Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescens in situ hybridisering på DNA Halo-preparater for å avsløre hele kromosomer, telomerer og genloci

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62017
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London, 2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

ERRATUM NOTICE

Summary

Kombinering av DNA-halopreparater med fluorescens in situ-hybridisering muliggjør høyoppløselig analyse av genomiske interaksjoner med nukleoskeletonet. Vedlagt genom fører til hybridiserte fluorescerende signaler lokalisert i de gjenværende ekstraherte kjernene, mens ikke-festet genom er i haloen av DNA som omgir de resterende kjernene.

Abstract

Genomet er forbundet med flere strukturer inne i cellekjerner, for å regulere aktiviteten og forankre den på bestemte steder. Disse strukturene er kollektivt kjent som nukleoskeleton og inkluderer kjernefysiske lamina, nukleolene og kjernelegemene. Selv om mange varianter av fluorescens in situ hybridisering (FISH) eksisterer for å studere genomet og dets organisasjon, er disse ofte begrenset av oppløsning og gir utilstrekkelig informasjon om genomets tilknytning til kjernefysiske strukturer. DNA-halo-metoden bruker høye saltkonsentrasjoner og ikke-ioniske vaskemidler for å generere DNA-sløyfer som forblir forankret til strukturer i kjerner gjennom festeområder i genomet. Her ekstraheres løselige nukleære proteiner, som histoner, lipider og DNA som ikke er tett bundet til den nukleære matrisen. Dette fører til dannelsen av en halo av ufestet DNA som omgir en gjenværende kjerne som i seg selv inneholder DNA nært forbundet med interne kjernefysiske strukturer og ekstraksjonsresistente proteiner. Disse utvidede DNA-strengene muliggjør økt oppløsning og kan lette fysisk kartlegging. I kombinasjon med FISH har denne metoden den ekstra fordelen av å studere genomiske interaksjoner med alle strukturer som genomet er forankret av. Denne teknikken, kalt HALO-FISH, er svært allsidig der DNA-haloer kan kombineres med nukleinsyreprober for å avsløre genloci, hele kromosomer, alfa-satellitt, telomerer og til og med RNA. Denne teknikken gir et innblikk i nukleær organisasjon og funksjon i normale celler og i sykdomsprogresjon som med kreft.

Introduction

Den "kjernefysiske matrisen" ble først beskrevet av Berezney og Coffey i 19741. Etter å ha utført ekstraksjoner med høye saltmolariteter og nukleasebehandling på rotteleverkjerner, identifiserte de et proteinholdig strukturelt rammeverk. DNA-halo-prosedyren ble senere tilpasset fra denne metoden og innebærer fjerning av løselige proteiner slik at bare kjernematrisen (NM) og NM-assosierte proteiner og kromosomer vedvarer. DNA-vedleggsregioner ligger ved basen av DNA-sløyfer og kalles matriksfestede regioner (MAR) eller stillasfesteregioner (SAR), som er resistente mot ekstraksjon med henholdsvis høye saltkonsentrasjoner og ionisk vaskemiddel litium-3,5-diiodosalisylat (LIS). I DNA-haloer er DNA assosiert med MARs / SARs bundet i den gjenværende kjernen, mens DNA-sløyfene strekker seg bort fra disse stedene og danner DNA-haloen. Vi vet nå at genomet er forankret via lamina assosierte domener (LADs) til kjernelamina og gjennom nukleolære assosierte regioner (NADs) og muligens gjennom andre kjernefysiske strukturer som spesifikke kjernelegemer.

DNA-halo-metoden kan brukes til fysisk kartlegging av DNA, gener og kromosomale regioner, da det utvidede DNA og kromatin gir en større oppløsning fordi kromatinet er strippet for histoner og DNA er strukket ut 2,3,4,5,6. Det er imidlertid noen begrensninger når du bruker DNA-haloer for denne applikasjonen. For eksempel kan DNA tett forbundet med gjenværende kjerner av DNA-haloer være utilgjengelig for prober, og dermed utelukke det fra analyse og fysisk kartlegging6. Andre teknikker som fiber-FISH 2,4,5,7 og molekylær kaming 8 muliggjør også fysisk kartlegging og har fordelen av å være relativt rask og enkel å utføre. Begge brukes fortrinnsvis til DNA-kartlegging av gener over DNA-haloer. Disse metodene ekstraherer kromatinfibre ved bruk av løsningsmiddel eller saltekstraksjoner fra kjernen, men molekylær kaming har en tendens til å ha bedre reproduserbarhet 8,9.

Det er et økende bevis på at nukleoskjelettet har en rolle i å støtte viktige kjernefysiske prosesser, for eksempel festesteder for DNA, kromatinremodellering, DNA-transkripsjon, DNA-reparasjon og DNA-replikasjon11,12. Som sådan ble DNA-haloteknikken utviklet for å undersøke samspillet mellom nukleoskjelettet og genomet under disse cellulære aktivitetene, og har blitt rutinemessig brukt og rapportert i forskning. Denne teknikken har også blitt brukt til å undersøke interaksjoner mellom genomet og nukleoskjelettet i forhold til sykdomsprogresjon med malignitetsassosierte endringer i nukleær struktur som blir identifisert11.

DNA-glorieteknikken har også blitt brukt til å undersøke forholdet mellom genomet og nukleoskeleton under utvikling og differensiering12. En rekke studier har brukt en variant av DNA-haloteknikken kjent som halosperm13 eller SpermHalo-FISH hvis kombinert med FISH14. Spermatozoakromatin er tett bundet til proteiner kjent som protaminer, og denne teknikken ble utviklet for å forbedre tilgangen til sædens DNA. Halosperm har blitt brukt til å undersøke integriteten til spermatozoa DNA og avgjøre om DNA-skade er tilstede. Spermatozoa med mindre DNA-skade korrelerer med en større DNA-halostørrelse, mens spermatozoa med økte nivåer av fragmentert og skadet DNA hadde enten små haloer eller ingen i det hele tatt. Dermed kan halosperm brukes som en potensiell prognostisk markør for embryokvalitet og vellykket graviditet med IVF13. Dette eksemplet understreker de potensielle kliniske anvendelsene av denne teknikken. I vårt arbeid har vi brukt HALO-FISH til å vurdere endringer i genomatferd og effekten av spesifikke medikamentelle behandlinger ved den premature aldringssykdommen Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.

Sammen belyser disse, og andre studier, bredden av prosesser/applikasjoner som DNA-glorieteknikken kan brukes til å studere og bruken av teknikken.

Protocol

1. Lysbildepreparering, sterilisering og cellekultur

  1. Tilbered 500 ml 10% HCl (v/v) og hell i et stort beger.
  2. Slippmikroskop glir individuelt inn i syren og inkuberer i 1 time ved romtemperatur på en shaker satt til 2 x g.
    FORSIKTIG: HCl er etsende og irriterende. Det kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader og irritasjon i hud, øyne og luftveier. Sørg for at passende personlig beskyttelse brukes, inkludert nitrilhansker, øyevern og laboratoriefrakk.
  3. Dekanter syre fra begeret og vask glir ti ganger i kranvann og deretter ytterligere ti ganger i avionisert vann.
  4. Skyll i metanol to ganger og hold i metanol til sterilisering ved flaming.
    FORSIKTIG: Metanol er en svært brannfarlig væske og giftig ved svelging, i kontakt med hud eller ved innånding. I tillegg kan metanol forårsake skade på organer, er etsende og irriterende. Overhold eksponeringsgrensene på arbeidsplassen og sørg for at passende personlig beskyttelse brukes, inkludert butylgummihansker, øyevern og laboratoriefrakk. Der det er mulig, håndteres i et avtrekkskapskap med lokal avtrekksventilasjon (LEV).
  5. Bruk metalltang eller lange tang, fjern et mikroskopglass fra begeret som inneholder metanol. Flamme over en Bunsen-brenner for å sterilisere, og overføre til et rektangulært cellekulturbeholder som inneholder fire rom for lysbilder, plassert nær Bunsen-brenneren.
    FORSIKTIG: Flaming tillater umiddelbar sterilisering av mikroskopglass før bruk; Denne metoden har imidlertid tilknyttede farer. Siden metanol er svært brannfarlig, er det viktig at begeret som inneholder skliene er plassert vekk fra Bunsen-brenneren. Lang tang eller tang bør brukes som tett grep lysbildene. Metanolnivået i begeret skal bare dekke lysbildene, både for å minimere mengden metanol som brukes og slik at bare endene av tangen/tangen er i kontakt med metanolen. Forsikre deg alltid om at metanolen har fordampet fra tangen eller tangen etter bruk, og at disse er avkjølt før du legger tilbake i begeret som inneholder lysbildene og metanol. Begeret skal dekkes av et stykke aluminiumsfolie for å sulte oksygenet hvis metanolen skulle ta fyr. Flamme glir aldri i en klasse II laminær hette der luften sirkuleres.
  6. Alternativt kan du utføre trinn 1.1 til 1.4, men i stedet for å flamme lysbildene etter inkubering med metanol, plasser lysbilder på lofritt vev for å lufttørke. Når det er tørt, pakk inn aluminiumsfolie og sett i en sterilisatorovn eller autoklav.
  7. Dyrk celler i egnet medium med serum i minst 48 timer ved 37 °C i 5 % CO2 til 60-70 % sammenløp er nådd. Denne protokollen ble utført på en tidlig passasje av humane dermale fibroblaster (HDF) og på klassiske Hutchinson-Gilford progeria syndrom (HGPS) fibroblaster (AG06297) og atypiske type 2 HGPS fibroblaster (AG08466). Høst hver celletype og telle ved hjelp av et hemocytometer for å bestemme celletetthet. Frø 1 x 105 celler i 10 ml medium per lysbilde.
    MERK: Celletettheten er viktig da DNA-sløyfer fra forskjellige kjerner kan konvergere hvis cellene blir for sammenflytende. Såtetthet må kanskje optimaliseres avhengig av celletypen som brukes som transformerte celler kan spre seg raskere, mens senere passasjecellekulturer kan ta lengre tid å nå ønsket konfluens.
  8. Hvis celler må arresteres i G0 for å bli hvilende, frø deretter 1 x 105 celler (i 10 ml medium) per lysbilde og la det vokse i 24 timer. Vask cellene to ganger med serumfritt medium og inkuber i standard medium som inneholder en lavere konsentrasjon av serum på 0,5% (nyfødt kalveserum, NCS; eller føtalt bovint serum, FBS) i 7 dager.
  9. Hvis cellens proliferative status er nødvendig for DNA Halo-analysen, må du bestemme celler som har passert gjennom S-fase ved inkorporering av 5-brom-2'-deoksy-uridin (BrdU) i DNA under replikasjon.
    1. Frøceller som normalt og vokser i 24 timer. Fjern dyrkningsmediet og erstatt med medium som inneholder BrdU og 5-fluor-2'-deoksyuridin (3 μg / μL). Etter ytterligere 24 timer, fjern mediet, vask cellene en gang med medium (10% NCS) og deretter re-mate med friskt medium (10% NCS). Inkuber i ytterligere 24 timer og klargjør deretter lysbildene for DNA-haloanalysen.

2. Forberedelse av sonde

  1. Kromosom- og armmalingssonder
    1. Lag kromosomprober fra amplifisering av strømningssorterte eller mikrodissekerte kromosomer ved degenerert oligonukleotid primet polymerasekjedereaksjon (DOP-PCR) ved hjelp av metoden av Telenius et al.16. Bruk DOP-PCR til å merke kromosomprober med enten Biotin-16-dUTP eller Digoxigenin-11-dUTP som vist i tabell 1. Vennligst sjekk produsentens instruksjoner for forsterkningsprofil, men betingelsene som brukes for dette eksperimentet er vist i tabell 2.
    2. Forbered arm- eller helkromosomsonden ved å legge sammen 8 μL merket PCR-produkt, 7 μL Cot-1 DNA, 3 μL sildesæd, 1/20th volum av 3 M natriumacetat (pH 5,4) og 2 volumer 100% etanol. Inkuber sondeoppløsningen i minimum 30 minutter ved -80 °C.
      MERK: Denne metoden kan brukes til å lage enkle kromosomprober, eller flere kromosomprober hvis forskjellige etiketter (dvs. Biotin-16-UTP og Digoxigenin-11-dUTP) brukes for hvert kromosom av interesse.
      FORSIKTIG: Etanol er en svært brannfarlig væske og damp og kan forårsake alvorlig øyeirritasjon. Holdes borte fra varme, varme overflater og tennkilder. Overhold eksponeringsgrensene på arbeidsplassen og sørg for at passende personlig beskyttelse brukes, inkludert butylgummihansker, øyevern og laboratoriefrakk. Der det er mulig, håndteres i et LEV-avtrekkskap.
    3. Sentrifugesondeoppløsning ved 13 700 x g i 15 minutter ved 4 °C og vask deretter med 70 % etanol. Gjenta sentrifugeringsprosedyren og kast supernatanten, pass på at du ikke forstyrrer eller mister DNA-pelleten. La DNA-pelleten tørke.
    4. Tilsett 12 μL hybridiseringsbuffer (50% formamid, 10% dekstransulfat, 10% 20x saltvannnatriumsitrat (SSC; 3 M NaCl, 0,3 M trinatriumcitrat; pH 7,0), 1% (v / v) polyoksyetylensorbinalmonolaurat (Tween-20)) til DNA-pelleten. La stå ved 37 °C i minst 2 timer for at DNA-pelleten skal oppløses i hybridiseringsbufferen.
      FORSIKTIG: Formamid er kreftfremkallende og teratogent, og kan derfor forårsake alvorlig skade på det ufødte barnet. Hvis en kvinne er gravid eller mistenker at hun er gravid, bør de unngå å jobbe med formamid. Formamid skal brukes i en LEV avtrekkshette. Overhold eksponeringsgrensene på arbeidsplassen og sørg for at passende personlig beskyttelse brukes, inkludert butylgummihansker, øyevern og laboratoriefrakk.
  2. DNA-isolering fra bakterielle kunstige kromosomer (BAC)
    1. Strek en liten del av glyserolbestanden fra BAC-klonen på en Luria-Bertani (LB) agarplate (1% (W / V) NaCl; 1% (w / v) trypton, 0,5% (w / v) gjærekstrakt, 1,5% (w / v) Agar Technical, 12,5 μg / ml (w / v) kloramfenikol). Inkuber over natten ved 37 °C.
    2. Velg en enkelt koloni fra platen og inokuler 10 ml LB-buljong (1% (w / v) NaCl, 1% (w / v) bactotrypton, 0,5% (w / v) gjærekstrakt, 12,5 μg / ml (w / v) kloramfenikol). La oppløsningen ligge i en risteinkubator over natten ved 37 °C.
      FORSIKTIG: Kloramfenikol mistenkes for å forårsake kreft. Håndter med forsiktighet og reduser eksponeringen.
    3. Sentrifugekultur ved 1 700 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
    4. Kast supernatanten og tilsett 300 μL P1-oppløsning (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A) til pelleten. Vortex kraftig og overføre celler til et 2 ml mikrosentrifugerør.
    5. Tilsett 300 μL P2-oppløsning (0,2 M NaOH, 1 % (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS) dråpevis til cellene. Snu det lukkede mikrosentrifugerøret 5 ganger og la det stå i romtemperatur i maksimalt 5 minutter.
      FORSIKTIG: Natriumhydroksid er etsende og kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Det kan være etsende på metaller. Håndter med forsiktighet og reduser eksponeringen. Overhold eksponeringsgrensene på arbeidsplassen og sørg for at passende personlig beskyttelse brukes, inkludert nitrilgummihansker, øyevern og laboratoriefrakk. Der det er mulig, håndteres i et LEV-avtrekkskap.
      FORSIKTIG: Natriumdodecylsulfat er et brennbart fast stoff, skadelig ved svelging og kan forårsake irritasjon i hud og luftveier. Det kan også forårsake alvorlig øyeskade. Sørg for at passende personlig beskyttelse brukes, inkludert nitrilgummihansker, øyevern og laboratoriefrakk. Der det er mulig, håndteres i et LEV-avtrekkskap.
    6. Tilsett 300 μL P3 (3 M kaliumacetat) sakte til cellene og bland forsiktig. Plasser mikrosentrifugerøret på is i 10 minutter.
    7. Sentrifuger ved 8 100 x g i 10 minutter ved 4 °C og overfør supernatanten til et rør inneholdende 800 μL iskald isopropanol. Snu røret flere ganger og inkuber ved -20 °C over natten.
      FORSIKTIG: Isopropanol er en svært brannfarlig væske og damp og kan forårsake alvorlig øyeirritasjon, døsighet eller svimmelhet. Holdes borte fra varme, varme overflater og tennkilder. Overhold eksponeringsgrensene på arbeidsplassen og sørg for at passende personlig beskyttelse brukes, inkludert nitrilgummihansker, øyevern og laboratoriefrakk. Der det er mulig, håndteres i et LEV)avtrekkskap.
    8. Sentrifuge ved 8 100 x g i 15 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og overfør til et annet rør. Tilsett 500 μL iskald 70% etanol. Inverter røret flere ganger og sentrifuge ved 8 100 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    9. Fjern supernatanten og lufttørk pelleten ved romtemperatur. Når pelleten er tørr, suspenderes den igjen i 40 μL dietylpyrokarbonatbehandlet vann (DEPC-behandlet) og la den stå ved 4 °C over natten. Når den er fullstendig resuspendert, fjern 5 μL oppløsning og legg på en 1% agarosegel for å kontrollere tilstedeværelsen av DNA.
  3. Enkelt genprobe forberedelse av BACs via nick oversettelse
    1. Bruk kommersielt tilgjengelige merkesett for kalleoversettelser. Alternativt kan du bruke følgende protokoll. Se tabell 3 for bestanddeler og volum.
    2. Legg bestanddelene fra tabell 3 sammen i et mikrosentrifugerør og tilsett DNA-polymerasen I sist, bland forsiktig og sentrifuge kort i noen sekunder. Inkuber oppløsningen ved 15 °C i 2 timer.
    3. For å verifisere fragmentstørrelser, legg 5 μL av løsningen på en 2% agarosegel. DNA-fragmentets størrelsesområde bør være mellom 200-600 bp. Hvis DNA-fragmentstørrelsene er større, fortsett å inkubere oppløsningen i ytterligere 15 minutter ved 15 ° C og kjør produkter på 2% agarosegel.
    4. Stopp nick-translasjonsreaksjonen ved å tilsette 10 mM EDTA, 0,1 % SDS (2,5 μL 0,5 M EDTA, pH 8,0 i 100 μL og 1 μL 10 % SDS i 100 μL). Varm oppløsningen opp ved 65 °C i 5 minutter.
    5. For å fjerne ikke-inkorporerte nukleotider, bruk BAC-sonde på en spinnkolonne. Kommersielle spinnkolonner kan kjøpes, eller de kan opprettes ved hjelp av en sprøyte som følger:
    6. Tilsett 30 g Sephadex G-50 til 500 ml kolonnebuffer (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Autoklav blandingen. Lag også 500 ml kolonnebuffer (uten Sephadex G-50) og autoklav.
    7. Lag spinnkolonner ved å legge autoklavert glassull til bunnen av en 1 ml sprøyte. Fyll sprøyten på 1 ml med Sephadex G-50 i kolonnebuffer. Plasser sprøyten på 1 ml i et 15 ml sentrifugerør som har et mikrosentrifugerør uten lokk nederst. Sentrifuge ved 1 600 x g i 5 min.
    8. Fjern sprøyten og kast mikrosentrifugerøret nederst. Tilsett et nytt mikrosentrifugerør tilbake i 15 ml sentrifugerøret. Legg til kolonnebuffer (uten Sephadex G-50) til 1 ml sprøyten og sett den tilbake i 15 ml sentrifugerør. Sentrifuge ved 1 600 x g i 5 min. Gjenta dette trinnet igjen to ganger.
    9. Fjern sprøyten og sett den inn i et 15 ml sentrifugerør som inneholder et nytt rent mikrosentrifugerør. Påfør sonden på sprøyten og samle sonden i mikrosentrifugerøret.
    10. For å utfelle DNA-sonden, tilsett 5 μL sildespermiens DNA (10 mg / ml), 10 μL natriumacetat og 2,25 volum 100% etanol til DNA-oppløsningen. Bland oppløsningen forsiktig og inkuber ved -80 °C i minst 1 time. Sentrifuge ved 13 700 x g i 15 minutter ved 4 °C.
    11. Kast supernatanten og vask pelleten med 200 μl iskald 70 % etanol i 15 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og lufttørk. Når det er tørt, skal pelleten henges opp igjen i 20 mikroliter DEPC-behandlet vann ved romtemperatur i flere timer eller over natten ved 4 °C. Sonden er nå klar til bruk eller kan oppbevares ved -20 °C.
    12. For hvert lysbilde blandes 5 μL sonde DNA med 5 μL Cot-1 DNA og tørker med en Speed Vac vakuumkonsentrator. Når pelleten har tørket, suspenderes den igjen i 12 μL hybridiseringsblanding.

3. DNA Halo-forberedelse

  1. Fjern den firkantede kulturskålen som inneholder lysbildene og vedlagte celler fra inkubatoren. Kast medium, merk lysbilder med blyant og legg i en Coplin krukke inneholdende 50 ml iskaldt cytoskjelett (CSK) buffer: 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3 M sukrose, 10 mM 1, 4-piperazindietansulfonsyre (PIPES; pH 7,8), 0,5% (v / v) Triton X-100 består i avionisert vann. Inkuber i 15 minutter på is eller ved 4 °C.
    FORSIKTIG: Triton X-100 kan forårsake hudirritasjon og alvorlig øyeskade. Håndter bruk av egnet personlig verneutstyr, inkludert nitrilhansker, vernebriller og laboratoriefrakk.
  2. Kast CSK-bufferen og skyll lysbildene raskt i 50 ml 1x DNA-halobuffer (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO 4, 15 mM KH2PO 4; pH7.4) tre ganger, dvs. dypp skyv inn i Coplin krukke som inneholder DHB og fjern.
  3. Overfør lysbilder til en koplinkrukke inneholdende 50 ml ekstraksjonsbuffer: 2 M NaCl, 10 mM RØR (pH 6,8), 10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,1 % (w/v) digitonin, 0,05 mM (v/v) spermin, 0,125 mM (v/v) spermidin. Inkuber i 4 minutter ved romtemperatur.
    FORSIKTIG: Digitonin er giftig ved svelging eller kontakt med hud og er dødelig ved innånding. Sørg for at digitonin håndteres i et LEV-avtrekkskap og bruk laboratoriefrakk, nitrilhansker (doble hansker), vernebriller og maske. Både spermin og spermidin kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader, mens EDTA forårsaker alvorlig øyeirritasjon, så håndter hvert kjemikalie med forsiktighet.
    MERK: Klargjør digitonin separat ved å løse opp pulveret i vann ved en temperatur på 60-70 °C. Tilsett oppløst digitonin til ekstraksjonsbufferen når den er avkjølt. Tilsett spermin, spermidin og digitonin sist til ekstraksjonsbufferen for å bevare den biologiske aktiviteten.
  4. Inkuber lysbilder fortløpende i 50 ml 10x DHB (1,4 M NaCl, 270 mM KCl, 1,1 M NaHPO 4, 150 mM KH2PO4; PH7.4), 5x, 2x og 1x DHB i 1 min hver.
  5. Dypp glir (rett inn og rett ut) gjennom en 50 ml sekvensiell etanolserie på 10%, 30%, 70% og 95% (v / v) etanol.
  6. Lufttørk sklier og oppbevares ved -80 °C inntil todimensjonal fluorescens in situ hybridisering (2D FISH) utføres.

4. Todimensjonal fluorescens in situ hybridisering

  1. Lag 20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M tri-natriumcitrat, pH 7,0. Denne bufferen kan autoklaveres, lagres ved romtemperatur og fortynnes etter behov.
  2. Lag 70 % (v/v) formamid, 2x SSC pH 7,0 og varm opp til 70 °C i vannbad.
  3. Inkuber lysbilder, i 5 minutter hver, gjennom en sekvensiell 50 ml etanolserie på 70, 90 og 100% etanol.
  4. Lufttørk skliene på en varmeplate og stek i en ovn på 70 °C i 5 minutter.
  5. Denaturskler ved å plassere i 70% formamid, 2x SSC-løsningen i 2 min ved 70 °C.
    MERK: Temperaturen og timingen er avgjørende for trinn 4.5. Hvis temperaturen er DNA vil ikke denaturere og sondene vil ikke hybridisere, og det vil ikke bli oppnådd noe signal fra DNA halo FISH.
  6. Plasser den denaturerte lysbildet i 50 ml iskald 70% etanol i 5 minutter og ta gjennom en etanolserie på 90%, 95% og 100% ved romtemperatur i 5 minutter hver.
  7. Lufttørk på en varmeplate
  8. Håndter direkte merkede totale menneskelige kromosomprober i henhold til produsentens instruksjoner. For disse forsøkene brukte vi menneskelige hele kromosommaling 1, 13, 15, 17 og 18. I tillegg ble CCND1 og CTNNA1 genprober i dette forsøket brukt.
    MERK: Både hele kromosomprobene og BAC-genspesifikke prober ble merket med biotin-11-dUTP og oppdaget av streptavidin konjugert til Cyanine 3 (Cy3). For kromosommalingsprobene laget av (DOP-PCR) og BAC DNA merket ved nick-oversettelse, vil disse bli referert til som DNA-prober fra dette punktet fremover i protokollen og behandlet som følger.
  9. Denaturert DNA-sonde (helkromosommaling eller genspesifikk sonde) ved 75 °C i 10 minutter i en varmblokk eller vannbad.
  10. Varm DNA-sonde ved 37 °C i 30 minutter i en varmblokk eller vannbad før du pipetterer 10 μL på riktig lysbilde.
    MERK: Dette trinnet er viktig for å blokkere repeterende kromosomale sekvenser. Hvis det ikke utføres, kan uspesifikke signaler produseres i DNA Halo FISH.
  11. Overleggssonde med 21 mm x 21 mm dekkslip og tetning med gummisement.
  12. Inkuber lysbilder i minimum 18 timer ved 37 °C i et fuktet hybridiseringskammer.
    MERK: Fuktede hybridiseringskamre kan lages av sandwichbokser som inneholder flere lag fuktet vev og en hevet plattform konstruert av kuttede 10 ml plastpipetter for å hvile lysbildene på. Dette er dekket av aluminiumsfolie for å minimere eksponering for lys.
  13. Fjern gummisementet forsiktig med tang.
  14. Inkuber lysbilder i 50 ml 50% (v/v) formamid, 2x SSC, pH 7,0 oppløsning som er forvarmet til 45 °C i tre 5 min inkubasjoner.
    MERK: La dekselet falle bort fra lysbildet i den første inkubasjonen i 50% (v / v) formamid, 2x SSC, pH 7,0 løsning. Dette forhindrer skade på DNA Halo-preparatet som kan være forårsaket av å "dra" dekselet bort. Skliene kan røres i bufferen via grep med tang for å hjelpe til med å løsne dekselet.
  15. Deretter plasserer du sklier i 50 ml 0,1x SSC, pH 7,0-oppløsning som er forvarmet til 60 °C, men plassert i et vannbad på 45 °C. Inkuber i 5 min og erstatt bufferen to ganger med 5 min inkubasjoner.
  16. Plasser glidene i en Coplin krukke inneholdende 50 ml 4x SSC, pH 7,0 oppløsning ved romtemperatur og inkuber i 15 minutter med tre endringer av buffer.
  17. Påfør 100 μL 4% BSA, 4x SSC-løsning på hvert lysbilde og overlegg med et stykke parafinfilm. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Dette forhindrer uspesifikk binding av antistoffet.
  18. For å oppdage den merkede sonden (biotin-16-dUTP), inkuber med 100 μL av en 1:200 (laget i 1% BSA, 4x SSC) streptapavidin-Cy3 i 1 time ved romtemperatur.
    MERK: Følg produsentens instruksjoner med fortynning av antistoffer og test fortynning før eksperimentet for å sikre at et godt signal produseres
  19. Plasser lysbildene i en Coplin krukke inneholdende 50 ml 4x SSC (0,5% Tween-20) pH 7,0 løsning ved romtemperatur og inkuber i 15 min med tre endringer av buffer. Lysbilder kan monteres på dette trinnet som vist i trinn 4.21 hvis immunfluorescens ikke er nødvendig.
  20. Hvis den proliferative statusen til celler laget i DNA-haloer er nødvendig, flekk med anti-pKi67-antistoffer etter FISH-trinnene, før montering eller flekk for innlemmet BrdU.
    1. Vask lysbildene 3 ganger i 5 min hver i 50 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS), etterfulgt av blokkering med 4% NCS i PBS i 1 time ved romtemperatur.
    2. Påfør 200 μL av det nødvendige primære antistoffet (kanin anti-human pKi67; mus anti-BrdU) til lysbildet, overlegg med en stripe parafinfilm og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
    3. Vask lysbildene 3 ganger i 5 minutter i 1x PBS og inkuber ved romtemperatur i 1 time i 200 μL fluorokrom-konjugert sekundært antistoff (pKi67: svin anti-kanin TRITC; BrdU: esel anti-mus Cy3). Utfør ytterligere 3 5 min vask med PBS. Alle fortynninger skal foretas ved bruk av 1 % (v/v) NCS i PBS på produsentens utvalg av foreslåtte fortynninger.
  21. Monter lysbilder i 20 μL monteringsmiddel som inneholder DAPI og overlegg med et 22 mm x 50 mm deksel.

5. Telomere PNA FISK

  1. For å oppdage telomerer, bruk telomere PNA FISH-sett - FITC; Utfør prosedyren med produsentens instruksjoner. Prosedyren skal utføres ved romtemperatur, med mindre annet er angitt.
  2. Dypp lysbildene i tris-bufret saltvann (TBS, pH 7,5) i 2 minutter og legg deretter i 3,7% formaldehyd (i TBS; v / v) i nøyaktig 2 minutter.
    FORSIKTIG: TBS-oppløsning inneholder 10-30% trometamol og 10-30% 2-amino-2-(hydroksymetyl) propan-1,3-diolhydroklorid. Dette kan forårsake alvorlig øye- og hudirritasjon, så bruk vernehansker og vernebriller/ansiktsbeskyttelse. Bruk i et godt ventilert område.
  3. Vask lysbildene i en Coplin krukke to ganger med TBS i 5 min hver.
  4. Dypp lysbildene i forbehandlingsløsningen i 10 min og vask deretter to ganger med TBS i 5 min per vask.
  5. Ta deretter lysbildene gjennom en iskald etanolserie bestående av 50 ml 70%, 85% og 95% (v / v) etanol i 2 minutter per konsentrasjon. Etterpå la skliene lufttørke.
  6. Påfør 10 μL Telomere PNA Probe/FITC (eller Cy3), avhengig av valg av fluorescerende fargelegging, på hvert lysbilde og dekkoverlegg med et deksel. Inkuber i en forvarmet ovn sett ved 80 °C i 5 minutter og sett deretter i mørket i ca. 1 time.
    FORSIKTIG: Telomere PNA Probe / FITC inneholder 6-100% formamid, som forårsaker alvorlig øyeirritasjon og er teratogen og kan forårsake alvorlig skade på et ufødt barn. Hvis en kvinne er gravid eller mistenker at hun er gravid, bør de unngå å jobbe med formamid. Formamid skal brukes i en LEV avtrekkshette og egnet øye- eller ansiktsbeskyttelse.
  7. For å fjerne dekkslippene, senk lysbildene i 'Skylleoppløsning' i 1 min og legg deretter i 'Vaskeoppløsning' i 5 minutter ved 65 °C.
    FORSIKTIG: Vaskeoppløsning inneholder 1-5% polyoksyetylenoktyl fenyleter og 1-5% natriumklorid. Dette er etsende og kan forårsake alvorlig øyeskade. Sørg for at vernebriller eller ansiktsbeskyttelse brukes når du håndterer vaskeoppløsningen.
  8. Inkuber glidninger gjennom en 50 ml iskald etanolserie (70%, 85% og 95% (v / v)) i 2 minutter per konsentrasjon og deretter lufttørke. Når det er tørt, monter lysbilde med monteringsmiddel som inneholder DAPI og overlegg med deksel.

6. Bildefangst og analyse

  1. For å visualisere DNA-haloer og kromosomterritorier, bruk et epifluorescensmikroskop (f.eks. Leica DM4000-mikroskop) som tar bilder ved hjelp av et HC PL FLUOTAR 100X/1.30 oljemål og DFC365FX-kamera.
  2. Ta gråtonebilder og definer farger for hver kanal som er tatt, for å muliggjøre pseudokolorering av bilder. En kommersiell programvare ble brukt i dette eksperimentet (f.eks. LAS AF versjon 4.5.0-programvare). De enkelte fargekanalene ble eksportert som TIFF-er.
  3. Analyser bilder ved hjelp av Java bildebehandlingsprogram Fiji ImageJ. Last opp bilde ved å trykke på Fil og åpne.
  4. Last inn separate bildekanaler eller del et sammensatt bilde i separate gråtonekanaler ved å klikke på Bilde | Farge | Delte kanaler. Velg en bildekanal og klikk på Bilde | Juster og velg deretter Lysstyrke og kontrast. Endre tilsvarende og gjenta med andre kanaler.
  5. Lag en maske av den gjenværende kjernen ved å velge den DAPI-fargede kanalen som viser kjernen. Klikk på Bilde | Juster , og velg deretter Terskelverdi. En dialogboks vises der terskelen kan endres, merk av for Mørk bakgrunn . Endre til gjenværende kjerne er klar og trykk Bruk og lukk dialogboksen.
    MERK: Dette oppretter en binær maske basert på pikselintensiteten, med hvite piksler som viser interesseområder og svarte piksler som viser bakgrunn. Gjenta samme prosedyre på sondekanalen.
  6. Bruk frihåndsmarkeringen til å skissere periferien til den gjenværende kjernen, og klikk deretter på Rediger og Fjern utsiden. Legg sondekanalen over på restkjernen. Dette kan gjøres ved å trykke på Bilde| Farge | Slå sammen kanaler.
  7. Hvis du vil angi måleskalaen i ImageJ, tegner du en linje på skalalinjen eller mellom punktene med to kjente avstander. Gå til Analyser og trykk på Angi skala. Legg til avstandslengden i dialogboksen og klikk OK. Hvis du vil måle avstander, tegner du en linje mellom punktene som måles, og klikker på Analyser | Måle. Dette vil overføre avstandsverdiene til et datavindu.
  8. Mål den lyseste DAPI-intensiteten da dette sammenfaller med sentrum av kjernen. Fra dette måles avstanden fra det kjernefysiske senteret til den lengste kromosomterritoriekanten (CTE). Mål avstanden til atomsenteret til kjernekanten (NE).
  9. Sørg for at resultatene fremstilles som et CTE/NE-forhold. Her er avstanden fra kjernesenteret til hver lengste kromosomterritoriekant (CTE) delt på avstanden fra kjernesenteret til hver respektive kjernefysiske kant (NE). Dette bør utføres på minimum 50 kjerner. Dette kan fremstilles som et stolpe- eller boksdiagram.
  10. For analyse av telomerene, analyser minimum 30 kjerner per datasett. Bilder kan analyseres ved hjelp av Fiji ImageJ eller manuelt for å telle antall telomerer i den gjenværende kjernen og i DNA-haloen. BrdU eller pKi67 muliggjorde differensiering av prolifererende (BrdU/piK67+) og senescent/quiescent (BrdU/pKi67-) kjerner. Data kan være avbildet i stolpediagrammer med feilfelt som tilsvarer standardfeil for gjennomsnittet (SEM).
  11. Bruk elevens t-test (uparet) for å statistisk sammenligne resultatene med p> 0,05 anses som signifikant.

Representative Results

Denne metoden for DNA-halopreparasjon har hjulpet oss i våre bestrebelser på å bestemme forskjeller i genomoppførsel i unge og gamle celler, men også i celler avledet fra for tidlig aldringssykdommer med avvikende nukleoskeletale proteiner15. Figur 1 viser eksempler på DNA-haloer der det er mulig å se kanten av en gjenværende kjerne, DNA som er igjen i den gjenværende kjernen og det ikke-tilknyttede DNA som har spolt ut i det omkringliggende området og skaper en DNA-halo. Den viser også analysen som viser hvordan restkjernen er oppnådd og NØ- og CTE-målingene. Det er mulig å skille mellom prolifererende og ikke-prolifererende celler ved enten å inkorporere et merket nukleotid som BrdU når celler er i S-fase eller ved å bruke den diagnostiske proliferasjonsmarkøren anti-pKi67, som avslører nukleoler og regioner av heterokromatin i G1-celler17,18. Primærceller dyrket i høyt serum uten å oppnå konfluens, som er negative for proliferasjonsmarkørene, antas å være senescent. Primære celler dyrket i lavt serum eller har blitt konfluente, dvs. kontakthemmet som er negative for proliferasjonsmarkørene, anses som hvilende og vil kunne gå inn i den proliferative cellesyklusen gitt de riktige næringsstoffene og situasjonen. Å kunne skille mellom Ki67 positive og negative celler har gjort det mulig for oss å bestemme forskjeller mellom prolifererende, hvilende og senescent humane dermale fibroblaster. Figur 2 viser DNA-haloer av prolifererende humane dermale fibroblaster opprettet fra celler der BrdU ble inkorporert i dem under DNA-replikasjon, en mekanisme som ikke forekommer i ikke-prolifererende celler, og deretter farget med anti-BrdU-antistoff. Farging med den proliferative markøren anti-pKi67 antistoff er også synlig i figur 2. Dette er et robust antigen og overlever FISH-protokollen og kan derfor farges for post-FISH og pre-montering. Dermed er prolifererende celler positive (røde) for BrdU og anti-pKi67 (røde) i venstre kolonne og ikke-prolifererende celler, faktisk senescentceller i figur 2 vises i høyre kolonne. De grønne signalene er individuelle telomerer avslørt med et telomere PNA FISH / FITC-sett. Kombinering av immunfluorescens med DNA-haloer muliggjør analyse under forskjellige celletilstander, som vist i figur 2 ved undersøkelse av prolifererende, hvilende og senescentceller. Avhengig av hvilket antistoff som velges, kan andre forhold undersøkes, for eksempel differensiering, DNA-skade via bestråling etc.

Kromosomterritorier kan også visualiseres i DNA-haloer ved hjelp av FISH. På grunn av preparatet som tillater spoling av DNA ut av kjernene, kan kromosomets territoriumform forstyrres, med mindre eller større mengder av kromosomet funnet i DNA-haloen, avhengig av forankring av genomet inne i restkjernen og dens strukturer. Figur 3 viser et panel av DNA-haloer hvor individuelle kromosomer har blitt avslørt med spesifikke helarmskromosommalingsprober (rød) for kromosomene 1, 13, 17 og 18. Anti-pKi67 (grønn) har blitt brukt til å markere prolifererende celler og dets fravær i samme kultur, på samme lysbilde, som angir senescentceller. Det er veldig tydelig fra bildene og dataene som presenteres som CTE/NE at det lille genfattige kromosom 18 er et kromosom som har få fester og spoler lenger ut i DNA-haloen vekk fra restkjernene og er betydelig lenger fra sentrum av restkjernene enn de andre kromosomene. Dette gjelder imidlertid også for kromosom 1 også. Ved å bruke den proliferative markøren anti-pKi67 har det også vært mulig å sammenligne prolifererende med senescentceller, innenfor samme kultur og på samme lysbilde, og denne analysen har vist at kromosomer i disse to svært forskjellige cellestatusene ikke er signifikant forskjellige fra hverandre, med hensyn til vedlegg med de gjenværende kjernefysiske strukturene.

Interessant nok viser gener også statistisk signifikante forskjeller mellom prolifererende og senescent celler med hensyn til å forbli i en gjenværende kjerne eller være lokalisert i DNA Halo. Figur 4 viser dette med genloci avgrenset av merkede BAC-sonder i rødt og anti-Ki67 i grønt. Det er ingen signifikante forskjeller mellom genplasseringer i prolifererende versus senescentcellene, etter et DNA Halo-preparat. Imidlertid er det betydelig flere catenin alfa 1 CTNNA1 loci i DNA-haloen enn cyklin D1 CNDD1 loci, hvor det er svært få. Figur 5 viser DNA-halopreparater med telomerer i grønt. Bakgrunnen er bevisst høy for å gjøre det mulig å visualisere telomersignaler i DNA-haloen. I dette settet med datahvileceller, dvs. celler som har vært serumsultet i 7 dager, er inkludert, og interessant nok er det betydelig flere telomerer uten tilknytning og lokalisert i DNA-haloene i hvileceller enn for prolifererende og senescentceller. I figur 5a kan andelen telomerer i DNA-haloen observeres, spesielt for bildet 'Eksperiment 2'. Dette samsvarer med figur 5b hvor gjennomsnittlig prosentandel telomerer i DNA-halo er ca. 17 % i hvileceller. Det er noen bevis på at ikke alle telomerer i senescent celler kan sees som noen av dem kanskje veldig korte.

Denne metoden for DNA-halo har vært vellykket for oss å undersøke genominteraksjonsendringer i kjerner i syke celler15. Figur 6 viser forskjeller i kromosomfeste i primære kontrollfibroblaster og i syke celler med typisk (lamin A-mutasjon) og atypisk Hutchinson-Gilford Progeria syndrom, som uttrykker en annen SUN1-isoform og ingen lamin A-mutasjon19. Kromosomene 1 og 13 viser statistisk signifikante forskjeller i deres vedlegg innenfor de resterende kjernene sammenlignet med kontroll-DNA-haloer. Figur 6b korrelerer posisjonen til hele kromosomterritoriet til restkjernen og DNA Halo. Verdier på 1 eller mindre indikerer at kromosomet ligger i restkjernen og verdier over 1 viser kromosomer eller deler av kromosomer i DNA Halo.

Samlet sett fremhever dette nytten av HALO-FISH i å undersøke genomiske interaksjoner av hele kromosomer, spesifikke gener og telomerer under en rekke forhold som påvirker cellesyklusen (proliferasjon, ro og aldring) eller i sykdomsceller, for eksempel progeria og kreftcellelinjer. Faktisk innebærer forskjellene i interaksjoner mellom disse tilstandene at nukleoskeleton har en viktig rolle i å regulere nøkkelprosesser i kjernen.

Figure 1
Figur 1: HDF ekstrahert kjerne som viser restkjernen og DNA-haloen og oversikt over analysemetode. (a) En HDF-kjerne fremstilt via DNA-haloanalyse og motfarget med DAPI. Den fargerike restkjernen viser DNA forankret til nukleoskjelettet, og dette er omgitt av det ikke-festede DNA som danner en halo av DNA. Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. (b) Den blå kanalen fanger den DAPI-fargede kjernen og omkringliggende DNA. Restkjernen velges og fjernes ved hjelp av ImageJ. Pilen viser avstanden fra atomsenteret til den gjenværende kjernefysiske kanten (NE). (c) Den røde kanalen viser sondesignalet. (d) Bildet som er angitt "Resultat" er resultatet av å legge den røde kanalen over det blå kanalbildet; Dette tillater avstanden fra atomsenteret til den lengste kromosomterritoriekanten (CTE). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: DNA-halopreparat med telomer-PNA-FISK på prolifererende og senescerende HDF. Telomere PNA FISH på HDF utsatt for DNA-haloanalyse. Telomersignaler visualiseres i grønt (FITC), rest- og halo-DNA ble motfarget ved hjelp av DAPI (blå) og prolifererende kjerner ble detektert ved bruk av enten anti-BrdU eller anti-pKi67 antistoffer via indirekte immunfluorescens i rødt (TRITC). Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 3
Figur 3: Nukleoskeleton-kromosominteraksjoner og analyse ved hjelp av DNA-haloanalyse. (a) 2D-FISH med sonder spesifikke for kromosomene 1, 13, 15, 17 og 18 ble utført på HDFer utsatt for DNA-halopreparering. Hele kromosomer ble malt i rødt (Cy3) og kjerner ble undersøkt med pKi67 for å avgjøre om de spredte seg eller senescent. Prolifererende celler (pKi67+) ble avgrenset i grønt (FITC), mens senescentceller forble ufarget (pKi67-), det vil si at det ikke ble oppdaget noe grønt signal. Forstørrelse = x 100; skalastang 10 μm. (b) Kromosomforankring ved nukleoskelet i prolifererende og senescent HDFer som hadde gjennomgått HALO-FISH. Målinger viser forholdet mellom lengst kromosomterritoriumkant (CTE) og respektive nukleær kant (NE) for kromosomer 1, 13, 15, 17 og 18 i prolifererende (pKi67+) og senescent (pKi67-) celler. Feilfelt representerer ± SEM. (c) Modifisert boksplottrepresentasjon av kromosomterritoriekant (CTE) til respektive nukleær kant (NE) av spesifikke kromosomer i pKi67+ og pKi67- kjerner. Q1 = lavere kvartil; Min = laveste verdi registrert; Med = median; Maks = maksimal verdi registrert; Q3 = øvre kvartil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 4
Figur 4: Genspesifikke interaksjoner i HDF ved bruk av HALO-FISH. (a) DNA halo ekstraherte kjerner ble undersøkt med genspesifikke prober (CCND1 og CTNNA1) for å undersøke deres forankring til NM på prolifererende og senescent celler. Gensignalene er vist i rødt (Cy3) og anti-pKi67 viser prolifererende celler og signalet visualiseres i grønt (FITC). For det prolifererende CCND1-bildet er den gjenværende kjernen innelukket i den hvite sirkelen, og mellomrommet mellom den hvite og grønne sirkelen viser DNA Halo. Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. (b) Genspesifikke signaler for CCND1 og CTNNA1 sammenlignes mellom gjenværende kjerne og DNA-halo, og også mellom prolifererende og senescentceller. Feilfelt representerer ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 5
Figur 5: DNA-haloanalyse på hvilende HDFer undersøkt med telomer PNA-FISH. (a) Stillhet av HDF ble indusert av dyrkning i lavt serummedium i 7 dager. DNA-haloanalysen ble utført, og PNA-FISH muliggjorde visualisering av telomerer ved FITC-signal (grønn) og gjenværende kjerne og omkringliggende DNA-halo ble motfarget med DAPI (blå). Celler ble også farget med anti-pKi67 antistoff for å sikre at kjerner ikke spredte. Dette ble gjentatt ved to separate anledninger. Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. (b) Sammenligning av gjennomsnittlig prosentandel telomerer lokalisert i DNA-haloen i prolifererende, senescent og hvilende HDF-celler. Feilfelt representerer ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Undersøkelse av helkromosomforankring til nukleoskjelettet i HGPS-celler med HALO-FISH26. (a) Kontroll HDF (2DD), klassisk HGPS (AG06297) og atypiske type 2 HGPS (AG08466) kjerner gjennomgikk DNA halo forberedelse og deretter 2D-FISH ved hjelp av hele kromosommaling for kromosom 1, 13, 15 og 17. Hele kromosomer er avbildet i grønt (FITC) og DNA ble motfarget med DAPI (blå). Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. (b) Plassering av kromosomer i ekstraherte kjerner ble bestemt ved å måle forholdet mellom gjennomsnittlig kromosomterritoriumkant (CTE) og kjernekanten (NE). Et forhold over 1 viser at den lengste CTE ligger utenfor den tilsvarende NE i DNA-haloen, mens et forhold under 1 betyr at den lengste CTE ligger innenfor NE i restkjernen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Bestanddeler Volum(μL)
5XDOP-PCRbuffer 10
dNTPmix(withoutdTTP)(2mM) 5
dTTP(2mM) 2
Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP 10
DOPprimer (20μM) 5
TaqDNAPolymerase(1U/μL) 1
PCRgradewater 12
Mal 5

Tabell 1: Tabell som viser DOP-PCR-komponentene og volumene for en 1x-reaksjon

Skritt Sykluser Temp (grad Celsius) Tid
Innledende denaturering 1 95 3 min
Denaturering 34 98 20 s
Primer glødning 62 1 min
Forlengelse 72 30 s
Endelig forlengelse 1 72 5 min
Kjøling 4 Holde

Tabell 2: Tabell som viser DOP-PCR-syklusen, temperatur og tidsprofil.

Konstituerende Volum(μL)
10x NT-buffer (0,5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA) 5
0,1 M beta-merkaptoetanol 5
10X nukleotidlager (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotin-16-dUTP) 5
Dnase I (1 ng/ml) 2
DNApolymerase I 5U per μg DNA
DNAmal (1 μg) 1
DEPC-behandlet vann Til 50 μL

Tabell 3: Tabell som viser nick-oversettelseskomponentene og -volumene for en sonde.

Discussion

DNA-halo-metoden er en utmerket metode for valg når man analyserer interaksjoner mellom nukleoskeleton og genom, men det er noen kritiske trinn som også må overholdes. En av de viktigste parametrene er optimalisering av cellesåingstettheten. Hvis celler blir overflytende, vil DNA-haloene overlappe med naboceller, noe som gjør det umulig å utføre analysen. CSK og ekstraksjonsbufferne må alltid gjøres ferske på bruksdagen med spermin, spermidin og digitonin tilsatt ekstraksjonsbufferen ved slutten av preparatprosessen for å opprettholde sin biologiske aktivitet. Hvis du utfører Halo-FISH, er det ekstremt viktig å bruke riktig denatureringstemperatur på DNA-haloene slik at sonden eller malingen deretter kan hybridisere.

Elektronmikroskopi har blitt brukt til å visualisere den nukleære matrisen, med trådformede strukturer som blir identifisert20. Imidlertid er elektronmikroskopi begrenset da matriseforeninger med kromatin ikke lett kan utledes. Faktisk er DNA Halo-metoden mer allsidig sammenlignet med elektronmikroskopi, da spesifikke gener, kromosomer og celletilstander alle kan undersøkes. Videre studeres proteomisk analyse av nukleære matriksproteiner21,22. Denne metoden er god for å sammenligne kjernefysiske matrisekomponenter, spesielt når man sammenligner syke celler, men den gir ikke den romlige fordelingen og vedleggene som er fremhevet av standard DNA Halo-teknikken.

DNA Halo-analyser har begrensninger. For det første, ettersom matrisen ekstraheres, kan dette bare utføres på faste celler, slik at levende avbildning ikke er mulig. Selv om DNA Halo-metoden er relativt rask og enkel å utføre, kan den totale prosessen være tidkrevende når cellekultur, sondegenerering, Halo-FISH og analyse tas i betraktning.

Bildeopptak av DNA, haloer og HALO-FISH ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi vil forbedre oppløsningen av DNA-spesifikke prober og antistoffer. I tillegg, da fluorokromer lettere kan løses spektralt, kan det være mulig å bruke en rekke DNA-prober i et enkelt eksperiment, noe som gir enda mer informasjon. Forbedringer i molekylærbiologiske teknikker som kromosomkonformasjonsfangst (3C) har blitt brukt til å bestemme interaksjoner av genloci og analysere den romlige organisasjonen på kromatin i cellen. DNA Halo-analyser og 3C kan kombineres, et begrep kjent som M3C23, som igjen demonstrerer tilpasningsevnen til DNA Halo-teknikken.

De opprinnelige dataene som presenteres her er for å demonstrere mulighetene for genomadferd, forhør og hvordan man presenterer disse dataene. Med disse dataene har vi vist at det er mulig å bestemme signifikante forskjeller i genomtilknytning ved hjelp av (1) kromosommalingsprober, i denne studien som viser at kromosom 18 er det minst festede kromosomet av de analyserte (figur 3); (2) Genloci med signifikante forskjeller mellom to genloci og (figur 4) (3) telomerer, som er mindre sterkt festet i hvileceller sammenlignet med prolifererende og senescent celler (figur 5). Vi er i stand til å skille mellom prolifererende og ikke-prolifererende celler via tilstedeværelsen av proliferasjonsmarkøren Ki67-antigenet, som er et uoppløselig protein, så forblir med de resterende kjernene eller ved å bruke inkorporering av nukleotider for å markere celler som har vært gjennom S-fase innenfor en bestemt tidsperiode (figur 2). Denne teknikken har også gjort det mulig for oss å analysere genomoppførsel i celler som er kompromittert i deres nukleoskeletoner, dvs. laminopaticeller, og her og i Bikkul et al., 2018 avslører vi at genomet kan være mindre tett festet sammenlignet med kontrollceller og kan gjenopprettes ved behandling med spesifikke legemidler som forbedrer effekten av lamin A-mutasjonen i klassiske HGPS-celler15. Vi viser imidlertid nye data her for de atypiske HGPS AGO8466-cellene, som mangler en lamin A-mutasjon, men som inneholder en uvanlig form av LINC-kompleksproteinet SUN1 19 som kromosom13 er mindre tett festet i (figur 6).

HALO-FISH er en unik metode som gjør det mulig å studere genomiske interaksjoner med nukleoskjelettet i kombinasjon med indirekte immunfluorescens for å løse proteiner som ikke er fjernet fra ekstraksjonsprosedyren. Det er vist at nukleoskjelettet er modifisert ved ulike sykdommer som visse krefttyper19 og betydningen av noen nukleoskeletonassosierte proteiner som diagnostiske biomarkører24,25. Dermed har denne teknikken en viktig rolle i å undersøke effekten av nukleoskeleton på kromatinorganisering / disorganisering i sykdom 15,24,25,27 og er ikke begrenset til humane celler, med kromosomale malingsprober fra andre dyr, kan den samme DNA-halo-protokollen brukes 28.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke professor Michael Bittner for den vennlige gaven av kromosomarmmalingssonder. LG ble støttet av EU-finansierte EURO-Laminopathies prosjektet og Brunel Progeria Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS Thermo Fisher Scientific 10388739 Used to create DNA halos
5-bromo-2′-deoxy-uridine   Sigma-Aldrich B5002-100MG Labelled nucleotide
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG Labelled nucleotide
Agar Technical Thermo Fisher Scientific 15562141 DNA isolation of BAC clones
Agarose Sigma-Aldrich A939-50G Check product size of DOP-PCR and nick translation
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) Coriell Institute AG08466 Cell line
Bacto tryptone Thermo Fisher Scientific 16269751 DNA isolation of BAC clones
Biotin-16-dUTP Roche Diagnostics  11093711103 Labelled nucleotides
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-25G DNA isolation of BAC clones
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)  Coriell Institute AG0297 Cell line
Coplin jar Thermo Fisher Scientific 12608596 Holds 5 slides or 8 slides back to back
Cot-1 DNA Thermo Fisher Scientific 15279011 Block nonspecific hybridization in HALO FISH
DEPC-treated water Sigma-Aldrich 693520-1L DNA isolation of BAC clones
Dextran sulphate Sigma-Aldrich S4030 Hybridisation mixture
Digitonin Sigma-Aldrich D141 Component of extraction buffer
Digoxigenin-11-dUTP  Sigma-Aldrich 11093088910 Labelled nucleotides
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson Laboratory 715-165-150 Secondary antibody
EDTA Sigma-Aldrich E6758 Component of extraction buffer
Ethanol Component of extraction buffer
Ethanol Sigma-Aldrich 443611 Probe precipitation and HALO FISH
Fetal bovine system Thermo Fisher Scientific 26140079 Cell culture serum
Formamide Thermo Fisher Scientific 10523525 2D FISH of DNA halos
Glass wool Sigma-Aldrich 18421 Spin column
Herring sperm Sigma-Aldrich D7290 Probe precipitation
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) OSRAM HXP-R120W45C VIS Image capture of DNA halos
Hydrochloric acid Thermo Fisher Scientific 10313680 Cleaning microscope slides
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML DNA isolation of BAC clones
KAPA HiFi PCR Kit KAPA Biosystems KK2103 PCR Kit
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. Leica Microsystems Image capture of DNA halos
Luria-Bertani agar  Thermo Fisher Scientific 13274843 DNA isolation of BAC clones
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266 Component of CSK buffer
Methanol Thermo Fisher Scientific 10284580 Cleaning and sterilizing microscope slides
Mouse anti-BrdU antibody BD Pharmingen B2531-100UL BrdU visualisation
Newborn calf serum Thermo Fisher Scientific 16010159 Cell culture serum and blocking reagent
Nick translation kit Invitrogen
PCR grade water Sigma-Aldrich 693520-1L PCR and DNA isolation of BAC clones
PCR Primers Sigma-Aldrich
PIPES Sigma-Aldrich P1851 Component of CSK and extraction buffers
Potassium acetate Sigma-Aldrich P1190-100G DNA isolation of BAC clones
QuadriPERM® 4 X 12 SARSTEDT 94.6077.307 Square cell culture dish, polysterene with four compartments.  This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.
Rabbit Anti-Ki67 antibody Sigma-Aldrich ZRB1007-25UL Proliferation marker
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 DNA isolation of BAC clones
Rubber cement Halford's 101836 2D FISH of DNA halos
Sephadex G-50 Sigma-Aldrich S6022-25G Spin column
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Probe precipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Component of CSK, extraction and SSC buffers
Sodium citrate Sigma-Aldrich C8532 Component of SSC buffer
Sodium dodecyl sulphate  L3771-100G DNA isolation of BAC clones
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G DNA isolation of BAC clones
Spermidine Sigma-Aldrich S2626 Component of extraction buffer
Spermine Sigma-Aldrich S4264 Component of extraction buffer
Streptavidin-Cy3  Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies pa43001 Probe antibody
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Component of CSK buffer
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 CSK buffer+A66:D68
SuperFrost™ microscope slides Thermo Fisher Scientific 12372098 Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.
Swine anti-rabbit TRITC  Dako
TELO-PNA FISH KIT Agilent Dako K532511-8 Delineation of telomeres
Tris-HCl Sigma-Aldrich T3253-100G Column buffer
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T9284 Component of CSK buffer
Tryptone Thermo Fisher Scientific 10158962 DNA isolation of BAC clones
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416- 100ML Detergent
Vectashield mountant containing DAPI Vector Laboratories H-1200 2D FISH of DNA halos
Whole human chromosome probes Calbiochem 2D FISH of DNA halos
Yeast extract Thermo Fisher Scientific 10108202 DNA isolation of BAC clones

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berezney, R., Coffey, D. S. Identification of a nuclear protein matrix. Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).
  2. Haaf, T., Ward, D. C. High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes. Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).
  3. Parra, I., Windle, B. High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization. Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).
  4. Senger, G., et al. Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization. Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).
  5. Florijn, R. J., et al. High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes. Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).
  6. Elcock, L. S., Bridger, J. M. Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres. Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).
  7. Heiskanen, M., et al. Visual mapping by fiber-FISH. Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).
  8. Bensimon, A., et al. Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface. Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).
  9. Michalet, X., et al. Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies. Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).
  10. Wilson, R. H., Coverley, D. Relationship between DNA replication and the nuclear matrix. Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).
  11. Wilson, R. H. C., Coverley, D. Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos. Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).
  12. Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).
  13. Tandara, M., et al. Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF. Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).
  14. Repping, S., et al. The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number. Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).
  15. Bikkul, M. U., et al. Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts. Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).
  16. Telenius, H., et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).
  17. Bridger, J. M., et al. Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells. Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).
  18. Sales Gil, R., Vagnarelli, P. Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).
  19. Bikkul, M. U., et al. Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform. Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).
  20. Jackson, D. A., Cook, P. R. Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat. EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).
  21. Albrethsen, J., et al. Unravelling the nuclear matrix proteome. Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).
  22. Mika, S., Rost, B. NMPdb: Database of nuclear matrix proteins. Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).
  23. Gavrilov, A. A., et al. of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).
  24. Sjakste, N., et al. Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis. Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).
  25. Leman, E. S., Getzenberg, R. H. Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).
  26. Volpi, E. V., Bridger, J. M. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).
  27. Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. Human Interphase Chromosomes. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).
  28. Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues. BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 169 DNA halo forberedelse kjernefysisk matrise nukleoskeleton genom organisasjon DNA-sløyfer kromosomterritorier utvidede kromatinfibre matrise vedlegg regioner telomerer

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. The Authors section was updated from:

Lauren S. Godwin1
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

to:

Lauren S. Godwin1
Emily Roberts2
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

Fluorescens in situ hybridisering på DNA Halo-preparater for å avsløre hele kromosomer, telomerer og genloci
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, … More

Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, J. M., Foster, H. A. Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. J. Vis. Exp. (169), e62017, doi:10.3791/62017 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter