Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescens in situ-hybridisering på DNA-halopreparat för att avslöja hela kromosomer, telomerer och genlokus

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62017
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London, 2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

ERRATUM NOTICE

Summary

Genom att kombinera DNA-halopreparat med fluorescens in situ-hybridisering möjliggörs högupplöst analys av genomiska interaktioner med nukleoskelettet. Bifogat genom leder till hybridiserade fluorescerande signaler belägna inom de kvarvarande extraherade kärnorna, medan icke-bundet genom ligger i DNA-halo som omger restkärnorna.

Abstract

Genomet är associerat med flera strukturer inuti cellkärnor för att reglera dess aktivitet och förankra den på specifika platser. Dessa strukturer är kollektivt kända som nukleoskelettet och inkluderar kärnlamina, nukleolerna och kärnkropparna. Även om många varianter av fluorescens in situ hybridisering (FISH) finns för att studera genomet och dess organisation, är dessa ofta begränsade av upplösning och ger otillräcklig information om genomets samband med kärnstrukturer. DNA-halometoden använder höga saltkoncentrationer och nonjoniska tvättmedel för att generera DNA-slingor som förblir förankrade i strukturer inom kärnor genom bindningsregioner i genomet. Här extraheras lösliga kärnproteiner, såsom histoner, lipider och DNA som inte är tätt bundna till kärnmatrisen. Detta leder till bildandet av en halo av obundet DNA som omger en kvarvarande kärna som i sig innehåller DNA nära associerat med inre kärnstrukturer och extraktionsresistenta proteiner. Dessa utökade DNA-strängar möjliggör ökad upplösning och kan underlätta fysisk kartläggning. I kombination med FISH har denna metod den extra fördelen att den studerar genomiska interaktioner med alla de strukturer som genomet är förankrat i. Denna teknik, som kallas halo-fisk, är mycket mångsidig varigenom DNA-halos kan kopplas med nukleinsyrasonder för att avslöja genlokus, hela kromosomer, alfasatellit, telomerer och till och med RNA. Denna teknik ger en inblick i kärnans organisation och funktion i normala celler och i sjukdomsprogression som med cancer.

Introduction

"Kärnmatrisen" beskrevs först av Berezney och Coffey 19741. Efter att ha utfört extraktioner med höga saltmolariteter och nukleasbehandling på råttleverkärnor identifierade de en proteinhaltig strukturell ram. DNA-haloproceduren anpassades därefter från denna metod och innebär avlägsnande av lösliga proteiner så att endast kärnmatrisen (NM) och NM-associerade proteiner och kromosomer kvarstår. DNA-fästregioner är belägna vid basen av DNA-slingor och kallas matrisfästa regioner (MAR) eller ställningsfästregioner (SAR), som är resistenta mot extraktion med höga saltkoncentrationer respektive jontvättmedel litium-3,5-dijodsalicylat (LIS). I DNA-halos är DNA associerat med MAR / SAR bundet inom restkärnan medan DNA-slingorna sträcker sig bort från dessa platser och bildar DNA-halo. Vi vet nu att genomet är förankrat via lamina associerade domäner (LAD) till nukleära lamina och genom nukleolära associerade regioner (NADs) och eventuellt genom andra kärnstrukturer såsom specifika kärnkroppar.

DNA-halometoden kan användas för fysisk kartläggning av DNA, gener och kromosomala regioner eftersom det utökade DNA och kromatin ger en större upplösning eftersom kromatinet avlägsnas från histoner och DNA sträcks ut 2,3,4,5,6. Det finns dock vissa begränsningar när du använder DNA-halor för denna applikation. Till exempel kan DNA som är tätt associerat med kvarvarande kärnor i DNA-halos vara otillgängligt för sonder, vilket utesluter det från analys och fysisk kartläggning6. Andra tekniker som fiber-FISH 2,4,5,7 och molekylär kamning 8 möjliggör också fysisk kartläggning och har fördelen att vara relativt snabb och enkel att utföra. Båda används företrädesvis för DNA-kartläggning av gener över DNA-halos. Dessa metoder extraherar kromatinfibrer via användning av lösningsmedel eller saltextraktioner från kärnan, men molekylär kamning tenderar att ha bättre reproducerbarhet 8,9.

Det finns ett ökande bevis för att nukleoskelettet har en roll i att stödja viktiga kärnprocesser, såsom fästplatser för DNA, kromatinremodellering, DNA-transkription, DNA-reparation och DNA-replikation11,12. Som sådan utvecklades DNA-halotekniken för att undersöka interaktionerna mellan nukleoskelettet och genomet under dessa cellulära aktiviteter och har rutinmässigt använts och rapporterats i forskning. Denna teknik har också använts för att undersöka interaktioner mellan genomet och nukleoskelettet i relation till sjukdomsprogression med malignitetsrelaterade förändringar i kärnstruktur som identifierats11.

DNA-halotekniken har också använts för att undersöka förhållandet mellan genomet och nukleoskelettet under utveckling och differentiering12. Ett antal studier har använt en variant av DNA-halotekniken som kallas halosperm13 eller SpermHalo-FISH om den kombineras med FISH14. Spermatozoakromatin är tätt bundet till proteiner som kallas protaminer och denna teknik utvecklades för att förbättra tillgången till spermiernas DNA. Halosperm har använts för att undersöka integriteten hos spermatozoa DNA och avgöra om DNA-skador är närvarande. Spermatozoa med mindre DNA-skador korrelerar med en större DNA-halostorlek, medan spermatozoer med ökade nivåer av fragmenterat och skadat DNA hade antingen små halor eller ingen alls. Således kan halosperm användas som en potentiell prognostisk markör för embryokvalitet och framgångsrik graviditet med IVF13. Detta exempel betonar de potentiella kliniska tillämpningarna av denna teknik. I vårt arbete har vi använt HALO-FISH för att bedöma förändringar i genombeteende och effekten av specifika läkemedelsbehandlingar vid sjukdomen för tidigt åldrande Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.

Tillsammans belyser dessa, och andra studier, bredden av processer/tillämpningar som DNA-halotekniken kan användas för att studera och användbarheten av tekniken.

Protocol

1. Glasberedning, sterilisering och cellodling

  1. Bered 500 ml 10% HCl (v/v) och häll i en stor bägare.
  2. Släpp mikroskopet individuellt i syran och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur på en skakapparat inställd på 2 x g.
    VARNING: HCl är frätande och irriterande. Det kan orsaka allvarliga hudbrännskador och ögonskador och irritation i hud, ögon och andningsorgan. Se till att lämpligt personligt skydd bärs, inklusive nitrilhandskar, ögonskydd och en laboratorierock.
  3. Dekantera syra från bägaren och tvätta glas tio gånger i kranvatten och sedan ytterligare tio gånger i avjoniserat vatten.
  4. Skölj glas i metanol två gånger och förvara i metanol tills sterilisering genom flamning.
    VARNING: Metanol är en mycket brandfarlig vätska och giftig vid förtäring, hudkontakt eller inandning. Dessutom kan metanol orsaka skador på organ, är frätande och irriterande. Följ gränserna för exponering på arbetsplatsen och se till att lämpligt personligt skydd bärs, inklusive butylgummihandskar, ögonskydd och en laboratorierock. Om möjligt handtag i ett lokalt frånluftsventilationsskåp (LEV).
  5. Använd metalltång eller långa pincett, ta bort ett mikroskopglas från bägaren som innehåller metanol. Flamma över en Bunsen-brännare för att sterilisera och överför till ett rektangulärt cellodlingskärl som innehåller fyra fack för objektglas, som ligger nära Bunsen-brännaren.
    VARNING: Flaming möjliggör omedelbar sterilisering av mikroskopglas före användning; Denna metod har dock tillhörande faror. Eftersom metanol är mycket brandfarligt är det viktigt att bägaren som innehåller objektglasen placeras bort från Bunsenbrännaren. Långa tang eller pincett bör användas som tätt greppar glidbanorna. Metanolnivån i bägaren ska bara täcka glasen, både för att minimera mängden metanol som används och så att endast ändarna på pincetten/tången är i kontakt med metanolen. Se alltid till att metanolen har avdunstat från pincetten eller tången efter användning och att dessa har svalnat innan du lägger tillbaka den i bägaren som innehåller glasen och metanolen. Bägaren ska täckas av en bit aluminiumfolie för att svälta syret om metanolen skulle fatta eld. Flamglider aldrig i en klass II laminär flödeshuv där luften cirkuleras.
  6. Alternativt kan du utföra steg 1.1 till 1.4, men istället för att flamma objektglasen efter inkubation med metanol, placera objektglas på luddfri vävnad för att lufttorka. När den är torr, linda in i aluminiumfolie och lägg i en steriliseringsugn eller autoklav.
  7. Odla celler i lämpligt medium med serum i minst 48 timmar vid 37 °C i 5 %CO2 tills 60–70 % sammanflöde uppnås. Detta protokoll utfördes på en tidig passage av humana dermala fibroblaster (HDF) och på klassiska Hutchinson-Gilford progeria syndrom (HGPS) fibroblaster (AG06297) och atypiska typ 2 HGPS-fibroblaster (AG08466). Skörda varje celltyp och räkna med hjälp av en hemocytometer för att bestämma celldensiteten. Frö 1 x 105 celler i 10 ml medium per bild.
    OBS: Celldensiteten är viktig eftersom DNA-slingor från olika kärnor kan konvergera om cellerna blir för sammanflytande. Sådensiteter kan behöva optimeras beroende på vilken celltyp som används eftersom transformerade celler kan föröka sig snabbare, medan cellkulturer med senare passage kan ta längre tid att nå önskat sammanflöde.
  8. Om celler måste stoppas i G0 för att bli vilande, frö sedan 1 x 105 celler (i 10 ml medium) per bild och låt växa i 24 timmar. Tvätta cellerna två gånger med serumfritt medium och inkubera i standardmedium som innehåller en lägre koncentration av serum vid 0,5% (nyfött kalvserum, NCS; eller fetalt bovint serum, FBS) i 7 dagar.
  9. Om cellernas proliferativa status krävs för DNA-haloanalysen, bestäm sedan celler som har passerat genom S-fas genom införlivande av 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) i DNA under replikation.
    1. Fröceller som vanligt och växer i 24 timmar. Ta bort odlingsmediet och ersätt med medium som innehåller BrdU och 5-fluor-2'-deoxiuridin (3 μg/μl). Efter ytterligare 24 timmar, ta bort mediet, tvätta cellerna en gång med medium (10% NCS) och mata sedan in igen med färskt medium (10% NCS). Inkubera i ytterligare 24 timmar och förbered sedan objektglasen för DNA-haloanalysen.

