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Biology

डीएनए हेलो पर सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति पूरे गुणसूत्र, टेलोमेरेस और जीन लोकी को प्रकट करने की तैयारी करती है

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62017
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London, 2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

ERRATUM NOTICE

Summary

सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति के साथ डीएनए हेलो तैयारी का संयोजन न्यूक्लियोस्केलेटन के साथ जीनोमिक इंटरैक्शन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण को सक्षम बनाता है। संलग्न जीनोम अवशिष्ट निकाले गए नाभिक के भीतर स्थित संकरित फ्लोरोसेंट संकेतों की ओर जाता है, जबकि गैर-संलग्न जीनोम अवशिष्ट नाभिक के आसपास डीएनए के प्रभामंडल में होता है।

Abstract

जीनोम सेल नाभिक के अंदर कई संरचनाओं से जुड़ा हुआ है, ताकि इसकी गतिविधि को विनियमित किया जा सके और इसे विशिष्ट स्थानों में लंगर डाला जा सके। इन संरचनाओं को सामूहिक रूप से न्यूक्लियोस्केलेटन के रूप में जाना जाता है और इसमें परमाणु लैमिना, न्यूक्लियोली और परमाणु निकाय शामिल हैं। यद्यपि जीनोम और उसके संगठन का अध्ययन करने के लिए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) के कई प्रकार मौजूद हैं, ये अक्सर संकल्प द्वारा सीमित होते हैं और परमाणु संरचनाओं के साथ जीनोम के संबंध पर अपर्याप्त जानकारी प्रदान करते हैं। डीएनए हेलो विधि डीएनए लूप उत्पन्न करने के लिए उच्च नमक सांद्रता और गैर-आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग करती है जो जीनोम के भीतर अनुलग्नक क्षेत्रों के माध्यम से नाभिक के भीतर संरचनाओं में लंगर डालती है। यहां, घुलनशील परमाणु प्रोटीन, जैसे हिस्टोन, लिपिड और डीएनए परमाणु मैट्रिक्स से कसकर बंधे नहीं होते हैं, निकाले जाते हैं। यह एक अवशिष्ट नाभिक के आसपास असंबद्ध डीएनए के प्रभामंडल के गठन की ओर जाता है जिसमें स्वयं आंतरिक परमाणु संरचनाओं और निष्कर्षण प्रतिरोधी प्रोटीन के साथ निकटता से जुड़े डीएनए होते हैं। ये विस्तारित डीएनए किस्में बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन को सक्षम करती हैं और भौतिक मानचित्रण की सुविधा प्रदान कर सकती हैं। फिश के साथ संयोजन में, इस विधि में उन सभी संरचनाओं के साथ जीनोमिक इंटरैक्शन का अध्ययन करने का अतिरिक्त लाभ है जो जीनोम द्वारा लंगर डाला जाता है। यह तकनीक, जिसे हेलो-फिश कहा जाता है, अत्यधिक बहुमुखी है जिससे डीएनए हेलो को जीन लोकी, पूरे गुणसूत्र, अल्फा उपग्रह, टेलोमेरेस और यहां तक कि आरएनए को प्रकट करने के लिए न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ जोड़ा जा सकता है। यह तकनीक परमाणु संगठन और सामान्य कोशिकाओं में और कैंसर जैसे रोग की प्रगति में एक अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

Introduction

"परमाणु मैट्रिक्स" को पहली बार 1974 में बेरेज़नी और कॉफी द्वारा वर्णित किया गयाथा। चूहे के यकृत नाभिक पर उच्च नमक दाढ़ और न्यूक्लियस उपचार के साथ निष्कर्षण करने के बाद, उन्होंने एक प्रोटीनयुक्त संरचनात्मक ढांचे की पहचान की। डीएनए हेलो प्रक्रिया को बाद में इस विधि से अनुकूलित किया गया था और इसमें घुलनशील प्रोटीन को हटाना शामिल है ताकि केवल परमाणु मैट्रिक्स (एनएम) और एनएम से जुड़े प्रोटीन और गुणसूत्र बने रहें। डीएनए अनुलग्नक क्षेत्र डीएनए लूप के आधार पर स्थित होते हैं और उन्हें मैट्रिक्स संलग्न क्षेत्र (एमएआर) या पाड़ अनुलग्नक क्षेत्र (एसएआर) कहा जाता है, जो क्रमशः उच्च नमक सांद्रता और आयनिक डिटर्जेंट लिथियम -3,5-डायियोडोसैलिसिलेट (एलआईएस) के साथ निष्कर्षण के लिए प्रतिरोधी होते हैं। डीएनए प्रभामंडल में, एमएआर / एसएआर से जुड़े डीएनए अवशिष्ट नाभिक के भीतर बंधे होते हैं जबकि डीएनए लूप इन साइटों से दूर होते हैं और डीएनए प्रभामंडल बनाते हैं। अब हम जानते हैं कि जीनोम को लैमिना से जुड़े डोमेन (एलएडी) के माध्यम से परमाणु लैमिना और न्यूक्लियोलर संबद्ध क्षेत्रों (एनएडी) के माध्यम से और संभवतः विशिष्ट परमाणु निकायों जैसे अन्य परमाणु संरचनाओं के माध्यम से लंगर डाला जाता है।

डीएनए हेलो विधि का उपयोग डीएनए, जीन और क्रोमोसोमल क्षेत्रों के भौतिक मानचित्रण के लिए किया जा सकता है क्योंकि विस्तारित डीएनए और क्रोमैटिन एक अधिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है क्योंकि क्रोमैटिन को हिस्टोन से छीन लिया जाता है और डीएनए 2,3,4,5,6 तक फैला होता है। हालांकि, इस आवेदन के लिए डीएनए हेलो का उपयोग करते समय कुछ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, डीएनए प्रभामंडल के अवशिष्ट नाभिक के साथ कसकर जुड़े डीएनए जांच के लिए दुर्गम हो सकते हैं, इस प्रकार इसे विश्लेषण और भौतिक मानचित्रण से अलग किया जा सकताहै। फाइबर-फिश 2,4,5,7 और आणविक कॉम्बिंग 8 जैसी अन्य तकनीकें भी भौतिक मानचित्रण को सक्षम करती हैं और अपेक्षाकृत तेज और प्रदर्शन करने में आसान होने का लाभ रखती हैं। दोनों अधिमानतः डीएनए प्रभामंडल पर जीन के डीएनए मानचित्रण के लिए उपयोग किए जाते हैं। ये विधियां नाभिक से विलायक या नमक निष्कर्षण के उपयोग के माध्यम से क्रोमैटिन फाइबर निकालती हैं, हालांकि, आणविक कंघी में बेहतर प्रजनन क्षमता 8,9 होती है।

एक बढ़ते सबूत हैं कि न्यूक्लियोस्केलेटन की प्रमुख परमाणु प्रक्रियाओं का समर्थन करने में भूमिका है, जैसे कि डीएनए, क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग, डीएनए ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए मरम्मत और डीएनए प्रतिकृति11,12 के लिए अनुलग्नक साइटें। जैसे, डीएनए हेलो तकनीक इन सेलुलर गतिविधियों के दौरान न्यूक्लियोस्केलेटन और जीनोम के बीच बातचीत की जांच करने के लिए विकसित की गई थी और अनुसंधान में नियमित रूप से उपयोग और रिपोर्ट की गई है। इस तकनीक का उपयोग परमाणु संरचना में घातकता से जुड़े परिवर्तनों के साथ रोग की प्रगति के संबंध में जीनोम और न्यूक्लियोस्केलेटन के बीच बातचीत की जांच करने के लिए भी किया गयाहै।

विकास और भेदभाव12 के दौरान जीनोम और न्यूक्लियोस्केलेटन के बीच संबंधों की जांच करने के लिए डीएनए हेलो तकनीक का भी उपयोग किया गया है। कई अध्ययनों ने डीएनए हेलो तकनीक की भिन्नता का उपयोग किया है जिसे हेलोस्पर्म13 या स्पर्महेलो-फिश के रूप में जाना जाता है यदि फिश14 के साथ युग्मित किया जाता है। शुक्राणुक्रोमैटिन प्रोटीन से कसकर बंधा होता है जिसे प्रोटामाइन कहा जाता है और इस तकनीक को शुक्राणु डीएनए तक पहुंच में सुधार के लिए विकसित किया गया था। हेलोस्पर्म का उपयोग शुक्राणुडीएनए की अखंडता की जांच करने और यह निर्धारित करने के लिए किया गया है कि डीएनए क्षति मौजूद है या नहीं। कम डीएनए क्षति वाले शुक्राणु एक बड़े डीएनए प्रभामंडल के आकार से संबंधित होते हैं, जबकि खंडित और क्षतिग्रस्त डीएनए के बढ़े हुए स्तर वाले शुक्राणुओं में या तो छोटे प्रभामंडल होते हैं या कोई भी नहीं होता है। इस प्रकार, हेलोस्पर्म का उपयोग आईवीएफ13 के साथ भ्रूण की गुणवत्ता और सफल गर्भावस्था के संभावित रोगसूचक मार्कर के रूप में किया जा सकता है। यह उदाहरण इस तकनीक के संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों पर जोर देता है। हमारे काम में हमने जीनोम व्यवहार में परिवर्तन और समय से पहले उम्र बढ़ने की बीमारी हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम (एचजीपीएस) 15 में विशिष्ट दवा उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए हेलो-फिश का उपयोग किया है।

साथ में, और अन्य अध्ययन, प्रक्रियाओं / अनुप्रयोगों की चौड़ाई को उजागर करते हैं जो डीएनए हेलो तकनीक का उपयोग तकनीक के अध्ययन और उपयोगिता के लिए किया जा सकता है।

