Kombination af DNA-halopræparater med fluorescens in situ-hybridisering muliggør højopløsningsanalyse af genomiske interaktioner med nukleoskelettet. Vedhæftet genom fører til hybridiserede fluorescerende signaler placeret i de resterende ekstraherede kerner, mens ikke-bundet genom er i DNA-haloen, der omgiver de resterende kerner.
Genomet er forbundet med flere strukturer inde i cellekerner for at regulere dets aktivitet og forankre det på bestemte steder. Disse strukturer er kollektivt kendt som nukleoskeletet og omfatter den nukleare lamina, nukleolerne og nukleare organer. Selvom der findes mange varianter af fluorescens in situ hybridisering (FISH) for at studere genomet og dets organisation, er disse ofte begrænset af opløsning og giver utilstrækkelig information om genomets tilknytning til nukleare strukturer. DNA-halo-metoden bruger høje saltkoncentrationer og ikke-ioniske vaskemidler til at generere DNA-sløjfer, der forbliver forankret til strukturer i kerner gennem tilknytningsregioner i genomet. Her ekstraheres opløselige nukleare proteiner, såsom histoner, lipider og DNA, der ikke er tæt bundet til den nukleare matrix. Dette fører til dannelsen af en halo af ikke-bundet DNA, der omgiver en resterende kerne, som selv indeholder DNA tæt forbundet med interne nukleare strukturer og ekstraktionsresistente proteiner. Disse udvidede DNA-strenge muliggør øget opløsning og kan lette fysisk kortlægning. I kombination med FISH har denne metode den ekstra fordel, at den studerer genomiske interaktioner med alle de strukturer, som genomet er forankret af. Denne teknik, kaldet HALO-FISH, er meget alsidig, hvorved DNA-haloer kan kobles med nukleinsyresonder for at afsløre genloci, hele kromosomer, alfa-satellit, telomerer og endda RNA. Denne teknik giver et indblik i nuklear organisation og funktion i normale celler og i sygdomsprogression som ved kræft.
Den “nukleare matrix” blev først beskrevet af Berezney og Coffey i 19741. Efter at have udført ekstraktioner med høje saltmolariteter og nukleasebehandling på rotteleverkerner, identificerede de en proteinholdig strukturel ramme. DNA-halo-proceduren blev efterfølgende tilpasset fra denne metode og involverer fjernelse af opløselige proteiner, således at kun den nukleare matrix (NM) og NM-associerede proteiner og kromosomer vedvarer. DNA-bindingsregioner er placeret i bunden af DNA-sløjfer og kaldes matrixbundne regioner (MAR’er) eller stilladsfastgørelsesregioner (SAR’er), som er resistente over for ekstraktion med høje saltkoncentrationer og henholdsvis ionisk vaskemiddel lithium-3,5-diiodosalicylat (LIS). I DNA-haloer er DNA forbundet med MAR’er / SAR’er bundet inden for den resterende kerne, mens DNA-sløjferne strækker sig væk fra disse steder og danner DNA-haloen. Vi ved nu, at genomet er forankret via lamina associerede domæner (LAD’er) til den nukleare lamina og gennem nukleolære associerede regioner (NAD’er) og muligvis gennem andre nukleare strukturer såsom specifikke nukleare legemer.
DNA-halo-metoden kan bruges til fysisk kortlægning af DNA, gener og kromosomale regioner, da det udvidede DNA og kromatin giver en større opløsning, fordi kromatinet strippes for histoner, og DNA’et strækkes ud 2,3,4,5,6. Der er dog nogle begrænsninger, når du bruger DNA-haloer til denne applikation. For eksempel kan DNA, der er tæt forbundet med resterende kerner af DNA-haloer, være utilgængeligt for sonder, hvilket forhindrer det i analyse og fysisk kortlægning6. Andre teknikker som fiber-FISH 2,4,5,7 og molekylær kæmning 8 muliggør også fysisk kortlægning og har fordelen ved at være relativt hurtig og nem at udføre. Begge bruges fortrinsvis til DNA-kortlægning af gener frem for DNA-haloer. Disse metoder ekstraherer kromatinfibre ved anvendelse af opløsningsmiddel- eller saltekstraktioner fra kernen, men molekylær kæmning har tendens til at have bedre reproducerbarhed 8,9.
Der er et stigende bevis for, at nukleoskelettet har en rolle i at understøtte vigtige nukleare processer, såsom fastgørelsessteder for DNA, kromatinmodellering, DNA-transkription, DNA-reparation og DNA-replikation11,12. Som sådan blev DNA-halo-teknikken udviklet til at undersøge interaktionerne mellem nukleoskelettet og genomet under disse cellulære aktiviteter og er rutinemæssigt blevet brugt og rapporteret i forskning. Denne teknik er også blevet brugt til at undersøge interaktioner mellem genomet og nukleoskelettet i forhold til sygdomsprogression med malignitetsassocierede ændringer i nuklear struktur, der identificeres11.
DNA-halo-teknikken er også blevet brugt til at undersøge forholdet mellem genomet og nukleoskelettet under udvikling og differentiering12. En række undersøgelser har brugt en variation af DNA-halo-teknikken kendt som halosperm13 eller SpermHalo-FISH, hvis den kombineres med FISH14. Spermatozokromatin er tæt bundet til proteiner kendt som protamin, og denne teknik blev udviklet for at forbedre adgangen til sæd-DNA. Halosperm er blevet brugt til at undersøge integriteten af spermatozoer DNA og afgøre, om DNA-skader er til stede. Spermatozoer med mindre DNA-skade korrelerer med en større DNA-halostørrelse, mens spermatozoer med øgede niveauer af fragmenteret og beskadiget DNA havde enten små haloer eller slet ingen. Således kan halosperm bruges som en potentiel prognostisk markør for embryokvalitet og vellykket graviditet med IVF13. Dette eksempel understreger de potentielle kliniske anvendelser af denne teknik. I vores arbejde har vi brugt HALO-FISH til at vurdere ændringer i genomadfærd og effekten af specifikke lægemiddelbehandlinger i den for tidligt aldrende sygdom Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.
Sammen fremhæver disse og andre undersøgelser bredden af processer/anvendelser, som DNA-halo-teknikken kan bruges til at studere og anvendeligheden af teknikken.
DNA-halo-metoden er en fremragende metode til valg ved analyse af interaktioner mellem nukleoskelettet og genomet, men der er nogle kritiske trin, der også skal overholdes. En af de vigtigste parametre er optimeringen af cellesåningstætheden. Hvis celler bliver overflydende, vil DNA-haloerne overlappe med naboceller, hvilket gør det umuligt at udføre analysen. CSK og ekstraktionsbuffere skal altid gøres friske på anvendelsesdagen, idet spermin, spermidin og digitonin tilsættes ekstraktionsbufferen ved afslutningen af fremstillingsprocessen for at opretholde deres biologiske aktivitet. Hvis du udfører Halo-FISH, er det ekstremt vigtigt at bruge den korrekte denatureringstemperatur for DNA-haloerne for at gøre det muligt for sonden eller malingen efterfølgende at hybridisere.
Elektronmikroskopi er blevet brugt til at visualisere den nukleare matrix, hvor filamentøse strukturer identificeres20. Imidlertid er elektronmikroskopi begrænset, da matrixforeninger med kromatin ikke let kan udledes. Faktisk er DNA Halo-metoden mere alsidig sammenlignet med elektronmikroskopi, da specifikke gener, kromosomer og celletilstande alle kan undersøges. Desuden undersøges proteomisk analyse af nukleare matrixproteiner21,22. Denne metode er god til sammenligning af nukleare matrixkomponenter, især når man sammenligner syge celler, men den giver ikke den rumlige fordeling og vedhæftede filer, der fremhæves af standard DNA Halo-teknikken.
DNA Halo-assays har begrænsninger. For det første, da matrixen ekstraheres, kan dette kun udføres på faste celler, så levende billeddannelse er ikke mulig. Selvom DNA Halo-metoden er relativt hurtig og nem at udføre, kan den samlede proces være tidskrævende, når cellekultur, sondegenerering, Halo-FISH og analyse alle tages i betragtning.
Billedoptagelse af DNA-haloer og HALO-FISH ved hjælp af superopløsningsmikroskopi ville i høj grad forbedre opløsningen af DNA-specifikke sonder og antistoffer. Da fluorkromer lettere kan opløses spektralt, kan det desuden være muligt at bruge et antal DNA-sonder i et enkelt eksperiment, hvilket giver endnu mere information. Forbedringer i molekylærbiologiske teknikker såsom kromosom konformation capture (3C) er blevet brugt til at bestemme interaktioner af gen loci og analysere den rumlige organisation på kromatin i cellen. DNA Halo-assays og 3C kan kombineres, et udtryk kendt som M3C23, hvilket igen demonstrerer tilpasningsevnen af DNA Halo-teknikken.
De originale data, der præsenteres her, skal demonstrere mulighederne for genomadfærdsforhør og hvordan man præsenterer disse data. Med disse data har vi vist, at det er muligt at bestemme signifikante forskelle i genombinding ved hjælp af (1) kromosommalingssonder, i denne undersøgelse afslørede kromosom 18 at være det mindst bundne kromosom ud af de analyserede (figur 3); (2) Gen-loci med signifikante forskelle mellem to gen-loci og (figur 4) (3) telomerer, som er mindre stærkt bundet i hvilende celler sammenlignet med prolifererende og senescerende celler (figur 5). Vi er i stand til at skelne mellem prolifererende og ikke-prolifererende celler via tilstedeværelsen af proliferationsmarkøren Ki67-antigenet, som er et uopløseligt protein, så forbliver hos de resterende kerner eller ved hjælp af inkorporering af nukleotider for at fremhæve celler, der har været igennem S-fase inden for en bestemt tidsperiode (figur 2). Denne teknik har også gjort det muligt for os at analysere genomadfærd i celler, der er kompromitteret i deres nukleoskeletoner, dvs. laminopaticeller, og her og i Bikkul et al., 2018 afslører vi, at genomet kan være mindre tæt knyttet sammenlignet med kontrolceller og kan gendannes ved behandling med specifikke lægemidler, der forbedrer effekten af lamin A-mutationen i klassiske HGPS-celler15. Vi viser dog nye data her for de atypiske HGPS AGO8466-celler, der mangler en lamin A-mutation, men indeholder en usædvanlig form af LINC-kompleksproteinet SUN1 19, som kromosom13 er mindre tæt knyttet til (figur 6).
HALO-FISH er en unik metode, der gør det muligt at studere genomiske interaktioner med nukleoskelettet i kombination med indirekte immunfluorescens for at løse proteiner, der ikke fjernes fra ekstraktionsproceduren. Det er blevet påvist, at nukleoskelettet er modificeret i forskellige sygdomme såsom visse kræfttyper19 og betydningen af nogle nukleoskeletassocierede proteiner som diagnostiske biomarkører24,25. Denne teknik har således en vigtig rolle i undersøgelsen af nukleoskelettets virkning på kromatinorganisation/disorganisering i sygdom 15,24,25,27 og er ikke begrænset til humane celler, med kromosommale malersonder fra andre dyr, den samme DNA-halo-protokol kunne anvendes 28.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke professor Michael Bittner for den venlige gave af kromosomarmmalerisonder. LG blev støttet af det EU-finansierede EURO-Laminopathies-projekt og Brunel Progeria Research Fund.
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |