Summary
Vi beskriver ett protokoll för kemisk konjugation av modellen antigen ovalbumin till en endocytosis receptor-specifika antikropp för in vivo dendritic cell inriktning. Protokollet omfattar rening av antikroppen, kemisk konjugation av antigenet samt rening av konjugat och verifiering av effektiv konjugation.
Abstract
Riktad antigen leverans till kors-presentera dendritiska celler (DC) in vivo inducerar effektivt T effector cell svar och visar ett värdefullt tillvägagångssätt i vaccin design. Antigen levereras till DC via antikroppar som är specifika för endocytosreceptorer som DEC-205 som inducerar upptag, bearbetning och MHC klass I- och II-presentation.
Effektiv och tillförlitlig konjugation av önskat antigen till en lämplig antikropp är ett kritiskt steg i DC-inriktning och beror bland annat på antigenets format. Kemisk konjugation av protein i full längd till renade antikroppar är en möjlig strategi. Tidigare har vi framgångsrikt etablerat korslänkning av modellen antigen ovalbumin (OVA) och en DEC-205-specifik IgG2a antikropp (αDEC-205) för in vivo DC inriktning studier på möss. Det första steget i protokollet är rening av antikroppen från supernatanten av NLDC (icke-lymfoida dendritiska celler)-145 hybridom genom affinitetskromatografi. Den renade antikroppen aktiveras för kemisk konjugation av sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidometyl] cyklohexan-1-karboxoxylat) samtidigt som sulfhydrylgrupperna i OVA-proteinet exponeras genom inkubation med TCEP-HCl (tris (2-karboxytyl) fosfinhydroklorid). Överskott av TCEP-HCl och sulfo-SMCC avlägsnas och antigenet blandas med den aktiverade antikroppen för koppling över natten. Den resulterande konjugatet αDEC-205/OVA är koncentrerad och befriad från obundet OVA. Framgångsrik konjugation av OVA till αDEC-205 verifieras av western blot analys och enzym-linked immunosorbent assay (ELISA).
Vi har framgångsrikt använt kemiskt tvärbundna αDEC-205/OVA för att inducera cytotoxiska T-cellssvar i levern och för att jämföra olika adjuvanser för deras potential att inducera humoral och cellulär immunitet efter in vivo-inriktning på DEC-205+ DC. Utöver detta erbjuder sådana kemiskt kopplade antikropps-/antigenkonjugater värdefulla verktyg för effektiv induktion av vaccinsvar på tumörantigener och har visat sig vara överlägsna klassiska immuniseringsmetoder när det gäller förebyggande och behandling av olika typer av tumörer.
Introduction
Dendritiska celler (DC) är centrala aktörer i immunsystemet. De är en mångsidig grupp celler specialiserade på antigenpresentation och deras huvudsakliga funktion är att överbrygga medfödd och adaptiv immunitet1,2. Viktigt är att DC inte bara spelar en viktig roll i effektiva och specifika patogenstyrda svar utan också är involverade i många aspekter av antitumörimmunitet1,3.
På grund av deras exklusiva roll i värdimmunitet kom DC i fokus som målceller för vaccination4. Ett tillvägagångssätt är att rikta antigener till DC in vivo för att inducera antigenspecifika immunsvar och under de senaste åren har ett stort antal studier ägnats åt att definiera lämpliga receptorer och inriktningsstrategier1,4. Ett exempel är C-typ lektinreceptorn DEC-205, som kan riktas mot DEC-205-specifika antikroppar för att inducera endocytos. Viktigt är att DEC-205-inriktning i kombination med lämpliga adjuvanser har visat sig effektivt inducera långlivade och skyddande CD4+ och CD8+ T-celler, liksom antikroppssvar, även mot tumörantigener3,5,6,7,8,9.
Det finns ett antal studier som visar att konjugerade antigener riktade till DC är överlägsna fria icke-konjugerade antigen3,5,10,11,12. Detta gör konjugationen av antigenet till respektive DC-inriktning moiety ett centralt steg i DC-inriktningsmetoder. När det gäller dc-inriktning via antikroppar eller antikroppsfragment kan antigener vara antingen kemiskt eller genetiskt kopplade och endera strategin ger sina egna (dis)fördelar1. Å ena sidan finns det i genetiskt konstruerade antikropps-antigenkonstruktioner en kontroll över antigendosen samt den plats som ger överlägsen jämförbarhet mellan del1. Samtidigt behöver dock kemisk konjugation mindre förberedelse och ger större flexibilitet, särskilt när man försöker testa och jämföra olika antigener och/eller vaccinationsstrategier i experimentella och prekliniska modeller.
Här presenterar vi ett protokoll för effektiv och tillförlitlig kemisk konjugation av ovalbumin (OVA) som modellproteinantigen till en DEC-205-specifik IgG2a-antikropp (αDEC-205) lämplig för in vivo DC-inriktning hos möss. Först renas αDEC-205 från NLDC-145 hybridomceller13. För kemisk konjugation används heterobifunctional tvärlänk sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), som innehåller NHS (N-hydroxysuccinimide) ester- och maleimidegrupper, vilket möjliggör kovalent konjugation av amine- och sulfhydrylinnehållande molekyler. Specifikt reagerar de primära aminer av antikroppen initialt med sulfo-SMCC och den resulterande maleimidaktiverade αDEC-205 reagerar sedan med det sulfhydrylinnehållande OVA-proteinet reducerat genom TCEP-HCl (Tris(2-karboxytyl) fosfinhydroklorid). Slutprodukten är kemiskt konjugerad αDEC-205/OVA(figur 1). Utöver kemisk konjugation i sig beskriver vårt protokoll avlägsnande av överskott av OVA från konjugat samt verifiering av framgångsrik konjugation genom western blot analys och en specifik enzym-linked immunosorbent analys. Vi har framgångsrikt använt detta tillvägagångssätt tidigare för att kemiskt konjugera OVA och andra proteiner eller immunogenic peptider till αDEC-205. Vi visar effektiv bindning till CD11c+ celler in vitro samt effektiv induktion av cellulär och humoral immunitet in vivo.
Visst finns det nackdelar med denna metod som i parti-till-parti jämförbarhet och i den exakta doseringen av antigenet inom den slutliga konjugaten. Icke desto mindre ger kemisk konjugation experimentell flexibilitet i valet av antikropp och proteinantigen jämfört med genetiskt konstruerade konstruktioner. Därför anser vi att detta tillvägagångssätt är särskilt värdefullt vid utvärdering av olika antigener för deras effektivitet i DC-inriktning i prekliniska musmodeller, viktigt även i samband med specifika antitumör immunsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna djurförsök godkändes av den lokala myndigheten (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; filnummer 33.12-42502-04-10/0108) och utfördes i enlighet med nationella och institutionella riktlinjer.
1. Produktion av αDEC-205 från hybridom cellinjen NLDC-145
- För antikroppsproduktion, tina kryopreserverade NLDC-145-celler som producerar αDEC-205 vid 37 °C i ett vattenbad. Expandera cellerna vid 37 °C och 5% CO2. Två 75 cm2 flaskor kommer att behövas för att gå vidare till antikroppsproduktion. Cellodlingsprocedurer bör utföras i ett säkerhetsskåp för att säkerställa säkra arbetsförhållanden och förhindra förorening av kulturerna.
- Återsuspend 1 mL tinade celler (1 x 106 - 5 x 106 celler/ml) i 9 ml ISF-1 medium kompletterat med 1% penicillin/streptomycin (förvärmd till 37 °C) till en cellodlingskolv (25 cm2). Placera kolven horisontellt i en cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5% CO2.
- Odla cellerna vid 37 °C och 5% CO2, tills 70% sammanflöde. Detta bör normalt uppnås efter 24- 48 h.
- När cellerna är 70% sammanflöde, överför den kompletta NLDC-145 cell suspensionen (10 mL) till ett 15 ml koniskt centrifugrör med hjälp av en pipettregulator med en pipett i ett volymområde från 1-10 ml. Pellet cellerna genom centrifugering vid 250 x g i 10 min vid rumstemperatur.
- Förvarmt ISF-1 medium till 37 °C i ett vattenbad och återanvänd pelleten i 12 ml ISF-1 medium kompletterat med 1% penicillin/streptomycin. Överför den återanvända cellfjädringen till en färsk cellodlingskolv (75 cm2).
- Odla och expandera cellerna i ISF-1 medium kompletterat med 1% penicillin/streptomycin vid 37 °C och 5% CO2, tills 70% sammanflöde och 99% livskraftig. Detta bör normalt uppnås efter 48- 72 h.
- Dela cellerna i två 75 cm2 flaskor. För att göra detta först spola cellodlingkolven botten / odlingsytan med cellfjädringen för att ta bort alla NLDC-145 celler från ytan. Överför 6 ml NLDC-145 cell suspension vardera till en av två färska 75 cm2 flaskor och tillsätt förvärmt ISF-1 medium kompletterat med 1% penicillin/ streptomycin upp till 12 ml.
OBS: Förnya inte cellodlingsmediet eftersom NLDC-145-cellerna har konditionerat mediet. Överför cellerna tillsammans med deras medium och fyll kulturen upp till önskad volym med färskt medium. Detta är avgörande för livskraften och maximal antikroppsproduktion av NLDC-145-cellerna. - Expandera cellkulturerna vid 37 °C och 5% CO2, tills ca 70% sammanflöde som vanligtvis uppnås efter 48 - 72 h.
- När cellerna är 70% sammanflöde, överför 10 ml av den expanderade NLDC-145 cell suspensionen från var och en av de 75 cm2 flaskorna till en PETG (polyeten terephthalate glykol) rullflaska (1 050 cm2). Spola för detta cellodlingskolvens botten/odlingsyta med cellfjädringen för att avlägsna alla celler från ytan med hjälp av en pipettregulator och 10 ml pipett.
- Tillsätt 140 ml ISF-1-medium kompletterat med 1% penicillin/streptomycin (förvärmt till 37 °C) direkt ur mellanflaskan till var och en av NLDC-145 som innehåller rullflaskor som fyller dem upp till 150 ml-märket.
OBS: Se anmärkning i steg 1.1.6. - Odla rullflaskorna vid 37 °C, 5% CO2 och 25 rundor/min i tre dagar.
- Tillsätt 150 ml ISF-1 medium kompletterat med 1% penicillin/streptomycin (förvärmt till 37 °C) till var och en av NLDC-145 innehållande rullflaskor som fyller dem upp till 300 ml-märket.
- Odla rullflaskorna som nu innehåller 300 ml-odling vardera vid 37 °C, 5% CO2 och 25 rundor/min i ytterligare tre dagar.
- Tillsätt ytterligare 100 ml ISF-1 medium kompletterat med 1% penicillin/streptomycin (förvärmt till 37 °C) till var och en av NLDC-145 som innehåller rullflaskor och fyll dem därmed upp till 400 ml-märket.
- Odla rullflaskorna som nu innehåller 400 ml-kultur vardera vid 37 °C, 5% CO2 och 25 rundor/min i ytterligare sju dagar.
OBS: Under denna vecka blir kulturen mycket tät (upp till 95% densitet) och livskraften minskar (ner till så lite som 50%), vilket möjliggör maximal antikroppsfrisättning.
- För rening av αDEC-205 från odlingsfanten häll NLDC-145 cellfjädringen (från båda rullflaskorna) direkt till 500 ml autoklaverade centrifugeringsflaskor.
OBS: En total volym på 800 ml kultur bör samlas in.- Centrifugera kulturen i 30 min vid 8 600 x g och 4 °C för att avlägsna celler och skräp.
- Samla supernatanterna, kassera pelletsen och slå samman supernatanterna i en steril reagensflaska.
OBS: Rening av αDEC-205 kan påbörjas omedelbart (steg 2.) eller supernatanten kan lagras kortvarigt vid 4 °C.
2. Rening av antikroppen αDEC-205 från NLDC-145-cells supernatanten
OBS: Från NLDC-145-cells supernatanten renas αDEC-205 med hjälp av en protein G Sepharose-kolonn (återanvändbar). Kolonnmåtten är 15 mm x 74 mm och 5 ml protein G Sepharose packas per kolumn.
- För beredning och tvättning av proteinet G Sepharose kolonn, sätt en lufttät gummiplugg på den övre öppningen av proteinet G Sepharose kolonn. Punktera gummipluggen med två sterila kanyler (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
- Anslut en 10 ml-spruta till en av de två kanylarna och ett flexibelt silikonrör (ca 100 cm långt, 2,5 - 3 mm i diameter) med en slangkontakt till den andra kanylen.
OBS: Sprut-/gummipluggskonstruktionen är återanvändbar och ger ett vakuum som resulterar i ett kontinuerligt flöde av den stora volymen av odlingsfant till proteinet G Sepharose-kolonnen. Dra därför tillbaka sprutans kolv något för att säkerställa kontinuerligt vätskeflöde i följande steg. - Tvätta kolonnen med 50 ml 0,1 M ättiksyra (pH 2) för att avlägsna potentiellt återstående antikroppar från tidigare antikroppsrening. Lägg änden av silikonröret i den 0,1 M isglans ättiksyra (pH 2) fyllda reagensflaskan. Som ett resultat av det inducerade vakuumet löper 50 ml av 0,1 M glacial ättiksyra (pH 2) droppvis genom proteinet G Sepharose kolonn.
OBS: 0,1 M ättiksyra (pH 2) ska förvaras i en reagensflaska eller fyllas i en bägare. - Tvätta kolonnen med 100-200 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Lägg änden av silikonröret i en PBS-fylld reagensflaska eller bägare. Låt 100-200 mL PBS köra dropwise genom proteinet G Sepharose kolonn.
- Anslut en 10 ml-spruta till en av de två kanylarna och ett flexibelt silikonrör (ca 100 cm långt, 2,5 - 3 mm i diameter) med en slangkontakt till den andra kanylen.
- För antikroppsrening från NLDC-145-supernatanten, belastning 800 ml NLDC-145 supernatant (erhållen från steg 1.2.2.) på kolonnen. Lägg änden av silikonröret i NLDC-145 supernatant fylld reagensflaska. Låt 800 mL NLDC-145 supernatant köra dropwise genom kolumnen.
- Tvätta kolonnen med 500 ml PBS. Lägg änden av silikonröret i en PBS-fylld reagensflaska eller bägare. Låt 500 ml PBS köras dropwise genom kolumnen.
- För elution, använd 20 1,5 mL rör och pipett 100 μL av 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) i varje 1,5 ml rör. Ta bort gummipluggen från kolonnen och pipetten 1 ml 0,1 M glycin (pH 3) till den övre kammaren i proteinet G Sepharose-kolonnen för att elute antikroppen från kolonnen. Samla upp genomströmningen direkt som eluat i ett av de beredda 1,5 ml-rören.
- Upprepa elutionssteget (2.2.2.) för alla 20 rör (1,5 ml).
- Bestäm den optiska densiteten hos alla elutionsfraktioner vid 280 nm (OD280)med hjälp av en spektrofotometer för att identifiera de antikroppsinnehållande fraktionerna.
OBS: Använd den första elutionsfraktionen som tom. - Poola alla fraktioner med en OD280 större än 0,5 (cirka 10 bråktal).
- Förvara proteinet G Sepharose kolonn fylld med 20% etanol vid 4 °C.
- Dialyze de poolade elutionerna mot 1000 mL PBS (i en 2000 mL bägare) vid 4 °C över natten med dialysrör med en molekylviktsskärning (MWCO) på 12 - 14 kDa.
- Skär dialysslangen i bitar om 20 cm. Koka dialysslangen i 500-800 ml 10 mM EDTA (pH 7,5) i 30 minuter i en bägare med hjälp av en kokplatta för att avlägsna förorening. Kassera 10 mM EDTA(pH 7,5) lösning och koka dialysslangen i avjoniserat vatten i 10 min.
OBS: Dialysslangen kan användas direkt eller förvaras i 0,01% natriumazid (NaN3)/H2O-lösning vid 4 °C fram till nästa användning. - Stäng botten av dialysslangen med en lämplig dialysrörsstängning/endelad gångjärnsklämma och rör försiktigt antikroppsalsalkan i dialysslangen. Stäng toppen av dialysslangen med en andra klämma.
- Fäst dialysslangens övre klämmor på ett flytande stativ, sätt ihop det med en magnetisk omrörningsstång i den PBS-fyllda bägaren och placera bägaren på en magnetisk omrörare.
- Dialysera över natten omrörning vid 4 °C.
- Skär dialysslangen i bitar om 20 cm. Koka dialysslangen i 500-800 ml 10 mM EDTA (pH 7,5) i 30 minuter i en bägare med hjälp av en kokplatta för att avlägsna förorening. Kassera 10 mM EDTA(pH 7,5) lösning och koka dialysslangen i avjoniserat vatten i 10 min.
- För att öka koncentrationen av αDEC-205, ladda hela dialysatet till en centrifugalkoncentrator med 10 kDa MWCO. Öppna en klämma på slangen och rör försiktigt ut hela dialysen ur dialysslangen i centrifugalkoncentratorn (10 kDa MWCO).
OBS: Rör inte vid koncentratorbotten med pipettspetsen.- Centrifug i 30 min vid 693 x g (2 000 varv/min) och 4 °C.
- Ladda centrifugalkoncentratorn med 10 ml PBS och centrifug vid 693 x g (2 000 varv/min) och 4 °C tills den slutliga volymen antikroppslösning kvar är 1-1,5 ml.
OBS: Upprepa vid behov centrifugeringssteget 2.4.1. för att anpassa sig till önskad mängd. - Med hjälp av en spektrofotometer bestämmer du den optiska densiteten hos den koncentrerade αDEC-205-lösningen vid 280 nm (OD280). Använd PBS som tomt.
- Beräkna koncentrationen av αDEC-205 med följande formel:
[mg/ml] = OD280/1,4. - Filtrera αDEC-205-lösningen med en 0,22 μm sprutfilterenhet.
OBS: Rening av αDEC-205 från NLDC-145 hybridom cell supernatant kan också uppnås genom FPLC (snabb protein flytande kromatografi). Renad αDEC-205 kan förvaras vid 4 °C eller vid -18 °C för långtidsförvaring.
3. Kemisk konjugation av OVA till αDEC-205
OBS: Ett förhållande på 0,5 mg OVA-protein och 2,5 mg αDEC-205 (1:5) krävs för optimal kemisk konjugation. Detta förhållande kan dock variera för andra proteiner och antikroppar och måste optimeras för alternativa konjugat. Reduktion av disulfidbindningarna av OVA-proteinet utförs genom inkubation med 30 mM TCEP-HCl, vilket exponerar sulfhydrylgrupperna för kemisk konjugation för αDEC-205 och 240 μl TCEP-HCl behövs i steg 3.2. Båda stegen, TCEP-inducerad reduktion av OVA (steg 3.1.) och sulfo-SMCC aktivering av αDEC-205 (steg 3.2.), bör helst utföras parallellt.
- Förbered en 125 mM TCEP-HCl-lösning (pH 7.0). Väg den önskade mängden TCEP-HCl och lös upp TCEP-HCl i 0,9 M Tris-basen (pH 8,8). Använd pH-indikatorremsor för att testa pH-värdet på 125 mM TCEP-HCl-lösningen (som ska vara neutral) och justera pH-värdet med Tris-basen (pH 8.8).
- Pipetter 200 μL OVA-proteinlösning (innehållande 0,5 mg OVA) i ett sterilt rör på 1,5 ml. Tillsätt 240 μl 125 mM TCEP-HCl och 560 μL sterilt ultrapure vatten till OVA-proteinet med en pipett till en slutlig koncentration av 0,5 mg/mL OVA-protein och 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
OBS: 2,5 mg EndoGrade OVA (frystorkad) löses upp i 1 ml PBS vilket resulterar i en 2,5 mg/mL OVA-lösning. - Inkubera den resulterande OVA/TCEP-HCl vid rumstemperatur i 1,5 timmar.
OBS: Förläng inte detta inkubationssteg.
- Pipetter 200 μL OVA-proteinlösning (innehållande 0,5 mg OVA) i ett sterilt rör på 1,5 ml. Tillsätt 240 μl 125 mM TCEP-HCl och 560 μL sterilt ultrapure vatten till OVA-proteinet med en pipett till en slutlig koncentration av 0,5 mg/mL OVA-protein och 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
- För att aktivera αDEC-205 för konjugation, lös upp 2 mg sulfo-SMCC i 100 μL ultrapurvatten.
OBS: Sulfo-SMCC är mottagligt för hydrolys. Därför bör större mängder olösta sulfo-SMCC hanteras snabbt eller tillgängliga 2 mg alikvoter användas.- Späd αDEC-205 i PBS så att 2,5 mg finns i 900 μL.
- Blanda 2,5 mg αDEC-205 (900 μL-volym, erhållen från steg 3.2.1) och 100 μL sulfo-SMCC (erhållen från steg 3.2) i ett 1,5 ml-rör, vilket resulterar i en total volym på 1 ml.
- Inkubera αDEC-205/sulfo-SMCC-lösningen i 30 min vid 37 °C och 550 varv/min i ett värmeblock.
- Efter dessa inkubationer avlägsnas överskott av sulfo-SMCC och TCEP-HCl omedelbart från lösningarna med hjälp av avsaltningskolonner (MWCO 7 kDa; 5 ml kolonnvolym).
- Vrid av kolonnerna (MWCO 7 kDa) bottenstängning, lossa locket och placera kolonnen i ett koniskt rör på 15 ml.
- Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g vid rumstemperatur för att avlägsna vätskan.
- Placera kolonnen i ett nytt rör och ta bort locket. Ladda långsamt antikroppen/sulfo-SMCC respektive OVA/TCEP-HCl till mitten av den kompakta hartsbädden i en kolonn vardera.
- Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g vid rumstemperatur.
- Ignorera kolumnerna efter användning. Lösningarna som innehåller antikroppar och OVA som är förberedda för konjugation finns i rören.
- Blanda omedelbart båda lösningarna genom pipettering för konjugation av αDEC-205 och OVA.
- Inkubera den resulterande αDEC-205- och OVA-blandningen över natten vid 4°C.
- Efter konjugation avlägsnas överskott av obundet OVA från lösningen och den kopplade αDEC-205/OVA koncentreras med hjälp av en centrifugalproteinkoncentrator (MWCO 150 kDa).
- Förskölj centrifugalproteinkoncentratorn (MWCO 150 kDa) genom pipettering 12 ml PBS på kolonnen och centrifugering i 2 min vid 2 000 x g vid rumstemperatur.
OBS: Upprepa vid behov centrifugeringssteget (3.4.1.) tills en volym på ca 5 ml har passerat genom kolonnen. - Innan αDEC-205/OVA lastas på centrifugalproteinkoncentratorn ska du spara ett 20 μL-prov av den okoncentrerade αDEC-205/OVA för analys av västra blot. Förvara denna alikvot vid 4 °C tills analysen.
- Ladda αDEC-205/OVA på centrifugalproteinkoncentratorn genom pipettering.
OBS: Undvik all kontakt med bädden i centrifugalkoncentratorns övre kammare. - Fyll koncentratorn till 15 ml med PBS och centrifugera koncentratorn i 5 min vid 2 000 x g vid rumstemperatur.
- Spara ett prov av genomströmningen (genomströmning I) för western blot-analys och kassera återstående genomströmning.
- Fyll koncentratorn till 10 ml med PBS och centrifugera koncentratorn i minst 8 min vid 2 000 x g vid rumstemperatur.
- Spara ett prov för det andra genomflödet (genomflöde II) för analys av västra blot och kassera det återstående genomflödet.
- När önskad berikning har uppnåtts (cirka 1,5 ml αDEC-205/OVA-lösningen ska lämnas i den övre kammaren) aspirera försiktigt det koncentrerade provet.
OBS: Om för mycket vätska finns kvar i den övre kammaren kan centrifugeringen upprepas men bör hållas så kort som möjligt.
- Förskölj centrifugalproteinkoncentratorn (MWCO 150 kDa) genom pipettering 12 ml PBS på kolonnen och centrifugering i 2 min vid 2 000 x g vid rumstemperatur.
- Bestäm proteinkoncentrationen i den resulterande αDEC-205/OVA med hjälp av en mikrovolumspektrofotometer. Använd PBS som tomt.
- Filtrera αDEC-205/OVA med hjälp av en 0,22 μm sprutfilterenhet.
OBS: För senare analys och in vivo-experiment kan αDEC-205/OVA förvaras vid 4 °C eller -18 °C.
4. Kontroll av den kemiska konjugationen av västra blot
OBS: För kontroll av framgångsrik kemisk konjugation utförs western blot-analys som detekterar antingen OVA (4.2) eller αDEC-205 (4.10). Detektion av OVA (4.2.) eller αDEC-205 (4.10.) bör utföras parallellt. En orbital plattform shaker bör helst användas för alla inkubationssteg i de västra blotmembranen för att möjliggöra en enhetlig fördelning av respektive lösning.
- Förbered standard 10% SDS (natrium dodecylsulfat) geler för SDS-PAGE (natrium dodecylsulfatpolyakrylamid gel elektrofores).
- Förbered proverna för SDS-PAGE för att upptäcka konjugerad och icke-konjugerad OVA och köra gelelektrofores.
- Späd ut olika mängder kopplade αDEC-205/OVA (t.ex. 200, 100 och 50 ng), rena OVA (t.ex. 80, 70, 60, 50, 40 och 30 ng), en alikvot av icke-konjugerad αDEC-205 (t.ex. 100 och 50 ng), ett alikvot av icke-konjugerad αDEC-205 (t.ex. 100 och 30 ng), ett alikvot av icke-konjugerad αDEC-205 (t.ex. 100 och 30 ng), ett alikvot av icke-konjugerad αDEC-205 (t.ex. (t.ex. 125 ng) och en alikvot genom genomströmning i I och II (steg 3.4.5. respektive 3.4.7. i 4 x icke-reducerande SDS-provbuffert.
OBS: Olika koncentrationer av konjugat och protein laddas för att säkerställa att både fria OVA och konjugat kan detekteras på samma fläck. - Denaturera proverna vid 65 °C i 10 min och 550 varv/min i ett värmeblock.
- Späd ut olika mängder kopplade αDEC-205/OVA (t.ex. 200, 100 och 50 ng), rena OVA (t.ex. 80, 70, 60, 50, 40 och 30 ng), en alikvot av icke-konjugerad αDEC-205 (t.ex. 100 och 50 ng), ett alikvot av icke-konjugerad αDEC-205 (t.ex. 100 och 30 ng), ett alikvot av icke-konjugerad αDEC-205 (t.ex. 100 och 30 ng), ett alikvot av icke-konjugerad αDEC-205 (t.ex. (t.ex. 125 ng) och en alikvot genom genomströmning i I och II (steg 3.4.5. respektive 3.4.7. i 4 x icke-reducerande SDS-provbuffert.
- Ladda proverna och en proteinstandard på en SDS-gel och kör SDS-PAGE.
- Utför standard blottning av proteinerna från SDS-gelen till ett metanolaktiverat PVDF-membran (polyvinyliden difluorid) (75 min, 125 mA).
- Efter blotting, lägg membranet i en lämplig skål och blockera membranet genom att pipettera 25 ml 4% måltidsersättningsskakpulver/TBS-T (Tris-buffrad saltlösning/0,1% Interpolering 20) blockera buffert i skålen som innehåller membranet.
- Inkubera membranet i blockeringslösningen i 60 min vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
- Kassera blockeringslösningen och färga membranet med kaninen αOVA primär antikropp i 2% måltidsersättningsskakpulver/TBS-T antikroppsbuffert (utspädning 1:3 000) genom att pipettera 15 ml primär antikroppslösning till membranet i skålen.
- Inkubera membranet i 45 minuter vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C (använd plattformsskakapparaten).
- Kassera antikroppslösningen och tvätta membranet i skålen (använd plattformsskakapparaten).
- Tillsätt 25 ml TBS-T i membranet och inkubera i 5 minuter. Kassera lösningen.
- Tillsätt 25 ml TBS-T/0,5 M NaCl till membranet och inkubera i 5 min. Kassera lösningen.
- Tillsätt 25 ml TBS-T/0,5% Triton X-100 i membranet och inkubera i 5 min. Kassera lösningen.
- Tillsätt 25 ml TBS-T i membranet och inkubera i 5 minuter. Kassera lösningen.
- Färga membranet med den sekundära antikroppen geten αrabbit-IgG-HRPO (hästrädisperoxidas) i 2% måltidsersättningsskakpulver/TBS-T antikroppsbuffert (utspädning 1:2 000) genom att pipettera 15 ml sekundär antikroppslösning till membranet i skålen.
- Inkubera membranet i 45 minuter vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C (på plattformsskakapparaten).
- Tvätta membranet igen enligt beskrivningen i steg 4.7.1.- 4.7.4. med hjälp av plattformsskakapparaten. För detta membran, fortsätt sedan med steg 4.16. (följande steg 4.10.- 4.15. (detektion av αDEC-205) kan utföras parallellt med steg 4.2.- 4.9.).
- Förbered proverna för detektion av αDEC-205 för SDS-PAGE och kör gelelektroforesen.
- Späd ut olika mängder αDEC-205/OVA (t.ex. 200, 100 och 50 ng), av den icke-konjugerade αDEC-205 (t.ex. 250, 125, 62,5 ng), av ren OVA (t.ex. 80 och 70 ng), ett prov av okoncentrerad αDEC-2. (t.ex. 125 ng) och en alikvot genom genomströmning i I och II (steg 3.4.5. respektive 3.4.7. i 4 x icke-reducerande SDS-provbuffert.
- Denaturera proverna vid 65 °C i 10 min och 550 varv/min i ett värmeblock.
- Ladda proverna och en proteinstandard till en SDS-gel och kör gelelektrofores.
- Utför standard blottning av proteinerna från SDS-gelen till ett metanolaktiverat PVDF-membran (polyvinylidendifluorid) (75 min, 125 mA).
- Efter blotting, lägg membranet i en lämplig skål och blockera membranet genom att pipettera 25 ml 10% blockerande buffert (mjölkpulver/TBS-T) i skålen som innehåller membranet.
OBS: Blockeringslösningarna skiljer sig åt mellan αDEC-205 och OVA-detektering (steg 4.5.).- Inkubera membranet i blockeringslösningen i 60 minuter vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C (med hjälp av plattformsskakapparaten).
- Kassera blockeringslösningen och färga membranet med geten αrat-IgG(H+L)-HRPO-antikroppen i 5% mjölkpulver/TBS-T antikroppsbuffert (utspädning 1:5 000) genom att leda 15 ml antikroppslösning till membranet i skålen.
OBS: Antikroppsbuffertarna skiljer sig mellan αDEC-205-detektion och OVA-detektion (steg 4.6. / 4.8.).- Inkubera membranet i 45 minuter vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C (med hjälp av plattformsskakapparaten).
- Tvätta membranet noggrant i skålen enligt beskrivningen i steg 4.7.1.- 4.7.4. (använd plattformsskakapparaten).
- Använd ett lämpligt detektionsreagens för att utveckla HRP-signalen och detektera chemiluminescensen i ett mörkt rum med hjälp av röntgenfilm eller via ett bildsystem.
5. ELISA:s kontroll av elisa:s kemiska konjugation
- Utför ELISA för ytterligare verifiering av framgångsrik kemisk konjugation som resulterar i αDEC-205/OVA.
- Belägga en lämplig ELISA-platta med 96 brunnar med 100 μL/brunn på 3 ng/μL kanin αOVA-antikropp i beläggningsbuffert (0,1 M natriumbikarbonat (NaHCO3)pH 9,6 utspädd i H2O).
- Inkubera plattan över natten vid 4 °C.
- Tvätta plattan tre gånger med PBS efter beläggning, t.ex. med hjälp av en ELISA-bricka.
- Blockera plattan genom att pipettera 200 μL blockeringsbuffert (10% FCS i PBS) i varje brunn på plattan och inkubera plattan i 30 min vid rumstemperatur.
- Späd ut αDEC-205/OVA (erhållen från steg 3.6.) 1:2 i blockeringsbuffert (10% FCS i PBS) för att erhålla utspädningar från 6 μg/mL ner till 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA och tillsätt 100 μL/brunn av dessa minskande mängder αDEC-205/OVA.
- Inkubera plattan i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta plattan tre gånger med PBS, t.ex. med en ELISA-bricka.
- Tillsätt 100 μL av geten αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO-antikroppen (utspädd till 1:2 000 i blockerande buffert (10% FCS i PBS)) till varje brunn på plattan.
- Inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta plattan tre gånger med PBS, t.ex. med elisa-bricka.
- Tillsätt 50 μL HRPO-substrat till brunnarna. När du observerar en tydlig färgreaktion, stoppa reaktionen genom tillsats av 150 μl stopplösning (1M H2SO4) per brunn.
- Efter 5 min, läs absorption vid 450 nm med en ELISA-läsare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemisk konjugation av αDEC-205 till OVA-protein med hjälp av detta protokoll möjliggör vanligtvis effektiv generering av αDEC-205/OVA för in vivo DC-inriktningsmetoder. Det finns olika strategier för att verifiera själva tekniken och för att testa funktionaliteten hos den resulterade konjugaten. Western blot analys och ELISA används för att verifiera framgångsrik konjugation och samtidigt upptäcka potentiellt vänsterfri OVA (figur 2). In vitro-bindande studier(figur 3) och in vivo-immuniseringar ( figur4) bekräftar bindning av konjugatet till DEC-205 och inriktning av DC.
Parallell western blot-analys används för att detektera både den konjugerade OVA(figur 2A) och konjugerad αDEC-205 (figur 2B). Specifikt bekräftar den positiva signalen för OVA på nivån för antikroppens molekylvikt i blot associationen mellan OVA och antikroppen (figur 2A). Dessutom gör färgning för OVA i den västra blot-analysen detektion av överskottsfria OVA som potentiellt fortfarande finns bredvid αDEC-205/OVA som anges i steg 3.6., vilket inte är fallet för den fläck som visas (figur 2A). Om stora mängder gratis OVA upptäcks, steg 3.4.1. till 3.4.8. protokollet bör upprepas. Som komplement till färgningen för OVA (figur 2A),färgning för αDEC-205 i western blot analys verifierar framgångsrik konjugation genom en ökning av molekylvikten mellan "naken" αDEC-205 och konjugatet som visas i figur 2B.
Förutom western blotting möjliggör också en specifik ELISA verifiering av den framgångsrika konjugationen av αDEC-205 till OVA. Till skillnad från de västra blot-analyserna tillåter dock denna ELISA inte detektion av fria och icke-konjugerade αDEC-205 eller OVA. På grund av analysinställningen (figur 2C) produceras endast en positiv signal om konjugationen var effektiv. Det positiva sambandet mellan den detekterade signalen (absorption vid 450 nm) och den analyserade mängden protein verifierar den framgångsrika genereringen av αDEC-205/OVA genom kemisk konjugation enligt figur 2D. Samtidigt visar den positiva signal som redan getts från 9,38 ng av konjugatet αDEC-205/OVA den starka känsligheten hos denna metod (figur 2D). Om det inte finns någon ökning av adsorption för ökande mängder konjugat, var konjugationen förmodligen inte framgångsrik. I detta fall skulle även de västra blot-analyserna ge negativa resultat, dvs. ingen detektion av konjugatet i fläcken färgade för OVA och ingen ökning av molekylvikten i fläcken färgade för αDEC-205.
Medan de västra blot- och ELISA-analyserna används för att utvärdera konjugationen och avlägsnandet av fritt antigen som sådant, behövs efterföljande funktionella analyser för att bekräfta bindning till DEC-205 och inriktning av DC. För detta ändamål har vi utfört in vitro-bindande studier (figur 3) och in vivo-immuniseringar ( figur4). För dessa experiment erhölls kvinnliga 6-8 veckors C57BL/6 och 8-12 veckor Balb/c möss från kommersiella källor eller uppföddes vid djuranläggningen vid Helmholtz Centre for Infection Research (HZI) och hölls under specifika patogenfria förhållanden. Figur 3 visar funktionella analyser för bindning av en konjugat av αDEC-205 och HCV Core-proteinet (αDEC-205/Core) till CD11c+ celler in vitro. Flödescytometri visade tydligt αDEC-205/Core för att effektivt binda benmärg härledda CD11c+ celler (figur 3A,B) samt nyisolerad mus CD11c+ splenocyter (data visas inte). Dessa analyser visar att den kemiska konjugationen inte stör bindningskapaciteten hos αDEC-205. Detta bekräftas ytterligare av immunofluorescensanalyser som visar bindning av αDEC-205/Core till MHC-II+ CD11c+ celler sorterade från in vitro-genererade benmärgsbaserade dendritiska celler (BMDC) (figur 3C).
Tidigare har vi visat de αDEC-205/OVA-konjugat som produceras av det demonstrerade protokollet för att effektivt inducera OVA-specifika immunsvar in vivo hos möss, vilket bekräftar framgångsrik generering av konjugate samt funktionell inriktning av DC (figur 4)12,14. Specifikt inducerad subkutan vaccination med αDEC-205/OVA effektivt humorala och cellulära OVA-specifika immunsvar. Viktigt, i en rekombinant adenovirus utmaning modell upptäckte vi antivirala CD8+ T-celler som kan eliminera virusinfekterade hepatocyter, vilket har starka konsekvenser för vacciner riktade mot hepatotropa virus12. Dessutom understryker den mycket effektiva induktion av antigenspecifika cytotoxiska T-celler potentialen i detta tillvägagångssätt för in vivo priming av antitumör immunitet. Vi har också framgångsrikt använt αDEC-205/OVA för att testa och jämföra olika adjuvanser i samband med in vivo DC-inriktning14. Vid vaccination med αDEC-205/OVA tillsammans med adjuvanskombinationen Poly(I:C) (polyinosinisk polycytidylsyra) och cpg (syntetiska olideoxynukleotider innehållande ouppfyllda CpG-motiv) observerade vi generellt (figur 4A) och under vissa tidpunkter betydligt högre OVA-specifika IgG-nivåer jämfört med vaccination med enbart OVA(figur 4B). Dessutom inducerade αDEC-205/OVA effektivt OVA-specifika CD4+ samt CD8+ T-cellssvar(figur 4C,D)och αDEC-205/OVA-inducerad CD8+ T-cellsrespons signifikant det som inducerades av enbart OVA(figur 4D).
Figur 1: Modell för kemisk konjugation av αDEC-205 och OVA. I ett första steg reagerar den primära amin av αDEC-205 med NHS-ester av tvärlänkssulfo-SMCC vilket resulterar i maleimideaktiverad αDEC-205. Efter reduktion av disulfidbindningarna av OVA-proteinet genom inkubation med TCEP-HCl reagerar maleimidaktiverade αDEC-205 med TCEP-HCl-reducerat OVA-protein för att bilda antikroppen/antigenkonjugatet αDEC-205/OVA. Förkortningar: N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester); sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidometyl]cyclohexan-1-karboxoxylat (sulfo-SMCC); Tris(2-karboxysetyl)fosfinhydroklorid (TCEP-HCl). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Kontroll av det kemiskt konjugerade αDEC-205/OVA. För att kontrollera effektiv kemisk konjugation av αDEC-205 och OVA-proteinet utförs western blotanalys(A,B) och ELISA (C,D). Prover av αDEC-205/OVA, αDEC-205 och olika koncentrationer av OVA-protein utsattes för SDS-PAGE (10%) och efterföljande western blot-analys med hjälp av en kanin αOVA primär antikropp och en get αrabbit-IgG-HRPO sekundär antikropp för att upptäcka OVA-protein ( A ) eller en get αrat-IgG(H+L)-HRPO- antikropp för att påvisa OVA-protein(A ) eller en get αrat-IgG(H+L)-HRPO- antikropp för att upptäcka OVA-protein ( A ) eller en get αrat-IgG(H+L)-HRPO- antikropp för att upptäcka OVA-protein (A) eller en get αrat-IgG(H+L)-HRPO- antikropp för att upptäcka ΑDEC- 205. C)Elisas schematiska återgivning för kontroll av konjugat av αDEC-205/OVA. Kaninen αOVA beläggning antikropp binder αDEC-205/OVA via konjugerade OVA. Goat αrat-IgG(H+L)-HRPO känner igen αDEC-205-fraktionen av den bundna konjugaten och en positiv signal bekräftar därmed effektiv konjugation. d)ELISA utfördes enligt beskrivningen iC. Seriellt utspädda mängder (1:2) av αDEC-205/OVA (600 ng till 9,38 ng) analyserades. Uppgifterna visas som medelvärdet av tre exemplar av en representativ analys. Förkortningar: enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA); Hästrädisperoxidas (HRPO); ovalbumin (OVA); natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektrofores (SDS-PAGE). Panelerna A och B har modifierats från Volckmar etal.12. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Bindning av αDEC-205/Core till benmärgsbaserade dendritiska celler (BMDC) genom flödescytometri och immunofluorescensmikroskopi. För att analysera kapaciteten hos αDEC-205/Core att binda sin målmolekyl DEC-205 på BMDC in vitro utfördes fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys (A,B) och immunofluorescensmikroskopi (C). Kort sagt, benmärg celler isolerades från bakbenen av kvinnliga Balb/c möss (n =3) 8-12 veckors ålder och odlades i RPMI medium kompletteras med 1% penicillin/streptomycin, 1% glutamin, 0,25 mM mercaptoethanol och 5 ng/mL GM-CSF (granulocyt-macrophage koloni stimulerande faktor). Dag 6 skördades de icke-vidhäftande BMDC: erna noggrant och användes för bindande analyser. (A,B) In vitro-genererade BMDC inkuberades med 10 μg/mL αDEC-205/Core, αDEC-205 eller medium (kontroll) i 1 h vid 4 °C följt av färgning med APC-märkt αCD11c [klon HL3]. Påvisande av bunden αDEC-205/Core på ytan av BMDC utfördes genom ytterligare färgning av cellerna med antingen PE-märkt get αrat (A) eller mus αHCV Core [klon C7-50] följt av sekundär αmouse-IgG1-PE färgning (B). Representativa histogram visar PE-signalen och % PE-positiva celler i de gated CD11c+ cellerna. c)BMDC som genererades in vitro från naiva Balb/c-möss sorterades för MHC-II+ och CD11c+ celler och inkuberades med 10 μg/mL αDEC-205/Core för 1 h vid 4 °C. Cellbunden αDEC-205/Core färgades med Alexa 594-kopplad αrat-IgG eller med mus αHCV Core [klon C7-50] och Alexa 488-kopplad αmouse-IgG i 30 min vid 4 °C efter tvätt. Cellerna visualiserades genom immunofluorescensmikroskopi (skalstång = 20 μm). Bindningskapaciteten för αDEC-205/Core till BMDC bekräftades genom ett överlägg av båda färgningarna (dubbelpositiv = orange). Förkortningar: benmärgsbaserade dendritiska celler (BMDC); Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Granulocyt-makrofag koloni stimulerande faktor (GM-CSF); hepatit C-virus (HCV). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: OVA-specifika humorala och cellulära immunsvar efter immunisering med αDEC-205/OVA. Funktionaliteten hos αDEC-205/OVA för att rikta in sig på DC in vivo bevisades genom immuniseringsexperiment som tidigare publicerats i Volckmar m.fl.12. Kortfattat immuniserades kvinnliga 6-8 veckor gamla C57BL/6 möss (n=5) subkutant på dag 0, 14 och 28 med 30 μg αDEC-205/OVA konjugat tillsammans med adjuvanserna 50 μg Poly(I:C)/50 μg CpG, 30 μg αDEC- μg αDEC- 20 Ytterligare kontroller behandlades med PBS ensam. (A,B) För att övervaka det humorala immunsvaret bedövades vaccinerade möss lätt genom isofluraninandning och blodprover samlades in från retro-orbital sinus dag 0, 13 och 27 och genom hjärt punktering på dag 42. Sera utarbetades enligt beskrivningen och analyseras för förekomst av OVA-specifik IgG av ELISA12. Endpoint titers uttrycktes som det ömsesidiga värdet av den senaste serum utspädning som gav en absorbans två gånger över värdena för negativa kontroller. Resultaten sammanställs från tre oberoende experiment. ( A) Kinetic av OVA-specifika serum IgG-titers som visas som gruppmedel. b)OVA-specifik IgG titer dag 27 och dag 42 som visas för enskilda möss tillsammans med gruppmedeltalet. Statistik: oparat tvåsidigt t-test. (C,D) Induktion av cellulära immunsvar analyserades av enzymlänkade immunsorbentfläckar (ELISPOT) analyser med hjälp av det murin IFNγ detektionspaketet dag 42 som tidigare publicerats12. Isolerade splenocyter från immuniserade möss slogs samman för de experimentella grupperna och antalet IFNγ spotbildande enheter/106 celler efter stimulering med 5 mg/mL CD4+ (C) eller CD8+ OVA-peptid (D) analyserades (OVA-peptider: CD4323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) och CD8257-264 (SIINFEKL)). Staplar representerar medelvärdet ± SEM (n=5, tre exemplar från poolade prover). Statistik: enkelriktad ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest (**p<0,01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Förkortningar: cytosin-fosfat-guanin oligonucleotide sekvenser (CpG), enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA), enzymlänkad immunsorbentfläck (ELISPOT), ovalbumin (OVA), fosfatbuffrad saltlösning (PBS), polyinosinisk-polycytidylsyra (Poly(I:C)). Denna siffra har modifierats från Volckmar et al.12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemisk konjugation av en endocytosreceptorspecifik antikropp och ett proteinantigen ger ett effektivt och, viktigast av allt, också flexibelt tillvägagångssätt för in vivo DC-inriktning i prekliniska musmodeller. Med vårt protokoll tillhandahåller vi ett effektivt tillvägagångssätt för framgångsrik konjugation av modellantigenet OVA till en DEC-205-specifik IgG-antikropp.
I vårt protokoll renas αDEC-205 från en hybridomcelllinje och tidigare har vi renat antikroppen med protein G sepharose enligt beskrivningen. Observera att vi också har använt FPLC för att rena αDEC-205 i senare studier och efterföljande kemisk konjugation var också effektiv. De kritiska stegen för effektiv kemisk konjugation är evakuering av både antikroppen och proteinet. Vi har optimerat dessa steg från olika tillgängliga protokoll för att slutligen utföra inkubation av antikroppen med tvärlänken sulfo-SMCC och minskning av proteinet genom TCEP-HCl. Specifikt är de kritiska stegen vid denna tidpunkt den nya beredningen av TCEP-HCl (steg 3.1.) och inkubationen av TCEP-HCl med proteinet, som inte bör förlängas (steg 3.1.2.). Dessutom är den proteinbuffert som används för att minska disulfidbindningarna genom TCEP-HCl kritisk, eftersom den kan påverka minskningen med TCEP-HCl negativt. Det är också viktigt att omedelbart blanda den aktiverade antikroppen och det reducerade proteinet (steg 3.3.6.) för att säkerställa optimala reaktionsförhållanden för konjugationen. I våra händer gav detta tillvägagångssätt de mest effektiva och tillförlitliga resultaten när det gäller konjugation. Ett ytterligare kritiskt steg för efterföljande in vivo-metoder är avlägsnandet av obundet OVA från konjugatet αDEC-205/OVA. För att verifiera detta steg har vi optimerat västerländska blotanalyser och rekommenderar detektion av både den konjugerade αDEC-205 samt det konjugerade OVA-proteinet (figur 2A och B). Om obundet OVA finns i den slutliga konjugatlösningen kommer blottning och påvisande av kända koncentrationer av OVA (som i figur 2A) att hjälpa till att uppskatta mängden obundet OVA i förhållande till den totala mängden protein som laddas för SDS-PAGE. Om konjugation var ineffektivt, bör felsökning ta itu med det antigen/antikroppsförhållande som används för konjugationen. Om konjugation var effektivt som upptäckts av ELISA, men inte kan detekteras genom western blot analys, har vi upplevt antikroppskoncentrationerna i de västra blot analyserna (steg 4.6., 4.8., 4.14.) den mest kritiska faktorn.
Den huvudsakliga begränsningen av vårt tillvägagångssätt är en ibland varierande konjugationseffektivitet där det inte finns någon fast korrelation mellan antalet antikroppsmolekyler och mängden kopplat protein. Ändå tror och har vi upplevt att det demonstrerade protokollet på ett tillförlitligt sätt tillåter efterföljande in vivo-studier av DC-inriktning som ger reproducerbara resultat. Dessutom, medan i princip i vårt protokoll både αDEC-205 och OVA-proteinet kan bytas ut mot alternativa antikroppar och antigener för in vivo-studier av olika intressen, måste enskilda steg i den kemiska konjugationen nyligen optimeras för de nya komponenterna. Detta gäller främst det optimala antikropps-/antigenförhållandet och kan t.ex. bero på tillgängligheten av redukterbara Cys-rester. I våra tillvägagångssätt var de optimala nyckeltalen som resulterade i framgångsrika konjugation reaktioner 1:5 för OVA till αDEC-205 och 1.35:1 för HCV proteiner NS3 (nonstructural protein 3) och Core till αDEC-205. För varje konjugat måste negativa effekter av tvärlänken eller konjugationen som sådan på antikroppens antigenbindningskapacitet uteslutas. Observera att konjugation av immunogena peptider istället för proteiner i full längd är mindre problematiskt i detta avseende. Proteiner ger dock högre antigen mångfald i efterföljande immunisering. Genetiska fusionsmetoder visar ett alternativ till kemisk konjugation och har också tydliga fördelar1. I slutändan kommer valet av strategi för att koppla samman antikroppar och antigener för DC-inriktning att bero på resurser, forskningsfokus och förväntade tillämpningar av konjugaterna. Vi anser att den relativa flexibiliteten när det gäller antikroppar och antigener visar en stor fördel med kemisk konjugation och vi har verkligen använt det protokoll som beskrivs här för effektiv kemisk konjugation av αDEC-205 till olika proteiner av hepatit C-viruset (HCV)(figur 3 och data som inte visas).
Sammantaget anser vi att kemisk konjugation av endocytosreceptorspecifika antikroppar mot proteinantigener som i αDEC-205/OVA visar ett flexibelt och tillförlitligt verktyg för att generera antikropps-/antigenkonjugat av exceptionellt värde vid studier av DC-inriktningsmetoder, även de som syftar till att inducera antitumörimmunitet, särskilt i prekliniska djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar S. Prettin för expertteknisk hjälp. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) som tillhandahölls som en del av Helmholtz Alliance ''Immunotherapy of Cancers' (HCC_WP2b).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al.
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