Protocol

1. स्लाइड तैयारी, नसबंदी और सेल संस्कृति

  1. 10% एचसीएल (वी / वी) का 500 एमएल तैयार करें और एक बड़े बीकर में डालें।
  2. माइक्रोस्कोप स्लाइड को व्यक्तिगत रूप से एसिड में गिराएं और 2 x g पर शेकर सेट पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    चेतावनी: एचसीएल संक्षारक और एक अड़चन है। यह गंभीर त्वचा जलने और आंखों की क्षति और त्वचा, आंखों और श्वसन प्रणाली की जलन का कारण बन सकता है। सुनिश्चित करें कि नाइट्राइल दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और एक प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा पहनी जाती है।
  3. बीकर से डिकेंट एसिड और नल के पानी में दस बार स्लाइड धोएं और फिर विआयनीकृत पानी में दस बार।
  4. मेथनॉल में स्लाइड को दो बार कुल्ला करें और फ्लेमिंग द्वारा नसबंदी तक मेथनॉल में रखें।
    सावधानी: मेथनॉल एक अत्यधिक ज्वलनशील तरल है और यदि निगल लिया जाता है, तो त्वचा के संपर्क में या यदि साँस ली जाती है। इसके अलावा, मेथनॉल अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है, संक्षारक और एक अड़चन है। कार्यस्थल जोखिम सीमा का पालन करें और सुनिश्चित करें कि ब्यूटाइल-रबर दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा पहनी जाए। जहां संभव हो स्थानीय निकास वेंटिलेशन (एलईवी) फ्यूम अलमारी में संभालना।
  5. धातु चिमटे या लंबे बल का उपयोग करके, मेथनॉल युक्त बीकर से एक माइक्रोस्कोप स्लाइड निकालें। बन्सन बर्नर पर लौ को स्टरलाइज़ करने के लिए, और एक आयताकार सेल कल्चर पोत में स्थानांतरित करें, जिसमें स्लाइड के लिए चार डिब्बे हों, जो बनसेन बर्नर के करीब स्थित है।
    सावधानी: फ्लेमिंग उपयोग से पहले माइक्रोस्कोप स्लाइड की तत्काल नसबंदी की अनुमति देता है; हालांकि, इस विधि में संबंधित खतरे हैं। चूंकि मेथनॉल अत्यधिक ज्वलनशील है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि स्लाइड युक्त बीकर को बनसेन बर्नर से दूर रखा जाए। लंबे चिमटे या बल का उपयोग किया जाना चाहिए जो स्लाइड को कसकर पकड़ते हैं। बीकर में मेथनॉल स्तर को सिर्फ स्लाइड को कवर करना चाहिए, दोनों उपयोग किए गए मेथनॉल की मात्रा को कम करने के लिए और ताकि केवल फोर्सप्स / चिमटे के छोर मेथनॉल के संपर्क में हों। हमेशा सुनिश्चित करें कि मेथनॉल उपयोग के बाद बल या चिमटे से वाष्पित हो गया है और ये स्लाइड और मेथनॉल युक्त बीकर में वापस रखने से पहले ठंडा हो गए हैं। मेथनॉल में आग लगने पर ऑक्सीजन को भूखा रखने के लिए बीकर को एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े से कवर किया जाना चाहिए। कभी भी लौ द्वितीय श्रेणी के लामिनर प्रवाह हुड के भीतर स्लाइड न करें जहां हवा प्रसारित हो रही है।
  6. वैकल्पिक रूप से, चरण 1.1 से 1.4 करें, लेकिन मेथनॉल के साथ इंजेक्ट करने के बाद स्लाइड ्स को जलाने के बजाय, लिंट-फ्री ऊतक पर स्लाइड ्स को हवा में सूखने के लिए रखें। सूखने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें और स्टेरिलाइज़र ओवन या आटोक्लेव में रखें।
  7. 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 48 घंटे के लिए सीरम के साथ उपयुक्त माध्यम में कोशिकाओं को विकसित करें जब तक कि 60-70% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाए। यह प्रोटोकॉल मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट (एचडीएफ) और शास्त्रीय हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम (एचजीपीएस) फाइब्रोब्लास्ट (एजी06297) और एटिपिकल टाइप 2 एचजीपीएस फाइब्रोब्लास्ट (एजी08466) के प्रारंभिक मार्ग पर किया गया था। सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए प्रत्येक सेल प्रकार की कटाई करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती करें। बीज 1 x 105 कोशिकाएं 10 एमएल माध्यम प्रति स्लाइड में।
    नोट: सेल घनत्व महत्वपूर्ण है क्योंकि विभिन्न नाभिकों से डीएनए लूप अभिसरण हो सकते हैं यदि कोशिकाएं बहुत अधिक कंफ्लुएंट हो जाती हैं। सीडिंग घनत्व को सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि रूपांतरित कोशिकाएं अधिक तेज़ी से फैल सकती हैं, जबकि बाद में मार्ग सेल संस्कृतियों को वांछित प्रवाह तक पहुंचने में अधिक समय लग सकता है।
  8. यदि कोशिकाओं को क्वीसेंट बनने के लिए जी0 में गिरफ्तार करने की आवश्यकता होती है, तो प्रति स्लाइड 1 x 105 कोशिकाओं (10 एमएल माध्यम में) को बीज दें और 24 घंटे के लिए बढ़ने के लिए छोड़ दें। कोशिकाओं को सीरम-मुक्त माध्यम से दो बार धोएं और मानक माध्यम में इनक्यूबेट करें जिसमें 7 दिनों के लिए 0.5% (नवजात बछड़ा सीरम, एनसीएस; या भ्रूण गोजातीय सीरम, एफबीएस) पर सीरम की कम सांद्रता होती है।
  9. यदि डीएनए हेलो परख के लिए कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव स्थिति की आवश्यकता होती है, तो प्रतिकृति के दौरान डीएनए में 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सी-यूरिडीन (बीआरडीयू) को शामिल करके एस-चरण से गुजरने वाली कोशिकाओं का निर्धारण करें।
    1. बीज कोशिकाएं सामान्य रूप से और 24 घंटे तक बढ़ती हैं। कल्चर माध्यम को हटा दें और बीआरडीयू और 5-फ्लोरो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (3 μg / μL) युक्त माध्यम से प्रतिस्थापित करें। एक और 24 घंटे के बाद, माध्यम को हटा दें, कोशिकाओं को एक बार मध्यम (10% एनसीएस) से धो लें और फिर ताजा माध्यम (10% एनसीएस) के साथ फिर से खिलाएं। अतिरिक्त 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें और फिर डीएनए हेलो परख के लिए स्लाइड तैयार करें।

2. जांच की तैयारी

  1. क्रोमोसोम संपूर्ण और हाथ पेंटिंग जांच।
    1. टेलेनियस एट अल.16 द्वारा विधि का उपयोग करके ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमेड पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (डीओपी-पीसीआर) द्वारा क्रमबद्ध या सूक्ष्मविच्छेदित गुणसूत्रों के प्रवाह के प्रवर्धन से क्रोमोसोम जांच करें। तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार बायोटिन-16-डीयूटीपी या डिगोक्सीजेनिन -11-डीयूटीपी के साथ क्रोमोसोम जांच को लेबल करने के लिए डीओपी-पीसीआर का उपयोग करें। कृपया प्रवर्धन प्रोफ़ाइल के लिए निर्माता के निर्देशों की जाँच करें, हालांकि, इस प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली शर्तों को तालिका 2 में दिखाया गया है।
    2. लेबल पीसीआर उत्पाद के 8 μL, Cot-1 DNA के 7 μL, हेरिंग शुक्राणु के 3 μL, 3 M सोडियम एसीटेट (pH 5.4) के 1/20वें आयतन और 100% इथेनॉल के 2 वॉल्यूम को जोड़कर हाथ या पूरे क्रोमोसोम प्रोब तैयार करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 30 मिनट के लिए जांच समाधान को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस विधि का उपयोग एकल गुणसूत्र जांच, या कई गुणसूत्र जांच बनाने के लिए किया जा सकता है यदि रुचि के प्रत्येक गुणसूत्र के लिए अलग-अलग लेबल (यानी, बायोटिन -16-यूटीपी और डिगोक्सीजेनिन -11-डीयूटीपी) का उपयोग किया जाता है।
      चेतावनी: इथेनॉल एक अत्यधिक ज्वलनशील तरल और वाष्प है और इससे आंखों में गंभीर जलन हो सकती है। गर्मी, गर्म सतहों और इग्निशन स्रोतों से दूर रखें। कार्यस्थल जोखिम सीमा का पालन करें और सुनिश्चित करें कि ब्यूटाइल-रबर दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा पहनी जाए। जहां संभव हो एक LEV फ्यूम अलमारी में संभाल।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 13,700 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज प्रोब समाधान और फिर 70% इथेनॉल के साथ धो लें। सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया को दोहराएं और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, इस बात का ध्यान रखें कि डीएनए गोली को परेशान या खो न दें। डीएनए गोली को सूखने दें।
    4. डीएनए गोली में संकरण बफर के 12 μL (50% फॉर्मामाइड, 10% डेक्सट्रान सल्फेट, 10% 20x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी; 3 एम एनएसीएल, 0.3 एम ट्राई-सोडियम साइट्रेट; पीएच 7.0), 1% (वी / वी) पॉलीऑक्सीथिलीन सोर्बिनल मोनोलॉरेट (ट्वीन -20)) जोड़ें। डीएनए गोली को संकरण बफर में घुलने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
      चेतावनी: फॉर्मामाइड कार्सिनोजेनिक और टेराटोजेनिक है इसलिए अजन्मे बच्चे को गंभीर नुकसान पहुंचा सकता है। यदि कोई महिला गर्भवती है या उसे संदेह है कि वह गर्भवती है तो उन्हें फॉर्मामाइड के साथ काम करने से बचना चाहिए। फॉर्मामाइड का उपयोग लेव फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए। कार्यस्थल जोखिम सीमा का पालन करें और सुनिश्चित करें कि ब्यूटाइल-रबर दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा पहनी जाए।
  2. बैक्टीरियल कृत्रिम क्रोमोसोम (बीएसी) से डीएनए अलगाव
    1. बीएसी क्लोन से ग्लिसरॉल स्टॉक के एक छोटे से हिस्से को लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेट (1% (डब्ल्यू / वी) एनएसीएल; 1% (डब्ल्यू / वी) ट्रिप्टोन, 0.5% (डब्ल्यू / वी) खमीर अर्क, 1.5% (डब्ल्यू / वी) एगर टेक्निकल, 12.5 μg / mL (डब्ल्यू / वी) क्लोरैम्फेनिकॉल) पर रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. प्लेट से एक कॉलोनी का चयन करें और 10 मिलीलीटर एलबी शोरबा (1% (डब्ल्यू / वी) एनएसीएल, 1% (डब्ल्यू / वी) बैक्टोट्रिप्टोन, 0.5% (डब्ल्यू / वी) खमीर अर्क, 12.5 μg / mL (डब्ल्यू / वी) क्लोरैम्फेनिकॉल) का टीका लगाएं। घोल को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिलाने वाले इनक्यूबेटर में छोड़ दें।
      सावधानी: क्लोरैम्फेनिकॉल कैंसर पैदा करने का संदेह है। देखभाल के साथ संभालें और जोखिम को कम करें।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1,700 x g पर सेंट्रीफ्यूज कल्चर।
    4. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ें और गोली में 300 μL P1 समाधान (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg / mL RNase A) जोड़ें। भंवर सख्ती से और कोशिकाओं को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. कोशिकाओं में पी 2 समाधान के 300 μL (0.2 M NaOH, 1% (w / v) सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS) ड्रॉपवाइज जोड़ें। बंद माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 5 बार उलटा करें और अधिकतम 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
      सावधानी: सोडियम हाइड्रॉक्साइड संक्षारक है और गंभीर त्वचा जलने और आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है। यह धातुओं के लिए संक्षारक हो सकता है। देखभाल के साथ संभालें और जोखिम को कम करें। कार्यस्थल जोखिम सीमा का पालन करें और सुनिश्चित करें कि नाइट्राइल-रबर दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा पहनी जाए। जहां संभव हो एक LEV फ्यूम अलमारी में संभाल।
      सावधानी: सोडियम डोडेसिल सल्फेट एक ज्वलनशील ठोस है, अगर निगल लिया जाता है तो हानिकारक होता है और त्वचा और श्वसन जलन पैदा कर सकता है। यह गंभीर आंखों की क्षति का कारण भी बन सकता है। सुनिश्चित करें कि नाइट्राइल-रबर दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और एक प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा पहनी जाती है। जहां संभव हो एक LEV फ्यूम अलमारी में संभाल।
    6. पी 3 (3 एम पोटेशियम एसीटेट) के 300 μL को धीरे-धीरे कोशिकाओं में जोड़ें और धीरे से मिलाएं। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8,100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को 800 μL बर्फ-ठंडे आइसोप्रोपेनोल युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को कई बार उलटा करें और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      सावधानी: आइसोप्रोपेनोल एक अत्यधिक ज्वलनशील तरल और वाष्प है और इससे गंभीर आंखों में जलन, उनींदापन या चक्कर आना हो सकता है। गर्मी, गर्म सतहों और इग्निशन स्रोतों से दूर रखें। कार्यस्थल जोखिम सीमाओं का पालन करें और सुनिश्चित करें कि नाइट्राइल-रबर दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा पहनी जाती है। जहां संभव हो एक LEV)फ्यूम अलमारी में संभाल।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 8,100 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला निकालें और दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ-ठंडा 70% इथेनॉल के 500 μL जोड़ें। कई बार इनवर्ट ट्यूब और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 8,100 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    9. सतह पर तैरनेवाला निकालें और कमरे के तापमान पर गोली को हवा में सुखाएं। एक बार जब गोली सूख जाती है, तो डायथाइल पाइरोकार्बोनेट-उपचारित पानी (डीईपीसी-उपचारित) के 40 μL में फिर से निलंबित कर दिया जाता है और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया जाता है। एक बार पूरी तरह से पुन: निलंबित होने के बाद 5 μL घोल निकालें और डीएनए की उपस्थिति की जांच के लिए 1% Agarose जेल पर लोड करें।
  3. निक अनुवाद के माध्यम से बीएसी की एकल जीन जांच तैयारी
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निक अनुवाद लेबलिंग किट का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग करें। घटकों और खंडों के लिए तालिका 3 देखें।
    2. डीएनए पोलीमरेज़ आई लास्ट को जोड़ते हुए तालिका 3 के घटकों को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक साथ जोड़ें, धीरे से मिलाएं और कुछ सेकंड के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। 2 घंटे के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर घोल को इनक्यूबेट करें।
    3. टुकड़े के आकार को सत्यापित करने के लिए, 2% एगारोस जेल पर समाधान के 5 μL लोड करें। डीएनए टुकड़े के आकार की सीमा 200-600 बीपी के बीच होनी चाहिए। यदि डीएनए टुकड़े का आकार बड़ा है, तो 15 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए समाधान को इनक्यूबेट करना जारी रखें और 2% एगारोस जेल पर उत्पादों को चलाएं।
    4. 10 mM EDTA, 0.1% SDS (0.5 M EDTA का 2.5 μL, 100 μL में pH 8.0 और 100 μL में 10% SDS का 1 μL) जोड़कर निक अनुवाद प्रतिक्रिया को रोकें। 5 मिनट के लिए घोल को 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    5. अनिगमित न्यूक्लियोटाइड को हटाने के लिए बीएसी जांच को स्पिन कॉलम में लागू करें। वाणिज्यिक स्पिन कॉलम खरीदे जा सकते हैं, या उन्हें निम्नानुसार सिरिंज का उपयोग करके बनाया जा सकता है:
    6. कॉलम बफर के 30 ग्राम सेफाडेक्स जी -50 से 500 एमएल (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8), 1 एमएम ईडीटीए, 0.1% एसडीएस) जोड़ें। मिश्रण को आटोक्लेव करें। इसके अलावा, 500 एमएल कॉलम बफर (सेफाडेक्स जी -50 के बिना) और आटोक्लेव बनाएं।
    7. 1 एमएल सिरिंज के तल पर आटोक्लेव ग्लास ऊन जोड़कर स्पिन कॉलम बनाएं। कॉलम बफर में सेफाडेक्स जी -50 के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें। 1 एमएल सिरिंज को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब हो जिसमें नीचे कोई ढक्कन नहीं हो। 5 मिनट के लिए 1,600 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    8. सिरिंज निकालें और नीचे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को छोड़ दें। 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वापस एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब जोड़ें। 1 एमएल सिरिंज में कॉलम बफर (सेफाडेक्स जी -50 के बिना) जोड़ें और 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वापस डालें। 5 मिनट के लिए 1,600 x g पर सेंट्रीफ्यूज। इस चरण को दो बार फिर से दोहराएं।
    9. सिरिंज निकालें और 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें जिसमें एक नया साफ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब हो। सिरिंज पर जांच लागू करें और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जांच एकत्र करें।
    10. डीएनए जांच को अवक्षेपित करने के लिए डीएनए समाधान में हेरिंग शुक्राणु डीएनए (10 मिलीग्राम / एमएल), सोडियम एसीटेट के 10 μL और 100% इथेनॉल की 2.25 मात्रा जोड़ें। धीरे से घोल मिलाएं और न्यूनतम 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 13,700 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    11. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और गोली को 200 μL बर्फ-ठंडा 70% इथेनॉल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए धो लें। सतह पर तैरनेवाला और हवा को सूखा दें। एक बार सूखने के बाद कई घंटों के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर डीईपीसी-उपचारित पानी के 20 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। जांच अब उपयोग करने के लिए तैयार है या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    12. प्रत्येक स्लाइड के लिए 5 μL जांच डीएनए को 5 μL Cot-1 डीएनए के साथ मिलाएं और स्पीड वैक वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके सुखाएं। एक बार गोली सूख जाने के बाद संकरण मिश्रण के 12 μL में फिर से निलंबित हो जाता है।

3. डीएनए हेलो तैयारी

  1. इनक्यूबेटर से स्लाइड और संलग्न कोशिकाओं वाले स्क्वायर कल्चर डिश को हटा दें। एक पेंसिल का उपयोग करके मध्यम, लेबल स्लाइड ्स को हटा दें और 50 मिलीलीटर बर्फ-कोल्ड साइटोस्केलेटन (सीएसके) बफर वाले कोप्लिन जार में रखें: 100 एमएम एनएसीएल, 3 एमएम एमजीसीएल2, 0.3 एम सुक्रोज, 10 एमएम 1, 4-पिपेराज़िनेडाइथेनसल्फोनिक एसिड (पाइप्स; पीएच 7.8), 0.5% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 विआयनीकृत पानी में बना है। बर्फ पर 15 मिनट या 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    सावधानी: ट्राइटन एक्स -100 त्वचा में जलन और गंभीर आंखों की क्षति का कारण बन सकता है। नाइट्राइल दस्ताने, चश्मे और प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करके संभालें।
  2. सीएसके बफर को छोड़ दें और जल्दी से 1x DNA हेलो बफर (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO 4, 15 mM KH2PO 4; pH7.4) के 50 मिलीलीटर में स्लाइड को तीन बार धोएं, यानी, डीएचबी युक्त कोप्लिन जार में स्लाइड करें और निकालें।
  3. 50 एमएल निष्कर्षण बफर युक्त कोप्लिन जार में स्लाइड स्थानांतरित करें: 2 एम एनएसीएल, 10 एमएम पाइप (पीएच 6.8), 10 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए), 0.1% (डब्ल्यू / वी) डिजिटोनिन, 0.05 एमएम (वी / वी) स्पर्मिन, 0.125 एमएम (वी / वी) स्पर्मिडिन। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    सावधानी: डिजिटोनिन विषाक्त है अगर निगल लिया जाता है या त्वचा के संपर्क में होता है और यदि साँस ली जाती है तो घातक है। सुनिश्चित करें कि डिजिटोनिन को एक एलईवी फ्यूम अलमारी में संभाला जाता है और एक प्रयोगशाला कोट, नाइट्राइल दस्ताने (डबल ग्लव), सुरक्षा चश्मा और मास्क पहनें। स्पर्मिन और स्पर्मिडाइन दोनों गंभीर त्वचा जलन और आंखों की क्षति का कारण बन सकते हैं, जबकि ईडीटीए गंभीर आंखों की जलन का कारण बनता है, इसलिए प्रत्येक रसायन को देखभाल के साथ संभालें।
    नोट: 60-70 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर पाउडर को पानी में घोलकर अलग से डिजिटोनिन तैयार करें। ठंडा होने के बाद निष्कर्षण बफर में घुलित डिजिटोनिन जोड़ें। जैविक गतिविधि को संरक्षित करने के लिए निष्कर्षण बफर में शुक्राणु, स्पर्मिडाइन और डिजिटोनिन जोड़ें।
  4. 10x DHB (1.4 M NaCl, 270 mM KCl, 1.1 M NaHPO 4, 150 mM KH2PO4; PH7.4), 5x, 2x और 1x DHB प्रत्येक 1 मिनट के लिए।
  5. 10%, 30%, 70% और 95% (v/v) इथेनॉल की 50 मिलीलीटर अनुक्रमिक इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से स्लाइड (स्ट्रेट-इन और स्ट्रेट-आउट) को डुबोएं।
  6. हवा सूखी स्लाइड और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि सीटू संकरण (2 डी फिश) में दो-आयामी प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन नहीं किया जाता है।

4. सीटू संकरण में द्वि-आयामी प्रतिदीप्ति

  1. 20x SSC बनाएं: 3 M NaCl, 0.3 M ट्राइ-सोडियम साइट्रेट, pH 7.0। इस बफर को आटोक्लेव किया जा सकता है, कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है, और आवश्यकतानुसार पतला किया जा सकता है।
  2. एक पानी के स्नान में 70% (वी / वी) फॉर्मामाइड, 2 x एसएससी पीएच 7.0 और 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी करें।
  3. 70, 90 और 100% इथेनॉल की अनुक्रमिक 50 एमएल इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से प्रत्येक 5 मिनट के लिए स्लाइड ्स को इनक्यूबेट करें।
  4. एक वार्मिंग प्लेट पर एयर ड्राई स्लाइड्स और 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में बेक करें।
  5. 70% फॉर्मामाइड, 2x एसएससी घोल को 70 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए रखकर डिनेचर स्लाइड करें।
    नोट: चरण 4.5 के लिए तापमान और समय महत्वपूर्ण हैं। यदि तापमान डीएनए है तो डीएनए विकृत नहीं होगा और जांच संकरण नहीं होगी, और डीएनए हेलो फिश से कोई संकेत प्राप्त नहीं किया जाएगा।
  6. 5 मिनट के लिए बर्फ-ठंडा 70% इथेनॉल के 50 मिलीलीटर में विकृत स्लाइड रखें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 90%, 95% और 100% की इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से लें।
  7. गर्म प्लेट पर हवा सुखाई जाए
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सीधे लेबल किए गए कुल मानव गुणसूत्र जांच को संभालें। इन प्रयोगों के लिए हमने मानव पूरे क्रोमोसोम पेंट 1, 13, 15, 17 और 18 का उपयोग किया। इसके अलावा, इस प्रयोग में, CCND1 और CTNNA1 जीन जांच का उपयोग किया गया था।
    नोट: पूरे क्रोमोसोम जांच और बीएसी जीन-विशिष्ट जांच दोनों को बायोटिन -11-डीयूटीपी के साथ लेबल किया गया था और स्ट्रेप्टाविडिन द्वारा साइनिन 3 (साइ 3) के लिए संयुग्मित किया गया था। (डीओपी-पीसीआर) द्वारा किए गए क्रोमोसोम पेंटिंग जांच और निक ट्रांसलेशन द्वारा लेबल किए गए बीएसी डीएनए के लिए, इन्हें प्रोटोकॉल में इस बिंदु से आगे डीएनए जांच के रूप में संदर्भित किया जाएगा और निम्नानुसार माना जाएगा।
  9. गर्म-ब्लॉक या पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर डीनेचर डीएनए जांच (पूरे क्रोमोसोम पेंट या जीन-विशिष्ट जांच)।
  10. उचित स्लाइड पर 10 μL को पाइप करने से पहले गर्म-ब्लॉक या पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म डीएनए जांच करें।
    नोट: दोहराए जाने वाले क्रोमोसोमल अनुक्रमों को अवरुद्ध करने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है। यदि प्रदर्शन नहीं किया जाता है, तो डीएनए हेलो फिश में गैर-विशिष्ट संकेत ों का उत्पादन किया जा सकता है।
  11. 21 मिमी x 21 मिमी कवरस्लिप के साथ ओवरले जांच और रबर सीमेंट का उपयोग करके सील।
  12. एक ह्यूमिडिफायर हाइब्रिडाइजेशन कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 18 घंटे के लिए स्लाइड ्स को इनक्यूबेट करें।
    नोट: ह्यूमिडिफाइड संकरण कक्ष सैंडविच बक्से से बनाए जा सकते हैं जिनमें नम ऊतक की कई परतें होती हैं और स्लाइड को आराम करने के लिए काटे गए 10 एमएल प्लास्टिक पिपेट से निर्मित एक उठा हुआ मंच होता है। प्रकाश के संपर्क को कम करने के लिए यह एल्यूमीनियम पन्नी में कवर किया गया है।
  13. बल का उपयोग करके रबर सीमेंट को सावधानी से हटा दें।
  14. 50 एमएल 50% (वी / वी) फॉर्मामाइड, 2 एक्स एसएससी, पीएच 7.0 समाधान में स्लाइड ्स को इनक्यूबेट करें जिसे तीन 5 मिनट ऊष्मायन के लिए 45 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म किया गया है।
    नोट: कवरस्लिप को 50% (वी / वी) फॉर्मामाइड, 2 एक्स एसएससी, पीएच 7.0 समाधान में पहले इनक्यूबेशन में स्लाइड से दूर गिरने की अनुमति दें। यह डीएनए हेलो तैयारी को नुकसान से बचाता है जो कवरस्लिप को 'खींचने' के कारण हो सकता है। कवरस्लिप को अलग करने में मदद करने के लिए स्लाइड्स को फोर्स द्वारा पकड़कर बफर में उत्तेजित किया जा सकता है।
  15. इसके बाद, स्लाइड को 0.1x SSC, pH 7.0 समाधान के 50 mL में रखें जिसे 60 °C तक गरम किया गया है लेकिन 45 °C पानी के स्नान में रखा गया है। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और बफर को 5 मिनट के ऊष्मायन के साथ दो और बार बदलें।
  16. स्लाइड को एक कोप्लिन जार में रखें जिसमें कमरे के तापमान पर 50 एमएल 4x एसएससी, पीएच 7.0 समाधान हो और बफर के तीन बदलावों के साथ 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  17. प्रत्येक स्लाइड पर 4% बीएसए के 100 μL, 4x SSC समाधान लागू करें और पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े के साथ ओवरले करें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। यह एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को रोकता है।
  18. लेबल की गई जांच (बायोटिन -16-डीयूटीपी) का पता लगाने के लिए, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1: 200 (1% बीएसए, 4 एक्स एसएससी में बनाया गया) स्ट्रेप्टाविडिन-साइ 3 के 100 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के साथ निर्माता के निर्देशों का पालन करें और एक अच्छा संकेत उत्पन्न करने के लिए प्रयोग से पहले कमजोर पड़ने का परीक्षण करें।
  19. कमरे के तापमान पर 4x SSC (0.5% ट्वीन -20) pH 7.0 समाधान के 50 मिलीलीटर वाले कोप्लिन जार में स्लाइड रखें और बफर के तीन परिवर्तनों के साथ 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यदि इम्यूनोफ्लोरेसेंस की आवश्यकता नहीं है तो चरण 4.21 में दिखाए गए अनुसार स्लाइड ्स को इस स्तर पर लगाया जा सकता है।
  20. यदि डीएनए प्रभामंडल में बनी कोशिकाओं की प्रोलिफेरेटिव स्थिति की आवश्यकता होती है, तो फिश चरणों के बाद एंटी-पीकेआई 67 एंटीबॉडी के साथ दाग लगाएं, इससे पहले कि बीआरडीयू को शामिल किया जाए।
    1. 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 50 एमएल में 5 मिनट के लिए स्लाइड को 3 बार धोएं, इसके बाद कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 4% एनसीएस के साथ अवरुद्ध करें।
    2. स्लाइड पर आवश्यक प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी मानव पीकेआई 67; माउस एंटी-बीआरडीयू) के 200 μL लागू करें, पैराफिन फिल्म की एक पट्टी के साथ ओवरले करें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. 1x PBS में 5 मिनट के लिए स्लाइड को 3 बार धोएं और फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (pKi67: स्वाइन एंटी-खरगोश TRITC) के 200 μL में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें; BrdU: गधा विरोधी माउस Cy3)। पीबीएस के साथ 3 और 5 मिनट धोने का काम करें। पीबीएस में 1% (वी / वी) एनसीएस का उपयोग करके निर्माताओं द्वारा सुझाए गए कमजोर पड़ने की सीमा पर सभी कमजोर पड़ने की आवश्यकता है।
  21. माउंट 20 μL माउंटेंट में स्लाइड करता है जिसमें DAPI होता है और 22 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप के साथ ओवरले होता है।

5. टेलोमेरे पीएनए फिश

  1. टेलोमेरेस का पता लगाने के लिए, टेलोमेयर पीएनए फिश किट - एफआईटीसी का उपयोग करें; निर्माता के निर्देशों के साथ प्रक्रिया निष्पादित करें। प्रक्रिया को कमरे के तापमान पर निष्पादित किया जाना चाहिए, जब तक कि अन्यथा न कहा जाए।
  2. 2 मिनट के लिए ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस, पीएच 7.5) में स्लाइड ्स को डुबोएं और फिर ठीक 2 मिनट के लिए 3.7% फॉर्मलाडेहाइड (टीबीएस; वी / वी में) में रखें।
    चेतावनी: टीबीएस समाधान में 10-30% ट्रोमेटामोल और 10-30% 2-एमिनो-2-(हाइड्रॉक्सीमिथाइल) प्रोपेन-1,3-डायोल हाइड्रोक्लोराइड होता है। इससे आंखों और त्वचा में गंभीर जलन हो सकती है, इसलिए सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मे / चेहरे की सुरक्षा पहनें। एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में उपयोग करें।
  3. कोप्लिन जार में स्लाइड को 5 मिनट के लिए टीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  4. 10 मिनट के लिए पूर्व-उपचार समाधान में स्लाइड डुबोएं और फिर 5 मिनट प्रति धोने के लिए टीबीएस के साथ दो बार धो लें।
  5. इसके बाद, 2 मिनट प्रति सांद्रता के लिए 70%, 85% और 95% (v / v) इथेनॉल के 50 मिलीलीटर से युक्त बर्फ-ठंडे इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से स्लाइड लें। बाद में स्लाइड्स को हवा में सूखने दें।
  6. फ्लोरोसेंट टैग रंग की पसंद के आधार पर टेलोमेयर पीएनए प्रोब / एफआईटीसी (या Cy3) के 10 μL लागू करें, प्रत्येक स्लाइड पर और कवर ओवरले को कवरस्लिप के साथ कवर करें। 5 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए पूर्व-गर्म ओवन में इनक्यूबेट करें और फिर लगभग 1 घंटे के लिए अंधेरे में रखें।
    एफआईटीसी में 6-100% फॉर्मामाइड होता है, जो गंभीर आंखों में जलन का कारण बनता है और टेराटोजेनिक होता है इसलिए अजन्मे बच्चे को गंभीर नुकसान पहुंचा सकता है। यदि कोई महिला गर्भवती है या उसे संदेह है कि वह गर्भवती है तो उन्हें फॉर्मामाइड के साथ काम करने से बचना चाहिए। फॉर्मामाइड का उपयोग एलईवी फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए और उचित आंख या चेहरे की सुरक्षा पहनी जानी चाहिए।
  7. कवरलिप को हटाने के लिए, स्लाइड को 1 मिनट के लिए 'कुल्ला समाधान' में डुबोएं और फिर 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 'वॉश सॉल्यूशन' में रखें।
    सावधानी: धोने के घोल में 1-5% पॉलीऑक्सीएथिलीन ऑक्टिल फिनाइल ईथर और 1-5% सोडियम क्लोराइड होता है। यह संक्षारक है और गंभीर आंखों की क्षति का कारण बन सकता है। सुनिश्चित करें कि धोने के घोल को संभालते समय चश्मे या चेहरे की सुरक्षा पहनी जाती है।
  8. 2 मिनट प्रति सांद्रता के लिए 50 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे इथेनॉल श्रृंखला (70%, 85% और 95% (वी / वी)) के माध्यम से स्लाइड करें और फिर हवा सूख जाएं। एक बार सूखने के बाद माउंट स्लाइड करें जिसमें डीएपीआई युक्त माउंट हो और कवरस्लिप के साथ ओवरले हो।

6. छवि कैप्चर और विश्लेषण

  1. डीएनए हेलो और क्रोमोसोम क्षेत्रों की कल्पना करने के लिए एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (जैसे, लीका डीएम 4000 माइक्रोस्कोप) का उपयोग करें, जो एचसी पीएल फ्लोटार 100एक्स / 1.30 तेल उद्देश्य और डीएफसी 365एफएक्स कैमरे का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करता है।
  2. ग्रे-स्केल छवियों को कैप्चर करें और छवियों के छद्म रंग को सक्षम करने के लिए कैप्चर किए गए प्रत्येक चैनल के लिए रंग परिभाषित करें। इस प्रयोग में एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था (उदाहरण के लिए, एलएएस एएफ संस्करण 4.5.0 सॉफ्टवेयर)। अलग-अलग रंग चैनलों को टीआईएफएफ के रूप में निर्यात किया गया था।
  3. जावा छवि प्रसंस्करण प्रोग्राम फिजी इमेजजे का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण करें। फ़ाइल दबाकर छवि अपलोड करें और खोलें.
  4. छवि पर क्लिक करके अलग-अलग छवि चैनल लोड करें या एक समग्र छवि को अलग-अलग ग्रेस्केल चैनलों में विभाजित करें रंग | विभाजित चैनल. एक छवि चैनल का चयन करें और छवि पर क्लिक करें | समायोजित करें और फिर ब्राइटनेस और कंट्रास्ट का चयन करें। तदनुसार बदलें और अन्य चैनलों के साथ दोहराएं।
  5. नाभिक को दर्शाने वाले डीएपीआई-दाग वाले चैनल का चयन करके अवशिष्ट नाभिक का एक मुखौटा बनाएं। चित्र पर क्लिक करें | समायोजित करें और तब थ्रेशोल्ड का चयन करें. एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा जहां थ्रेशोल्ड को बदला जा सकता है, डार्क बैकग्राउंड बॉक्स की जांच करें। अवशिष्ट नाभिक स्पष्ट होने तक बदलें और संवाद बॉक्स को लागू और बंद करें।
    नोट: यह पिक्सेल तीव्रता के आधार पर एक बाइनरी मास्क बनाता है, जिसमें सफेद पिक्सेल रुचि के क्षेत्र दिखाते हैं और काले पिक्सेल पृष्ठभूमि दिखाते हैं। जांच चैनल पर एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
  6. अवशिष्ट नाभिक की परिधि को रेखांकित करने के लिए फ्रीहैंड चयन का उपयोग करें, फिर संपादित करें और बाहर साफ़ करें पर क्लिक करें। अवशिष्ट नाभिक पर जांच चैनल को ओवरले करें। यह छवि दबाकर किया जा सकता है | रंग | चैनलों का मर्ज करें.
  7. इमेजजे में माप पैमाने को सेट करने के लिए, स्केल बार पर या दो ज्ञात दूरी के बिंदुओं के बीच एक रेखा खींचें। विश्लेषण पर जाएँ और सेट स्केल दबाएँ. संवाद बॉक्स में, दूरी की लंबाई जोड़ें और OK क्लिक करें. दूरी मापने के लिए, मापा जा रहा बिंदुओं के बीच एक रेखा खींचें और विश्लेषण करें पर क्लिक करें | माप। यह दूरी मानों को डेटा विंडो में स्थानांतरित कर देगा।
  8. सबसे चमकीले DAPI तीव्रता को मापें क्योंकि यह नाभिक के केंद्र के साथ मेल खाता है। इस माप से परमाणु केंद्र से सबसे दूर क्रोमोसोम टेरिटरी एज (सीटीई) तक की दूरी। परमाणु केंद्र की दूरी को परमाणु किनारे (एनई) से मापें।
  9. सुनिश्चित करें कि परिणाम सीटीई / एनई अनुपात के रूप में चित्रित किए गए हैं। यहां परमाणु केंद्र से प्रत्येक सबसे दूर क्रोमोसोम टेरिटरी एज (सीटीई) की दूरी को परमाणु केंद्र से प्रत्येक संबंधित परमाणु किनारे (एनई) की दूरी से विभाजित किया गया है। यह कम से कम 50 नाभिक पर किया जाना चाहिए। इसे बार या बॉक्स चार्ट के रूप में दर्शाया जा सकता है।
  10. टेलोमेरेस के विश्लेषण के लिए, प्रति डेटासेट न्यूनतम 30 नाभिक का विश्लेषण करें। अवशिष्ट नाभिक के भीतर और डीएनए प्रभामंडल के भीतर टेलोमेरेस की संख्या की गणना करने के लिए फिजी इमेजजे का उपयोग करके या मैन्युअल रूप से छवियों का विश्लेषण किया जा सकता है। BrdU या pKi67 ने प्रसार (BrdU/piK67+) और सेनेसेंट/क्विसेंट (BrdU/pKi67-) नाभिकों के विभेदन को सक्षम किया। डेटा को बार चार्ट में माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि के अनुरूप त्रुटि पट्टियों के साथ चित्रित किया जा सकता है।
  11. पी> 0.05 के साथ परिणामों की सांख्यिकीय रूप से तुलना करने के लिए छात्र के टी-टेस्ट (अप्रकाशित) का उपयोग करें।

Representative Results

डीएनए हेलो तैयारी की इस विधि ने हमें युवा और पुरानी कोशिकाओं के भीतर जीनोम व्यवहार में अंतर निर्धारित करने के हमारे प्रयासों में मदद की है, लेकिन असामान्य न्यूक्लियोस्केलेटल प्रोटीन15 के साथ समय से पहले उम्र बढ़ने की बीमारियों से प्राप्त कोशिकाओं में भी। चित्र 1 डीएनए प्रभामंडल के उदाहरणों को प्रदर्शित करता है जहां अवशिष्ट नाभिक के किनारे को देखना संभव है, अवशिष्ट नाभिक के भीतर शेष डीएनए और असंबद्ध डीएनए जो डीएनए प्रभामंडल बनाने के लिए आसपास के क्षेत्र में जमा हो गया है। यह विश्लेषण को भी दर्शाता है कि अवशिष्ट नाभिक कैसे प्राप्त किया जाता है और एनई और सीटीई माप। कोशिकाओं के एस-चरण में होने पर या तो बीआरडीयू जैसे लेबल न्यूक्लियोटाइड को शामिल करके या नैदानिक प्रसार मार्कर एंटी-पीकेआई 67 को नियोजित करके प्रसार और गैर-प्रसार कोशिकाओं के बीच अंतर करना संभव है, जो न्यूक्लियोली का खुलासा करता है, और जी 1 कोशिकाओं में हेटेरोक्रोमैटिन के क्षेत्र17,18। उच्च सीरम में विकसित प्राथमिक कोशिकाएं, जो प्रसार मार्करों के लिए नकारात्मक हैं, को संवेदनशील माना जाता है। कम सीरम में विकसित प्राथमिक कोशिकाएं या कंफ्लुएंट हो गई हैं, यानी, संपर्क बाधित जो प्रसार मार्करों के लिए नकारात्मक हैं, उन्हें क्विसेंट माना जाता है और सही पोषक तत्वों और स्थिति को देखते हुए प्रोलिफेरेटिव सेल चक्र में फिर से प्रवेश करने में सक्षम होंगे। Ki67 सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं के बीच अंतर करने में सक्षम होने के कारण हमें प्रसार, क्विसेंट और सेनेसेंट मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के बीच अंतर निर्धारित करने में सक्षम बनाया गया है। चित्रा 2 उन कोशिकाओं से निर्मित मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के प्रसार के डीएनए प्रभामंडल को प्रदर्शित करता है जहां डीएनए प्रतिकृति के दौरान बीआरडीयू को उनमें शामिल किया गया था, एक तंत्र जो गैर-प्रसार कोशिकाओं में नहीं होता है, और बाद में एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जाता है। प्रोलिफेरेटिव मार्कर एंटी-पीकेआई 67 एंटीबॉडी के साथ धुंधला होना चित्रा 2 में भी दिखाई देता है। यह एक मजबूत एंटीजन है और फिश प्रोटोकॉल से बचता है और इसलिए पोस्ट-फिश और प्री-माउंटिंग के लिए दाग लगाया जा सकता है। इस प्रकार, प्रसार कोशिकाएं बाएं हाथ के स्तंभ में बीआरडीयू और एंटी-पीकेआई 67 (लाल) और गैर-प्रसार कोशिकाओं के लिए सकारात्मक (लाल) हैं, वास्तव में चित्रा 2 में सेनेसेंट कोशिकाएं दाएं हाथ के कॉलम में प्रदर्शित होती हैं। हरे रंग के संकेत अलग-अलग टेलोमेरेस होते हैं जो टेलोमेयर पीएनए फिश / एफआईटीसी किट के साथ प्रकट होते हैं। डीएनए हेलो के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस का संयोजन विभिन्न सेल राज्यों के दौरान विश्लेषण को सक्षम बनाता है, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है जब प्रसार, क्विसेंट और सेनेसेंट कोशिकाओं की जांच की जाती है। चुने गए एंटीबॉडी के आधार पर अन्य स्थितियों की जांच की जा सकती है, जैसे भेदभाव, विकिरण के माध्यम से डीएनए क्षति आदि।

क्रोमोसोम क्षेत्रों को फिश का उपयोग करके डीएनए प्रभामंडल के भीतर भी देखा जा सकता है। डीएनए को नाभिक से बाहर निकालने की अनुमति देने वाली तैयारी के कारण, डीएनए प्रभामंडल में पाए जाने वाले गुणसूत्र की छोटी या बड़ी मात्रा के साथ, क्रोमोसोम क्षेत्र का आकार गड़बड़ा सकता है, जो अवशिष्ट नाभिक और इसकी संरचनाओं के अंदर जीनोम के लंगर पर निर्भर करता है। चित्रा 3 डीएनए प्रभामंडल के एक पैनल को प्रकट करता है जिसके तहत क्रोमोसोम 1, 13, 17 और 18 के लिए विशिष्ट पूरे हाथ क्रोमोसोम पेंटिंग जांच (लाल) के साथ व्यक्तिगत गुणसूत्रों का पता चला है। एंटी-पीकेआई 67 (हरा) का उपयोग एक ही संस्कृति के भीतर कोशिकाओं के प्रसार और इसकी अनुपस्थिति को चिह्नित करने के लिए किया गया है, एक ही स्लाइड पर, सेनेसेंट कोशिकाओं को दर्शाता है। एनई के रूप में प्रस्तुत छवियों और आंकड़ों से यह बहुत स्पष्ट है कि छोटा जीन-गरीब गुणसूत्र 18 एक गुणसूत्र है जिसमें अवशिष्ट नाभिक से दूर डीएनए प्रभामंडल में कुछ संलग्नक और स्पूल होते हैं और अन्य गुणसूत्रों की तुलना में अवशिष्ट नाभिक के केंद्र से काफी आगे होते हैं। हालांकि, यह क्रोमोसोम 1 के लिए भी सच है। प्रोलिफेरेटिव मार्कर एंटी-पीकेआई 67 का उपयोग करके एक ही संस्कृति के भीतर और एक ही स्लाइड पर सेनेसेंट कोशिकाओं के साथ प्रसार की तुलना करना भी संभव हो गया है, और इस विश्लेषण से पता चला है कि अवशिष्ट परमाणु संरचनाओं के साथ लगाव के संबंध में इन दो बहुत अलग सेल स्थितियों के भीतर गुणसूत्र एक दूसरे से काफी भिन्न नहीं हैं।

दिलचस्प बात यह है कि जीन भी अवशिष्ट नाभिक के भीतर रहने या डीएनए हेलो में स्थित होने के संबंध में प्रसार और सेनेसेंट कोशिकाओं के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखा रहे हैं। चित्रा 4 इसे लाल और एंटी-केआई 67 में लेबल किए गए बीएसी जांच द्वारा चित्रित जीन लोकी के साथ प्रदर्शित करता है। डीएनए हेलो की तैयारी के बाद, प्रसार बनाम सेनेसेंट कोशिकाओं में जीन स्थानों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं हैं। हालांकि, साइक्लिन डी 1 सीएनडीडी 1 लोकी की तुलना में डीएनए प्रभामंडल के भीतर काफी अधिक कैटेनिन अल्फा 1 सीटीएनएनए 1 लोकी हैं, जहां बहुत कम हैं। चित्रा 5 हरे रंग में टेलोमेरेस के साथ डीएनए प्रभामंडल की तैयारी प्रदर्शित करता है। डीएनए प्रभामंडल के भीतर टेलोमेयर संकेतों को देखने में सक्षम बनाने के लिए पृष्ठभूमि को जानबूझकर ऊंचा छोड़ दिया जाता है। डेटा के इस सेट में क्वीसेंट कोशिकाओं को शामिल किया गया है, यानी, जिन कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए सीरम भूखा रखा गया है, उन्हें शामिल किया गया है और दिलचस्प बात यह है कि प्रसार और सेनेसेंट कोशिकाओं की तुलना में क्वीसेंट कोशिकाओं में डीएनए हेलो के भीतर काफी अधिक टेलोमेरेस असंबद्ध और स्थित हैं। चित्रा 5 ए में डीएनए प्रभामंडल में टेलोमेरेस का अनुपात देखा जा सकता है, विशेष रूप से छवि 'प्रयोग 2' के लिए। यह चित्रा 5 बी से मेल खाता है जहां डीएनए प्रभामंडल में टेलोमेरेस का औसत प्रतिशत क्विसेंट कोशिकाओं में लगभग 17% है। कुछ सबूत हैं कि सेनेसेंट कोशिकाओं में सभी टेलोमेरेस को नहीं देखा जा सकता है क्योंकि उनमें से कुछ बहुत छोटे हो सकते हैं।

डीएनए प्रभामंडल की यह विधि हमारे लिए रोगग्रस्तकोशिकाओं में नाभिक के भीतर जीनोम इंटरैक्शन परिवर्तनों की जांच करने में सफल रही है। चित्रा 6 प्राथमिक नियंत्रण फाइब्रोब्लास्ट ्स में क्रोमोसोम लगाव में अंतर को दर्शाता है और विशिष्ट (लैमिन ए म्यूटेशन) और एटिपिकल हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम के साथ रोगग्रस्त कोशिकाओं में, एक अलग सन 1 आइसोफॉर्म और कोई लैमिन ए म्यूटेशन19 व्यक्त नहीं करता है। क्रोमोसोम 1 और 13 नियंत्रित डीएनए प्रभामंडल की तुलना में अवशिष्ट नाभिक के भीतर उनके लगाव में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं। चित्रा 6 बी पूरे गुणसूत्र क्षेत्र की स्थिति को अवशिष्ट नाभिक और डीएनए प्रभामंडल से संबंधित करता है। 1 या उससे कम के मान इंगित करते हैं कि गुणसूत्र अवशिष्ट नाभिक के भीतर स्थित है और 1 से अधिक मान डीएनए हेलो के भीतर गुणसूत्रों या गुणसूत्रों के कुछ हिस्सों को प्रदर्शित करते हैं।

कुल मिलाकर, यह विभिन्न स्थितियों के तहत पूरे गुणसूत्रों, विशिष्ट जीन और टेलोमेरेस के जीनोमिक इंटरैक्शन की जांच में हेलो-फिश की उपयोगिता पर प्रकाश डालता है जो सेल चक्र (प्रसार, जिज्ञासा और सेनेसेंस) या रोग कोशिकाओं के भीतर जैसे प्रोजेरिया और कैंसर सेल लाइनों को प्रभावित करते हैं। दरअसल, इन राज्यों के बीच बातचीत में अंतर का मतलब है कि न्यूक्लियोस्केलेटन की नाभिक के भीतर महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका है।

Figure 1
चित्रा 1: एचडीएफ ने अवशिष्ट नाभिक और डीएनए प्रभामंडल को प्रदर्शित करने वाले नाभिक को निकाला और विश्लेषण विधि का अवलोकन किया। (ए) डीएनए हेलो परख के माध्यम से तैयार किया गया एक एचडीएफ नाभिक और डीएपीआई के साथ प्रतिरूपित। चमकदार दाग वाला अवशिष्ट नाभिक न्यूक्लियोस्केलेटन से जुड़े डीएनए को दिखाता है और यह गैर-संलग्न डीएनए से घिरा होता है जो डीएनए का प्रभामंडल बनाता है। आवर्धन = x 100; स्केल बार 10 μm. (b) नीला चैनल DAPI-दाग वाले नाभिक और आसपास के डीएनए को पकड़ता है। इमेजजे का उपयोग करके अवशिष्ट नाभिक का चयन और हटाया जाता है। तीर परमाणु केंद्र से अवशिष्ट परमाणु किनारे (एनई) तक की दूरी को दर्शाता है। (ग) लाल चैनल जांच संकेत दिखाता है। (घ) 'परिणाम' निरूपित छवि ब्लू चैनल छवि पर लाल चैनल को अधिरोपित करने का परिणाम है; यह परमाणु केंद्र से सबसे दूर क्रोमोसोम टेरिटरी एज (सीटीई) तक की दूरी की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 2
चित्रा 2: एचडीएफ के प्रसार और सेनेसेंट पर टेलोमेयर पीएनए फिश के साथ डीएनए हेलो तैयारी। डीएनए हेलो परख के अधीन एचडीएफ पर टेलोमेरे पीएनए फिश। टेलोमेयर संकेतों को हरे रंग (एफआईटीसी) में देखा जाता है, अवशिष्ट और प्रभामंडल डीएनए को डीएपीआई (नीले) का उपयोग करके प्रतिरूप ति किया गया था और लाल रंग में अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस (टीआरआईटीसी) के माध्यम से एंटी-बीआरडीयू या एंटी-पीकेआई 67 एंटीबॉडी का उपयोग करके नाभिक के प्रसार का पता लगाया गया था। आवर्धन = x 100; स्केल बार 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 3
चित्रा 3: डीएनए हेलो परख का उपयोग करके न्यूक्लियोस्केलेटन-क्रोमोसोम इंटरैक्शन और विश्लेषण। (क) क्रोमोसोम 1, 13, 15, 17 और 18 के लिए विशिष्ट जांच के साथ 2डी-फिश को डीएनए हेलो तैयार करने के अधीन एचडीएफ पर किया गया था। पूरे क्रोमोसोम को लाल रंग (Cy3) में चित्रित किया गया था और नाभिक को pKi67 के साथ जांच की गई थी ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि वे प्रसार या सेनेसेंट थे या नहीं। प्रसार कोशिकाओं (पीकेआई 67+) को हरे रंग (एफआईटीसी) में चित्रित किया गया था, जबकि सेनेसेंट कोशिकाएं बिना दाग (पीकेआई 67-) रहीं यानी कोई ग्रीन सिग्नल नहीं मिला। आवर्धन = x 100; स्केल बार 10 μm. (b) न्यूक्लियोस्केलेटन द्वारा क्रोमोसोम एंकरेज जो HALO-FISH से गुजरने वाले एचडीएफ के प्रसार और सेनेसेंट में होता है। माप क्रोमोसोम 1, 13, 15, 17 और 18 के लिए प्रोलिफ़ेरेटिंग (पीकेआई 67+) और सेनेसेंट (पीकेआई 67-) कोशिकाओं में सबसे दूर क्रोमोसोम टेरिटरी एज (सीटीई) और संबंधित परमाणु किनारे (एनई) के अनुपात को दिखाते हैं। ±(ग) पीकेआई 67+ और पीकेआई 67- नाभिक में विशिष्ट गुणसूत्रों के संबंधित परमाणु किनारे (एनई) के लिए क्रोमोसोम टेरिटरी एज (सीटीई) का संशोधित बॉक्स प्लॉट प्रतिनिधित्व। क्यू 1 = कम चतुर्थक; न्यूनतम = सबसे कम मान दर्ज किया गया; मेड = औसत; अधिकतम = अधिकतम मान दर्ज किया गया; Q3 = ऊपरी चतुर्थक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 4
चित्रा 4: हेलो-फिश का उपयोग करके एचडीएफ में जीन-विशिष्ट इंटरैक्शन। (क) डीएनए प्रभामंडल निकाले गए नाभिकों की जांच जीन विशिष्ट जांच (सीसीएनडी1 और सीटीएनएनए1) से की गई थी ताकि कोशिकाओं के प्रसार और सेनेसेंट कोशिकाओं के प्रसार पर एनएम के उनके लंगर की जांच की जा सके। जीन संकेतों को लाल (Cy3) में दिखाया गया है और एंटी-pKi67 प्रसार कोशिकाओं को दर्शाता है और सिग्नल को हरे रंग (FITC) में देखा जाता है। सीसीएनडी 1 छवि के प्रसार के लिए, अवशिष्ट नाभिक सफेद सर्कल के भीतर संलग्न है, और सफेद और हरे सर्कल के बीच का स्थान डीएनए हेलो को दर्शाता है। आवर्धन = x 100; (ख) सीसीएनडी1 और सीटीएनए1 के लिए जीन-विशिष्ट संकेतों की तुलना अवशिष्ट नाभिक और डीएनए प्रभामंडल के बीच की जाती है, और प्रसार और सेनेसेंट कोशिकाओं के बीच भी की जाती है। त्रुटि पट्टियाँ SEM ± प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 5
चित्रा 5: टेलोमेयर पीएनए-फिश के साथ जांच किए गए क्विसेंट एचडीएफ पर डीएनए हेलो परख। (क) एचडीएफ की गतिशीलता को 7 दिनों के लिए कम सीरम माध्यम में कल्चर द्वारा प्रेरित किया गया था। डीएनए हेलो परख का प्रदर्शन किया गया था, और पीएनए-फिश ने एफआईटीसी सिग्नल (हरे) द्वारा टेलोमेरेस के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम किया और अवशिष्ट नाभिक और आसपास के डीएनए प्रभामंडल को डीएपीआई (नीले) के साथ प्रतिरूप किया गया। कोशिकाओं को एंटी-पीकेआई 67 एंटीबॉडी के साथ भी दाग दिया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नाभिक गैर-प्रसार कर रहे थे। यह दो अलग-अलग अवसरों पर दोहराया गया था। आवर्धन = x 100; स्केल बार 10 μm. (b) डीएनए प्रभामंडल के भीतर स्थानीयकृत टेलोमेरेस के औसत प्रतिशत की तुलना एचडीएफ कोशिकाओं के प्रसार, सेनेसेंट और क्विसेंट में। त्रुटि पट्टियाँ SEM ± प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 6
चित्रा 6: हेलो-फिश26 का उपयोग करके एचजीपीएस कोशिकाओं में न्यूक्लियोस्केलेटन के लिए पूरे गुणसूत्र लंगर की जांच करना। (क) नियंत्रण एचडीएफ (2डीडी), क्लासिकल एचजीपीएस (एजी06297) और एटिपिकल टाइप 2 एचजीपीएस (एजी08466) नाभिकों ने डीएनए हेलो तैयार किया और फिर क्रोमोसोम 1, 13, 15 और 17 के लिए संपूर्ण क्रोमोसोम पेंट का उपयोग करके 2डी-फिश का उपयोग किया। पूरे क्रोमोसोम को हरे रंग (एफआईटीसी) में चित्रित किया गया है और डीएनए को डीएपीआई (नीले) के साथ प्रतिरूप किया गया था। आवर्धन = x 100; स्केल बार 10 μm. (b) निकाले गए नाभिक के भीतर गुणसूत्रों की स्थिति का निर्धारण माध्य गुणसूत्र क्षेत्र किनारे (सीटीई) और परमाणु किनारे (एनई) के अनुपात को मापकर किया गया था। 1 से ऊपर का अनुपात दर्शाता है कि सबसे दूर सीटीई डीएनए प्रभामंडल के भीतर संबंधित एनई के बाहर स्थित है, जबकि 1 से नीचे का अनुपात दर्शाता है कि सबसे दूर सीटीई अवशिष्ट नाभिक के भीतर एनई के भीतर स्थित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक Volume(μL)
5XDOP-PCRbuffer 10
dNTPmix (dTTP के बिना)(2mM) 5
dTTP (2mM) 2
Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP 10
DOPprimer(20μM) 5
TaqDNAPolymerase(1U/μL) 1
पीसीआरग्रेड वाटर 12
साँचा 5

तालिका 1: 1x प्रतिक्रिया के लिए DOP-PCR घटकों और वॉल्यूम दिखाने वाली तालिका

क़दम चक्र तापमान (डिग्री सेंटीग्रेड) समय
प्रारंभिक विकृतीकरण। 1 95 3 मिनट
विकृतीकरण। 34 98 20 s
प्राइमर एनीलिंग 62 1 मिनट
विस्तार 72 30 s
अंतिम विस्तार 1 72 5 मिनट
शीतलन 4 पकड

तालिका 2: डीओपी-पीसीआर चक्र, तापमान और समय प्रोफ़ाइल दिखाने वाली तालिका।

संघटक Volume(μL)
10x NT बफर (0.5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA) 5
0.1 एम बीटा-मर्कैप्टोथेनॉल 5
10X न्यूक्लियोटाइड स्टॉक (0.5 mM dATP, 0.5 mM dCTP, 0.5 mM dGTP, 0.5 mM dTTP, 0.5 mg/ml बायोटिन-16-dUTP) 5
Dnase I (1 ng/ml) 2
डीएनएपोलीमरेज़ I डीएनए के 5U प्रति μg
DNAtemplate (1 μg) 1
डीईपीसी-उपचारित पानी 50 μL

तालिका 3: एक जांच के लिए निक अनुवाद घटकों और संस्करणों को दिखाने वाली तालिका।

Discussion

न्यूक्लियोस्केलेटन और जीनोम के बीच बातचीत का विश्लेषण करते समय डीएनए हेलो विधि पसंद की एक उत्कृष्ट विधि है, हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका पालन भी किया जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक सेल सीडिंग घनत्व का अनुकूलन है। यदि कोशिकाएं अधिक संकुचित हो जाती हैं, तो डीएनए प्रभामंडल पड़ोसी कोशिकाओं के साथ ओवरलैप हो जाएगा जिससे विश्लेषण करना असंभव हो जाएगा। सीएसके और निष्कर्षण बफर को हमेशा उपयोग के दिन ताजा बनाया जाना चाहिए, जिसमें उनकी जैविक गतिविधि को बनाए रखने के लिए तैयारी प्रक्रिया के अंत में निष्कर्षण बफर में शुक्राणु, स्पर्मिडाइन और डिजिटोनिन जोड़ा जाता है। यदि हेलो-फिश का प्रदर्शन किया जाता है, तो डीएनए प्रभामंडल के सही विकृतीकरण तापमान का उपयोग करना बेहद महत्वपूर्ण है ताकि जांच या पेंट को बाद में संकरण करने में सक्षम बनाया जा सके।

परमाणु मैट्रिक्स की कल्पना करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया है, जिसमें फिलामेंटस संरचनाओं की पहचानकी जा रही है। हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सीमित है क्योंकि क्रोमैटिन के साथ मैट्रिक्स एसोसिएशन आसानी से अनुमान नहीं लगाया जा सकता है। दरअसल, डीएनए हेलो विधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिक बहुमुखी है क्योंकि विशिष्ट जीन, गुणसूत्र और सेल राज्यों की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, परमाणु मैट्रिक्स प्रोटीन के प्रोटिओमिक विश्लेषण का अध्ययन किया जा रहाहै21,22। यह विधि परमाणु मैट्रिक्स घटकों की तुलना करने के लिए अच्छी है, खासकर जब रोगग्रस्त कोशिकाओं की तुलना की जाती है, हालांकि, यह मानक डीएनए हेलो तकनीक द्वारा हाइलाइट किए गए स्थानिक वितरण और अनुलग्नक प्रदान नहीं करता है।

डीएनए हेलो परख की सीमाएं हैं। सबसे पहले, जैसा कि मैट्रिक्स निकाला जाता है, यह केवल निश्चित कोशिकाओं पर किया जा सकता है इसलिए लाइव इमेजिंग संभव नहीं है। यद्यपि डीएनए हेलो विधि अपेक्षाकृत तेज और प्रदर्शन करने में आसान है, लेकिन समग्र प्रक्रिया में समय लग सकता है जब सेल कल्चर, जांच पीढ़ी, हेलो-फिश और विश्लेषण सभी को ध्यान में रखा जाता है।

सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डीएनए हेलोस और हेलो-फिश की छवि कैप्चर डीएनए विशिष्ट जांच और एंटीबॉडी के रिज़ॉल्यूशन में काफी सुधार करेगी। इसके अलावा, जैसा कि फ्लोरोक्रोम को अधिक आसानी से वर्णक्रमीय रूप से हल किया जा सकता है, एक ही प्रयोग में कई डीएनए जांच का उपयोग करना संभव हो सकता है, जो और भी अधिक जानकारी प्रदान करता है। आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में सुधार जैसे क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर (3 सी) का उपयोग जीन लोकी की बातचीत को निर्धारित करने और सेल में क्रोमैटिन पर स्थानिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। डीएनए हेलो परख और 3 सी को जोड़ा जा सकता है, एक शब्द जिसे एम 3 सी23 के रूप में जाना जाता है, फिर से डीएनए हेलो तकनीक की अनुकूलनशीलता का प्रदर्शन करता है।

यहां प्रस्तुत मूल डेटा जीनोम व्यवहार पूछताछ के लिए संभावनाओं को प्रदर्शित करने और उन डेटा को प्रस्तुत करने के तरीके को प्रदर्शित करने के लिए है। इन आंकड़ों के साथ हमने प्रदर्शित किया है कि (1) क्रोमोसोम पेंटिंग जांच का उपयोग करके जीनोम अनुलग्नक में महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करना संभव है, इस अध्ययन में गुणसूत्र 18 का विश्लेषण किए गए लोगों में से सबसे कम संलग्न गुणसूत्र है (चित्रा 3); (2) दो जीन लोकी और (चित्रा 4) (3) टेलोमेरेस के बीच महत्वपूर्ण अंतर के साथ जीन लोकी, जो प्रसार और सेनेसेंट कोशिकाओं की तुलना में क्विसेंट कोशिकाओं में कम दृढ़ता से जुड़े होते हैं (चित्रा 5)। हम प्रसार मार्कर Ki67 एंटीजन की उपस्थिति के माध्यम से प्रसार और गैर-प्रसार कोशिकाओं के बीच अंतर करने में सक्षम हैं, जो एक अघुलनशील प्रोटीन है, इसलिए अवशिष्ट नाभिक के साथ रहता है या एक विशिष्ट समय अवधि के भीतर एस-चरण के माध्यम से होने वाली कोशिकाओं को उजागर करने के लिए न्यूक्लियोटाइड के समावेश का उपयोग करता है (चित्रा 2)। इस तकनीक ने हमें उन कोशिकाओं में जीनोम व्यवहार का विश्लेषण करने में भी सक्षम बनाया है जो अपने न्यूक्लियोस्केलेटन यानी लैमिनोपैथी कोशिकाओं में समझौता करते हैं और यहां और बिकुल एट अल, 2018 में हम प्रकट करते हैं कि नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में जीनोम को कम कसकर जोड़ा जा सकता है और विशिष्ट दवाओं के साथ इलाज करते समय बहाल किया जा सकता है जो शास्त्रीय एचजीपीएसकोशिकाओं में लैमिन ए उत्परिवर्तन के प्रभाव को सुधारते हैं।. हालांकि, हम यहां एटिपिकल एचजीपीएस एजीओ 8466 कोशिकाओं के लिए नए डेटा दिखाते हैं, जिसमें लैमिन ए उत्परिवर्तन की कमी होती है, लेकिन एलआईएनसी कॉम्प्लेक्स प्रोटीन सन 119 का एक असामान्य रूप होता है जिसमें क्रोमोसोम 13 कम कसकर जुड़ा होता है (चित्रा 6)।

हेलो-फिश निष्कर्षण प्रक्रिया से हटाए गए प्रोटीन को हल करने के लिए अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ संयोजन में न्यूक्लियोस्केलेटन के साथ जीनोमिक इंटरैक्शन के अध्ययन को सक्षम करके एक अनूठी विधि है। यह प्रदर्शित किया गया है कि न्यूक्लियोस्केलेटन को विभिन्न बीमारियों में संशोधित किया जाता है जैसे कि कुछ कैंसरप्रकार 19 और नैदानिक बायोमार्कर24,25 के रूप में कुछ न्यूक्लियोस्केलेटन से जुड़े प्रोटीन का महत्व। इस प्रकार, रोग15,24,25,27 में क्रोमैटिन संगठन / विघटन पर न्यूक्लियोस्केलेटन के प्रभाव की जांच करने में इस तकनीक की महत्वपूर्ण भूमिका है और यह मानव कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है, अन्य जानवरों से क्रोमोसोमल पेंटिंग जांच के साथ, एक ही डीएनए-हेलोप्रोटोकॉल को नियोजित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम क्रोमोसोम आर्म पेंटिंग जांच के उपहार के लिए प्रोफेसर माइकल बिटनर को धन्यवाद देना चाहते हैं। एलजी को यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित यूरो-लैमिनोपैथिस परियोजना और ब्रुनेल प्रोजेरिया रिसर्च फंड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS Thermo Fisher Scientific 10388739 Used to create DNA halos
5-bromo-2′-deoxy-uridine   Sigma-Aldrich B5002-100MG Labelled nucleotide
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG Labelled nucleotide
Agar Technical Thermo Fisher Scientific 15562141 DNA isolation of BAC clones
Agarose Sigma-Aldrich A939-50G Check product size of DOP-PCR and nick translation
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) Coriell Institute AG08466 Cell line
Bacto tryptone Thermo Fisher Scientific 16269751 DNA isolation of BAC clones
Biotin-16-dUTP Roche Diagnostics  11093711103 Labelled nucleotides
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-25G DNA isolation of BAC clones
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)  Coriell Institute AG0297 Cell line
Coplin jar Thermo Fisher Scientific 12608596 Holds 5 slides or 8 slides back to back
Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279011 Block nonspecific hybridization in HALO FISH
DEPC-treated water Sigma-Aldrich 693520-1L DNA isolation of BAC clones
Dextran sulphate Sigma-Aldrich S4030 Hybridisation mixture
Digitonin Sigma-Aldrich D141 Component of extraction buffer
Digoxigenin-11-dUTP  Sigma-Aldrich 11093088910 Labelled nucleotides
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson Laboratory 715-165-150 Secondary antibody
EDTA Sigma-Aldrich E6758 Component of extraction buffer
Ethanol Component of extraction buffer
Ethanol Sigma-Aldrich 443611 Probe precipitation and HALO FISH
Fetal bovine system Thermo Fisher Scientific 26140079 Cell culture serum
Formamide Thermo Fisher Scientific 10523525 2D FISH of DNA halos
Glass wool Sigma-Aldrich 18421 Spin column
Herring sperm Sigma-Aldrich D7290 Probe precipitation
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) OSRAM HXP-R120W45C VIS Image capture of DNA halos
Hydrochloric acid Thermo Fisher Scientific 10313680 Cleaning microscope slides
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML DNA isolation of BAC clones
KAPA HiFi PCR Kit KAPA Biosystems KK2103 PCR Kit
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. Leica Microsystems Image capture of DNA halos
Luria-Bertani agar  Thermo Fisher Scientific 13274843 DNA isolation of BAC clones
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266 Component of CSK buffer
Methanol Thermo Fisher Scientific 10284580 Cleaning and sterilizing microscope slides
Mouse anti-BrdU antibody BD Pharmingen B2531-100UL BrdU visualisation
Newborn calf serum Thermo Fisher Scientific 16010159 Cell culture serum and blocking reagent
Nick translation kit Invitrogen
PCR grade water Sigma-Aldrich 693520-1L PCR and DNA isolation of BAC clones
PCR Primers Sigma-Aldrich
PIPES Sigma-Aldrich P1851 Component of CSK and extraction buffers
Potassium acetate Sigma-Aldrich P1190-100G DNA isolation of BAC clones
QuadriPERM® 4 X 12 SARSTEDT 94.6077.307 Square cell culture dish, polysterene with four compartments.  This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.
Rabbit Anti-Ki67 antibody Sigma-Aldrich ZRB1007-25UL Proliferation marker
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 DNA isolation of BAC clones
Rubber cement Halford's 101836 2D FISH of DNA halos
Sephadex G-50 Sigma-Aldrich S6022-25G Spin column
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Probe precipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Component of CSK, extraction and SSC buffers
Sodium citrate Sigma-Aldrich C8532 Component of SSC buffer
Sodium dodecyl sulphate  L3771-100G DNA isolation of BAC clones
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G DNA isolation of BAC clones
Spermidine Sigma-Aldrich S2626 Component of extraction buffer
Spermine Sigma-Aldrich S4264 Component of extraction buffer
Streptavidin-Cy3  Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies pa43001 Probe antibody
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Component of CSK buffer
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 CSK buffer+A66:D68
SuperFrost™ microscope slides Thermo Fisher Scientific 12372098 Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.
Swine anti-rabbit TRITC  Dako
TELO-PNA FISH KIT Agilent Dako K532511-8 Delineation of telomeres
Tris-HCl Sigma-Aldrich T3253-100G Column buffer
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T9284 Component of CSK buffer
Tryptone Thermo Fisher Scientific 10158962 DNA isolation of BAC clones
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416- 100ML Detergent
Vectashield mountant containing DAPI Vector Laboratories H-1200 2D FISH of DNA halos
Whole human chromosome probes Calbiochem 2D FISH of DNA halos
Yeast extract Thermo Fisher Scientific 10108202 DNA isolation of BAC clones

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References

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Formal Correction: Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. The Authors section was updated from:

Lauren S. Godwin1
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

to:

Lauren S. Godwin1
Emily Roberts2
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

डीएनए हेलो पर सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति पूरे गुणसूत्र, टेलोमेरेस और जीन लोकी को प्रकट करने की तैयारी करती है
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Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, J. M., Foster, H. A. Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. J. Vis. Exp. (169), e62017, doi:10.3791/62017 (2021).

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