Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescens in situ hybridisering på DNA halo præparater til at afsløre hele kromosomer, telomerer og gen loci

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62017
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London, 2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

ERRATUM NOTICE

Summary

Kombination af DNA-halopræparater med fluorescens in situ-hybridisering muliggør højopløsningsanalyse af genomiske interaktioner med nukleoskelettet. Vedhæftet genom fører til hybridiserede fluorescerende signaler placeret i de resterende ekstraherede kerner, mens ikke-bundet genom er i DNA-haloen, der omgiver de resterende kerner.

Abstract

Genomet er forbundet med flere strukturer inde i cellekerner for at regulere dets aktivitet og forankre det på bestemte steder. Disse strukturer er kollektivt kendt som nukleoskeletet og omfatter den nukleare lamina, nukleolerne og nukleare organer. Selvom der findes mange varianter af fluorescens in situ hybridisering (FISH) for at studere genomet og dets organisation, er disse ofte begrænset af opløsning og giver utilstrækkelig information om genomets tilknytning til nukleare strukturer. DNA-halo-metoden bruger høje saltkoncentrationer og ikke-ioniske vaskemidler til at generere DNA-sløjfer, der forbliver forankret til strukturer i kerner gennem tilknytningsregioner i genomet. Her ekstraheres opløselige nukleare proteiner, såsom histoner, lipider og DNA, der ikke er tæt bundet til den nukleare matrix. Dette fører til dannelsen af en halo af ikke-bundet DNA, der omgiver en resterende kerne, som selv indeholder DNA tæt forbundet med interne nukleare strukturer og ekstraktionsresistente proteiner. Disse udvidede DNA-strenge muliggør øget opløsning og kan lette fysisk kortlægning. I kombination med FISH har denne metode den ekstra fordel, at den studerer genomiske interaktioner med alle de strukturer, som genomet er forankret af. Denne teknik, kaldet HALO-FISH, er meget alsidig, hvorved DNA-haloer kan kobles med nukleinsyresonder for at afsløre genloci, hele kromosomer, alfa-satellit, telomerer og endda RNA. Denne teknik giver et indblik i nuklear organisation og funktion i normale celler og i sygdomsprogression som ved kræft.

Introduction

Den "nukleare matrix" blev først beskrevet af Berezney og Coffey i 19741. Efter at have udført ekstraktioner med høje saltmolariteter og nukleasebehandling på rotteleverkerner, identificerede de en proteinholdig strukturel ramme. DNA-halo-proceduren blev efterfølgende tilpasset fra denne metode og involverer fjernelse af opløselige proteiner, således at kun den nukleare matrix (NM) og NM-associerede proteiner og kromosomer vedvarer. DNA-bindingsregioner er placeret i bunden af DNA-sløjfer og kaldes matrixbundne regioner (MAR'er) eller stilladsfastgørelsesregioner (SAR'er), som er resistente over for ekstraktion med høje saltkoncentrationer og henholdsvis ionisk vaskemiddel lithium-3,5-diiodosalicylat (LIS). I DNA-haloer er DNA forbundet med MAR'er / SAR'er bundet inden for den resterende kerne, mens DNA-sløjferne strækker sig væk fra disse steder og danner DNA-haloen. Vi ved nu, at genomet er forankret via lamina associerede domæner (LAD'er) til den nukleare lamina og gennem nukleolære associerede regioner (NAD'er) og muligvis gennem andre nukleare strukturer såsom specifikke nukleare legemer.

DNA-halo-metoden kan bruges til fysisk kortlægning af DNA, gener og kromosomale regioner, da det udvidede DNA og kromatin giver en større opløsning, fordi kromatinet strippes for histoner, og DNA'et strækkes ud 2,3,4,5,6. Der er dog nogle begrænsninger, når du bruger DNA-haloer til denne applikation. For eksempel kan DNA, der er tæt forbundet med resterende kerner af DNA-haloer, være utilgængeligt for sonder, hvilket forhindrer det i analyse og fysisk kortlægning6. Andre teknikker som fiber-FISH 2,4,5,7 og molekylær kæmning 8 muliggør også fysisk kortlægning og har fordelen ved at være relativt hurtig og nem at udføre. Begge bruges fortrinsvis til DNA-kortlægning af gener frem for DNA-haloer. Disse metoder ekstraherer kromatinfibre ved anvendelse af opløsningsmiddel- eller saltekstraktioner fra kernen, men molekylær kæmning har tendens til at have bedre reproducerbarhed 8,9.

Der er et stigende bevis for, at nukleoskelettet har en rolle i at understøtte vigtige nukleare processer, såsom fastgørelsessteder for DNA, kromatinmodellering, DNA-transkription, DNA-reparation og DNA-replikation11,12. Som sådan blev DNA-halo-teknikken udviklet til at undersøge interaktionerne mellem nukleoskelettet og genomet under disse cellulære aktiviteter og er rutinemæssigt blevet brugt og rapporteret i forskning. Denne teknik er også blevet brugt til at undersøge interaktioner mellem genomet og nukleoskelettet i forhold til sygdomsprogression med malignitetsassocierede ændringer i nuklear struktur, der identificeres11.

DNA-halo-teknikken er også blevet brugt til at undersøge forholdet mellem genomet og nukleoskelettet under udvikling og differentiering12. En række undersøgelser har brugt en variation af DNA-halo-teknikken kendt som halosperm13 eller SpermHalo-FISH, hvis den kombineres med FISH14. Spermatozokromatin er tæt bundet til proteiner kendt som protamin, og denne teknik blev udviklet for at forbedre adgangen til sæd-DNA. Halosperm er blevet brugt til at undersøge integriteten af spermatozoer DNA og afgøre, om DNA-skader er til stede. Spermatozoer med mindre DNA-skade korrelerer med en større DNA-halostørrelse, mens spermatozoer med øgede niveauer af fragmenteret og beskadiget DNA havde enten små haloer eller slet ingen. Således kan halosperm bruges som en potentiel prognostisk markør for embryokvalitet og vellykket graviditet med IVF13. Dette eksempel understreger de potentielle kliniske anvendelser af denne teknik. I vores arbejde har vi brugt HALO-FISH til at vurdere ændringer i genomadfærd og effekten af specifikke lægemiddelbehandlinger i den for tidligt aldrende sygdom Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.

Sammen fremhæver disse og andre undersøgelser bredden af processer/anvendelser, som DNA-halo-teknikken kan bruges til at studere og anvendeligheden af teknikken.