2. Förberedelse av sond

  1. Kromosom hela och armmålningssonder
    1. Gör kromosomprober från amplifiering av flödessorterade eller mikrodissekerade kromosomer genom degenererad oligonukleotidgrundad polymeraskedjereaktion (DOP-PCR) med hjälp av metoden av Telenius et al.16. Använd DOP-PCR för att märka kromosomprober med antingen Biotin-16-dUTP eller Digoxigenin-11-dUTP som visas i tabell 1. Kontrollera tillverkarens instruktioner för förstärkningsprofil, men de förhållanden som används för detta experiment visas i tabell 2.
    2. Bered armen eller hela kromosomsonden genom att addera 8 μL märkt PCR-produkt, 7 μL Cot-1-DNA, 3 μL sillsperma, 1/20:e volym 3 M natriumacetat (pH 5,4) och 2 volymer 100 % etanol. Inkubera sondlösningen i minst 30 minuter vid -80 °C.
      OBS: Denna metod kan användas för att skapa enstaka kromosomprober eller flera kromosomprober om olika etiketter (dvs. Biotin-16-UTP och Digoxigenin-11-dUTP) används för varje kromosom av intresse.
      VARNING: Etanol är en mycket brandfarlig vätska och ånga och kan orsaka allvarlig ögonirritation. Förvaras åtskilt från värme, heta ytor och antändningskällor. Följ gränserna för exponering på arbetsplatsen och se till att lämpligt personligt skydd bärs, inklusive butylgummihandskar, ögonskydd och en laboratorierock. Om möjligt hanteras i ett LEV-dragskåp.
    3. Centrifugera sondlösningen vid 13 700 x g i 15 min vid 4 °C och tvätta sedan med 70 % etanol. Upprepa centrifugeringsproceduren och kassera supernatanten, var försiktig så att du inte stör eller förlorar DNA-pelleten. Låt DNA-pelleten torka.
    4. Tillsätt 12 μL hybridiseringsbuffert (50% formamid, 10% dextransulfat, 10% 20x saltlösningsnatriumcitrat (SSC; 3 M NaCl, 0,3 M trinatriumcitrat; pH 7,0), 1% (v/v) polyoxietylensorbinalmonolaurat (Tween-20)) till DNA-pelleten. Låt stå vid 37 °C i minst 2 timmar så att DNA-pelleten löses upp i hybridiseringsbufferten.
      VARNING: Formamid är cancerframkallande och teratogent så det kan orsaka allvarliga skador på ett ofött barn. Om en kvinna är gravid eller misstänker att hon är gravid bör de undvika att arbeta med formamid. Formamid ska användas i en LEV dragskåp. Följ gränserna för exponering på arbetsplatsen och se till att lämpligt personligt skydd bärs, inklusive butylgummihandskar, ögonskydd och en laboratorierock.
  2. DNA-isolering från bakteriella konstgjorda kromosomer (BAC)
    1. Stryk en liten del av glycerolstammen från BAC-klonen på en Luria-Bertani (LB) agarplatta (1% (W/V) NaCl; 1% (w/v) trypton, 0,5% (w/v) jästextrakt, 1,5% (w/v) Agar Technical, 12,5 μg/ml (w/v) kloramfenikol). Inkubera över natten vid 37 °C.
    2. Välj en enda koloni från plattan och inokulera 10 ml LB-buljong (1% (w / v) NaCl, 1% (w / v) bactotryptone, 0,5% (w / v) jästextrakt, 12,5 μg / ml (w / v) kloramfenikol). Låt lösningen ligga i en skakande inkubator vid 37 °C över natten.
      VARNING: Kloramfenikol misstänks orsaka cancer. Hantera varsamt och minska exponeringen.
    3. Centrifugera kulturen vid 1 700 x g i 10 min vid rumstemperatur.
    4. Kassera supernatanten och tillsätt 300 μl P1-lösning (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNas A) till pelleten. Virvla kraftigt och överför celler till ett 2 ml mikrocentrifugrör.
    5. Tillsätt 300 μL P2-lösning (0,2 M NaOH, 1% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS) droppvis till cellerna. Vänd det slutna mikrocentrifugröret 5 gånger och låt stå i rumstemperatur i högst 5 minuter.
      VARNING: Natriumhydroxid är frätande och kan orsaka allvarliga hudbrännskador och ögonskador. Det kan vara frätande för metaller. Hantera varsamt och minska exponeringen. Följ gränserna för exponering på arbetsplatsen och se till att lämpligt personligt skydd bärs, inklusive handskar av nitrilgummi, ögonskydd och en laboratorierock. Om möjligt hanteras i ett LEV-dragskåp.
      VARNING: Natriumdodecylsulfat är ett brandfarligt fast ämne, skadligt vid förtäring och kan orsaka hud- och andningsirritation. Det kan också orsaka allvarliga ögonskador. Se till att lämpligt personligt skydd bärs, inklusive handskar av nitrilgummi, ögonskydd och en laboratorierock. Om möjligt hanteras i ett LEV-dragskåp.
    6. Tillsätt långsamt 300 μL P3 (3 M kaliumacetat) till cellerna och blanda försiktigt. Placera mikrocentrifugröret på is i 10 minuter.
    7. Centrifugera vid 8 100 x g i 10 minuter vid 4 °C och överför supernatanten till ett rör som innehåller 800 μl iskall isopropanol. Vänd röret upp och ned flera gånger och inkubera vid -20 °C över natten.
      VARNING: Isopropanol är en mycket brandfarlig vätska och ånga och kan orsaka allvarlig ögonirritation, dåsighet eller yrsel. Förvaras åtskilt från värme, heta ytor och antändningskällor. Följ gränserna för exponering på arbetsplatsen och se till att lämpligt personligt skydd bärs, inklusive handskar av nitrilgummi, ögonskydd och en laboratorierock. Om möjligt hanteras i ett LEV)dragskåp.
    8. Centrifugera vid 8 100 x g i 15 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten och överför till ett annat rör. Tillsätt 500 μL iskall 70% etanol. Vänd röret upp och ned flera gånger och centrifugera vid 8 100 x g i 5 min vid 4 °C.
    9. Ta bort supernatanten och lufttorka pelleten vid rumstemperatur. När pelleten är torr, suspendera igen i 40 μl dietylpyrokarbonatbehandlat vatten (DEPC-behandlat) och låt stå vid 4 °C över natten. När den är helt återsuspenderad, avlägsna 5 μl lösning och fyll på en 1% agarosgel för att kontrollera förekomsten av DNA.
  3. Enstaka genprobberedning av BAC via nicköversättning
    1. Använd etiketteringssatser för nicköversättning som finns i handeln. Du kan också använda följande protokoll. Se tabell 3 för beståndsdelar och volymer.
    2. Tillsätt beståndsdelarna från tabell 3 tillsammans i ett mikrocentrifugrör och tillsätt DNA-polymeras I sist, blanda försiktigt och centrifugera kort i några sekunder. Inkubera lösningen vid 15 °C i 2 timmar.
    3. För att verifiera fragmentstorlekar, fyll på 5 μL av lösningen på en 2% agarosgel. DNA-fragmentstorleksintervallet bör vara mellan 200-600 bp. Om DNA-fragmenten är större, fortsätt sedan att inkubera lösningen i ytterligare 15 minuter vid 15 °C och kör produkterna på 2 % agarosgel.
    4. Stoppa nicköversättningsreaktionen genom att tillsätta 10 mM EDTA, 0,1 % SDS (2,5 μL 0,5 M EDTA, pH 8,0 i 100 μL och 1 μL 10 % SDS i 100 μL). Värm lösningen vid 65 °C i 5 min.
    5. För att avlägsna icke-inkorporerade nukleotider, applicera BAC-sond på en spinnkolonn. Kommersiella spinnkolumner kan köpas, eller de kan skapas med en spruta enligt följande:
    6. Tillsätt 30 g Sephadex G-50 till 500 ml kolonnbuffert (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Autoklav blandningen. Gör också 500 ml kolonnbuffert (utan Sephadex G-50) och autoklav.
    7. Gör snurrkolonner genom att lägga autoklaverad glasull i botten av en 1 ml spruta. Fyll 1 ml sprutan med Sephadex G-50 i kolonnbuffert. Placera 1 ml spruta i ett 15 ml centrifugrör som har ett mikrocentrifugrör utan lock i botten. Centrifugera vid 1 600 x g i 5 min.
    8. Ta bort sprutan och kassera mikrocentrifugröret längst ner. Lägg tillbaka ett nytt mikrocentrifugrör i 15 ml centrifugrör. Tillsätt kolonnbuffert (utan Sephadex G-50) till 1 ml sprutan och sätt tillbaka i 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 1 600 x g i 5 min. Upprepa detta steg igen två gånger.
    9. Ta bort sprutan och sätt in i ett 15 ml centrifugrör som innehåller ett nytt rent mikrocentrifugrör. Applicera sonden på sprutan och samla sonden i mikrocentrifugröret.
    10. För att fälla ut DNA-sonden tillsätts 5 μL DNA från sillspermier (10 mg/ml), 10 μL natriumacetat och 2,25 volymdelar 100 % etanol till DNA-lösningen. Blanda försiktigt lösningen och inkubera vid -80 °C i minst 1 timme. Centrifugera vid 13 700 x g i 15 min vid 4 °C.
    11. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 200 μl iskall 70 % etanol i 15 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och lufttorka. När pelleten är torr, suspendera den i 20 μl DEPC-behandlat vatten vid rumstemperatur i flera timmar eller över natten vid 4 °C. Sonden är nu klar att användas eller kan förvaras vid -20 °C.
    12. Blanda 5 μL sond-DNA med 5 μL Cot-1-DNA för varje objektsglas och torka med en Speed Vac vakuumkoncentrator. När pelleten har torkat, återsuspendera i 12 μL hybridiseringsblandning.

3. DNA Halo-preparat

  1. Ta bort den fyrkantiga odlingsskålen som innehåller glasen och bifogade celler från inkubatorn. Kassera medium, etikettglas med en penna och placera i en Coplin-burk innehållande 50 ml iskall cytoskelettbuffert (CSK): 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3 M sackaros, 10 mM 1, 4-piperazindietansulfonsyra (PIPES; pH 7,8), 0,5% (v/v) Triton X-100 gjord i avjoniserat vatten. Inkubera i 15 minuter på is eller vid 4 °C.
    VARNING: Triton X-100 kan orsaka hudirritation och allvarliga ögonskador. Hantera med lämplig personlig skyddsutrustning inklusive nitrilhandskar, skyddsglasögon och laboratorierock.
  2. Kassera CSK-bufferten och skölj snabbt glasen i 50 ml 1x DNA-halobuffert (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO 4, 15 mM KH2PO 4; pH7.4) tre gånger, dvs doppa glid i Coplin burk innehållande DHB och ta bort.
  3. Överför objektglas till en Coplin-burk innehållande 50 ml extraktionsbuffert: 2 M NaCl, 10 mM RÖR (pH 6,8), 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,1% (w/v) digitonin, 0,05 mM (v/v) spermin, 0,125 mM (v/v) spermidin. Inkubera i 4 minuter vid rumstemperatur.
    VARNING: Digitonin är giftigt vid förtäring eller hudkontakt och är dödligt vid inandning. Se till att digitonin hanteras i ett LEV-dragskåp och använd en laboratorierock, nitrilhandskar (dubbelhandske), skyddsglasögon och mask. Både spermin och spermidin kan orsaka allvarliga hudbrännskador och ögonskador, medan EDTA orsakar allvarlig ögonirritation, så hantera varje kemikalie med försiktighet.
    Förbered digitonin separat genom att lösa pulvret i vatten vid en temperatur av 60-70 °C. Tillsätt upplöst digitonin till extraktionsbufferten när den har svalnat. Tillsätt spermin, spermidin och digitonin sist till extraktionsbufferten för att bevara den biologiska aktiviteten.
  4. Inkubera glas i följd i 50 ml 10x DHB (1,4 M NaCl, 270 mM KCl, 1,1 M NaHPO 4, 150 mM KH2PO4; PH7.4), 5x, 2x och 1x DHB i 1 min vardera.
  5. Doppglas (rakt in och rakt ut) genom en 50 ml sekventiell etanolserie med 10%, 30%, 70% och 95% (v / v) etanol.
  6. Lufttorka glas och förvara vid -80 °C tills tvådimensionell fluorescens in situ-hybridisering (2D FISH) utförs.

4. Tvådimensionell fluorescens in situ hybridisering

  1. Gör 20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M trinatriumcitrat, pH 7,0. Denna buffert kan autoklaveras, förvaras vid rumstemperatur och spädas efter behov.
  2. Gör 70% (v/v) formamid, 2x SSC pH 7,0 och värm till 70 °C i ett vattenbad.
  3. Inkubera glas, i 5 minuter vardera, genom en sekventiell 50 ml etanolserie av 70, 90 och 100% etanol.
  4. Lufttorka rutschkanor på värmeplatta och grädda i 70 °C ugn i 5 min.
  5. Denaturera glasen genom att placera i 70% formamid, 2x SSC-lösningen i 2 min vid 70 °C.
    OBS: Temperaturen och tidpunkten är kritiska för steg 4.5. Om temperaturen är det kommer DNA inte att denatureras och sonderna kommer inte att hybridiseras, och ingen signal kommer att erhållas från DNA-halofisk.
  6. Placera den denaturerade bilden i 50 ml iskall 70% etanol i 5 minuter och ta igenom en etanolserie på 90%, 95% och 100% vid rumstemperatur i 5 minuter vardera.
  7. Lufttorka på en värmeplatta
  8. Hantera direkt märkta totala mänskliga kromosomsonder enligt tillverkarens instruktioner. För dessa experiment använde vi mänskliga hela kromosomfärger 1, 13, 15, 17 och 18. Dessutom användes i detta experiment CCND1 och CTNNA1 gensonder.
    OBS: Både hela kromosomproberna och BAC-genspecifika sonder märktes med biotin-11-dUTP och detekterades av streptavidin konjugerat till cyanin 3 (Cy3). För kromosommålningssonder gjorda av (DOP-PCR) och BAC DNA märkta med nicköversättning, kommer dessa att kallas DNA-sonder från denna punkt framåt i protokollet och behandlas enligt följande.
  9. Denaturera DNA-sond (hel kromosomfärg eller genspecifik sond) vid 75 °C i 10 minuter i ett varmblocks- eller vattenbad.
  10. Värm DNA-sonder vid 37 °C i 30 minuter i ett varmblocks- eller vattenbad innan 10 μl pipetteras på lämpligt objektglas.
    OBS: Detta steg är viktigt för att blockera repetitiva kromosomala sekvenser. Om de inte utförs kan icke-specifika signaler produceras i DNA Halo FISH.
  11. Överläggssond med en 21 mm x 21 mm täckglas- och tätning med gummicement.
  12. Inkubera objektglas i minst 18 timmar vid 37 °C i en fuktad hybridiseringskammare.
    OBS: Befuktade hybridiseringskammare kan tillverkas av sandwichlådor som innehåller flera lager fuktad vävnad och en upphöjd plattform konstruerad av skurna 10 ml plastpipetter för att vila glasen på. Detta är täckt av aluminiumfolie för att minimera exponeringen för ljus.
  13. Ta bort gummicementet försiktigt med pincett.
  14. Inkubera objektglas i 50 ml 50% (v/v) formamid, 2x SSC, pH 7,0-lösning som har förvärmts till 45 °C under tre 5 minuters inkubationer.
    OBS: Låt täckglaset falla bort från glaset i den första inkubationen i 50% (v/v) formamid, 2x SSC, pH 7,0-lösning. Detta förhindrar skador på DNA Halo-preparatet som kan orsakas av att "dra" täckglaset bort. Objektglasen kan omröras i bufferten via grepp med pincett för att hjälpa till att lossa täckglaset.
  15. Placera sedan objektglas i 50 ml 0,1x SSC, pH 7,0-lösning som har förvärmts till 60 °C men placerats i ett 45 °C vattenbad. Inkubera i 5 minuter och ersätt bufferten ytterligare två gånger med 5 minuters inkubationer.
  16. Placera objektglas i en Coplin burk innehållande 50 ml 4x SSC, pH 7,0 lösning vid rumstemperatur och inkubera i 15 minuter med tre buffertbyten.
  17. Applicera 100 μL 4% BSA, 4x SSC-lösning på varje glas och lägg över med en bit paraffinfilm. Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter. Detta förhindrar ospecifik bindning av antikroppen.
  18. För att detektera den märkta sonden (biotin-16-dUTP), inkubera med 100 μL av en 1:200 (tillverkad i 1% BSA, 4x SSC) streptavidin-Cy3 i 1 h vid rumstemperatur.
    OBS: Följ tillverkarens instruktioner med utspädningar av antikroppar och testutspädning före experiment för att säkerställa att en bra signal produceras
  19. Placera objektglas i en Coplin burk innehållande 50 ml 4x SSC (0,5% Tween-20) pH 7,0 lösning vid rumstemperatur och inkubera i 15 minuter med tre buffertbyten. Glas kan monteras i detta skede som visas i steg 4.21 om immunofluorescens inte krävs.
  20. Om proliferativ status för celler gjorda i DNA-halos krävs, färga med anti-pKi67-antikroppar efter FISH-stegen, före montering eller fläck för införlivad BrdU.
    1. Tvätta glas 3 gånger i 5 min vardera i 50 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), följt av blockering med 4% NCS i PBS i 1 timme vid rumstemperatur.
    2. Applicera 200 μl av den nödvändiga primära antikroppen (kanin anti-human pKi67; mus anti-BrdU) på objektglaset, överlägg med en remsa paraffinfilm och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme.
    3. Tvätta glas 3 gånger i 5 min i 1x PBS och inkubera vid rumstemperatur i 1 h i 200 μL fluorkromkonjugerad sekundär antikropp (pKi67: svin anti-kanin TRITC; BrdU: åsna anti-mus Cy3). Utför ytterligare 3 5 min tvättar med PBS. Alla utspädningar skall göras med användning av 1 % (v/v) NCS i PBS enligt tillverkarens intervall av föreslagna utspädningar.
  21. Montera glas i 20 μL fäste innehållande DAPI och överlägg med 22 mm x 50 mm täckglas.

5. Telomere PNA FISK

  1. För att upptäcka telomererer, använd telomeren PNA FISH kit - FITC; Utför proceduren med tillverkarens instruktioner. Proceduren bör utföras vid rumstemperatur, om inte annat anges.
  2. Sänk ner objektglasen i trisbuffrad saltlösning (TBS, pH 7,5) i 2 minuter och lägg sedan i 3,7 % formaldehyd (i TBS; v/v) i exakt 2 min.
    VARNING: TBS-lösning innehåller 10-30% trometamol och 10-30% 2-amino-2-(hydroximetyl) propan-1,3-diolhydroklorid. Detta kan orsaka allvarlig ögon- och hudirritation, så använd skyddshandskar och skyddsglasögon / ansiktsskydd. Använd i ett väl ventilerat område.
  3. Tvätta rutschkanor i en Coplin burk två gånger med TBS i 5 minuter vardera.
  4. Sänk ner objektglasen i förbehandlingslösning i 10 minuter och tvätta sedan två gånger med TBS i 5 minuter per tvätt.
  5. Ta sedan bilderna genom en iskall etanolserie bestående av 50 ml 70%, 85% och 95% (v / v) etanol i 2 min per koncentration. Låt sedan rutschkanorna lufttorka.
  6. Applicera 10 μL Telomere PNA Probe / FITC (eller Cy3) beroende på valet av fluorescerande taggfärgning, på varje glas och täcköverlägg med ett täckglas. Inkubera i en förvärmd ugn inställd på 80 °C i 5 minuter och placera sedan i mörker i cirka 1 timme.
    VARNING: Telomere PNA Probe / FITC innehåller 6-100% formamid, vilket orsakar allvarlig ögonirritation och är teratogen så kan orsaka allvarliga skador på ett ofött barn. Om en kvinna är gravid eller misstänker att hon är gravid bör de undvika att arbeta med formamid. Formamid ska användas i en LEV-dragkåpa och lämpligt ögon- eller ansiktsskydd ska bäras.
  7. För att ta bort täckglasen, sänk ner glasen i "Sköljlösning" i 1 minut och lägg sedan i "Tvättlösning" i 5 minuter vid 65 °C.
    VARNING: Tvättlösningen innehåller 1-5% polyoxietylenoktylfenyleter och 1-5% natriumklorid. Detta är frätande och kan orsaka allvarliga ögonskador. Se till att skyddsglasögon eller ansiktsskydd bärs vid hantering av tvättlösningen.
  8. Inkubera glider genom en 50 ml iskall etanolserie (70%, 85% och 95% (v / v)) i 2 min per koncentration och lufttorka sedan. När du har torkat fästet glider du med monteringsmedel som innehåller DAPI och överlägg med ett täckglas.

6. Bildtagning och analys

  1. För att visualisera DNA-halos och kromosomområden, använd ett epifluorescensmikroskop (t.ex. Leica DM4000-mikroskop) som tar bilder med ett HC PL FLUOTAR 100X/1.30-oljemål och DFC365FX-kamera.
  2. Ta gråskalebilder och definiera färg för varje kanal som tas för att aktivera pseudofärgning av bilder. En kommersiell programvara användes i detta experiment (t.ex. LAS AF version 4.5.0-programvara). De enskilda färgkanalerna exporterades som TIFF-filer.
  3. Analysera bilder med hjälp av Java bildbehandlingsprogram Fiji ImageJ. Ladda upp bilden genom att trycka på Arkiv och Öppna.
  4. Läs in separata bildkanaler eller dela upp en sammansatt bild i separata gråskalekanaler genom att klicka på Bild | Färg | Dela kanaler. Välj en bildkanal och klicka på Bild | Justera och välj sedan Ljusstyrka &; Kontrast. Ändra därefter och upprepa med andra kanaler.
  5. Skapa en mask av den återstående kärnan genom att välja den DAPI-färgade kanalen som visar kärnan. Klicka på bild | Justera och välj sedan Tröskelvärde. En dialogruta visas där tröskeln kan ändras, markera rutan Mörk bakgrund . Ändra tills kvarvarande kärna är klar och tryck på Apply och stäng dialogrutan.
    Detta skapar en binär mask baserad på pixelintensiteten, med vita pixlar som visar intressanta områden och svarta pixlar som visar bakgrund. Upprepa samma procedur på sondkanalen.
  6. Använd frihandsmarkeringen för att skissera periferin av den återstående kärnan och klicka sedan på Redigera och rensa utanför. Överlägg sondkanalen på restkärnan. Detta kan göras genom att trycka på Bild| Färg | Slå samman kanaler.
  7. För att ställa in mätskalan i ImageJ, rita en linje på skalstapeln eller mellan punkterna på två kända avstånd. Gå till Analysera och tryck på Ange skala. Lägg till avståndslängden i dialogrutan och klicka på OK. Om du vill mäta avstånd ritar du en linje mellan de punkter som mäts och klickar på Analysera | Mäta. Detta överför avståndsvärdena till ett datafönster.
  8. Mät den ljusaste DAPI-intensiteten eftersom detta sammanfaller med kärnans centrum. Från detta mäta avståndet från kärncentret till den längsta kromosomrevirkanten (CTE). Mät avståndet från kärncentret till kärnkanten (NE).
  9. Se till att resultaten visas som ett CTE / NE-förhållande. Här divideras avståndet från kärncentret till varje längst kromosomrevirkant (CTE) med avståndet från kärncentret till respektive kärnkant (NE). Detta bör utföras på minst 50 kärnor. Detta kan visas som ett stapel- eller rutdiagram.
  10. För analys av telomererna, analysera minst 30 kärnor per dataset. Bilder kan analyseras med Fiji ImageJ eller manuellt för att räkna antalet telomerer i den kvarvarande kärnan och inom DNA-halo. BrdU eller pKi67 möjliggjorde differentiering av prolifererande (BrdU / piK67 +) och senescent/vilande (BrdU / pKi67-) kärnor. Data kan visas i stapeldiagram med felstaplar som motsvarar medelmedelfelet (SEM).
  11. Använd elevens t-test (ej parkopplat) för att statistiskt jämföra resultaten med p> 0,05 anses vara signifikant.

Representative Results

Denna metod för DNA-haloberedning har hjälpt oss i våra ansträngningar att bestämma skillnader i genombeteende inom unga och gamla celler, men också i celler som härrör från för tidiga åldrande sjukdomar med avvikande nukleoskeletala proteiner15. Figur 1 visar exempel på DNA-halos där det är möjligt att se kanten av en kvarvarande kärna, DNA kvar i restkärnan och det obundna DNA som har spolat ut i det omgivande området och skapat en DNA-halo. Den visar också analysen som visar hur restkärnan erhålls och NE- och CTE-mätningarna. Det är möjligt att skilja mellan prolifererande och icke-prolifererande celler genom att antingen införliva en märkt nukleotid, såsom BrdU, när celler är i S-fas eller använda den diagnostiska proliferationsmarkören anti-pKi67, som avslöjar nukleoler, och regioner av heterokromatin i G1-celler17,18. Primära celler som odlas i högt serum utan att uppnå sammanflöde, som är negativa för proliferationsmarkörerna, antas vara senescenta. Primära celler som odlas i lågt serum eller har blivit konfluenta, dvs kontakthämmade som är negativa för proliferationsmarkörerna anses vara vilande och skulle kunna återinträda i den proliferativa cellcykeln med rätt näringsämnen och situation. Att kunna skilja mellan Ki67-positiva och negativa celler har gjort det möjligt för oss att bestämma skillnader mellan proliferera, vilande och senescenta humana dermala fibroblaster. Figur 2 visar DNA-halos av prolifererande humana dermala fibroblaster skapade från celler där BrdU införlivades i dem under DNA-replikation, en mekanism som inte förekommer i icke-prolifererande celler och därefter färgades med anti-BrdU-antikropp. Färgning med proliferativ markör anti-pKi67-antikropp syns också i figur 2. Detta är ett robust antigen och överlever FISH-protokollet och kan därför färgas för post-FISH och förmontering. Således är prolifererande celler positiva (röda) för BrdU och anti-pKi67 (röda) i den vänstra kolumnen och icke-prolifererande celler, faktiskt senescenta celler i figur 2 visas i den högra kolumnen. De gröna signalerna är individuella telomerer avslöjade med ett telomer-PNA FISH/FITC-kit. Kombination av immunofluorescens med DNA-halos möjliggör analys under olika celltillstånd, vilket visas i figur 2 vid undersökning av proliferera, vilande och senescenta celler. Beroende på vilken antikropp som väljs kan andra tillstånd undersökas, såsom differentiering, DNA-skador via bestrålning etc.

Kromosomrevir kan också visualiseras i DNA-halos med hjälp av FISH. På grund av preparatet som tillåter spolning av DNA ut ur kärnorna kan kromosomrevirformen störas, med mindre eller större mängder av kromosomen som finns i DNA-halon, beroende på förankringen av genomet inuti restkärnan och dess strukturer. Figur 3 avslöjar en panel av DNA-halos där enskilda kromosomer har avslöjats med specifika hela armkromosommålningssonder (röda) för kromosomerna 1, 13, 17 och 18. Anti-pKi67 (grön) har använts för att markera prolifererande celler och dess frånvaro inom samma kultur, på samma bild, vilket betecknar senescenta celler. Det framgår mycket tydligt av bilderna och de data som presenteras som CTE/NE att den lilla genfattiga kromosomen 18 är en kromosom som har få fästen och spolar längre ut i DNA-halon bort från restkärnorna och är betydligt längre från mitten av restkärnorna än de andra kromosomerna. Detta gäller dock även för kromosom 1. Med hjälp av den proliferativa markören anti-pKi67 har det också varit möjligt att jämföra proliferering med senescenta celler, inom samma kultur och på samma objektglas, och denna analys har visat att kromosomer inom dessa två mycket olika cellstatuser inte skiljer sig signifikant från varandra, med avseende på bindning med de kvarvarande kärnstrukturerna.

Intressant nog visar gener också statistiskt signifikanta skillnader mellan prolifererande och senescenta celler med avseende på att förbli inom en kvarvarande kärna eller vara belägen i DNA-halo. Figur 4 visar detta med genlokus avgränsade av märkta BAC-sonder i rött och anti-Ki67 i grönt. Det finns inga signifikanta skillnader mellan genplatser i prolifererande kontra senescenta celler, efter ett DNA Halo-preparat. Det finns dock betydligt fler catenin alpha 1 CTNNA1-loci inom DNA-halo än cyklin D1 CNDD1-loci , där det finns mycket få. Figur 5 visar DNA-halopreparat med telomerer i grönt. Bakgrunden lämnas medvetet hög för att telomersignaler ska kunna visualiseras i DNA-halo. I denna uppsättning data har vilande celler, dvs celler som har varit serumsvält i 7 dagar inkluderats och intressant nog finns det betydligt fler telomerer som inte är fästa och ligger i DNA-halorna i vilande celler än för prolifererande och senescenta celler. I figur 5a kan andelen telomerer i DNA-halo observeras, särskilt för bilden "experiment 2". Detta motsvarar figur 5b där den genomsnittliga andelen telomerer i DNA-halo är cirka 17% i vilande celler. Det finns vissa bevis för att inte alla telomerer i senescenta celler kan ses som några av dem kanske mycket korta.

Denna metod för DNA-halo har varit framgångsrik för oss att undersöka genominteraktionsförändringar inom kärnor i sjuka celler15. Figur 6 visar skillnader i kromosombindning i primärkontrollfibroblaster och i sjuka celler med typisk (lamin A-mutation) och atypisk Hutchinson-Gilford Progeria syndrom, vilket uttrycker en annan SUN1-isoform och ingen lamin A-mutation19. Kromosomerna 1 och 13 visar statistiskt signifikanta skillnader i deras bindning inom restkärnorna jämfört med kontroll-DNA-halos. Figur 6b korrelerar positionen för hela kromosomområdet till restkärnan och DNA-halo. Värden på 1 eller mindre indikerar att kromosomen ligger inom den återstående kärnan och värden över 1 visar kromosomer eller delar av kromosomer inom DNA-halo.

Sammantaget belyser detta nyttan av HALO-FISH för att undersöka genomiska interaktioner mellan hela kromosomer, specifika gener och telomerer under olika förhållanden som påverkar cellcykeln (proliferation, vilande och åldrande) eller inom sjukdomsceller, t.ex. progeria och cancercellinjer. Faktum är att skillnaderna i interaktioner mellan dessa tillstånd innebär att nukleoskeletten har en viktig roll för att reglera nyckelprocesser inom kärnan.

Figure 1
Figur 1: HDF-extraherad kärna som visar kvarvarande kärna och DNA-halo och översikt över analysmetod. a) En HDF-kärna som beretts via DNA-haloanalys och motfärgats med DAPI. Den ljust färgade kvarvarande kärnan visar DNA förankrat i nukleoskelettet och detta är omgivet av det icke-bundna DNA som bildar en halo av DNA. Förstoring = x 100; skalstreck 10 μm. b) Den blå kanalen fångar upp den DAPI-färgade kärnan och omgivande DNA. Den återstående kärnan väljs och avlägsnas med ImageJ. Pilen visar avståndet från kärncentret till den återstående kärnkanten (NE). c) Den röda kanalen visar sondsignalen. d) Den bild som betecknas "Resultat" är resultatet av att den röda kanalen läggs ovanpå den blå kanalbilden. detta möjliggör avståndet från kärncentret till den längsta kromosomområdeskanten (CTE). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: DNA-halopreparat med telomeren PNA FISH på prolifererande och senescenta HDF. Telomeren PNA FISH på HDF som utsatts för DNA-haloanalys. Telomersignaler visualiseras i grönt (FITC), rest- och halo-DNA motfärgades med DAPI (blått) och prolifererande kärnor detekterades med antingen anti-BrdU- eller anti-pKi67-antikroppar via indirekt immunofluorescens i rött (TRITC). Förstoring = x 100; Skalstreck 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Nukleoskelett-kromosominteraktioner och analys med DNA-haloanalys. a) 2D-FISH med prober specifika för kromosomerna 1, 13, 15, 17 och 18 utfördes på HDF som utsatts för DNA-halopreparat. Hela kromosomer målades i rött (Cy3) och kärnor undersöktes med pKi67 för att avgöra om de förökade sig eller senescent. Prolifererande celler (pKi67+) avgränsades i grönt (FITC), medan senescenta celler förblev ofärgade (pKi67-) dvs ingen grön signal detekterades. Förstoring = x 100; skalstång 10 μm. b) Kromosomförankring av nukleoskelettet i prolifererande och senescenta HDF som genomgått halofisk. Mätningar visar förhållandet mellan den längsta kromosomrevirkanten (CTE) och respektive kärnkant (NE) för kromosomerna 1, 13, 15, 17 och 18 i prolifererande (pKi67+) och senescenta (pKi67-) celler. Felstaplar representerar ± SEM. (c) Modifierad låddiagramrepresentation av kromosomrevirkanten (CTE) till respektive kärnkant (NE) av specifika kromosomer i pKi67+ och pKi67-kärnor. Q1 = nedre kvartil; Min = lägsta registrerade värde; Med = median; Max = högsta registrerade värde; Q3 = övre kvartil. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Genspecifika interaktioner i HDF med halo-fisk. a) DNA-haloextraherade kärnor undersöktes med genspecifika sonder (CCND1 och CTNNA1) för att undersöka deras förankring till NM på prolifererande och senescenta celler. Gensignalerna visas i rött (Cy3) och anti-pKi67 visar prolifererande celler och signalen visualiseras i grönt (FITC). För den prolifererande CCND1-bilden är den återstående kärnan innesluten i den vita cirkeln, och utrymmet mellan den vita och gröna cirkeln visar DNA-halo. Förstoring = x 100; Skalstapel 10 μm. b) Genspecifika signaler för CCND1 och CTNNA1 jämförs mellan den kvarvarande kärnan och DNA-halo, och även mellan prolifererande och senescenta celler. Felstaplar representerar ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: DNA-haloanalys på vilande HDF sonderade med telomeren PNA-FISH. a) Bibehållna fettfibrers stillhet inducerades genom odling i ett lågserummedium i 7 dagar. DNA-haloanalysen utfördes och PNA-FISH möjliggjorde visualisering av telomerer med FITC-signal (grön) och den kvarvarande kärnan och omgivande DNA-halo motfärgades med DAPI (blå). Celler färgades också med anti-pKi67-antikroppar för att säkerställa att kärnorna inte förökades. Detta upprepades vid två olika tillfällen. Förstoring = x 100; Skalstapel 10 μm. b) Jämförelse av den genomsnittliga procentandelen telomerer lokaliserade i DNA-halo i prolifererade, senescenta och vilande HDF-celler. Felstaplar representerar ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Undersökning av hela kromosomförankringen till nukleoskelettet i HGPS-celler med hjälp av HALO-FISH26. (a) Kontrollera HDF (2DD), klassisk HGPS (AG06297) och atypisk typ 2 HGPS (AG08466) kärnor genomgick DNA-haloberedning och sedan 2D-FISH med användning av hela kromosomfärger för kromosom 1, 13, 15 och 17. Hela kromosomer avbildas i grönt (FITC) och DNA motfärgades med DAPI (blått). Förstoring = x 100; Skalstång 10 μm. (b) Positionering av kromosomer inom extraherade kärnor bestämdes genom att mäta förhållandet mellan den genomsnittliga kromosomrevirkanten (CTE) och kärnkanten (NE). Ett förhållande över 1 visar att den längsta CTE ligger utanför motsvarande NE inom DNA-halo, medan ett förhållande under 1 betyder att den längsta CTE ligger inom NE inom restkärnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Beståndsdelar Volym (μL)
5XDOP-PCRbuffert 10
dNTPmix(utanTTP)(2mM) 5
dTTP(2mM) 2
Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP 10
DOPprimer (20μM) 5
TaqDNAPolymeras(1U/μL) 1
PCRgradevatten 12
Mall 5

Tabell 1: Tabell som visar DOP-PCR-komponenter och volymer för en 1x-reaktion

Steg Cykler Temp (examen Celsius) Tid
Inledande denaturering 1 95 3 minuter
Denaturering 34 98 20 sekunder
Primer glödgning 62 1 minuter
Förlängning 72 30 sekunder
Slutlig förlängning 1 72 5 minuter
Kylning 4 Hålla

Tabell 2: Tabell som visar DOP-PCR-cykel, temperatur och tidsprofil.

Konstituerande Volym (μL)
10x NT-buffert (0,5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA) 5
0,1 M beta-merkaptoetanol 5
10X nukleotidlager (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotin-16-dUTP) 5
Dnas I (1 ng/ml) 2
DNApolymeras I 5U per μg DNA
DNAmall (1 μg) 1
DEPC-behandlat vatten Till 50 μL

Tabell 3: Tabell som visar nicköversättningskomponenter och volymer för en prob.

Discussion

DNA-halometoden är en utmärkt metod att välja när man analyserar interaktioner mellan nukleoskelettet och genomet, men det finns några kritiska steg som också måste följas. En av de viktigaste parametrarna är optimeringen av cellsådddensiteten. Om celler blir översammanflytande, kommer DNA-halorna att överlappa med angränsande celler vilket gör det omöjligt att utföra analysen. CSK- och extraktionsbuffertarna måste alltid göras färska på användningsdagen och spermin, spermidin och digitonin tillsätts extraktionsbufferten i slutet av beredningsprocessen för att bibehålla sin biologiska aktivitet. Om du utför Halo-FISH är det extremt viktigt att använda rätt denatureringstemperatur för DNA-halorna för att sonden eller färgen därefter ska kunna hybridiseras.

Elektronmikroskopi har använts för att visualisera kärnmatrisen, med filamentösa strukturer som identifieras20. Elektronmikroskopi är emellertid begränsad eftersom matrisföreningar med kromatin inte lätt kan härledas. Faktum är att DNA Halo-metoden är mer mångsidig jämfört med elektronmikroskopi eftersom specifika gener, kromosomer och celltillstånd alla kan undersökas. Vidare studeras proteomisk analys av kärnmatrisproteiner21,22. Denna metod är bra för att jämföra kärnmatriskomponenter, särskilt när man jämför sjuka celler, men den ger inte den rumsliga fördelningen och bilagorna som markeras av standard DNA Halo-tekniken.

DNA Halo-analyser har begränsningar. För det första, eftersom matrisen extraheras, kan detta endast utföras på fasta celler så levande avbildning är inte möjlig. Även om DNA Halo-metoden är relativt snabb och enkel att utföra, kan den övergripande processen vara tidskrävande när cellodling, sondgenerering, Halo-FISH och analys beaktas.

Bildtagning av DNA-halos och halo-fish med hjälp av superupplösningsmikroskopi skulle avsevärt förbättra upplösningen av DNA-specifika sonder och antikroppar. Dessutom, eftersom fluorokromer lättare kan lösas spektralt, kan det vara möjligt att använda ett antal DNA-sonder i ett enda experiment, vilket ger ännu mer information. Förbättringar i molekylärbiologiska tekniker såsom kromosomkonformationsfångst (3C) har använts för att bestämma interaktioner mellan genlokus och analysera den rumsliga organisationen på kromatin i cellen. DNA Halo-analyser och 3C kan kombineras, en term som kallas M3C23, vilket återigen visar anpassningsförmågan hos DNA Halo-tekniken.

De ursprungliga data som presenteras här är att visa möjligheterna för genombeteendeförhör och hur man presenterar dessa data. Med dessa data har vi visat att det är möjligt att bestämma signifikanta skillnader i genombindning med hjälp av (1) kromosommålningssonder, i denna studie avslöjar kromosom 18 att vara den minst fästa kromosomen av de analyserade (Figur 3); (2) Genlokus med signifikanta skillnader mellan två genlokus och (figur 4) (3) Telomerer, som är mindre starkt bundna i vilande celler jämfört med prolifererande och senescenta celler (figur 5). Vi kan skilja mellan prolifererande och icke-prolifererande celler via närvaron av proliferationsmarkören Ki67-antigen, vilket är ett olösligt protein, så förblir med restkärnorna eller använder införlivandet av nukleotider för att markera celler som har gått igenom S-fas inom en viss tidsperiod (Figur 2). Denna teknik har också gjort det möjligt för oss att analysera genombeteende i celler som är komprometterade i sina nukleoskelett, dvs laminopaticeller, och här och i Bikkul et al., 2018, avslöjar vi att genomet kan vara mindre tätt fäst jämfört med kontrollceller och kan återställas vid behandling med specifika läkemedel som förbättrar effekten av lamin A-mutationen i klassiska HGPS-celler15. Vi visar dock nya data här för de atypiska HGPS AGO8466-cellerna, som saknar en lamin A-mutation men innehåller en ovanlig form av LINC-komplexproteinet SUN119 som kromosom 13 är mindre tätt fäst i (figur 6).

HALO-FISH är en unik metod som möjliggör studier av genomiska interaktioner med nukleoskelettet i kombination med indirekt immunofluorescens för att lösa proteiner som inte avlägsnats från extraktionsproceduren. Det har visats att nukleoskelettet är modifierat vid olika sjukdomar såsom vissa cancertyper19 och betydelsen av vissa nukleoskelettassocierade proteiner som diagnostiska biomarkörer24,25. Således har denna teknik en viktig roll för att undersöka effekten av nukleoskelettet på kromatinorganisation / disorganisation vid sjukdom 15,24,25,27 och är inte begränsad till mänskliga celler, med kromosomala målningssonder från andra djur kan samma DNA-haloprotokoll användas 28.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka professor Michael Bittner för den vänliga gåvan av kromosomarmmålningssonder. LG stöddes av det EU-finansierade projektet EURO-Laminopathies och Brunel Progeria Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS Thermo Fisher Scientific 10388739 Used to create DNA halos
5-bromo-2′-deoxy-uridine   Sigma-Aldrich B5002-100MG Labelled nucleotide
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG Labelled nucleotide
Agar Technical Thermo Fisher Scientific 15562141 DNA isolation of BAC clones
Agarose Sigma-Aldrich A939-50G Check product size of DOP-PCR and nick translation
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) Coriell Institute AG08466 Cell line
Bacto tryptone Thermo Fisher Scientific 16269751 DNA isolation of BAC clones
Biotin-16-dUTP Roche Diagnostics  11093711103 Labelled nucleotides
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-25G DNA isolation of BAC clones
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)  Coriell Institute AG0297 Cell line
Coplin jar Thermo Fisher Scientific 12608596 Holds 5 slides or 8 slides back to back
Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279011 Block nonspecific hybridization in HALO FISH
DEPC-treated water Sigma-Aldrich 693520-1L DNA isolation of BAC clones
Dextran sulphate Sigma-Aldrich S4030 Hybridisation mixture
Digitonin Sigma-Aldrich D141 Component of extraction buffer
Digoxigenin-11-dUTP  Sigma-Aldrich 11093088910 Labelled nucleotides
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson Laboratory 715-165-150 Secondary antibody
EDTA Sigma-Aldrich E6758 Component of extraction buffer
Ethanol Component of extraction buffer
Ethanol Sigma-Aldrich 443611 Probe precipitation and HALO FISH
Fetal bovine system Thermo Fisher Scientific 26140079 Cell culture serum
Formamide Thermo Fisher Scientific 10523525 2D FISH of DNA halos
Glass wool Sigma-Aldrich 18421 Spin column
Herring sperm Sigma-Aldrich D7290 Probe precipitation
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) OSRAM HXP-R120W45C VIS Image capture of DNA halos
Hydrochloric acid Thermo Fisher Scientific 10313680 Cleaning microscope slides
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML DNA isolation of BAC clones
KAPA HiFi PCR Kit KAPA Biosystems KK2103 PCR Kit
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. Leica Microsystems Image capture of DNA halos
Luria-Bertani agar  Thermo Fisher Scientific 13274843 DNA isolation of BAC clones
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266 Component of CSK buffer
Methanol Thermo Fisher Scientific 10284580 Cleaning and sterilizing microscope slides
Mouse anti-BrdU antibody BD Pharmingen B2531-100UL BrdU visualisation
Newborn calf serum Thermo Fisher Scientific 16010159 Cell culture serum and blocking reagent
Nick translation kit Invitrogen
PCR grade water Sigma-Aldrich 693520-1L PCR and DNA isolation of BAC clones
PCR Primers Sigma-Aldrich
PIPES Sigma-Aldrich P1851 Component of CSK and extraction buffers
Potassium acetate Sigma-Aldrich P1190-100G DNA isolation of BAC clones
QuadriPERM® 4 X 12 SARSTEDT 94.6077.307 Square cell culture dish, polysterene with four compartments.  This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.
Rabbit Anti-Ki67 antibody Sigma-Aldrich ZRB1007-25UL Proliferation marker
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 DNA isolation of BAC clones
Rubber cement Halford's 101836 2D FISH of DNA halos
Sephadex G-50 Sigma-Aldrich S6022-25G Spin column
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Probe precipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Component of CSK, extraction and SSC buffers
Sodium citrate Sigma-Aldrich C8532 Component of SSC buffer
Sodium dodecyl sulphate  L3771-100G DNA isolation of BAC clones
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G DNA isolation of BAC clones
Spermidine Sigma-Aldrich S2626 Component of extraction buffer
Spermine Sigma-Aldrich S4264 Component of extraction buffer
Streptavidin-Cy3  Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies pa43001 Probe antibody
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Component of CSK buffer
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 CSK buffer+A66:D68
SuperFrost™ microscope slides Thermo Fisher Scientific 12372098 Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.
Swine anti-rabbit TRITC  Dako
TELO-PNA FISH KIT Agilent Dako K532511-8 Delineation of telomeres
Tris-HCl Sigma-Aldrich T3253-100G Column buffer
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T9284 Component of CSK buffer
Tryptone Thermo Fisher Scientific 10158962 DNA isolation of BAC clones
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416- 100ML Detergent
Vectashield mountant containing DAPI Vector Laboratories H-1200 2D FISH of DNA halos
Whole human chromosome probes Calbiochem 2D FISH of DNA halos
Yeast extract Thermo Fisher Scientific 10108202 DNA isolation of BAC clones

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berezney, R., Coffey, D. S. Identification of a nuclear protein matrix. Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).
  2. Haaf, T., Ward, D. C. High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes. Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).
  3. Parra, I., Windle, B. High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization. Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).
  4. Senger, G., et al. Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization. Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).
  5. Florijn, R. J., et al. High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes. Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).
  6. Elcock, L. S., Bridger, J. M. Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres. Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).
  7. Heiskanen, M., et al. Visual mapping by fiber-FISH. Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).
  8. Bensimon, A., et al. Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface. Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).
  9. Michalet, X., et al. Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies. Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).
  10. Wilson, R. H., Coverley, D. Relationship between DNA replication and the nuclear matrix. Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).
  11. Wilson, R. H. C., Coverley, D. Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos. Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).
  12. Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).
  13. Tandara, M., et al. Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF. Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).
  14. Repping, S., et al. The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number. Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).
  15. Bikkul, M. U., et al. Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts. Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).
  16. Telenius, H., et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).
  17. Bridger, J. M., et al. Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells. Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).
  18. Sales Gil, R., Vagnarelli, P. Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).
  19. Bikkul, M. U., et al. Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform. Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).
  20. Jackson, D. A., Cook, P. R. Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat. EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).
  21. Albrethsen, J., et al. Unravelling the nuclear matrix proteome. Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).
  22. Mika, S., Rost, B. NMPdb: Database of nuclear matrix proteins. Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).
  23. Gavrilov, A. A., et al. of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).
  24. Sjakste, N., et al. Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis. Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).
  25. Leman, E. S., Getzenberg, R. H. Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).
  26. Volpi, E. V., Bridger, J. M. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).
  27. Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. Human Interphase Chromosomes. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).
  28. Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues. BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 169 DNA-haloberedning kärnmatris nukleoskelett genomorganisation DNA-slingor kromosomterritorier utökade kromatinfibrer matrisfästregioner telomerer

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. The Authors section was updated from:

Lauren S. Godwin1
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

to:

Lauren S. Godwin1
Emily Roberts2
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

Fluorescens in situ-hybridisering på DNA-halopreparat för att avslöja hela kromosomer, telomerer och genlokus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, … More

Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, J. M., Foster, H. A. Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. J. Vis. Exp. (169), e62017, doi:10.3791/62017 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter