免在标记反应期间蛋白质结构的扰动。反应时间由用户决定，尽管在示例条件下的 1 分钟反应可最大限度地减少重叠和 DEPC14的潜在水解。 - 1 分钟后，从水浴中取出含有反应混合物的管子，用 1 M imidazole 溶液中的 1μL 淬气反应，以清除剩余的未反应 DEPC。
注：反应混合物中二氧化二甲苯的最终浓度应等于反应混合物中DEPC浓度的50倍。这将确保清除剩余未反应的 DEPC。
3. 为自下而上的LC-MS准备蛋白质消化
注意：选择符合兴趣蛋白的消化条件。常见的步骤包括展开蛋白质，减少和碱化任何脱硫键。
- 通过在反应混合物中加入适当的展开试剂来展开蛋白质。
注：常见的展开剂包括ACN、尿素和盐酸瓜尼丁（GuHCl）。 - 通过称出每个 5 毫克，并在 174.4 和 270.3 μL 的 10 mM pH 7.4 MOPS 缓冲器中分别溶解新的微中微富支管，分别准备三合院（2-卡盒乙基）磷酸 （TCEP） 和碘乙酰胺 （IAM） 的解决方案，用于减少和分解步骤。
- 通过在反应混合物中加入 100 mM TCEP 中的 2μL（反应混合物中最终浓度为 2 mM）溶液，并在室温下反应 3 分钟，减少脱硫键。
注：TCEP的最终浓度应等于溶液中每份脱硫键蛋白质浓度的40倍。 - 烷基酸酯在黑暗中用100m IAM溶液中的4μL（反应混合物的最终浓度为4mM）减少半胱氨酸30分钟。IAM 对光敏感，会在直接光下分解。
注：IAM在溶液中的最终浓度应是 TCEP 浓度的两倍，或每脱硫键蛋白质浓度的 80 倍。 - 用适当的酶（如三氯辛或肌氨酸）消化蛋白质。10：1 蛋白质：在 37 °C 下消化 3 小时的酶比，以 300 冲程/分钟的摇动速度与固定酶进行 3 小时消化，通常足以获得 DEPC 标记的蛋白质。请参阅讨论。
- 消化后，以12，000 rpm的速度以离心机将固定酶与消化肽分离5分钟。
- 立即通过LC-MS/MS分析样品，或用液氮将样品闪冻，以尽量减少样品降解和标签损失。将闪冻结样品存放在<-20 °C，直到准备好进行LC-MS/MS分析。
4. LC-MS/MS 分析
注：自下而上的蛋白质组学标准LC-MS/MS参数可用于识别蛋白解肽片段上的标记位点。下面概述了一个通用示例。
- 使用倒相 C18 静止相位分离 DEPC 标记肽。使用两种溶剂的典型LC移动相：（A） 水 + 0.1% 用于微酸，（B） ACN + 0.1% 用于梯度（如 图 2），以实现肽的最佳分离。
注意：可根据样品的复杂性优化分离时间，移动相流速取决于是否使用毛细纸或纳米LC。 - 使用能够在线 LC-MS 和 MS/MS 的质谱仪来识别肽上的 DEPC 修改站点。在我们的实验中，我们成功地使用了几种类型的质谱仪。在LC-MS分析过程中，任何能够自动执行许多肽MS/MS的质谱仪都应该是合适的。相关 MS 参数包括：常规 ESI 的 ESI 源电压 = -4000 V;-2000 V表示纳米喷雾：轨道拉普分辨率 = 60，000;动态排除持续时间 = 30s;MS/MS 激活类型：CID、ETD 或两者兼有;质量扫描范围 = 200-2，000;自动增益控制 = 4.0E5（轨道圈中的 MS1）和 5.0E4（线性四足离子陷阱中的 MS2）。
- 将消化的、标记的蛋白质样本加载并注入LC系统，并开始LC-MS/MS采集。如果样品已闪冻结，在分析前解冻。将LC废水分流到废物中前5分钟，以避免过量的盐进入 ESI 源。
注意：通常使用 5 μL 注射回路，允许向 LC-MS/MS 注射约 2.5 微克蛋白质。这取决于LC的加载条件，以不堵塞样品喷油器。
5. 数据分析
- 识别DEPC标签站点，并使用用于所用质谱仪的适当软件量化肽峰值区域。
- 包括DEPC添加（72.02 Da）和卡巴米多姆甲基化（57.02 Da）作为可变修改。MS / MS 分析的其他搜索参数如下：最大未通过的 = 3 ;碎片离子类型=b和y：前体m/z公差 = 10ppm（如果使用四足离子陷阱质谱仪，此值应更高）;碎片 m/z 公差 = 0.5 Da（如果用于产品离子扫描的高分辨率质谱仪，此值应较低）;前体电荷=1-4。
注意：不同的数据库搜索算法有不同的评分系统，并且许多算法可能难以识别DEPC修改的肽，因为修改水平可能较低。调整分数截止点可能需要识别更多标记的肽。如果是这样，则应使用手动询问 MS/MS 数据来验证低分肽。DEPC 标签的水解产品不包括在数据搜索中，因为水解 DEPC 不再对核嗜血侧链有反应。 - 使用修改后的多肽的改性和未修改版本的色谱峰值区域确定残留级修改百分比。
注意：任何含有修改后的兴趣残留物的肽必须予以考虑，所有测量样本中必须包含所有充电状态。肽具有不同的电热效率和在不同的时间洗脱导致此值是一个相对的，而不是对特定站点的修改的绝对衡量。
其中 Ai.z 表示任何特定肽 （i） 的峰值区域，该肽 （i） 包含利息残留物，并考虑所有检测到的电荷状态 （z）。 - 使用统计评估确定控制样本和实验样本之间的标签变化是否显著。每个样本的三个复制测量是典型的，t 测试最常用于 95 或 99% 的置信间隔。
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Representative Results
识别 DEPC 修改站点和修改百分比
由于共价标签而增加的质量可以测量在 （a） 完整的蛋白质和 （b） 肽水平8，9。在完好无损的水平上，可以通过直接分析或贴有标签的蛋白质样本的LC-MS获得具有不同标签数的蛋白质物种的分布。要获得更高的分辨率结构信息（即特定于站点的标记数据），必须在肽级别进行测量。在标记和淬火步骤之后，标记的蛋白质进行自下而上的蛋白质组分析（即脱硫减少、烷基化、蛋白质解析消化和LC-MS/MS）。图3显示了如何识别DEPC标记的站点，并计算其修改水平为DEPC CL-MS实验的蛋白质β-2微球蛋白（+2m）21。MS/MS 用于对标记的肽进行排序，并精确定位其 DEPC 标记的位点，同时根据提取离子色谱图中的相对峰值区域计算修改百分比（见图 3A）。
使用DEPC CL-MS绘制蛋白质表面映射
由于蛋白质拓扑学和标签率之间的关系，DEPC已经被用来研究蛋白质高阶结构（HOS）的变化，并识别蛋白质相互作用点8，9。一个例子是 Cu （II） 结合对 β2m 结构的影响。通过不同的DEPC浓度和产生二阶动能图14，24来测量未绑定+2m和Cu（II）绑定+2m（b2m-Cu）肽片段的DEPC修改率系数（表2）。β2m-Cu 中残留物的 DEPC 反应性揭示了 His31、Ser33 和 Thr4 的显著标记率变化，而其他站点（包括不同的残留物）在统计学上保持不变。这些数据与 His31（但不是其他残留物）在 200 万英镑（2m）中结合 Cu 在 His31（即 Ser33） 和 N-终点站附近（即 Thr4） （图 4）14、26、27附近引起结构变化的事实一致。
用于识别 HOS 更改的 DEPC CL-MS
带有MS检测的DEPC标签也是描述HOS对蛋白质变化的宝贵工具，它对蛋白质治疗有重要影响，而蛋白质治疗是目前制药市场增长最快的28个领域。DEPC CL可以识别在热应激和氧化应激18时发生结构变化的特定蛋白质区域。在 β2m 暴露于热应激中后，许多标签范围显著降低的残留物（N-总站、Ser28、His31、Ser33、Ser55、Ser57、Lys58）聚集在蛋白质的一侧，表明蛋白质的这一区域会发生构象变化或可能进行中介聚合（图 5A）。除了这些残留物外，在蛋白质暴露于氧化应激后，标签减少的其他残留物（Ser11、His13、Lys19、Lys41、Lys94）在蛋白质的另一张脸上形成一个簇状，表明氧化引起的构象变化发生在其他地方（图5B）。我们小组的其他工作也表明，DEPC CL-MS可以检测和识别热应力单克隆抗体治疗20的构象变化部位。
DEPC CL-MS 研究蛋白质-蛋白质相互作用
通过DEPC标签以及9，可以深入了解淀粉样蛋白形成蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用部位和聚合接口。寡头形成后残留物的修改水平降低，可以揭示绑定接口。DEPC CL-MS用于描述β2m的淀粉样蛋白前寡聚物，这是在透析相关淀粉样蛋白中毒29中形成淀粉样蛋白的蛋白质，在启动淀粉样蛋白形成与Cu（II）15，16，26。将 β2m 单体的 DEPC 反应性与添加 Cu （II） 后形成的 2 h 前淀粉样 β+2m 二进器进行比较后显示，9 个残留物的标签减少，而 6 个残留物的标签没有变化或略有增加（图 6A）。在绘制 β2m 上的这些变化映射后，立即可以明显看出，较暗的接口涉及 200 万欧元单体（图6B）15的 ABED β片。
DEPC CL-MS 研究蛋白质-脂结合
与蛋白质结合的利甘德导致与配体相互作用的残留物的溶剂可及性降低，基于DEPC的CL-MS可用于识别蛋白质上的配体结合位点。例如，在淀粉样形成条件下，在 2m 上的表皮定位-3-gallate （EGCG） 的结合位点可以通过在 EGCG 装订所埋藏的残留物上的 DEPC 标签显著减少来识别。在 ECGC 的存在下，Lys6 和 Lys91 的 DEPC 修改百分比较低（图 7），这些残留物聚集在蛋白质的一个区域，表示由于配体结合而保护残留物。同时，N-总站、Thr4 和 His31 的标签范围（图7）增加，这表明 ECGC 引起的结构变化，并表明 14、30、31 上的 Cu（II） 绑定点可能会因ECGC 绑定32而中断。此外，使用CL-MS19鉴定了β2m淀粉样蛋白形成的其他两个小分子抑制剂——利法霉素SV和多西环素的结合位点。然而，在这项研究中，仅靠DEPC标签的结果不足以绘制具有足够结构分辨率的绑定位点的地图。从三种不同的CL试剂的结果，即DEPC，BD，和1-乙基-3-（二甲基苯甲酸酯）丙二胺 - 乙二酯（EDC/GEE）对是必要的，以更好地确定结合点19。
提高结构分辨率并减少标签混搭
即使 DEPC 标签导致形成共价键，但因水解而导致的标签丢失可能发生，尤其是对于 Ser、Thr 和 Tyr 残留物（图 8）。标签损失可以通过减少DEPC CL反应和LC-MS分析之间的时间，使用短的蛋白酶消化（例如，2小时消化与固定酶），而不是隔夜消化来最小化。快速消化导致测量更多的修改残留物，增加蛋白质结构信息的数量。例如，2小时消化固定的胸腺素持续导致识别更多的DEPC修改残留物在+2m （图9）17.通过隔夜消化，检测到 β2m 中的 Ser、Thr、Tyr、His 和 Lys 残留物的 75%，但当使用 2 小时消化来缩短标签和 LC-MS 之间的时间时，检测到 β2m 中的这些残留物的 95%。大多数新检测到的修改残留物是易发生水解的 Tyr 和 Thr 残留物。
在与 DEPC 合作的过程中，我们注意到，在某些蛋白质中，DEPC 会修改脱硫键中的 Cys 残留物，即使脱硫键在 DEPC 标记反应期间完好无损。这种Cys残留物的标签之所以出现，是因为自由硫醇可以与溶液中其他修改后的残留物（图10）发生反应，导致所谓的"标签争抢"，因为碳水化合物组被转移到赛斯残留物。标签拼贴会降低其他残留物的修改水平，并提供不正确的蛋白质结构信息。为了避免标签争抢，免费的Cys硫醇必须在脱硫减少33后立即完全烷基化。
图1：共价标记-质谱仪（CL-MS）。单功能试剂用于修改溶剂可访问氨基酸，并可用于提供有关蛋白质（上图与下图）中构象变化或交互接口的站点特定信息。改性蛋白被蛋白解消化，由此产生的肽通过液相色谱 （LC） 与 MS 和串联 MS （MS/MS） 一起进行分析。图已被改编自林皮基拉蒂，P.，刘，T.，瓦切特，R.W.科瓦伦特标签-质量光谱学研究蛋白质结构和相互作用。方法 144，79-93 （2018）.请单击此处查看此图的较大版本。
| 使用量 （μL） | 解决方案中的浓度 （μM） | |
| 蛋白质 （100μM， MOPS） | 50 | 50 |
| MOPS （10 米， pH 7.4） | 48.8 | 不适用 |
| 德普克 （100 米） | 0.2 | 200 （+4x [蛋白质]） |
| 伊米达佐尔 （1 M） | 1 | 10，000 （+50倍[德普克]） |
| 总成交量 | 100 |
表1。 通用DEPC标签协议。
图2。多肽分离的LC梯度示例。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3 说明如何识别DEPC标记的站点及其修改级别。在DEPC标记和蛋白质分析消化后，（A） 对消化蛋白进行LC-MS分析。用于计算色谱图中未贴标签的 （B） 和 （C） 标记肽的峰值区域。在LC-MS期间，肽受CID MS/MS的约束，无标签的（D）串联质谱和（E）和（F）标记肽在特定保留时间获得用于肽测序和识别DEPC标记站点。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 残留 | b2m | b2米-库 |
| 第 4 次 | 0.082 ± 0.004 | 0.052 ± 0.009 |
| 他的13 | 0.041 ± 0.003 | 0.033 ± 0.005 |
| 他的31 | 0.010 ± 0.001 | 0.003 ± 0.001 |
| Ser33 | 0.010 ± 0.002 | 0.004 ± 0.001 |
| 他的51 | 0.036 ± 0.003 | 0.030 ± 0.004 |
| Ser88 | 0.029 ± 0.007 | 0.020 ± 0.006 |
表2在 Cu （II） 缺席和存在的情况下，b2m 的站点特定 DEPC 修改速率系数 （k， M-1s-1）。
图4 使用 DEPC CL-MS 确定 Cu （II） 结合对 + 2m 结构的影响：（A） 残留物的蛋白质表面映射，DEPC 标签率（蓝色）显著降低，指示其溶剂可访问性在 Cu （II） 绑定后的变化，以及标签率（品红色）（PDB 加入代码 1JNJ） 没有显著变化的残留物。（B） 在 Cu （II） 存在和不存在的情况下，α2m 反应的特定站点特定二阶动能图具有不同浓度的 DEPC。标签速率系数（k）可从动能图的坡度中获取。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5 应力与原生 +2m 的共价标记结果：（A） 热应激 - 24 小时在 75 °C 加热和 （B） 氧化应激 - 3% H2O2 表示 24 h。修改百分比显著变化以蓝色（标签减少）和红色（标签增加）显示，而未显著标签更改的残留物以淡绿色显示（PDB 加入代码 1JNJ）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6使用 DEPC CL-MS 确定 β2m 预淀粉样二分的更暗入器的更暗的接口：（A） 添加 Cu（II） 后，单体（即 t = 0）和更暗 2 h 中修改后的 DPC 修改水平变化摘要。标签范围显著降低的残留物由星号 （*） 表示。（B） 绘制在 β2m 结构上的共价标记结果。标签减少的残留物以蓝色显示，没有变化或标签略有增加的残留物以红色显示（PDB 加入代码 1LDS）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7 EGCG 绑定与未绑定 b2m 的共价标记结果。显示显示的残留物的 DEPC 修改百分比。共同价标签百分比的统计显著差异由星号 （*） 表示。ECGC 绑定上的标签增加以红色显示，而减少以蓝色显示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8DEPC 共价标签反应（核嗜乙酰替代）和标签丢失（碳水化合物残留物的水解） 请单击此处查看此图的更大版本。
图9 绘制 β2m 上测量的修改站点的映射。（A） 常规隔夜消化后标记的站点，以及 （B） 使用固定的胸腺素在 2 小时消化后标记的站点。 请单击此处查看此图的较大版本。
图10DEPC 标签混杂的假设机制（Cys 捕获的碳水化合物脱氧他的） 请单击此处查看此图的更大版本。
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Discussion
关键步骤
应考虑有关实验设计的若干点，以确保可靠的标记结果。首先，为了最大限度地提高蛋白质标签，有必要避免缓冲具有强烈核嗜血组（如Tris），因为它们可以与DEPC发生反应并降低标签的程度。也可以想象，这种缓冲器可能与标记的残留物发生反应，导致标签被移除，从而丢失结构信息。我们建议MOPS作为缓冲，但磷酸盐缓冲盐水也有效。其次，应避免使用二硫化物来减少二硫化物键，因为这种试剂中的免费硫醇可以与标记残留物发生反应并去除DEPC修改。同样的化学成分是为什么它必须碱化减少脱硫剂，因为自由囊会导致蛋白质内标签争先恐后33。第三，与伊米达佐尔（协议步骤2.4）的淬淬步骤对于停止标签反应至关重要，因此任何剩余的DEPC都无法继续对蛋白质做出反应。
同样重要的是要认识到，DEPC 标签反应是第二顺序，这意味着改变蛋白质或 DEPC 浓度将影响标签的程度。我们经验发现，当蛋白质浓度在 μM 范围的 10 分之内时，4：1 DEPC：蛋白质浓度比是一个合理的值，因为它倾向于避免任何标签引起的结构变化14。然而，最佳的DEPC：蛋白质浓度比是蛋白质依赖和浓度依赖，有些蛋白质需要更高的比率才能实现足够的标签。最佳的DEPC浓度，以尽量减少标签给定蛋白质的结构扰动，可以估计从溶剂访问他和Lys残留物的数量23。
为了避免由于试剂随时间的降解而标签范围的变异性，最好在同一天进行控制和实验反应。DEPC 在暴露于水中时会经历快速水解，并在储存过程中降解，因此良好的实验室实践和试剂处理是关键。未使用时，DEPC 库存瓶应存放在干燥器中。
修改和故障排除
由于DEPC CL是一种运动控制反应，因此标签率，因此修改水平，由蛋白质和试剂浓度，标签时间和温度控制。如上所述，通常 DEPC CL 在 37 °C 下执行 1 分钟，与蛋白质摩尔的比例为 4 比 1。在这个摩尔比（4倍），蛋白质可以安全地标记没有结构扰动14。DEPC：大于4的蛋白质摩尔比可用于某些蛋白质，而DEPC浓度的提高可产生更广泛的标签和更多的结构信息，也就不足为奇了。使用更高DEPC浓度而不扰动结构的最安全方法是生成剂量响应图，其中蛋白质的蛋白解质片段的反应性被测量为DEPC浓度的函数（见图4B）14，24。 但是，此方法可能非常耗时，因为它需要多次测量。最近，我们证明，从他和Lys残留的蛋白质23的数量和SASA中可以估计出最佳的DEPC浓度。在最近的工作中，我们还提出了其他方法来评估蛋白质的结构在CL9，24期间没有受到干扰。
蛋白解消化也是DEPC CL-MS的重要一步，因为产生的肽允许在LC-MS/MS分析后本地化结构信息。一般来说，血清蛋白酶，如三氯辛和肌氨酸对蛋白质消化有效。Trypsin 更常用，因为它在 Lys 和 Arg 残留物的 C 端端具有效率和特异性。然而，在 DEPC 标记的 Lys 残留物之后， trypsin 通常不会裂开，导致标记的 Lys 残留物的丢失，有时会使数据分析复杂化。chymotrypsin 的活性，在大量疏水残留物后裂开，通常不受 DEPC 标签的影响，但这种酶的效率和特异性低于 trypsin 。此外，对于具有大量疏水残留物的蛋白质，霉素可以产生几个短肽片段，这些片段在标准LC-MS条件下很难分离和检测。
LC-ESI-MS/MS 对蛋白质消化的分析需要稳定的电溅才能获得可靠的半量定量结果。毛细亚和纳米LC是常用的分离平台，可以用少量蛋白质获得有效的分离。然而，根据我们的经验，毛细管LC提供比纳米LC更可靠的定量信息（即修改水平），因为使用的样本量较高。对于被消化成大量标记和无标签肽的大蛋白质，可能会发生类似疏水性肽的凝血。在这些情况下，应使用更长的LC梯度进行更好的分离。
快速高效的 MS/MS 对于良好的序列覆盖和标签站点识别非常重要。带有四足离子陷阱的质谱仪是用于此目的的优秀仪器。一般来说，CID是肽分离的一种常见且高效的方法：然而，我们观察到DEPC标签在CID期间争抢标签肽离子的情况，导致标签网站标识34的模糊性。在这些有些罕见的情况下，ETD 提供更可靠的信息。因此，如果可能，两种分离技术之间的交替可能会有所帮助。由于DEPC可以标记许多不同的残留类型，因此在修改后的侧链中生成给定肽片段的异位体是很常见的。很多时候，这些肽异位素可以通过LC分离，尽管它们往往在非常相似的时候发音。在自动 LC-MS/MS 分析期间设置 MS/MS 排除时间时应考虑这种可能性。通常，应使用比平常更短的排除时间。
局限性
虽然DEPC CL-MS对研究蛋白质结构和相互作用非常有益，并且在解决各种蛋白质系统方面取得了重大进展，但这项技术仍然存在一些局限性。如果标签条件没有很好地优化（例如，使用过高的DEPC浓度），过度贴标会干扰蛋白质结构，导致结构信息不准确14、23、24。此外，测量的修改水平的准确性和精确性受几个因素的影响，包括如果样品在LC-MS分析之前坐得太久，以及化学标签步骤错误，则标签丢失。每个实验步骤的一致性对于可靠的结果都很重要。目前与基于 DEPC 的 CL-MS 相关的更具挑战性的问题之一是数据分析软件。现成的数据分析程序没有优化，无法成功识别修改百分比低的肽（例如，< 1%）。因此，我们开发并使用专门的软件，使低修改水平的肽能够轻易识别18。
即使DEPC CL-MS可以提供中等蛋白质结构分辨率，但无法从标签技术中获得详细的3D结构。最近，一些基于标签数据的结构预测工具已经开发出来。然而，需要有更多的发展，以最佳方式将DEPC标签结果与计算建模，以预测蛋白质结构。
与替代方法相比的意义
与 X 射线晶体学或 NMR 等技术相比，基于 DEPC 的 CL-MS 可能具有的结构分辨率适中，因此将该技术与 HDX-MS、XL-MS 和其他 CL-MS 或其他 CL-MS 或足迹处理方法进行比较最为合适。正如介绍中提到的，CL-MS 是 HDX-MS 的补充，因为它提供了有关蛋白质残留物侧链的信息，而 HDX-MS 则报告了骨干结构和动力学。这种互补性使这两种技术能够一起用于获取更多的结构信息，正如第37、38、39、40、41组所表明的那样。与基于DEPC的CL-MS相关的一个新兴想法是，当它与HDX-MS22配合使用时，可以获得协同信息。由于与这两种技术相关的标签时间框架，基于DEPC的CL-MS通常可以澄清与HDX减少的蛋白质区域的歧义。由于结合性或蛋白质动力学减少，可减少溶剂可访问性，可产生HDX下降。DEPC 反应本质上比 HDX 反应慢 2-3 个数量级，因此 DEPC 标签基本上不受蛋白质动力学变化的影响，只要它们不伴有溶剂可访问性的变化。
CL-MS 比 HDX-MS 实验有一些优势，即标签争先恐后，如果采取适当的预防措施，标签损失将微乎其微。在 HDX 实验中，标签丢失或反交换是该技术的标准特征，在低 pH 口下快速消化和 LC 分离是将此问题降到最低的尝试。不过，重要的是要认识到，背交换问题是由通常以 HDX-MS 衡量的标记站点数量增加所抵消的。标签争先恐后是 HDX-MS 中一个更大的问题，因为随后会获得不正确的信息，因此必须优化分析条件以尽量减少此问题。
XL-MS 和 CL-MS 在标签丢失和争抢方面具有类似的优势，因为两者都涉及形成一种足够坚固的共价债券，在消化和 LC-MS 分析期间保持稳健。然而，对相互关联肽的测序和识别比对共价标记肽更具挑战性，需要使用专门的软件。XL-MS 在 CL-MS 上的优势之一是它能够提供距离限制，这在预测或缩小可能的蛋白质结构时可能很有价值。CL-MS数据已被用于促进蛋白质结构预测36，42，43，但这一领域需要更多的工作，以充分发挥其潜力。
与其他 CL-MS 方法（包括使用特定或非特定标签试剂的方法）相比，DEPC 具有一些优点和缺点。与使用氨基酸特异性试剂的方法一样，DEPC 标签简单明了：试剂只需要添加到感兴趣的样本中。这种简单性与蛋白质 （FPOP） 的快速光化学氧化或基于同步加速器的 HRF 等方法形成鲜明对比，这些方法需要复杂的光源来产生羟基基。与使用特定试剂的方法不同，DEPC 可以标记六种不同的氨基酸和 N 终点站，使其能够提供更高的结构分辨率。但是，DEPC 可以标记的残留物数量小于水氧基可氧化的残留物数量，因此基于 DEPC 的 CL-MS 可获得的结构分辨率较低。DEPC 标记的残留物较少的一个实际后果是，使用试剂有时不能提供所有所需的结构信息，因此它可以从与其他标签试剂一起使用中获益。我们最近证明了使用DEPC与试剂对1-乙基-3-（3-二甲基丙基）碳水化合物（EDC）/乙二乙醚（GEE）的价值，它可以标记谷氨酸和分离残留物19。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢国家卫生研究院（NIH）在格兰特R01转基因075092下的支持。用于获取此处描述的一些数据的温度轨道拉普融合质谱仪是从国家卫生研究院赠款 S10OD010645 获得的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
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