Protocol

1. Diasforberedelse, sterilisering og cellekultur

  1. Der tilberedes 500 ml 10% HCl (v/v) og hældes i et stort bægerglas.
  2. Dråbemikroskopet glider individuelt ind i syren og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur på en ryster indstillet til 2 x g.
    FORSIGTIG: HCI er ætsende og irriterende. Det kan forårsage alvorlige hudforbrændinger og øjenskader og irritation af hud, øjne og åndedrætsorganer. Sørg for, at passende personlig beskyttelse bæres, herunder nitrilhandsker, øjenbeskyttelse og laboratoriefrakke.
  3. Dekanteret syre fra bægerglasset og vask glider ti gange i postevand og derefter yderligere ti gange i deioniseret vand.
  4. Skyl dias i methanol to gange og opbevar i methanol indtil sterilisering ved flamme.
    FORSIGTIG: Methanol er en meget brandfarlig væske og giftig ved indtagelse, hudkontakt eller indånding. Derudover kan methanol forårsage organskade, er ætsende og irriterende. Overhold grænserne for eksponering på arbejdspladsen, og sørg for, at der bæres passende personlige værnemidler, herunder butylgummihandsker, øjenbeskyttelse og laboratorielak. Hvor det er muligt, håndteres i et lokalt stinkskab til udsugning (LEV).
  5. Brug metaltænger eller lange tang til at fjerne et mikroskopglas fra bægerglasset, der indeholder methanol. Flamme over en bunsenbrænder for at sterilisere, og overfør til en rektangulær cellekulturbeholder indeholdende fire rum til dias, der ligger tæt på bunsenbrænderen.
    FORSIGTIG: Flammende tillader øjeblikkelig sterilisering af mikroskopglas før brug; Denne metode har dog tilknyttede farer. Da methanol er meget brandfarligt, er det vigtigt, at bægeret med objektglassene er placeret væk fra bunsenbrænderen. Der skal bruges lange tænger eller tang, der griber godt fat i diasene. Methanolniveauet i bægerglasset skal kun dække gliderne, både for at minimere mængden af anvendt metanol, og så kun enderne af tangen/tangen er i kontakt med metanolen. Sørg altid for, at metanolen er fordampet fra tangen eller tangen efter brug, og at disse er afkølet, før de lægges tilbage i bægerglasset med objektglas og methanol. Bægerglasset skal dækkes af et stykke aluminiumsfolie for at sulte ilten, hvis methanolen brænder. Flammen glider aldrig inden i en klasse II laminar strømningshætte, hvor luften cirkuleres.
  6. Alternativt kan du udføre trin 1.1 til 1.4, men i stedet for at flamme diasene efter inkubation med methanol, skal du placere dias på fnugfrit væv for at lufttørre. Når det er tørt, pakkes det ind i aluminiumsfolie og anbringes i en sterilisatorovn eller autoklave.
  7. Celler dyrkes i passende medium med serum i mindst 48 timer ved 37 °C i 5% CO2 , indtil 60-70 % sammenløb er nået. Denne protokol blev udført på en tidlig passage af humane dermale fibroblaster (HDF'er) og på klassiske Hutchinson-Gilford progeria syndrom (HGPS), fibroblaster (AG06297) og atypiske type 2 HGPS fibroblaster (AG08466). Høst hver celletype og tæl ved hjælp af et hæmocytometer til bestemmelse af celletæthed. Frø 1 x 105 celler i 10 ml medium pr. dias.
    BEMÆRK: Celletætheden er vigtig, da DNA-sløjfer fra forskellige kerner kan konvergere, hvis cellerne bliver for sammenflydende. Såtætheder skal muligvis optimeres afhængigt af den anvendte celletype, da transformerede celler kan sprede sig hurtigere, mens senere passagecellekulturer kan tage længere tid at nå den ønskede sammenløb.
  8. Hvis celler skal arresteres i G0 for at blive hvilende, skal du frø 1 x 105 celler (i 10 ml medium) pr. dias og lade vokse i 24 timer. Cellerne vaskes to gange med serumfrit medium og inkuberes i standardmedium, der indeholder en lavere koncentration af serum på 0,5 % (nyligt kalveserum, NCS; eller føtalt bovint serum, FBS) i 7 dage.
  9. Hvis cellernes proliferative status er påkrævet til DNA Halo-assayet, skal du bestemme celler, der har passeret gennem S-fase ved inkorporering af 5-brom-2'-deoxy-uridin (BrdU) i DNA'et under replikation.
    1. Frøceller som normalt og vokse i 24 timer. Dyrkningsmediet fjernes og erstattes med substrat indeholdende BrdU og 5-fluor-2'-deoxyuridin (3 μg/μL). Efter yderligere 24 timer fjernes mediet, cellerne vaskes en gang med medium (10% NCS) og tilføres derefter igen med frisk medium (10% NCS). Inkuber i yderligere 24 timer, og forbered derefter diasene til DNA-halo-assayet.

2. Forberedelse af sonde

  1. Kromosom-, hel- og armmalingssonder
    1. Lav kromosomprober fra amplifikation af flowsorterede eller mikrodissekerede kromosomer ved degenereret oligonukleotidprimet polymerasekædereaktion (DOP-PCR) ved hjælp af metoden af Telenius et al.16. Brug DOP-PCR til at mærke kromosomprober med enten Biotin-16-dUTP eller Digoxigenin-11-dUTP som vist i tabel 1. Se producentens instruktioner for forstærkningsprofil, men betingelserne for dette eksperiment er vist i tabel 2.
    2. Forbered arm eller hel kromosomsonde ved at sammensætte 8 μL mærket PCR-produkt, 7 μL Cot-1 DNA, 3 μL sildesæd, 1/20th volumen 3 M natriumacetat (pH 5,4) og 2 volumener 100% ethanol. Sondeopløsningen inkuberes i mindst 30 minutter ved -80 °C.
      BEMÆRK: Denne metode kan bruges til at oprette enkeltkromosomprober eller flere kromosomprober, hvis forskellige etiketter (dvs. Biotin-16-UTP og Digoxigenin-11-dUTP) anvendes til hvert kromosom af interesse.
      FORSIGTIG: Ethanol er en meget brandfarlig væske og damp og kan forårsage alvorlig øjenirritation. Holdes væk fra varme, varme overflader og antændelseskilder. Overhold grænserne for eksponering på arbejdspladsen, og sørg for, at der bæres passende personlige værnemidler, herunder butylgummihandsker, øjenbeskyttelse og laboratorielak. Hvor det er muligt, håndteres i et LEV-stinkskab.
    3. Centrifugersondeopløsning ved 13.700 x g i 15 minutter ved 4 °C og vask derefter med 70 % ethanol. Centrifugeringsproceduren gentages, og supernatanten kasseres, idet det sikres, at DNA-pelletsen ikke forstyrres eller tabes. Lad DNA-pillen tørre.
    4. Der tilsættes 12 μL hybridiseringsbuffer (50% formamid, 10% dextransulfat, 10% 20x saltvandsnatriumcitrat (SSC; 3 M NaCl, 0,3 M trinatriumcitrat; pH 7,0), 1% (v/v) polyoxyethylensorbinalmonolaurat (Tween-20)) til DNA-pelleten. Der henstår ved 37 °C i mindst 2 timer, før DNA-pelleten opløses i hybridiseringsbufferen.
      FORSIGTIG: Formamid er kræftfremkaldende og teratogent, så det kan forårsage alvorlig skade på et ufødt barn. Hvis en kvinde er gravid eller har mistanke om, at hun er gravid, bør de undgå at arbejde med formamid. Formamid bør anvendes i en LEV-stinkhætte. Overhold grænserne for eksponering på arbejdspladsen, og sørg for, at der bæres passende personlige værnemidler, herunder butylgummihandsker, øjenbeskyttelse og laboratorielak.
  2. DNA-isolering fra bakterielle kunstige kromosomer (BAC'er)
    1. Stribe en lille del af glycerolstammen fra BAC-klonen på en Luria-Bertani (LB) agarplade (1% (W / V) NaCl; 1% (w / v) trypton, 0,5% (w / v) gærekstrakt, 1,5% (w / v) agarteknisk, 12,5 μg / ml (w / v) chloramphenicol). Der inkuberes natten over ved 37 °C.
    2. Vælg en enkelt koloni fra pladen og pod 10 ml LB bouillon (1% (w / v) NaCl, 1% (w / v) bactotrypton, 0,5% (w / v) gærekstrakt, 12,5 μg / ml (w / v) chloramphenicol). Opløsningen efterlades i en rysteinkubator natten over ved 37 °C.
      FORSIGTIG: Chloramphenicol mistænkes for at forårsage kræft. Håndter forsigtigt og reducer eksponeringen.
    3. Centrifuger kultur ved 1.700 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Supernatant kasseres, og pelletsen tilsættes 300 μL P1-opløsning (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A). Vortex kraftigt og overfør celler til et 2 ml mikrocentrifugerør.
    5. Tilsæt 300 μL P2-opløsning (0,2 M NaOH, 1% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS) dråbevis til cellerne. Vend det lukkede mikrocentrifugeglas 5 gange og lad det stå ved stuetemperatur i maksimalt 5 min.
      FORSIGTIG: Natriumhydroxid er ætsende og kan forårsage alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Det kan være ætsende for metaller. Håndter forsigtigt og reducer eksponeringen. Overhold grænserne for eksponering på arbejdspladsen, og sørg for, at der bæres passende personlige værnemidler, herunder nitrilgummihandsker, øjenbeskyttelse og laboratorielak. Hvor det er muligt, håndteres i et LEV-stinkskab.
      FORSIGTIG: Natriumdodecylsulfat er et brandfarligt fast stof, skadeligt ved indtagelse og kan forårsage hud- og åndedrætsirritation. Det kan også forårsage alvorlig øjenskade. Sørg for, at passende personlige værnemidler bæres, herunder nitrilgummihandsker, øjenbeskyttelse og laboratorielak. Hvor det er muligt, håndteres i et LEV-stinkskab.
    6. Tilsæt 300 μL P3 (3 M kaliumacetat) langsomt til cellerne og bland forsigtigt. Anbring mikrocentrifugerøret på is i 10 min.
    7. Der centrifugeres ved 8,100 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten overføres til et glas indeholdende 800 μl iskold isopropanol. Vend røret flere gange og inkuber ved -20 °C natten over.
      FORSIGTIG: Isopropanol er en meget brandfarlig væske og damp og kan forårsage alvorlig øjenirritation, døsighed eller svimmelhed. Holdes væk fra varme, varme overflader og antændelseskilder. Overhold grænserne for eksponering på arbejdspladsen, og sørg for, at der bæres passende personlig beskyttelse, herunder nitrilgummihandsker, øjenbeskyttelse og en laboratoriefrakke. Hvor det er muligt, håndteres i et stinkskab.
    8. Der centrifugeres ved 8.100 x g i 15 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes og overføres til et andet glas. Tilsæt 500 μL iskold 70% ethanol. Inverter glasset flere gange og centrifuger ved 8.100 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    9. Supernatanten fjernes og lufttørres pellet ved stuetemperatur. Når pelletten er tør, opslæmmes 40 μL diethylpyrocarbonatbehandlet vand (DEPC-behandlet) og efterlades ved 4 °C natten over. Når den er helt resuspenderet, fjernes 5 μL opløsning og lægges på en 1% agarosegel for at kontrollere tilstedeværelsen af DNA.
  3. Enkeltgenprobeforberedelse af BAC'er via nick-oversættelse
    1. Brug kommercielt tilgængelige nick oversættelse mærkning kits. Alternativt kan du bruge følgende protokol. Se tabel 3 for bestanddele og mængder.
    2. Tilsæt bestanddelene fra tabel 3 sammen i et mikrocentrifugerør, tilsæt DNA-polymerase I til sidst, bland forsigtigt og centrifuger kort i nogle få sekunder. Opløsningen inkuberes ved 15 °C i 2 timer.
    3. For at kontrollere fragmentstørrelser lægges 5 μL af opløsningen på en 2% agarosegel. DNA-fragmentstørrelsesområdet skal være mellem 200-600 bp. Hvis DNA-fragmentstørrelserne er større, skal du fortsætte med at inkubere opløsningen i yderligere 15 minutter ved 15 °C og køre produkterne på 2% agarosegel.
    4. Stop nick-oversættelsesreaktionen ved at tilføje 10 mM EDTA, 0,1% SDS (2,5 μL 0,5 M EDTA, pH 8,0 i 100 μL og 1 μL 10% SDS i 100 μL). Opløsningen opvarmes ved 65 °C i 5 min.
    5. For at fjerne ikke-inkorporerede nukleotider påføres BAC-sonde på en spinsøjle. Kommercielle spinkolonner kan købes, eller de kan oprettes ved hjælp af en sprøjte som følger:
    6. Der tilsættes 30 g Sephadex G-50 til 500 ml kolonnebuffer (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Autoklave blandingen. Lav også 500 ml søjlebuffer (uden Sephadex G-50) og autoklave.
    7. Lav centrifugeringskolonner ved at tilføje autoklaveret glasuld til bunden af en 1 ml sprøjte. Fyld 1 ml sprøjten med Sephadex G-50 i kolonnebuffer. Anbring 1 ml sprøjte i et 15 ml centrifugerør, der har et mikrocentrifugerør uden låg i bunden. Centrifuger ved 1.600 x g i 5 min.
    8. Fjern sprøjten og kassér mikrocentrifugerøret i bunden. Tilsæt et frisk mikrocentrifugerør tilbage i 15 ml centrifugeglasset. Tilsæt kolonnebuffer (uden Sephadex G-50) til 1 ml sprøjten og sæt tilbage i 15 ml centrifugeglasset. Centrifuger ved 1.600 x g i 5 min. Gentag dette trin igen to gange.
    9. Fjern sprøjten og sæt den ind i et 15 ml centrifugerør, der indeholder et nyt rent mikrocentrifugerør. Påfør sonden på sprøjten og opsaml sonden i mikrocentrifugerøret.
    10. For at udfælde DNA-sonden tilsættes 5 μL sildesæd-DNA (10 mg/ml), 10 μL natriumacetat og 2,25 volumen 100% ethanol til DNA-opløsningen. Bland forsigtigt opløsningen og inkuber ved -80 °C i mindst 1 time. Der centrifugeres ved 13.700 x g i 15 minutter ved 4 °C.
    11. Supernatanten kasseres, og pelletpen vaskes med 200 μL iskold 70 % ethanol i 15 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes og lufttørres. Når pellet er tørt, resuspenderes pellet i 20 μL DEPC-behandlet vand ved stuetemperatur i flere timer eller natten over ved 4 °C. Sonden er nu klar til brug eller kan opbevares ved -20 °C.
    12. For hvert dias blandes 5 μL sonde-DNA med 5 μL Cot-1 DNA og tørres ved hjælp af en Speed Vac vakuumkoncentrator. Når pelleten er tørret, suspenderes den igen i 12 μL hybridiseringsblanding.

3. DNA Halo-forberedelse

  1. Fjern den firkantede kulturskål, der indeholder diasene og vedhæftede celler fra inkubatoren. Kassér mediet, mærk dias med en blyant og læg det i en Coplin-krukke indeholdende 50 ml iskold cytoskeletbuffer (CSK): 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3 M saccharose, 10 mM 1, 4-piperazindiethanesulfonsyre (PIPES; pH 7,8), 0,5% (v/v) Triton X-100 i deioniseret vand. Der inkuberes i 15 minutter på is eller ved 4 °C.
    FORSIGTIG: Triton X-100 kan forårsage hudirritation og alvorlig øjenskade. Håndter ved hjælp af passende personlige værnemidler, herunder nitrilhandsker, beskyttelsesbriller og laboratoriefrakke.
  2. Kassér CSK-bufferen, og skyl hurtigt dias i 50 ml 1x DNA-halobuffer (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO 4, 15 mM KH2PO 4; pH7,4) tre gange, dvs. dypp skub i Coplin-krukken indeholdende DHB og fjern.
  3. Overfør dias til en Coplin krukke indeholdende 50 ml ekstraktionsbuffer: 2 M NaCl, 10 mM RØR (pH 6,8), 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,1% (w / v) digitonin, 0,05 mM (v / v) spermin, 0,125 mM (v / v) spermidin. Inkuber i 4 minutter ved stuetemperatur.
    FORSIGTIG: Digitonin er giftigt ved indtagelse eller i hudkontakt og er dødeligt ved indånding. Sørg for, at digitonin håndteres i et LEV-stinkskab, og brug laboratoriefrakke, nitrilhandsker (dobbelthandske), sikkerhedsbriller og maske. Både spermin og spermidin kan forårsage alvorlige hudforbrændinger og øjenskader, mens EDTA forårsager alvorlig øjenirritation, så håndter hvert kemikalie med omhu.
    BEMÆRK: Forbered digitonin separat ved at opløse pulveret i vand ved en temperatur på 60-70 °C. Tilsæt opløst digitonin til ekstraktionsbufferen, når den er afkølet. Tilsæt spermin, spermidin og digitonin sidst til ekstraktionsbufferen for at bevare den biologiske aktivitet.
  4. Inkuber dias fortløbende i 50 ml 10x DHB (1,4 M NaCl, 270 mM KCl, 1,1 M NaHPO 4, 150 mM KH2PO4; PH7.4), 5x, 2x og 1x DHB for 1 min hver.
  5. Dip glider (lige ind og lige ud) gennem en 50 ml sekventiel ethanolserie på 10%, 30%, 70% og 95% (v / v) ethanol.
  6. Lufttørres og opbevares ved -80 °C, indtil todimensionel fluorescens in situ-hybridisering (2D FISH) udføres.

4. Todimensionel fluorescens in situ hybridisering

  1. Lav 20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M trinatriumcitrat, pH 7,0. Denne buffer kan autoklaveres, opbevares ved stuetemperatur og fortyndes efter behov.
  2. Lav 70% (v / v) formamid, 2x SSC pH 7,0 og opvarm til 70 ° C i et vandbad.
  3. Inkuber dias i 5 minutter hver gennem en sekventiel 50 ml ethanolserie på 70, 90 og 100% ethanol.
  4. Lufttørre glider på en varmeplade og bages i en 70 °C ovn i 5 min.
  5. Denatureringen glider ved at anbringe 2x SSC-opløsningen på 70% formamid i 2 minutter ved 70 °C.
    BEMÆRK: Temperaturen og timingen er afgørende for trin 4.5. Hvis temperaturen er, denatureres DNA'et ikke, og sonderne hybridiseres ikke, og der opnås intet signal fra DNA-halo FISH.
  6. Placer det denaturerede dias i 50 ml iskold 70% ethanol i 5 min og tag gennem en ethanolserie på 90%, 95% og 100% ved stuetemperatur i 5 min hver.
  7. Lufttør på en varmeplade
  8. Håndter direkte mærkede samlede humane kromosomprober i henhold til producentens anvisninger. Til disse eksperimenter brugte vi menneskelige hele kromosommaling 1, 13, 15, 17 og 18. Derudover blev CCND1 og CTNNA1 genprober anvendt i dette eksperiment.
    BEMÆRK: Både hele kromosomproberne og BAC-genspecifikke sonder blev mærket med biotin-11-dUTP og påvist af streptavidin konjugeret med cyanin 3 (Cy3). For kromosommalingssonder fremstillet af (DOP-PCR) og BAC-DNA mærket ved nick-translation, vil disse blive omtalt som DNA-sonder fra dette tidspunkt og frem i protokollen og behandlet som følger.
  9. Denaturer DNA-sonde (hel kromosommaling eller genspecifik sonde) ved 75 °C i 10 minutter i en varmeblok eller vandbad.
  10. Varm DNA-sonder ved 37 °C i 30 minutter i en varmeblok eller et vandbad, før der pipetteres 10 μL på det relevante objektglas.
    BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at blokere gentagne kromosomale sekvenser. Hvis der ikke udføres ikke-specifikke signaler, kan der produceres uspecifikke signaler i DNA Halo FISH.
  11. Overlejringssonde med et 21 mm x 21 mm dæksel og tætning ved hjælp af gummicement.
  12. Der inkuberes objektglas i mindst 18 timer ved 37 °C i et befugtet hybridiseringskammer.
    BEMÆRK: Befugtede hybridiseringskamre kan fremstilles af sandwichkasser, der indeholder flere lag fugtet væv og en hævet platform konstrueret af skårne 10 ml plastpipetter til at hvile gliderne på. Dette er dækket af aluminiumsfolie for at minimere udsættelse for lys.
  13. Fjern gummicementen forsigtigt ved hjælp af tang.
  14. Inkuber dias i 50 ml 50% (v/v) formamid, 2x SSC, pH 7,0 opløsning, der er forvarmet til 45 °C i tre 5 minutters inkubationer.
    BEMÆRK: Lad dæksedlen falde væk fra objektglasset i den første inkubation i 50% (v/v) formamid, 2x SSC, pH 7,0 opløsning. Dette forhindrer beskadigelse af DNA Halo-præparatet, der kan være forårsaget af at 'trække' dækslet væk. Gliderne kan omrøres i bufferen via greb med pincet for at hjælpe med at løsne dækslet.
  15. Derefter anbringes objektglas i 50 ml 0,1x SSC, pH 7,0-opløsning, der er forvarmet til 60 °C, men anbragt i et 45 °C vandbad. Inkuber i 5 min og erstat bufferen to gange mere med 5 min inkubationer.
  16. Anbring gliderne i en Coplin-krukke indeholdende 50 ml 4x SSC, pH 7,0-opløsning ved stuetemperatur og inkuber i 15 minutter med tre bufferændringer.
  17. Påfør 100 μL 4% BSA, 4x SSC-opløsning på hvert dias og overlejr med et stykke paraffinfilm. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Dette forhindrer ikke-specifik binding af antistoffet.
  18. For at detektere den mærkede sonde (biotin-16-dUTP) inkuberes med 100 μL af en 1:200 (fremstillet i 1% BSA, 4x SSC) streptavidin-Cy3 i 1 time ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Følg producentens anvisninger med fortyndinger af antistoffer og testfortynding inden eksperiment for at sikre, at der produceres et godt signal
  19. Anbring objektglassene i en Coplin-krukke indeholdende 50 ml 4x SSC (0,5% Tween-20) pH 7,0-opløsning ved stuetemperatur og inkuber i 15 minutter med tre bufferskift. Slides kan monteres på dette trin som vist i trin 4.21, hvis immunofluorescens ikke er påkrævet.
  20. Hvis proliferativ status for celler lavet til DNA-haloer er påkrævet, pletter med anti-pKi67-antistoffer efter FISH-trinnene, før montering eller pletter for inkorporeret BrdU.
    1. Vask dias 3 gange i 5 minutter hver i 50 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS), efterfulgt af blokering med 4% NCS i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
    2. Påfør 200 μL af det nødvendige primære antistof (kanin anti-human pKi67; mus anti-BrdU) på diaset, overlejring med en strimmel paraffinfilm og inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
    3. Vask dias 3 gange i 5 minutter i 1x PBS og inkuber ved stuetemperatur i 1 time i 200 μL fluorkrom-konjugeret sekundært antistof (pKi67: svin anti-kanin TRITC; BrdU: æsel anti-mus Cy3). Udfør yderligere 3 5 minutters vask med PBS. Alle fortyndinger skal foretages ved hjælp af 1% (v/v) NCS i PBS ved producentens udvalg af foreslåede fortyndinger.
  21. Monter gliderne i 20 μL monteringsmiddel indeholdende DAPI og overlay med en 22 mm x 50 mm coverslip.

5. Telomer PNA FISK

  1. For at detektere telomerer skal du bruge telomer PNA FISH kit - FITC; Udfør proceduren med producentens anvisninger. Proceduren skal udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
  2. Nedsænk dias i tris-bufret saltvand (TBS, pH 7,5) i 2 minutter og læg derefter i 3,7% formaldehyd (i TBS; v / v) i nøjagtigt 2 minutter.
    TBS-opløsning indeholder 10-30% trometamol og 10-30% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propan-1,3-diolhydrochlorid. Dette kan forårsage alvorlig øjen- og hudirritation, så brug beskyttelseshandsker og beskyttelsesbriller / ansigtsbeskyttelse. Brug i et godt ventileret område.
  3. Vask dias i en Coplin krukke to gange med TBS i 5 min hver.
  4. Nedsænk dias i forbehandlingsopløsningen i 10 minutter, og vask derefter to gange med TBS i 5 minutter pr. vask.
  5. Derefter tages diasene gennem en iskold ethanolserie bestående af 50 ml 70%, 85% og 95% (v / v) ethanol i 2 minutter pr. Koncentration. Lad derefter rutsjebanerne lufttørre.
  6. Påfør 10 μL Telomere PNA Probe/FITC (eller Cy3) afhængigt af valget af fluorescerende mærkefarve på hvert dias og dækseloverlejring med en dæksel. Der inkuberes i en forvarmet ovn, der er indstillet til 80 °C i 5 minutter, og anbringes derefter i mørke i ca. 1 time.
    FORSIGTIG: Telomere PNA Probe/FITC indeholder 6-100% formamid, som forårsager alvorlig øjenirritation og er teratogen, så det kan forårsage alvorlig skade på et ufødt barn. Hvis en kvinde er gravid eller har mistanke om, at hun er gravid, bør de undgå at arbejde med formamid. Formamid bør anvendes i en LEV-stinkhætte, og passende øjen- eller ansigtsbeskyttelse bør bæres.
  7. For at fjerne dæksedlerne nedsænkes diasene i 'Rinse Solution' i 1 min og placeres derefter i 'Wash Solution' i 5 minutter ved 65 °C.
    FORSIGTIG: Vaskeopløsningen indeholder 1-5% polyoxyethylenoctylphenylether og 1-5% natriumchlorid. Dette er ætsende og kan forårsage alvorlig øjenskade. Sørg for, at beskyttelsesbriller eller ansigtsbeskyttelse bæres, når du håndterer vaskeopløsningen.
  8. Inkuber dias gennem en 50 ml iskold ethanolserie (70%, 85% og 95% (v / v)) i 2 minutter pr. Koncentration og lufttør derefter. Når tørmonteringen er tør, skal du glide med monteringsmiddel indeholdende DAPI og overlejre med en dæksel.

6. Billedoptagelse og analyse

  1. For at visualisere DNA-haloer og kromosomområder skal du bruge et epifluorescensmikroskop (f.eks. Leica DM4000-mikroskop), der tager billeder ved hjælp af et HC PL FLUOTAR 100X/1.30 oliemål og DFC365FX-kamera.
  2. Tag gråtonebilleder, og definer farve for hver kanal, der er taget, for at aktivere pseudofarvning af billeder. En kommerciel software blev brugt i dette eksperiment (f.eks. LAS AF version 4.5.0-software). De enkelte farvekanaler blev eksporteret som TIFF'er.
  3. Analysér billeder ved hjælp af Java-billedbehandlingsprogrammet Fiji ImageJ. Upload billede ved at trykke på Filer og Åbn.
  4. Indlæs separate billedkanaler, eller opdel et sammensat billede i separate gråtonekanaler ved at klikke på Billede | Farve | Opdel kanaler. Vælg en billedkanal, og klik på Billede | Juster , og vælg derefter Lysstyrke og kontrast. Skift i overensstemmelse hermed, og gentag med andre kanaler.
  5. Opret en maske af den resterende kerne ved at vælge den DAPI-farvede kanal, der viser kernen. Klik på Billede | Juster, og vælg derefter Tærskel. Der vises en dialogboks, hvor tærsklen kan ændres, marker afkrydsningsfeltet Mørk baggrund . Skift, indtil restkernen er klar, og tryk på Anvend , og luk dialogboksen.
    BEMÆRK: Dette opretter en binær maske baseret på pixelintensiteten, hvor hvide pixels viser områder af interesse og sorte pixels viser baggrund. Gentag den samme procedure på sondekanalen.
  6. Brug frihåndsmarkeringen til at skitsere periferien af den resterende kerne, og klik derefter på Rediger og ryd udenfor. Overlejr sondekanalen på den resterende kerne. Dette kan gøres ved at trykke på Image| Farve | Flet kanaler.
  7. Hvis du vil indstille måleskalaen i BilledeJ, skal du tegne en streg på skalabjælken eller mellem punkterne på to kendte afstande. Gå til Analysér , og tryk på Indstil skala. Tilføj afstandslængden i dialogboksen, og klik på OK. Hvis du vil måle afstande, skal du tegne en linje mellem de punkter, der måles, og klikke på Analysér | Mål. Dette overfører afstandsværdierne til et datavindue.
  8. Mål den klareste DAPI-intensitet, da denne falder sammen med kernens centrum. Fra denne måling afstanden fra atomcentret til den fjerneste kromosomområdekant (CTE). Mål afstanden fra atomcentret til den nukleare kant (NE).
  9. Sørg for, at resultaterne vises som et CTE / NE-forhold. Her divideres afstanden fra kernecentret til hver fjerneste kromosomområdekant (CTE) med afstanden fra kernecentret til hver respektive nukleare kant (NE). Dette skal udføres på mindst 50 kerner. Dette kan være afbildet som et søjle- eller boksdiagram.
  10. Til analyse af telomererne skal du analysere mindst 30 kerner pr. datasæt. Billeder kan analyseres ved hjælp af Fiji ImageJ eller manuelt for at tælle antallet af telomerer i den resterende kerne og inden for DNA-haloen. BrdU eller pKi67 muliggjorde differentiering af prolifererende (BrdU/piK67+) og senescerende/hvilende (BrdU/pKi67-) kerner. Data kan afbildes i søjlediagrammer med fejlbjælker svarende til standardfejl for middelværdien (SEM).
  11. Brug elevens t-test (uparret) til statistisk at sammenligne resultaterne med p> 0,05, der betragtes som signifikante.

Representative Results

Denne metode til DNA-haloforberedelse har hjulpet os i vores bestræbelser på at bestemme forskelle i genomadfærd inden for unge og gamle celler, men også i celler afledt af for tidlige aldringssygdomme med afvigende nukleoskeletale proteiner15. Figur 1 viser eksempler på DNA-haloer, hvor det er muligt at se kanten af en restkerne, DNA'et, der forbliver i den resterende kerne, og det ikke-bundne DNA, der er spoleret ud i det omkringliggende område og skaber en DNA-halo. Det viser også analysen, der viser, hvordan restkernen opnås og NE- og CTE-målingerne. Det er muligt at skelne mellem prolifererende og ikke-prolifererende celler ved enten at inkorporere et mærket nukleotid, såsom BrdU, når celler er i S-fase eller anvende den diagnostiske proliferationsmarkør anti-pKi67, som afslører nukleoler, og regioner af heterochromatin i G1-celler17,18. Primære celler dyrket i højt serum uden at opnå sammenløb, der er negative for proliferationsmarkørerne, antages at være senescerende. Primære celler dyrket i lavt serum eller er blevet sammenflydende, dvs. kontakthæmmede, der er negative for proliferationsmarkørerne, anses for hvilende og ville være i stand til at komme ind i den proliferative cellecyklus igen givet de korrekte næringsstoffer og situation. At være i stand til at skelne mellem Ki67 positive og negative celler har gjort det muligt for os at bestemme forskelle mellem spredende, hvilende og senescerende humane dermale fibroblaster. Figur 2 viser DNA-haloer af prolifererende humane dermale fibroblaster skabt af celler, hvor BrdU blev inkorporeret i dem under DNA-replikation, en mekanisme, der ikke forekommer i ikke-prolifererende celler og efterfølgende farvet med anti-BrdU-antistof. Farvning med det proliferative markør anti-pKi67-antistof er også synligt i figur 2. Dette er et robust antigen og overlever FISH-protokollen og kan derfor farves til post-FISH og formontering. Således er prolifererende celler positive (røde) for BrdU og anti-pKi67 (røde) i venstre kolonne og ikke-prolifererende celler, faktisk vises senescerende celler i figur 2 i højre kolonne. De grønne signaler er individuelle telomerer, der afsløres med et telomer PNA FISH/FITC-sæt. Kombination af immunfluorescens med DNA-haloer muliggør analyse under forskellige celletilstande, som vist i figur 2, når man undersøger proliferationerende, hvilende og senescerende celler. Afhængigt af det valgte antistof kan andre betingelser undersøges, såsom differentiering, DNA-skade via bestråling osv.

Kromosomområder kan også visualiseres inden for DNA-haloer ved hjælp af FISH. På grund af præparatet, der tillader spolering af DNA ud af kernerne, kan kromosomets territoriesform forstyrres, med mindre eller større mængder af kromosomet, der findes i DNA-haloen, afhængigt af forankringen af genomet inde i den resterende kerne og dens strukturer. Figur 3 afslører et panel af DNA-haloer, hvorved individuelle kromosomer er blevet afsløret med specifikke helarmskromosommalingssonder (røde) for kromosomer 1, 13, 17 og 18. Anti-pKi67 (grøn) er blevet brugt til at markere prolifererende celler og dets fravær inden for samme kultur på det samme dias, der betegner senescerende celler. Det fremgår meget tydeligt af billederne og de data, der præsenteres som CTE/NE, at det lille genfattige kromosom 18 er et kromosom, der har få bindinger og spoler længere ud i DNA-haloen væk fra restkernerne og er signifikant længere væk fra midten af restkernerne end de andre kromosomer. Dette gælder dog også for kromosom 1. Ved hjælp af proliferativ markør anti-pKi67 har det også været muligt at sammenligne formering med senescerende celler inden for samme kultur og på samme dias, og denne analyse har afsløret, at kromosomer inden for disse to meget forskellige cellestatusser ikke er signifikant forskellige fra hinanden med hensyn til binding med de resterende nukleare strukturer.

Interessant nok viser gener også statistisk signifikante forskelle mellem prolifererende og senescerende celler med hensyn til at forblive inden for en resterende kerne eller være placeret i DNA-haloen. Figur 4 viser dette med gen-loci afgrænset af mærkede BAC-sonder i rødt og anti-Ki67 i grønt. Der er ingen signifikante forskelle mellem genplaceringer i de prolifererende versus de senescerende celler efter et DNA Halo-præparat. Der er dog betydeligt flere catenin alpha 1 CTNNA1 loci inden for DNA-haloen end cyclin D1 CNDD1 loci, hvor der er meget få. Figur 5 viser DNA-halopræparater med telomerer i grønt. Baggrunden efterlades bevidst høj for at gøre det muligt at visualisere telomersignaler i DNA-haloen. I dette sæt data hvilende celler, dvs. celler, der har været serum sultet i 7 dage, er inkluderet, og interessant nok er der signifikant flere telomerer, der ikke er fastgjort og placeret i DNA-haloerne i hvilende celler end for prolifererende og senescerende celler. I figur 5a kan andelen af telomerer i DNA-haloen observeres, især for billedet 'Eksperiment 2'. Dette svarer til figur 5b , hvor den gennemsnitlige procentdel af telomerer i DNA-halo er ca. 17% i hvilende celler. Der er nogle tegn på, at ikke alle telomerer i senescerende celler kan ses, da nogle af dem måske er meget korte.

Denne metode til DNA-halo har været vellykket for os at undersøge genominteraktionsændringer i kerner i syge celler15. Figur 6 viser forskelle i kromosombinding i primære kontrolfibroblaster og i syge celler med typisk (lamin A-mutation) og atypisk Hutchinson-Gilford Progeria-syndrom, der udtrykker en anden SUN1-isoform og ingen lamin A-mutation19. Kromosomerne 1 og 13 viser statistisk signifikante forskelle i deres binding inden for de resterende kerner sammenlignet med kontrol-DNA-haloer. Figur 6b korrelerer placeringen af hele kromosomområdet med restkernen og DNA-haloen. Værdier på 1 eller mindre angiver, at kromosomet er placeret inden for den resterende kerne, og værdier over 1 demonstrerer kromosomer eller dele af kromosomer i DNA-haloen.

Samlet set fremhæver dette nytten af HALO-FISH til at undersøge genomiske interaktioner mellem hele kromosomer, specifikke gener og telomerer under en række forhold, der påvirker cellecyklussen (proliferation, hviletilstand og ældning) eller inden for sygdomsceller, f.eks. progeria og kræftcellelinjer. Faktisk indebærer forskellene i interaktioner mellem disse tilstande, at nukleoskeletet har en vigtig rolle i reguleringen af nøgleprocesser i kernen.

Figure 1
Figur 1: HDF-ekstraheret kerne, der viser restkernen og DNA-haloen og oversigt over analysemetode. a) En HDF-kerne fremstillet ved hjælp af DNA-haloanalyse og modfarvet med DAPI. Den farvestrålende restkerne viser DNA forankret til nukleoskelettet, og dette er omgivet af det ikke-bundne DNA, der danner en glorie af DNA. Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. (b) Den blå kanal fanger den DAPI-farvede kerne og omgivende DNA. Den resterende kerne vælges og fjernes ved hjælp af ImageJ. Pilen viser afstanden fra kernecentret til den resterende nukleare kant (NE). c) Den røde kanal viser sondesignalet. d) Billedet med betegnelsen »resultat« er resultatet af at lægge den røde kanal oven på billedet af den blå kanal. dette tillader afstanden fra kernecentret til den fjerneste kromosomområdekant (CTE). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: DNA-halopræparat med telomer PNA FISH på prolifererende og senescerende HDF'er. Telomere PNA FISH på HDF'er udsat for DNA-halo-assay. Telomersignaler visualiseres i grønt (FITC), rest- og halo-DNA blev modfarvet ved hjælp af DAPI (blå), og prolifererende kerner blev detekteret ved hjælp af enten anti-BrdU- eller anti-pKi67-antistoffer via indirekte immunfluorescens i rødt (TRITC). Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Nukleoskelet-kromosominteraktioner og analyse ved hjælp af DNA-halo-assay. a) 2D-FISH med sonder, der er specifikke for kromosomerne 1, 13, 15, 17 og 18, blev udført på HDF'er, der blev underkastet DNA-halo-præparation. Hele kromosomer blev malet i rødt (Cy3), og kerner blev undersøgt med pKi67 for at afgøre, om de spredte sig eller var senescerende. Prolifererende celler (pKi67+) blev afgrænset i grønt (FITC), mens senescerende celler forblev ufarvede (pKi67-), dvs. intet grønt signal detekteret. Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. b) Nukleoskelettets kromosomforankring i syd- og senescerende HDF'er, der har gennemgået HALO-FISH. Målinger viser forholdet mellem den fjerneste kromosomkant (CTE) og respektive nukleare kant (NE) for kromosomer 1, 13, 15, 17 og 18 i prolifererende (pKi67+) og senescerende (pKi67-) celler. Fejlbjælker repræsenterer ± SEM. (c) Modificeret boksplotrepræsentation af kromosomterritoriekant (CTE) til respektive kernekant (NE) af specifikke kromosomer i pKi67+ og pKi67- kerner. Q1 = nedre kvartil; Min = laveste registrerede værdi Med = median; Max = registreret maksimalværdi Q3 = øvre kvartil. Klik her for at se en større version af denne figur. 

Figure 4
Figur 4: Genspecifikke interaktioner i HDF'er ved hjælp af HALO-FISH. a) DNA-halo-ekstraherede kerner blev undersøgt med genspecifikke sonder (CCND1 og CTNNA1) for at undersøge deres forankring til NM på prolifererende og senescerende celler. Gensignalerne vises med rødt (Cy3), og anti-pKi67 viser celler, der formerer sig, og signalet visualiseres i grønt (FITC). For det prolifererende CCND1-billede er den resterende kerne indesluttet i den hvide cirkel, og mellemrummet mellem den hvide og grønne cirkel viser DNA-haloen. Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. (b) Genspecifikke signaler for CCND1 og CTNNA1 sammenlignes mellem restkernen og DNA-haloen og også mellem prolifererende og senescerende celler. Fejlbjælker repræsenterer ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: DNA-halo-analyse på hvilende HDF'er undersøgt med telomer PNA-FISH. (a) Hviletilstand for HDF blev induceret ved dyrkning i lavt serummedium i 7 dage. DNA-halo-analysen blev udført, og PNA-FISH muliggjorde visualisering af telomerer ved hjælp af FITC-signal (grøn), og den resterende kerne og omgivende DNA-halo blev modfarvet med DAPI (blå). Celler blev også farvet med anti-pKi67-antistof for at sikre, at kerner ikke spredte sig. Dette blev gentaget ved to separate lejligheder. Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. (b) Sammenligning af den gennemsnitlige procentdel af telomerer lokaliseret i DNA-haloen i spredende, senescerende og hvilende HDF-celler. Fejlbjælker repræsenterer ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Undersøgelse af hele kromosomforankring til nukleoskelettet i HGPS-celler ved hjælp af HALO-FISH26. a) Kontrolkerner af HDF (2DD), klassisk HGPS (AG06297) og atypisk type 2 HGPS (AG08466) gennemgik DNA-halo-forberedelse og derefter 2D-FISH ved hjælp af hele kromosommalinger til kromosom 1, 13, 15 og 17. Hele kromosomer er afbildet i grønt (FITC), og DNA blev modfarvet med DAPI (blå). Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. (b) Placeringen af kromosomer i ekstraherede kerner blev bestemt ved at måle forholdet mellem den gennemsnitlige kromosomområdekant (CTE) og kernekanten (NE). Et forhold over 1 viser, at den fjerneste CTE ligger uden for den tilsvarende NE inden for DNA-haloen, mens et forhold under 1 betyder, at den fjerneste CTE ligger inden for NE inden for den resterende kerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vælgere Volumen(μL)
5XDOP-PCRbuffer 10
dNTPmix (udenTTP) (2mM) 5
dTTP(2mM) 2
Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP 10
DOPprimer(20μM) 5
TaqDNAPolymerase(1U/μL) 1
PCRgradewater 12
Skabelon 5

Tabel 1: Tabel, der viser DOP-PCR-komponenter og volumener for en 1x reaktion

Skridt Cykler Temp (grad Celsius) Tidspunkt
Indledende denaturering 1 95 3 minutter
Denaturering 34 98 20 sek.
Primer udglødning 62 1 min
Forlængelse 72 30 s
Endelig forlængelse 1 72 5 minutter
Køling 4 Holde

Tabel 2: Tabel, der viser DOP-PCR-cyklus, temperatur og tidsprofil.

Konstituerende Volumen(μL)
10x NT-buffer (0,5 M Tris-HCl pH-værdi 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA) 5
0,1 M beta-mercaptoethanol 5
10X nukleotidlager (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotin-16-dUTP) 5
Dnase I (1 ng/ml) 2
DNApolymerase I 5U pr. μg DNA
DNA-skabelon (1 μg) 1
DEPC-behandlet vand Til 50 μL

Tabel 3: Tabel, der viser nick-oversættelseskomponenter og -volumener for en enkelt sonde.

Discussion

DNA-halo-metoden er en fremragende metode til valg ved analyse af interaktioner mellem nukleoskelettet og genomet, men der er nogle kritiske trin, der også skal overholdes. En af de vigtigste parametre er optimeringen af cellesåningstætheden. Hvis celler bliver overflydende, vil DNA-haloerne overlappe med naboceller, hvilket gør det umuligt at udføre analysen. CSK og ekstraktionsbuffere skal altid gøres friske på anvendelsesdagen, idet spermin, spermidin og digitonin tilsættes ekstraktionsbufferen ved afslutningen af fremstillingsprocessen for at opretholde deres biologiske aktivitet. Hvis du udfører Halo-FISH, er det ekstremt vigtigt at bruge den korrekte denatureringstemperatur for DNA-haloerne for at gøre det muligt for sonden eller malingen efterfølgende at hybridisere.

Elektronmikroskopi er blevet brugt til at visualisere den nukleare matrix, hvor filamentøse strukturer identificeres20. Imidlertid er elektronmikroskopi begrænset, da matrixforeninger med kromatin ikke let kan udledes. Faktisk er DNA Halo-metoden mere alsidig sammenlignet med elektronmikroskopi, da specifikke gener, kromosomer og celletilstande alle kan undersøges. Desuden undersøges proteomisk analyse af nukleare matrixproteiner21,22. Denne metode er god til sammenligning af nukleare matrixkomponenter, især når man sammenligner syge celler, men den giver ikke den rumlige fordeling og vedhæftede filer, der fremhæves af standard DNA Halo-teknikken.

DNA Halo-assays har begrænsninger. For det første, da matrixen ekstraheres, kan dette kun udføres på faste celler, så levende billeddannelse er ikke mulig. Selvom DNA Halo-metoden er relativt hurtig og nem at udføre, kan den samlede proces være tidskrævende, når cellekultur, sondegenerering, Halo-FISH og analyse alle tages i betragtning.

Billedoptagelse af DNA-haloer og HALO-FISH ved hjælp af superopløsningsmikroskopi ville i høj grad forbedre opløsningen af DNA-specifikke sonder og antistoffer. Da fluorkromer lettere kan opløses spektralt, kan det desuden være muligt at bruge et antal DNA-sonder i et enkelt eksperiment, hvilket giver endnu mere information. Forbedringer i molekylærbiologiske teknikker såsom kromosom konformation capture (3C) er blevet brugt til at bestemme interaktioner af gen loci og analysere den rumlige organisation på kromatin i cellen. DNA Halo-assays og 3C kan kombineres, et udtryk kendt som M3C23, hvilket igen demonstrerer tilpasningsevnen af DNA Halo-teknikken.

De originale data, der præsenteres her, skal demonstrere mulighederne for genomadfærdsforhør og hvordan man præsenterer disse data. Med disse data har vi vist, at det er muligt at bestemme signifikante forskelle i genombinding ved hjælp af (1) kromosommalingssonder, i denne undersøgelse afslørede kromosom 18 at være det mindst bundne kromosom ud af de analyserede (figur 3); (2) Gen-loci med signifikante forskelle mellem to gen-loci og (figur 4) (3) telomerer, som er mindre stærkt bundet i hvilende celler sammenlignet med prolifererende og senescerende celler (figur 5). Vi er i stand til at skelne mellem prolifererende og ikke-prolifererende celler via tilstedeværelsen af proliferationsmarkøren Ki67-antigenet, som er et uopløseligt protein, så forbliver hos de resterende kerner eller ved hjælp af inkorporering af nukleotider for at fremhæve celler, der har været igennem S-fase inden for en bestemt tidsperiode (figur 2). Denne teknik har også gjort det muligt for os at analysere genomadfærd i celler, der er kompromitteret i deres nukleoskeletoner, dvs. laminopaticeller, og her og i Bikkul et al., 2018 afslører vi, at genomet kan være mindre tæt knyttet sammenlignet med kontrolceller og kan gendannes ved behandling med specifikke lægemidler, der forbedrer effekten af lamin A-mutationen i klassiske HGPS-celler15. Vi viser dog nye data her for de atypiske HGPS AGO8466-celler, der mangler en lamin A-mutation, men indeholder en usædvanlig form af LINC-kompleksproteinet SUN1 19, som kromosom13 er mindre tæt knyttet til (figur 6).

HALO-FISH er en unik metode, der gør det muligt at studere genomiske interaktioner med nukleoskelettet i kombination med indirekte immunfluorescens for at løse proteiner, der ikke fjernes fra ekstraktionsproceduren. Det er blevet påvist, at nukleoskelettet er modificeret i forskellige sygdomme såsom visse kræfttyper19 og betydningen af nogle nukleoskeletassocierede proteiner som diagnostiske biomarkører24,25. Denne teknik har således en vigtig rolle i undersøgelsen af nukleoskelettets virkning på kromatinorganisation/disorganisering i sygdom 15,24,25,27 og er ikke begrænset til humane celler, med kromosommale malersonder fra andre dyr, den samme DNA-halo-protokol kunne anvendes 28.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke professor Michael Bittner for den venlige gave af kromosomarmmalerisonder. LG blev støttet af det EU-finansierede EURO-Laminopathies-projekt og Brunel Progeria Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS Thermo Fisher Scientific 10388739 Used to create DNA halos
5-bromo-2′-deoxy-uridine   Sigma-Aldrich B5002-100MG Labelled nucleotide
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG Labelled nucleotide
Agar Technical Thermo Fisher Scientific 15562141 DNA isolation of BAC clones
Agarose Sigma-Aldrich A939-50G Check product size of DOP-PCR and nick translation
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) Coriell Institute AG08466 Cell line
Bacto tryptone Thermo Fisher Scientific 16269751 DNA isolation of BAC clones
Biotin-16-dUTP Roche Diagnostics  11093711103 Labelled nucleotides
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-25G DNA isolation of BAC clones
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)  Coriell Institute AG0297 Cell line
Coplin jar Thermo Fisher Scientific 12608596 Holds 5 slides or 8 slides back to back
Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279011 Block nonspecific hybridization in HALO FISH
DEPC-treated water Sigma-Aldrich 693520-1L DNA isolation of BAC clones
Dextran sulphate Sigma-Aldrich S4030 Hybridisation mixture
Digitonin Sigma-Aldrich D141 Component of extraction buffer
Digoxigenin-11-dUTP  Sigma-Aldrich 11093088910 Labelled nucleotides
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson Laboratory 715-165-150 Secondary antibody
EDTA Sigma-Aldrich E6758 Component of extraction buffer
Ethanol Component of extraction buffer
Ethanol Sigma-Aldrich 443611 Probe precipitation and HALO FISH
Fetal bovine system Thermo Fisher Scientific 26140079 Cell culture serum
Formamide Thermo Fisher Scientific 10523525 2D FISH of DNA halos
Glass wool Sigma-Aldrich 18421 Spin column
Herring sperm Sigma-Aldrich D7290 Probe precipitation
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) OSRAM HXP-R120W45C VIS Image capture of DNA halos
Hydrochloric acid Thermo Fisher Scientific 10313680 Cleaning microscope slides
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML DNA isolation of BAC clones
KAPA HiFi PCR Kit KAPA Biosystems KK2103 PCR Kit
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. Leica Microsystems Image capture of DNA halos
Luria-Bertani agar  Thermo Fisher Scientific 13274843 DNA isolation of BAC clones
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266 Component of CSK buffer
Methanol Thermo Fisher Scientific 10284580 Cleaning and sterilizing microscope slides
Mouse anti-BrdU antibody BD Pharmingen B2531-100UL BrdU visualisation
Newborn calf serum Thermo Fisher Scientific 16010159 Cell culture serum and blocking reagent
Nick translation kit Invitrogen
PCR grade water Sigma-Aldrich 693520-1L PCR and DNA isolation of BAC clones
PCR Primers Sigma-Aldrich
PIPES Sigma-Aldrich P1851 Component of CSK and extraction buffers
Potassium acetate Sigma-Aldrich P1190-100G DNA isolation of BAC clones
QuadriPERM® 4 X 12 SARSTEDT 94.6077.307 Square cell culture dish, polysterene with four compartments.  This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.
Rabbit Anti-Ki67 antibody Sigma-Aldrich ZRB1007-25UL Proliferation marker
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 DNA isolation of BAC clones
Rubber cement Halford's 101836 2D FISH of DNA halos
Sephadex G-50 Sigma-Aldrich S6022-25G Spin column
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Probe precipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Component of CSK, extraction and SSC buffers
Sodium citrate Sigma-Aldrich C8532 Component of SSC buffer
Sodium dodecyl sulphate  L3771-100G DNA isolation of BAC clones
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G DNA isolation of BAC clones
Spermidine Sigma-Aldrich S2626 Component of extraction buffer
Spermine Sigma-Aldrich S4264 Component of extraction buffer
Streptavidin-Cy3  Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies pa43001 Probe antibody
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Component of CSK buffer
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 CSK buffer+A66:D68
SuperFrost™ microscope slides Thermo Fisher Scientific 12372098 Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.
Swine anti-rabbit TRITC  Dako
TELO-PNA FISH KIT Agilent Dako K532511-8 Delineation of telomeres
Tris-HCl Sigma-Aldrich T3253-100G Column buffer
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T9284 Component of CSK buffer
Tryptone Thermo Fisher Scientific 10158962 DNA isolation of BAC clones
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416- 100ML Detergent
Vectashield mountant containing DAPI Vector Laboratories H-1200 2D FISH of DNA halos
Whole human chromosome probes Calbiochem 2D FISH of DNA halos
Yeast extract Thermo Fisher Scientific 10108202 DNA isolation of BAC clones

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berezney, R., Coffey, D. S. Identification of a nuclear protein matrix. Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).
  2. Haaf, T., Ward, D. C. High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes. Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).
  3. Parra, I., Windle, B. High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization. Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).
  4. Senger, G., et al. Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization. Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).
  5. Florijn, R. J., et al. High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes. Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).
  6. Elcock, L. S., Bridger, J. M. Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres. Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).
  7. Heiskanen, M., et al. Visual mapping by fiber-FISH. Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).
  8. Bensimon, A., et al. Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface. Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).
  9. Michalet, X., et al. Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies. Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).
  10. Wilson, R. H., Coverley, D. Relationship between DNA replication and the nuclear matrix. Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).
  11. Wilson, R. H. C., Coverley, D. Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos. Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).
  12. Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).
  13. Tandara, M., et al. Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF. Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).
  14. Repping, S., et al. The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number. Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).
  15. Bikkul, M. U., et al. Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts. Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).
  16. Telenius, H., et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).
  17. Bridger, J. M., et al. Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells. Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).
  18. Sales Gil, R., Vagnarelli, P. Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).
  19. Bikkul, M. U., et al. Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform. Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).
  20. Jackson, D. A., Cook, P. R. Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat. EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).
  21. Albrethsen, J., et al. Unravelling the nuclear matrix proteome. Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).
  22. Mika, S., Rost, B. NMPdb: Database of nuclear matrix proteins. Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).
  23. Gavrilov, A. A., et al. of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).
  24. Sjakste, N., et al. Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis. Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).
  25. Leman, E. S., Getzenberg, R. H. Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).
  26. Volpi, E. V., Bridger, J. M. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).
  27. Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. Human Interphase Chromosomes. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).
  28. Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues. BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 169 DNA-haloforberedelse nuklear matrix nukleoskelet genomorganisation DNA-sløjfer kromosomområder udvidede kromatinfibre matrixvedhæftningsregioner telomerer

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. The Authors section was updated from:

Lauren S. Godwin1
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

to:

Lauren S. Godwin1
Emily Roberts2
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

Fluorescens in situ hybridisering på DNA halo præparater til at afsløre hele kromosomer, telomerer og gen loci
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, … More

Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, J. M., Foster, H. A. Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. J. Vis. Exp. (169), e62017, doi:10.3791/62017 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter