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Chemistry

Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Les procédures expérimentales pour effectuer un marquage covalent à base de diéthylpyrocarbonate avec détection spectrométrique de masse sont décrites. Le diéthylpyrocarbonate est simplement mélangé avec la protéine ou le complexe protéique d’intérêt, conduisant à la modification des résidus d’acides aminés accessibles aux solvants. Les résidus modifiés peuvent être identifiés après digestion protéolytique et analyse chromatographie liquide/spectrométrie de masse.

Abstract

La caractérisation de la structure d’ordre supérieur d’une protéine est essentielle pour comprendre sa fonction. La spectrométrie de masse (SEP) est apparue comme un outil puissant à cette fin, en particulier pour les systèmes protéiques difficiles à étudier par des méthodes traditionnelles. Pour étudier la structure d’une protéine par MS, des réactions chimiques spécifiques sont réalisées en solution qui codent l’information structurelle d’une protéine dans sa masse. Une approche particulièrement efficace consiste à utiliser des réactifs qui modifient de manière covalente les chaînes latérales d’acides aminés accessibles aux solvants. Ces réactions conduisent à des augmentations de masse qui peuvent être localisées avec une résolution au niveau des résidus lorsqu’elles sont combinées à la digestion protéolytique et à la spectrométrie de masse en tandem. Ici, nous décrivons les protocoles associés à l’utilisation du diéthylpyrocarbonate (DEPC) comme réactif de étiquetage covalent avec la détection de milliseconde. Le DEPC est une molécule hautement électrophile capable de étiqueter jusqu’à 30% des résidus dans la protéine moyenne, offrant ainsi une excellente résolution structurelle. Le DEPC a été utilisé avec succès avec ms pour obtenir des informations structurelles pour de petites protéines à domaine unique, telles que la β2-microglobuline, aux grandes protéines multi-domaines, telles que les anticorps monoclonaux.

Introduction

Les protéines sont des biomolécules essentielles dans pratiquement tous les processus physiologiques. La variété des fonctions que les protéines remplissent est possible en raison des structures qu’elles adoptent et des interactions qu’elles ont avec d’autres biomolécules. Pour comprendre la fonction des protéines à un niveau plus profond, des outils biochimiques et biophysiques sont nécessaires pour élucider ces caractéristiques et interactions structurelles importantes. Traditionnellement, la cristallographie aux rayons X, la microscopie électronique cryogénique et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont fourni le détail de niveau atomique souhaité pour révéler la structure des protéines. Cependant, de nombreux systèmes protéiques ne peuvent pas être interrogés par ces techniques en raison d’un comportement de cristallisation médiocre, d’une disponibilité limitée des protéines, d’une hétérogénéité excessive des échantillons ou de limitations de poids moléculaire. Par conséquent, de nouvelles méthodes d’analyse ont vu le jour pour surmonter ces limites. Parmi les techniques émergentes qui peuvent fournir des informations structurelles sur les protéines, il y a la spectrométrie de masse.

La spectrométrie de masse (MS) mesure le rapport masse/charge (m/z) d’une molécule, de sorte que les informations structurelles d’ordre supérieur des protéines doivent être obtenues en codant les informations structurelles souhaitées dans la masse de la protéine. Plusieurs approches pour coder ces informations ont été développées, notamment l’échange hydrogène-deutérium (HDX)1,2,3,4,la réticulation chimique (XL)5,6,et le étiquetage covalent (CL)7,8,9,10. Dans HDX, les hydrogènes d’amide de base sont échangés par des deutériums légèrement plus massifs à des vitesses qui dépendent de l’accessibilité des solvants et de l’étendue de la liaison H. L’étendue de HDX peut être localisée en digérant rapidement la protéine en fragments peptidiques avant de séparer et de mesurer ces fragments par le spectromètre de masse ou en dissociant la protéine dans une expérience descendante. La détermination du taux de change fournit un aperçu supplémentaire de la dynamique des protéines. HDX s’est avéré être un outil précieux pour caractériser la structure des protéines malgré les défis associés à l’échange de dos et le besoin d’équipement spécialisé pour maximiser la reproductibilité. Dans XL-MS, les protéines réagissent avec des réactifs bi-fonctionnels qui lient de manière covalent les chaînes latérales de résidus adjacentes au sein d’une protéine donnée ou entre deux protéines. Ce faisant, XL-MS peut fournir des contraintes de distance qui peuvent être utilisées pour caractériser la structure des protéines. Les régions de la protéine qui sont réticulées peuvent être identifiées par digestion protéolytique suivie d’une analyse par chromatographie liquide (LC)-MS. Bien que XL-MS soit un outil polyvalent qui a été utilisé pour étudier une variété de complexes protéiques, y compris les cellules internes, l’identification des produits XL est difficile et nécessite un logiciel spécialisé.

La CL-MS est apparue récemment comme un outil complémentaire et parfois alternatif basé sur la SEP pour étudier la structure et les interactions des protéines. Dans la CL-MS, une protéine ou un complexe protéique est modifié de manière covalente avec un réactif mono-fonctionnel qui peut réagir avec des chaînes latérales exposées au solvant (Figure 1). En comparant les degrés de modification d’une protéine ou d’un complexe protéique dans différentes conditions, des changements de conformation, des sites de liaison et des interfaces protéine-protéine peuvent être révélés. Après la réaction CL, des informations spécifiques au site, souvent au niveau d’un seul acide aminé, peuvent être obtenues à l’aide de flux de travail protéomiques ascendants typiques dans lesquels les protéines sont digérées protéolytiquement, les fragments peptidiques sont séparés par LC et les sites modifiés sont identifiés à l’aide de la SP en tandem (MS / MS). La riche histoire de la chimie bioconjuguée a rendu de nombreux réactifs disponibles pour les expériences cl-ms. Les réactifs cl se répartissent en deux grandes catégories: (i) spécifique et (ii) non spécifique. Des réactifs spécifiques réagissent avec un seul groupe fonctionnel (p. ex. amines libres)8,10 et sont faciles à mettre en œuvre, mais ils ont tendance à fournir des informations structurelles limitées. Les réactifs non spécifiques réagissent avec une large gamme de chaînes latérales, mais nécessitent souvent des équipements spécialisés tels que des lasers ou des sources synchrotron pour produire ces espèces hautement réactives. Les radicaux hydroxyles sont le réactif non spécifique le plus couramment utilisé, ayant été appliqué dans les expériences d’empreintes de radicaux hydroxyles (HRF)7,11,12,13 pour étudier un large éventail de protéines et de complexes protéiques dans diverses conditions.

Notre groupe de recherche a utilisé avec succès un autre réactif relativement non spécifique appelé diéthylpyrocarbonate (DEPC) pour étudier la structure et les interactions des protéines dans le contexte des expériences CL-MS14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC offre la simplicité de réactifs d’étiquetage spécifiques (c’est-à-dire qu’aucun équipement spécialisé n’est nécessaire pour effectuer les réactions), tout en réagissant avec jusqu’à 30% d’acides aminés dans la protéine moyenne. En tant que réactif hautement électrophile, DEPC est capable de réagir avec le N-terminus et les chaînes latérales nucléophiles de la cystéine, de l’histidine, de la lysine, de la tyrosine, de la sérine et des résidus de thréonine. Typiquement, un seul produit de ces réactions est généré, ce qui entraîne une augmentation de masse de 72,02 Da. Ce type unique de produit contraste avec les jusqu’à 55 produits différents qui peuvent être produits lorsque les protéines réagissent avec les radicaux hydroxyles7. Une telle chimie simple facilite l’identification des sites étiquetés.

Ici, nous fournissons des protocoles pour l’utilisation de CL-MS à base de DEPC pour étudier la structure et les interactions des protéines. Les détails associés à la préparation des réactifs, aux réactions des protéines DEPC, aux conditions de digestion des protéines, aux paramètres LC-MS et MS/MS, ainsi qu’à l’analyse des données sont décrits. Nous démontrons également l’utilité du étiquetage DEPC en fournissant des exemples de résultats d’interactions protéine-métal, protéine-ligand et protéine-protéine ainsi que de protéines subissant des changements structurels lors du chauffage.

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Protocol

1. Préparation de protéines et de réactifs

Remarque : ce protocole inclut un exemple de flux de travail pour le étiquetage d’une protéine avec DEPC. Certaines conditions et concentrations de réactifs énumérées peuvent varier en fonction de la protéine de choix.

  1. Préparer toutes les solutions réactives dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
  2. Préparer une solution protéique de la concentration désirée, habituellement de l’ordre de dizaines de μM, dans un tampon d’acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS) de 10 mM à un pH de 7,4. Alternativement, préparer une solution protéique existante d’échange tampon dans un pH de 10 mM de 7,4 MOPS si l’échantillon contient un tampon nucléophile qui serait réactif avec le DEPC. D’autres tampons (p. ex. solution saline tamponnée au phosphate) peuvent également être utilisés, à condition qu’ils n’aient pas de groupes fonctionnels nucléophiles.
  3. Préparer une solution de DEPC de 100 mM dans de l’acétonitrile sec (ACN) en piper 1,45 μL de la solution de DEPC mère de 6,9 M dans 98,55 μL de l’ACN.
    REMARQUE: Il n’y a pas un seul ensemble de concentrations qui fonctionnera avec chaque protéine, bien que les concentrations optimales puissent être estimées en fonction du nombre de résidus His et Lys23. Par exemple, avec 50 μL d’une solution de β2-microglobuline de 50 μM, réagissez la protéine avec 0,2 μL du DEPC de 100 mM pour une concentration finale de DEPC de 200 μM (égale à 4x la concentration en protéines) pour assurer le rapport molaire souhaité en utilisant cet exemple général(tableau 1). Le étiquetage DEPC est une réaction d’ordre 2nd, donc changer la concentration de protéines ou de DEPC dans le mélange réactionnel changera le taux d’étiquetage.
  4. Préparer une solution d’imidazole 1 M en pesant 10 mg d’imidazole et en les dissolvant dans 146,9 μL d’eau de qualité CLHP.

2. Étiquetage covalent des protéines intactes

  1. Réglez la température du bain d’eau à 37 °C et attendez que le bain atteigne une température stable.
    REMARQUE : Les concentrations et les volumes de réactifs pour un exemple de protocole d’étiquetage se trouvent dans le tableau 1.
  2. Dans un nouveau tube à microcentrifugation, mélanger le tampon MOPS et la solution protéique dans les volumes énumérés au tableau 1.
  3. À la protéine et au tampon, ajoutez 0,2 μL de la solution de DEPC, en vous assurant de bien mélanger la solution résultante, puis placez le tube contenant le mélange réactionnel dans le bain-marie à 37 °C pendant 1 minute.
    REMARQUE: Le volume d’ACN ajouté ne doit pas dépasser 1% du volume total de réaction pour éviter la perturbation de la structure de la protéine pendant la réaction de étiquetage. Le temps de réaction est à la charge de l’utilisateur, bien qu’une réaction de 1 minute dans les conditions d’exemple minimise le surétiquetage et l’hydrolyse potentielle de DEPC14.
  4. Après 1 minute, retirer le tube contenant le mélange réactionnel du bain-marie et éteindre la réaction avec 1 μL de la solution d’imidazole 1 M pour récupérer le DEPC restant qui n’a pas réagi.
    NOTA: La concentration finale d’imidazole dans le mélange réactionnel doit être égale à 50 fois la concentration de DEPC dans le mélange réactionnel. Cela garantira que le DEPC restant n’ayant pas réagi est récupéré.

3. Préparation du digeste protéique pour la LC-MS ascendante

REMARQUE: Choisissez des conditions de digestion qui se prêtent à la protéine d’intérêt. Les étapes courantes consistent à déplier la protéine et à réduire et à alkyler les liaisons disulfures.

  1. Dépliez la protéine en ajoutant un réactif de dépliage approprié au mélange réactionnel.
    REMARQUE: Les agents de dépliage courants comprennent l’ACN, l’urée et le chlorhydrate de guanidine (GuHCl).
  2. Préparer des solutions de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) et d’iodoacétamide (IAM) en pesant 5 mg de chacune et en les dissolvant dans de nouveaux tubes microcentrifugés dans 174,4 et 270,3 μL de tampon MOPS de 10 mM pH 7,4, respectivement, pour les étapes de réduction et d’alkylation.
  3. Réduire les liaisons disulfures en ajoutant 2 μL de la solution de PTCE (concentration finale de 2 mM dans le mélange réactionnel) de 100 mM au mélange réactionnel et en réagissant pendant 3 minutes à température ambiante.
    NOTA : La concentration finale de PTCE doit être égale à 40 fois la concentration en protéines par liaison disulfure présente dans la solution.
  4. L’alkylate a réduit les cystéines avec 4 μL de la solution IAM de 100 mM (concentration finale de 4 mM dans le mélange réactionnel) pendant 30 minutes dans l’obscurité. IAM est sensible à la lumière et se décompose sous la lumière directe.
    NOTA : La concentration finale d’IAM en solution devrait être deux fois plus forte que celle utilisée pour le PTCE, ou 80 fois la concentration protéique par liaison disulfure.
  5. Digérer la protéine avec une enzyme appropriée telle que la trypsine ou la chymotrypsine. Un rapport protéines/enzymes de 10:1 pour une digestion de 3 heures à 37 °C avec une enzyme immobilisée à un taux de secousse de 300 coups/min est généralement suffisant pour les protéines marqués par DEPC. Voir discussion.
  6. Après digestion, séparer l’enzyme immobilisée des peptides digérés par centrifugation à 12 000 rpm pendant 5 minutes.
  7. Analyser l’échantillon immédiatement par CL-MS/MS ou congeler l’échantillon avec de l’azote liquide pour minimiser la dégradation de l’échantillon et la perte de l’étiquette. Conserver les échantillons congelés instantanément à < -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’analyse LC-MS/MS.

4. Analyse LC-MS/MS

REMARQUE : Les paramètres LC-MS/MS standard pour la protéomique ascendante peuvent être utilisés pour identifier les sites marqués sur les fragments peptidiques protéolytiques. Un exemple général est présenté ci-dessous.

  1. Séparez les peptides marqués par le DEPC à l’aide d’une phase stationnaire C18 en phase inversée. Utiliser une phase mobile LC typique de deux solvants : (A) eau + 0,1 % d’acide formique et (B) ACN + 0,1 % d’acide formique à l’aide d’un gradient (p. ex. figure 2)pour obtenir la meilleure séparation des peptides.
    REMARQUE: Le temps de séparation peut être optimisé en fonction de la complexité de l’échantillon, et le débit de phase mobile dépend de l’utilisation d’un capillar ou d’un nano LC.
  2. Utilisez un spectromètre de masse capable de faire de la LC-MS et de la MS/MS en ligne pour identifier les sites de modification de LAPC sur le peptide. Dans nos expériences, nous avons utilisé avec succès plusieurs types de spectromètres de masse. Tout spectromètre de masse capable d’effectuer automatiquement des MS/MS de nombreux peptides au cours d’une analyse LC-MS devrait convenir. Les paramètres MS pertinents incluent: tension source ESI = -4000 V pour ESI régulier; -2000 V pour nanospray; Résolution Orbitrap = 60 000; Durée d’exclusion dynamique = 30 s; Type d’activation MS/MS : CID, ETD ou les deux ; Plage de balayage de masse = 200-2 000; Contrôle automatique du gain = 4.0E5 (MS1 dans Orbitrap) et 5.0E4 (MS2 dans le piège à ions quadripôle linéaire).
  3. Chargez et injectez l’échantillon de protéines digérées et étiquetées dans le système LC et commencez l’acquisition de LC-MS/MS. Si l’échantillon a été congelé à l’éclair, décongeler avant l’analyse. Détourner l’effluent de LC en déchets pendant les 5 premières minutes pour éviter que des sels excessifs ne pénètrent dans la source ESI.
    NOTA : Une boucle d’injection de 5 μL est généralement utilisée, ce qui permet l’injection d’environ 2,5 μg de protéines dans la LC-MS/MS. Cela dépend des conditions de chargement du LC pour ne pas obstruer l’injecteur d’échantillon.

5. Analyse des données

  1. Identifier les sites d’étiquette DEPC et quantifier les zones de pic peptidique à l’aide du logiciel approprié pour le spectromètre de masse utilisé.
  2. Inclure l’ajout de DEPC (72,02 Da) et la carbamidométhylation (57,02 Da) comme modifications variables. Voici d’autres paramètres de recherche pour l’analyse ms/ms : clivages manqués maximum = 3; Types d’ions fragments = b et y; Tolérance m/z du précurseur = 10 ppm (cette valeur devrait être plus élevée si un spectromètre de masse à piège ionique quadripolaire est utilisé); Tolérance au fragment m/z = 0,5 Da (cette valeur doit être inférieure si un spectromètre de masse à haute résolution est utilisé pour un balayage ionique de produit); Charge de précurseur = 1-4.
    REMARQUE: Différents algorithmes de recherche de base de données ont différents systèmes de notation, et beaucoup peuvent avoir des difficultés à identifier les peptides modifiés par DEPC car les niveaux de modification peuvent être faibles. L’ajustement de la limite du score peut être nécessaire pour identifier plus de peptides marqués. Si c’est le cas, l’interrogation manuelle des données MS/MS devrait être utilisée pour vérifier les peptides à faible score. Le produit de l’hydrolyse de l’étiquette DEPC n’est pas inclus dans la recherche de données parce que le DEPC hydrolysé n’est plus réactif envers les chaînes latérales nucléophiles.
  3. Déterminer les pourcentages de modification au niveau des résidus à l’aide des zones de pic chromatographique des versions modifiées et non modifiées des peptides.
    NOTA : Tout peptide contenant le résidu modifié d’intérêt doit être pris en compte et tous les états d’accusation qui sont inclus doivent être présents dans tous les échantillons mesurés. Les peptides ayant des efficacités d’ionisation différentes et éluant à différents moments fait que cette valeur est une mesure relative plutôt qu’absolue de la modification d’un site spécifique.
    Equation 1
    où Ai,z représente la surface de crête d’un peptide donné (i) qui contient le résidu d’intérêt et prend en compte tous les états de charge détectés (z).
  4. Déterminer si un changement d’étiquetage entre un échantillon témoin et un échantillon expérimental est significatif à l’aide d’une évaluation statistique. Trois mesures répétées pour chaque échantillon sont typiques, et les tests t sont le plus souvent utilisés avec des intervalles de confiance de 95 ou 99 %.

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Representative Results

Identification des sites de modification de DEPC et des pourcentages de modification
L’addition de masse due au marquage covalent peut être mesurée aux niveaux (a) de protéines intactes et (b) depeptides 8,9. Au niveau intact, une distribution d’espèces protéiques avec différents nombres d’étiquettes peut être obtenue à partir d’une analyse directe ou de LC-MS d’échantillons de protéines marqués. Pour obtenir des renseignements structurels à plus haute résolution (c.-à-d. des données d’étiquetage propres au site), des mesures doivent être effectuées au niveau peptidique. Après les étapes de étiquetage et de trempe, les protéines étiquetées sont soumises à une analyse protéomique ascendante (c.-à-d. réduction du disulfure, alkylation, digestion protéolytique et LC-MS/MS). La figure 3 montre comment les sites marqués par le DEPC sont identifiés et leurs niveaux de modification sont calculés pour une expérience de CL-MS du DEPC sur la protéine β-2-microglobuline (β2m)21. Ms/MS est utilisé pour séquencer les peptides marqués et identifier leurs sites marqués DEPC, tandis que les pourcentages de modification sont calculés à partir de leurs zones de pic relatives dans les chromatogrammes ioniques extraits (Voir Figure 3A).

Cartographie de surface des protéines à l’aide de DEPC CL-MS
En raison de la relation entre la topologie des protéines et le taux d’étiquetage, le DEPC a été utilisé pour étudier les changements dans la structure d’ordre supérieur des protéines (HOS) et identifier les sites d’interaction des protéines8,9. Un exemple est l’effet de la liaison Cu(II) sur la structure de β2m. Les coefficients de taux de modification DEPC des fragments peptidiques provenant de β2m non liés et de β2m (b2m-Cu) liés au Cu(II) peuvent être mesurés(tableau 2)en faisant varier les concentrations de DEPC et en générant des graphiques cinétiques de second ordre14,24. La réactivité DEPC des résidus dans β2m-Cu révèle des changements significatifs de taux d’étiquetage pour His31, Ser33 et Thr4, tandis que d’autres sites, y compris différents résidus his, sont statistiquement inchangés. Ces données sont compatibles avec le fait que His31, mais pas d’autres résidus his dans β2m, se lie Cu provoquant des changements structurels près de His31 (c’est-à-dire Ser33) et près de l’extrémité N-terminus (c’est-à-dire Thr4) (Figure 4)14,26,27.

DEPC CL-MS pour identifier les changements dans HOS
L’étiquetage DEPC avec détection de la SEP est également un outil précieux pour caractériser les changements HOS dans les protéines, ce qui a des implications importantes pour les thérapies protéiques, qui sont actuellement le segment à la croissance la plus rapide du marché pharmaceutique28. DEPC CL peut identifier des régions protéiques spécifiques qui subissent des changements structurels lors de contraintes thermiques et oxydatives18. Après que β2m est exposé au stress thermique, de nombreux résidus qui subissent des diminutions significatives dans les étendues de marquage (N-terminus, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) sont regroupés sur un côté de la protéine, ce qui suggère que cette région de la protéine subit un changement conformationnel ou peut-être médie l’agrégation (Figure 5A). En plus de ces résidus, après que la protéine est exposée au stress oxydatif, d’autres résidus avec une diminution du étiquetage (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) forment un cluster sur une autre face de la protéine, indiquant que les changements conformationnels induits par l’oxydation se produisent ailleurs(Figure 5B). D’autres travaux de notre groupe ont également montré que depc CL-MS peut détecter et identifier des sites de changements conformationnels dans les anticorps monoclonaux thermo-stressés thérapeutiques20.

DEPC CL-MS pour étudier les interactions protéine-protéine
Un aperçu des sites d’interaction protéine-protéine et des interfaces d’agrégation pour les protéines formant de l’amyloïde peut également être obtenu à l’aide du étiquetage DEPC9. La diminution des niveaux de modification des résidus lors de la formation d’oligomères peut révéler les interfaces de liaison. DEPC CL-MS a été utilisé pour caractériser les oligomères pré-amyloïdes de β2m, qui est la protéine qui forme des amyloïdes dans l’amylose liée à la dialyse29,après avoir initié la formation amyloïde avec Cu(II)15,16,26. La comparaison de la réactivité DEPC du monomère β2m avec le dimère pré-amyloïde β2m qui se forme 2 h après l’ajout de Cu(II) montre que neuf résidus subissent des diminutions dans l’étiquetage tandis que six résidus ne subissent aucun changement ou de légères augmentations dans l’étiquetage (Figure 6A). Lors de la cartographie de ces changements sur le β2m, il est immédiatement évident que l’interface dimère implique les feuilles de β ABED de monomères β2m(figure 6B)15.

DEPC CL-MS pour étudier la liaison protéine-ligand
La liaison du ligand aux protéines entraîne une diminution de l’accessibilité au solvant des résidus qui interagissent avec le ligand, et la CL-MS à base de DEPC peut être utilisée pour identifier les sites de liaison au ligand sur les protéines. Par exemple, les sites de liaison de l’épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) sur β2m dans des conditions de formation d’amyloïde peuvent être identifiés par des diminutions significatives du étiquetage de DEPC au niveau des résidus enfouis par la liaison d’EGCG. En présence d’ECGC, Lys6 et Lys91 ont des pourcentages de modification de DEPC plus faibles (Figure 7), et ces résidus sont regroupés dans une région de la protéine, indiquant une protection des résidus due à la liaison au ligand. Le N-terminus, Thr4, et His31, quant à eux, subissent des augmentations des étendues d’étiquetage(Figure 7),qui sont indicatives des changements structurels induits par ECGC et suggèrent que les sites de liaison Cu(II) sur β2m (N-terminus et His31)14,30,31 peuvent être perturbés à la suite de la liaisonECGC 32. De plus, les sites de liaison des deux autres inhibiteurs de petites molécules de la formation amyloïde β2m, la rifamycine SV et la doxycycline, ont été identifiés à l’aide de CL-MS19. Dans cette étude, cependant, les résultats de l’étiquetage DEPC seul n’étaient pas suffisants pour cartographier les sites de liaison avec une résolution structurelle suffisante. Les résultats de trois réactifs CL différents, à savoir la paire DEPC, BD et 1-éthyl-3-(3-(diméthylamino)propyl)carbodiimide - ester éthylique de glycine (EDC/GEE) ont été nécessaires pour mieux localiser les sites de liaison19.

Amélioration de la résolution structurelle et réduction du brouillage des étiquettes
Même si le étiquetage DEPC provoque la formation d’une liaison covalente, une perte d’étiquette due à l’hydrolyse peut se produire, en particulier pour les résidus Ser, Thr et Tyr (Figure 8). La perte d’étiquette peut être minimisée en diminuant le temps entre la réaction DEPC CL et l’analyse de LC-MS utilisant de courtes digestions protéolytiques (par exemple, digestion de 2 h avec des enzymes immobilisées) plutôt que des digestions de nuit. Les digestions rapides entraînent la mesure d’un plus grand nombre de résidus modifiés, ce qui augmente la quantité d’informations structurelles sur les protéines. Par exemple, une digestion de 2 h avec de la chymotrypsine immobilisée conduit constamment à l’identification de plus de résidus modifiés par le DEPC dans β2m(figure 9)17. Avec une digestion pendant la nuit, environ 75% des résidus ser, thr, tyr, his et lys dans β2m sont détectés, mais lorsque le temps entre le étiquetage et la LC-MS est réduit en utilisant une digestion de 2 h, 95% de ces résidus dans β2m sont détectés. La plupart des résidus modifiés nouvellement détectés sont des résidus tyr et thr qui sont sujets à l’hydrolyse.

Au cours de notre travail avec DEPC, nous avons remarqué que dans certaines protéines, les résidus de Cys provenant des liaisons disulfures sont modifiés par DEPC, même si les liaisons disulfures sont intactes lors des réactions de étiquetage DEPC. Un tel marquage des résidus de Cys se produit parce que les thiols libres peuvent réagir avec d’autres résidus modifiés en solution(figure 10),ce qui conduit à ce que l’on appelle le « brouillage de l’étiquette » lorsque le groupe carbéthoxy est transféré au résidu Cys. Le brouillage de l’étiquette diminue les niveaux de modification à d’autres résidus et fournit des informations structurelles incorrectes sur les protéines. Pour éviter le brouillage de l’étiquette, les thiols Cys libres doivent être entièrement alkylés juste après réduction du disulfure33.

Figure 1
Figure 1: Marquage covalent-spectrométrie de masse (CL-MS). Un réactif monofonctionnel est utilisé pour modifier les acides aminés accessibles au solvant et peut être utilisé pour fournir des informations spécifiques au site sur les changements conformationnels ou les interfaces d’interaction dans les protéines (image supérieure ou inférieure). La protéine modifiée est digérée protéolytiquement, et les peptides résultants sont analysés par chromatographie liquide (LC) en conjonction avec MS et MS tandem (MS/MS). La figure a été adaptée de Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Interactions. Méthodes 144, 79-93 (2018). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Volume utilisé (μL) Concentration en solution (μM)
Protéines (100 μM, MOPS) 50 50
MOPS (10 mM, pH 7,4) 48.8 n/a
DEPC (100 mM) 0.2 200 (=4x[protéine])
Imidazole (1 M) 1 10 000 (=50x[DEPC])
Total Volume 100

Tableau 1. Protocole d’étiquetage DEPC général.

Figure 2
Figure 2. Exemple de gradient LC pour la séparation des peptides. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Graphique 3 Illustration de la façon dont les sites étiquetés DEPC sont identifiés et leurs niveaux de modification sont calculés. Après le étiquetage DEPC et la digestion protéolytique, (A) l’analyse LC-MS de la protéine digérée est effectuée. Les zones de crête des peptides (B) non marqués et (C) marqués dans un chromatogramme sont utilisées pour calculer le pourcentage de étiquetage. Au cours de la LC-MS, les peptides sont soumis à la CID MS/MS. Les spectres de masse en tandem de peptides (D) non marqués et (E) &(F) marqués obtenus à des temps de rétention spécifiques sont utilisés pour le séquençage peptidique et l’identification des sites marqués par DEPC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

résidu b2m b2m-Cu
Thr4 0,082 ± 0,004 0,052 ± 0,009
His13 0,041 ± 0,003 0,033 ± 0,005
His31 0,010 ± 0,001 0,003 ± 0,001
Ser33 0,010 ± 0,002 0,004 ± 0,001
His51 0,036 ± 0,003 0,030 ± 0,004
Ser88 0,029 ± 0,007 0,020 ± 0,006

Tableau 2 Coefficients de taux de modification de DEPC spécifiques au site (k, M-1s-1)pour b2m en l’absence et en présence de Cu(II).

Figure 4
Graphique 4 Utilisation de DEPC CL-MS pour déterminer l’effet de la liaison au Cu(II) sur la structure du β2m: (A) Cartographie de surface des protéines des résidus avec des diminutions significatives des taux d’étiquetage DEPC (bleu), indiquant des changements dans leur accessibilité au solvant lors de la liaison au Cu(II), et ceux sans changements significatifs dans le taux d’étiquetage (magenta) (code d’accession APB 1JNJ). (B) Exemple de placettes cinétiques de second ordre spécifiques au site de la réaction de β2m avec différentes concentrations de DEPC en présence et en l’absence de Cu(II). Le coefficient de taux d’étiquetage (k) peut être obtenu à partir de la pente de la placette cinétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Graphique 5 Résultats de l’étiquetage covalent pour le β2m stressé par rapport au β2m natif: (A) Stress thermique - chauffage à 75 °C pendant 24 h et (B) stress oxydatif - avec 3%H2O2pendant 24 h. Les changements significatifs dans les pourcentages de modification sont indiqués en bleu (diminution de l’étiquetage) et en rouge (augmentation de l’étiquetage), tandis que les résidus sans changements significatifs d’étiquetage sont indiqués en vert pâle (code d’accession APB 1JNJ). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Graphique 6 Utilisation de DEPC CL-MS pour déterminer l’interface du dimère pour le dimère pré-amyloïde de β2m: (A) Résumé des changements de niveau de modification de DEPC pour les résidus modifiés dans le monomère (c’est-à-dire t = 0) et le dimère 2 h après l’ajout de Cu(II). Les résidus dont l’étendue de l’étiquetage diminue considérablement sont signalés par un astérisque (*). (B) Résultats de l’étiquetage covalent cartographiés sur la structure β2m. Les résidus dont l’étiquetage a diminué sont indiqués en bleu et les résidus sans modification ou légère augmentation de l’étiquetage sont indiqués en rouge (code d’accession APB 1LDS). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Graphique 7 Résultats covalents d’étiquetage pour EGCG-lié contre b2m non lié. Les pourcentages de modification de DEPC sont indiqués pour les résidus affichés. Les différences statistiquement significatives dans le pourcentage d’étiquetage covalent sont indiquées par un astérisque (*). Les augmentations de l’étiquetage lors de la liaison ecgc sont indiquées en rouge tandis que les diminutions sont indiquées en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Graphique 8 Réactions de étiquetage covalent de DEPC (substitution d’acyle nucléophile) et perte d’étiquette (hydrolyse des résidus carbéthoxylés) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Graphique 9 Cartographie des sites de modification mesurés sur β2m. (A) sites marqués après digestion pendant la nuit conventionnelle, et (B) emplacements marqués après une digestion de 2 h avec la chymotrypsine immobilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10 Mécanisme hypothétique du brouillage de l’étiquette DEPC (Cys capture de carbethoxylated His) S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Étapes critiques
Plusieurs points concernant la conception expérimentale devraient être pris en compte pour assurer des résultats d’étiquetage fiables. Tout d’abord, pour maximiser l’étiquetage des protéines, il est nécessaire d’éviter les tampons avec des groupes fortement nucléophiles (par exemple, Tris) car ils peuvent réagir avec le DEPC et réduire l’étendue de l’étiquetage. Il est également concevable que de tels tampons puissent réagir avec des résidus étiquetés, entraînant la suppression de l’étiquette et donc la perte d’informations structurelles. Nous recommandons mops comme tampon, mais la solution saline tamponnée au phosphate fonctionne également. Deuxièmement, le dithiothreitol doit être évité pour la réduction des liaisons disulfures car les thiols libres dans ce réactif peuvent réagir avec des résidus marqués et éliminer la modification de DEPC. Cette même chimie est la raison pour laquelle il est essentiel d’alkyler les disulfures réduits parce que le Cys libre peut provoquer un brouillage intra-protéique de l’étiquette33. Troisièmement, l’étape de trempe avec l’imidazole (étape 2.4 du protocole) est essentielle pour arrêter la réaction de marquage afin que tout DEPC restant soit incapable de continuer à réagir avec la protéine.

Il est également important d’apprécier que la réaction de étiquetage DEPC est de 2es ordre, ce qui signifie que la modification de la protéine ou de la concentration de DEPC affectera l’étendue de l’étiquetage. Nous avons constaté empiriquement qu’un rapport de concentration de 4:1 DEPC:protéine est une valeur raisonnable lorsque la protéine a une concentration dans les 10 de gamme de μM, car elle tend à éviter tout changement structurel induit par l’étiquetage14. Cependant, le rapport optimal de concentration de DEPC:protéine est protéine-dépendant aussi bien que de concentration-dépendant, et certaines protéines exigent des rapports plus élevés pour obtenir l’étiquetage suffisant. La concentration optimale de DEPC pour minimiser la perturbation structurelle du étiquetage d’une protéine donnée peut être estimée à partir du nombre de solvants accessibles His et Lys résidus23.

Pour éviter la variabilité des étendues d’étiquetage due à la dégradation des réactifs au fil du temps, les réactions de contrôle et expérimentales devraient idéalement être effectuées le même jour. Le DEPC subit une hydrolyse rapide lorsqu’il est exposé à l’eau et se dégrade également pendant le stockage, de sorte que les bonnes pratiques de laboratoire et la manipulation des réactifs sont essentielles. Lorsqu’elle n’est pas utilisée, la bouteille de stock DEPC doit être stockée dans un dessicateur.

Modifications et dépannage
Étant donné que le CL DEPC est une réaction à commande cinétique, la vitesse d’étiquetage, et donc le niveau de modification, sont contrôlés par les concentrations de protéines et de réactifs, le temps d’étiquetage et la température. Comme indiqué ci-dessus, souvent DEPC CL est effectué pendant 1 minute à 37 °C avec un rapport molaire DEPC/protéine de 4 pour 1. A ce rapport molaire (4x), les protéines peuvent être étiquetées en toute sécurité sans perturbations structurelles14. DEPC: les rapports molaires des protéines qui sont supérieurs à 4 peuvent être utilisés pour certaines protéines, et sans surprise des concentrations plus élevées de DEPC entraînent un étiquetage plus étendu et plus d’informations structurelles. Le moyen le plus sûr d’utiliser des concentrations plus élevées de DEPC sans structure perturbante est de générer des diagrammes dose-réponse dans lesquels la réactivité des fragments protéolytiques d’une protéine est mesurée en fonction de la concentration de DEPC (voir figure 4B)14,24. Toutefois, cette approche peut prendre beaucoup de temps, car elle nécessite plusieurs mesures. Récemment, nous avons démontré que la concentration optimale de DEPC peut être estimée pour une protéine donnée à partir du nombre et du SASA de résidus His et Lys dans cette protéine23. Dans des travaux récents, nous avons également suggéré d’autres façons d’évaluer que la structure d’une protéine n’est pas perturbée pendant CL9,24.

La digestion protéolytique est également une étape importante dans le DEPC CL-MS, car les peptides générés permettent de localiser les informations structurelles après l’analyse LC-MS / MS. En général, les sérine protéases telles que la trypsine et la chymotrypsine sont efficaces pour la digestion des protéines. La trypsine est plus couramment utilisée en raison de son efficacité de clivage et de sa spécificité du côté C-terminal des résidus de Lys et d’Arg. Cependant, la trypsine ne se fend généralement pas après les résidus de Lys marqués par le DEPC, ce qui provoque un clivage manqué aux résidus de Lys marqués qui peuvent parfois compliquer l’analyse des données. L’activité de la chymotrypsine, qui se fend après des résidus hydrophobes encombrants, n’est généralement pas affectée par le étiquetage DEPC, mais cette enzyme a une efficacité et une spécificité de clivage inférieures à celles de la trypsine. En outre, pour les protéines avec de nombreux résidus hydrophobes, la chymotrypsine peut générer plusieurs fragments peptidiques courts qui peuvent être difficiles à séparer et à détecter dans des conditions standard de LC-MS.

Les analyses LC-ESI-MS/MS des digestions protéiques nécessitent un électrospray stable pour obtenir des résultats semi-quantitatives fiables. Capillaire et nano LC sont des plates-formes de séparation couramment utilisées où une séparation efficace peut être obtenue avec de petites quantités de protéines. Cependant, d’après notre expérience, la LC capillaire fournit des informations quantitatives plus fiables (c’est-à-dire les niveaux de modification) que les nano LC en raison des quantités d’échantillons plus élevées utilisées. Pour les grandes protéines qui sont digérées dans un grand nombre de peptides marqués et non marqués, la coelution de peptides avec une hydrophobicité similaire peut se produire. Dans ces cas, des gradients LC plus longs devraient être utilisés pour de meilleures séparations.

La SP/SM rapide et efficace est importante pour une bonne couverture des séquences et une bonne identification du site sur l’étiquette. Les spectromètres de masse avec pièges à ions quadripolaire sont d’excellents instruments à cet effet. Généralement, cid est une méthode commune et très efficace pour la dissociation peptidique ; cependant, nous avons observé des cas de brouillage de l’étiquette DEPC au cours de la CID d’ions peptidiques marqués, ce qui entraîne une ambiguïté dans l’étiquetage de l’identité du site34. Dans ces cas plutôt rares, ETD fournit des informations plus fiables. Par conséquent, si possible, l’alternance entre les deux techniques de dissociation peut être utile. Étant donné que le DEPC peut étiqueter de nombreux types de résidus différents, il est courant que des isomères d’un fragment peptidique donné soient générés qui diffèrent dans la chaîne latérale modifiée. Plusieurs fois, ces isomères peptidiques peuvent être séparés par LC, bien qu’ils aient tendance à éluer à des moments très similaires. Cette probabilité doit être prise en compte lors de la définition des temps d’exclusion des MS/MS lors des analyses automatisées LC-MS/MS. En règle générale, des temps d’exclusion plus courts que d’habitude doivent être utilisés.

Limitations
Bien que la CL-MS de DEPC soit extrêmement bénéfique pour l’étude de la structure et des interactions protéiques, et que des progrès significatifs aient été réalisés pour traiter une grande variété de systèmes protéiques, certaines limites de cette technique demeurent. Si les conditions d’étiquetage ne sont pas bien optimisées (par exemple, en utilisant une concentration trop élevée de DEPC), un étiquetage trop élevé peut perturber la structure protéique et entraîner des informations structurelles inexactes14,23,24. De plus, l’exactitude et la précision des niveaux de modification mesurés sont affectées par plusieurs facteurs, y compris la perte sur l’étiquette si les échantillons restent trop longtemps avant l’analyse LC-MS et les erreurs dans les étapes d’étiquetage chimique. La cohérence de chaque étape expérimentale est importante pour des résultats fiables. L’un des problèmes les plus difficiles actuellement associés au CL-MS basé sur DEPC est le logiciel d’analyse de données. Les programmes d’analyse de données facilement disponibles ne sont pas optimisés pour identifier avec succès les peptides avec de faibles pourcentages de modification (p. ex., < 1 %). Par conséquent, nous avons développé et utilisé un logiciel spécialisé pour permettre d’identifier facilement les peptides à faible niveau de modification18.

Même si dePC CL-MS peut fournir une résolution structurelle modérée de protéine, une structure 3D détaillée ne peut pas être obtenue à partir de la technique de étiquetage. Récemment, certains outils de prédiction structurelle basés sur des données d’étiquetage ont été développés35,36. Cependant, d’autres développements sont nécessaires pour intégrer de manière optimale les résultats de l’étiquetage DEPC avec une modélisation informatique pour prédire la structure des protéines.

Importance par rapport aux méthodes alternatives
La résolution structurelle possible avec cl-ms à base de DEPC est modérée par rapport à des techniques comme la cristallographie aux rayons X ou la RMN, il est donc plus approprié de comparer la technique à HDX-MS, XL-MS, et d’autres cl-ms, ou empreinte, approches. Comme mentionné dans l’introduction, cl-ms est complémentaire à HDX-MS parce qu’il fournit des informations sur les chaînes latérales de résidus dans une protéine, tandis que HDX-MS rapporte sur la structure et la dynamique du squelette. Cette complémentarité permet d’utiliser ensemble les deux techniques pour obtenir des informations plus structurelles, comme l’ont montré plusieurs groupes37,38,39,40,41. Une idée émergente pertinente pour CL-MS basée sur DEPC est l’information synergique qui est disponible lorsqu’il est utilisé en conjonction avec HDX-MS22. En raison des délais d’étiquetage associés aux deux techniques, cl-ms à base de DEPC peut souvent clarifier l’ambiguïté avec les régions protéiques qui subissent une diminution du HDX. La diminution du HDX peut résulter soit d’une accessibilité réduite des solvants due à la liaison, soit d’une diminution de la dynamique des protéines. Les réactions DEPC sont intrinsèquement 2-3 ordres de grandeur plus lentes que les réactions HDX, de sorte que le étiquetage DEPC n’est en grande partie pas affecté par les changements dans la dynamique des protéines tant qu’ils ne sont pas accompagnés de changements dans l’accessibilité des solvants.

Cl-MS présente certains avantages par rapport aux expériences HDX-MS en ce que le brouillage et la perte d’étiquette sont minimes lorsque des précautions appropriées sont prises. Dans les expériences HDX, la perte d’étiquette ou le rétro-échange est une caractéristique standard de la technique, et les digestions rapides et les séparations LC à faible pH sont des tentatives pour minimiser ce problème. Il est important de reconnaître, cependant, que le problème d’échange arrière est contrebalancé par le nombre plus élevé de sites étiquetés qui sont généralement mesurés dans HDX-MS. Le brouillage d’étiquetage est un problème plus important dans HDX-MS car des informations incorrectes seraient alors obtenues, de sorte que les conditions d’analyse doivent être optimisées pour minimiser ce problème.

XL-MS et CL-MS présentent des avantages similaires en ce qui concerne la perte d’étiquette et le brouillage, car les deux impliquent la formation d’une liaison covalente suffisamment robuste pour rester pendant la digestion et les analyses LC-MS. Le séquençage et l’identification des peptides réticulés, cependant, sont plus difficiles que pour les peptides marqués de manière covalente, nécessitant l’utilisation d’un logiciel spécialisé. L’un des principaux avantages de XL-MS par rapport à CL-MS est sa capacité à fournir des contraintes de distance, ce qui peut être utile lors de la prédiction ou de la réduction des structures protéiques possibles. Les données cl-ms ont été utilisées pour faciliter la prédiction de la structure des protéines36,42,43,mais ce domaine nécessite plus de travail pour atteindre pleinement son potentiel.

Par rapport à d’autres méthodes cl-ms, y compris celles qui utilisent des réactifs d’étiquetage spécifiques ou non spécifiques, DEPC présente certains avantages et inconvénients. Comme les méthodes qui utilisent des réactifs spécifiques aux acides aminés, le étiquetage DEPC est simple; le réactif doit seulement être ajouté à l’échantillon d’intérêt. Cette simplicité contraste avec des méthodes telles que l’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP) ou la HRF à base de synchrotron qui nécessitent des sources de lumière sophistiquées pour produire des radicaux hydroxyles. Contrairement aux méthodes qui utilisent des réactifs spécifiques, DEPC peut étiqueter six acides aminés différents et le N-terminus, ce qui lui permet de fournir une résolution structurelle plus élevée. Cependant, le nombre de résidus qui peuvent être marqués par DEPC sont inférieurs au nombre qui peuvent être oxydés par des radicaux hydroxyles, de sorte que la résolution structurelle pouvant être obtenue par CL-MS à base de DEPC est inférieure. Une ramification pratique de moins de résidus marqués par DEPC est que l’utilisation du réactif ne fournit parfois pas toutes les informations structurelles souhaitées, et qu’il peut donc bénéficier d’être utilisé en conjonction avec d’autres réactifs de étiquetage. Nous avons récemment démontré l’intérêt d’utiliser le DEPC avec la paire de réactifs 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC)/éther éthylique de glycine (GEE), qui peut étiqueter les résidus de glutamate et d’aspartate19.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent le soutien des National Institutes of Health (NIH) dans le cadre de la subvention R01 GM075092. Le spectromètre de masse Thermo Orbitrap Fusion utilisé pour acquérir certaines des données décrites ici a été acquis avec des fonds de la subvention S10OD010645 des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

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Chimie Numéro 172 Spectrométrie de masse étiquetage covalent structure d’ordre supérieur des protéines complexes protéine-ligand complexes protéiques diéthylpyrocarbonate surface accessible aux solvants
Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse
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