Summary
여기서는 제브라피시 난소 여포에 여포 세포와 난소 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시하여 제브라피시의 난소 발달에 대한 조사를 용이하게 합니다.
Abstract
Zebrafish는 척추동물의 난소 발달을 연구하기에 이상적인 모델이 되었습니다. 여포는 난소와 주변 여포 세포로 구성된 난소의 기본 단위입니다. 여포 세포의 1차 배양, 유전자 발현 분석, 난낭 성숙및 체외 수정 등과 같은 다양한 연구 목적을 위해 여포 세포와 난미세포를 분리하는 것이 중요합니다. 종래의 방법은 집게를 사용하여 두 구획을 분리하는데, 이는 힘들고 시간이 많이 걸리며 난소세포에 높은 손상을 줍니다. 여기서, 우리는 당겨진 유리 모세관을 사용하여 두 구획을 분리하는 간단한 방법을 확립했습니다. 스테레오 현미경의 밑에, oocytes 및 여포 세포는 뽑아낸 미세 유리 모세관에서 파이펫으로 쉽게 분리될 수 있습니다 (직경은 여포 직경에 달려 있습니다). 종래의 방법에 비해, 이 새로운 방법은 난모세포와 여포 세포를 분리하는 데 있어서 고효율을 가지며 난모세포에 대한 손상이 낮습니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 사전 vitellogenesis 단계에서를 포함하여 초기 단계 여포에 적용될 수 있습니다. 따라서, 이 간단한 방법은 제브라피시의 여포 세포 및 난모세포를 분리하는 데 사용될 수 있다.
Introduction
Zebrafish는 척추 동물 발달 및 생리학연구를 위한 주요 모형 유기체입니다. 제브라피쉬는 난소발달1,2,3의분자 메커니즘을 연구하는 좋은 모델이 될 수 있다. 난소 발달의 많은 특징은 물고기에서 포유류1,2로진화하는 동안 많이 보존된다. 다른 척추동물과 유사하게, 제브라피시 성인은 비동기 난소를 가지고 있으며, 모든 발달 단계4의난소 여포를 함유하고 있다. 여포는 난소의 기본 생식 요소입니다. 여포는 여포 세포에게 불린 체세포의 하나 또는 여러 층으로 포위되는 oocyte로 이루어져 있습니다. 여포의 발달은 난모세포와 여포 세포5사이의 양방향 통신에 의존한다. 여포 세포 원발문화, 유전자 발현 분석, 난소 성숙도 및 체외 수정과 같은 다른 연구 목적을 위해 난소 여포에서 여포와 난모세포를 분리하는 것이 중요합니다.
전통적인 분리 방법은 집게 및 효소소화6,7,8,9,10에의한 기계적분리를포함한다. 그러나, 집게에 의한 기계적 분리는 시간이 많이 걸리고 힘들다. 또한 분리 시 난소에 높은 손상을 입힙니다. 효소 소화 방법은 조작이 간단하고 짧은 시간이 필요하지만, 치료 시간과 효소 농도를 검증해야 하며, 고립된 난모세포의 무결성과 생존율은 이상적이지 않다. 따라서, 우리는 당겨진 유리 모세관 관을 사용하여 다른 발달 단계에서 두 구획을 분리하는 간단한 방법을 설립했다.
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Protocol
어류 실험에서 수행되는 모든 절차는 노스웨스트 사범 대학의 동물 실험 윤리 위원회의 규정에 따라 수행됩니다.
1. 준비
- 마리
- 4-6cm의 몸 길이와 성인 여성 얼룩말 피시를 사용 하십시오.
참고 : 우리는 현지 시장에서 제브라피시를 사용했습니다. - 제브라피쉬를 14h 광및 10시간 암울한 사이클로 순환된 물 시스템에 약 28°C로 보관하십시오.
- 새로 부화 소금물 새우와 함께 매일 두 번 물고기를 공급합니다.
- 4-6cm의 몸 길이와 성인 여성 얼룩말 피시를 사용 하십시오.
- 뽑아낸 유리 모세관
- 15cm 의 유리 모세관을 사용하여 머리를 알코올 버너에 넣고 가열하십시오. 유리 모세관의 한쪽 끝을 손으로 잡고 다른 쪽 끝을 집게로 잡습니다.
- 5-10초를 가열한 후, 알코올 버너의 불에 탄 유리는 빨간색과 부드러워집니다. 필요한 직경으로 모세관을 열수 있도록 집게로 유리 모세관의 머리를 스트레칭합니다.
참고: 직경은 모낭 직경에 따라 달라집니다: previtellogenic (PV; 직경 약 0.30 mm), 초기 vitellogenic (EV; 직경 약 0.40 mm), midvitellogenic (MV; 직경 약 0.50 mm), 늦은 비텔로겐성 (LV; 직경 약 0.60 mm) 및 전체 성숙 (F5 직경) - 유리 모세관의 개구부를 적절한 직경으로 스트레칭하여 분리 된 여포의 크기가 약간 작습니다. 난소 여포의 크기보다 훨씬 큰 개구부를 가진 유리 모세관은 분리를 수행할 수 없습니다, 그러나 훨씬 작은 것들은 분리하는 동안 여포를 깰 것입니다. 유리 모세관의 스트레칭을 여러 번 연습하십시오.
참고 : 가열 시간은 유리 모세관의 크기에 따라 달라집니다. 알코올 버너의 불에 유리 모세관을 직접 스트레칭하지 마십시오. 유리 모세관을 깨뜨릴 것입니다. - 앰플 커터로 유리 모세관을 자르고 집게로 유리 모세관을 부러뜨려 매끄러운 절개를 얻습니다.
참고: 유리 모세관의 날카롭거나 부러진 개구부로 여포가 손상됩니다. - 30cm 플라스틱 튜브를 사용하여 한쪽 끝에 필터 요소로 1mL 파이펫 팁을 삽입하고 파이펫 끝에 당겨진 유리 모세관을 삽입하고 다른 쪽 끝에 200 μL 파이펫 팁을 연결합니다.
2. 다른 단계에서 제브라피피 피낭과 여포 세포의 분리
- 제브라피시 난소의 해부
- 얼음 양동이를 슬러리 얼음으로 가득 4/5로 채우고 슬러리 얼음이 떠있게하기에 충분한 생선 물을 추가하십시오. 2-5분 간 기다렸다가 수온을 확인하고 온도가 2-4°C 사이인지 확인하십시오.
- 물고기가 아가미 움직임을 멈출 때까지 적어도 2-5 분 동안 얼음 물에 물고기를 배치하여 성인 여성을 마취시합니다. 죽음을 보장하기 위해 날카로운 가위를 사용하여 척수를 끊어 물고기를 참수.
- 물고기는 집게로 해부 접시에 놓습니다.
- 해부 가위를 사용하여 다음과 같이 잘라냅니다. 클로카에서 복부의 중간선을 따라 아가미로 해부한다. 클로카 의 뒷면에서 잘라. 전방 끝에서 등쪽으로 잘라냅니다. 신체의 한쪽에 있는 피부와 근육을 부드럽게 제거합니다. 내부 장기를 노출하고 집게로 전체 난소를 꺼낸다.
- 즉시 난소를 60% 라이보비츠의 L-15(L-15) 배지가 들어 있는 100mm 배양 접시에 부드럽게 넣습니다.
- 난소 여포의 격리
참고 : 우리가 채택 한 스테이징 시스템은 셀만 외4의원래 정의를 기반으로합니다.- 이전에 설명된 바와 같이 미세 한 개의 포셉을 사용하여 다른 단계의 여포를 수동으로분리합니다.
- PV, EV, MV, LV 및 FG 단계의 난소 여포를 다음 단계로 그룹화합니다.
- 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리
- 난소 여포를 다른 단계에 넣고 60% L-15 배지를 함유한 깨끗한 페트리 접시에 넣습니다.
- 1.2 단계에서 당겨진 유리 모세관을 사용하여 여포를 유리 모세관 2-3cm로 빨아 내어 날려 버리세요.
참고: 유리 모세 혈관의 개구름이 적절한 경우 여포를 한 번 흡입하여 난낭과 분리할 수 있습니다.- 여포 세포 층이 난소에 단단히 부착되면 완전한 분리를 달성하기 위해 2-3 번 반복하십시오. 여포를 손상시킬 작은 모세관을 통해 여포를 강요하는 여러 번의 시도를 피하십시오.
참고: 흡입 및 불기 과정에서 여포 층이 낙상되어 난소에서 분리되고, 마지막으로 여포 세포와 탈모낭이 분리된다(도1).
- 여포 세포 층이 난소에 단단히 부착되면 완전한 분리를 달성하기 위해 2-3 번 반복하십시오. 여포를 손상시킬 작은 모세관을 통해 여포를 강요하는 여러 번의 시도를 피하십시오.
- 비누드하지만 그대로 난귀를 풀고 추가 에세이를 위해 살아남은 황토를 수집합니다.
- 여포 세포가 그대로 여포에서 분리되었는지 여부를 조사하기 위해, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 그대로 여포와 분리 된 난귀세포를 얼룩.
- 샘플을 실온(RT)에서 4% 버퍼링한 파라포름알데히드로 1시간 동안 수정합니다. PBS로 여러 번 씻으시면 됩니다.
- 30 분 동안 RT에서 DAPI에 의해 얼룩. PBS로 여러 번 씻겨. 형광 현미경으로 보고 사진 (예를 들어, 라이카 DFC7000 T).
- 완성된 분리를 확인하기 위해, 4°C에서 4% 완충 된 파라포름알데히드에 그대로 여포및 분리 된 난모를 고정하고 - 25 °C에서 조직 동결 배지 (예를 들어, 라이카)를 포함한다.
- 마이크로토메의 고정 된 조직을 잘라 유리 슬라이드에 장착합니다.
- PBS의 섹션을 세척하고 DAPI로 세포 핵을 시각화합니다. 형광 현미경으로 보고 사진.
3. 체외 성숙 (IVM) 및 체외 수정 (IVF)
참고 : IVF의 IVM의 절차는 사소한 수정 11,12,13이전에설명된 바와 같이 따랐다.
- 성인 제브라피쉬 암컷의 난소 해부 전에 신선한 성숙 배지(+DHP 배지)를 준비하십시오. 신선한 성숙 매체를 준비하려면 라이보비츠의 L-15 배지 인 pH 9.0의 9 mL을 15 mL 원문 튜브에 추가하십시오. 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one(DHP), dH2O의 490 μL, 10% 소 세럼 알부민(BSA)의 500 μL을 추가합니다.
- 행크의 솔루션과 E3 솔루션을 미리 준비합니다. Baars 외14에의해 설명 된 행크스의 솔루션을 준비합니다. 준비 E3 매체: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2,0.33 mM MgSO4,1-5% 메틸렌 블루.
- 단계 2에서와 같이 얼룩말 피시 난소의 해부와 난소 여포의 격리를 수행합니다.
- 전체 성장 단계 여포를 수집하고 미숙한 난모로 사용합니다. 각 성인 여성 얼룩말 물고기에 대 한, 적어도 150-200 전체 성장 단계 여포 격리 될 수 있습니다. IVM에 대한 손상되지 않고 건강한 여포를 선택합니다.
- 12웰 플레이트에 +DHP 배지로 전체 재배 단계 여포를 배양하여 주기적으로 검사하여 난모세포가 그대로 유지되도록 합니다. 파스퇴르 파이펫으로 리싱 난모를 제거합니다.
참고: 난모세포 성숙시, 난모세포는 점진적으로 반투명하게 됩니다. 난모세포의 대부분은 2 시간 동안 DHP의 치료 후 반투명된다. 이것은 전송된 광 광학을 가진 해부 현미경의 밑에 관찰될 수 있습니다. - 단계 2.3에 설명된 대로 각 성숙한 난피세포에서 가장 바깥쪽 여포 세포를 제거한다.
- 비누드 난우두질을 배양 배지 몇 방울로 페트리 접시에 옮기고 수정을 진행합니다.
- 행크스용액 500μL에서 적어도 3명의 남성으로부터 해부된 고환을 사용하여 신선한 정자 용액을 준비한다. 최대 2-3 시간 동안 수정의 효능을 유지할 수있는 얼음에 정자 용액을 넣습니다.
- 페트리 접시에 100 μL의 정자 용액을 넣고, 소멸되고 성숙한 난모세포에 넣습니다. 부드럽게 계란 사이에 정자 용액을 추가하고 피펫 팁을 사용하여 정자와 계란을 함께 소용돌이.
- 즉시 E3 배지 용액 1mL을 추가하여 계란을 활성화하고 파이펫 팁을 사용하여 계란과 정자를 부드럽게 소용돌이시습니다.
- 약 1 분 후 수정 후 (mpf), E3 중간 용액으로 접시를 홍수. 전체 초리온 확장은 10-15 mpf 내에서 관찰 될 수있다.
- 35-45 mpf 사이, 2 세포 단계로 대칭 분열을 겪고 있는 배아를 선택하, 따라서 수정된다. 세포 분열을 겪고 있지 않은 배아를 제거합니다.
- 배아는 10cm 플레이트당 80개의 배아의 한계를 가진 28°C에서 페트리 접시에서 발전하도록 허용합니다. 배아 발달을 보고 촬영합니다.
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Representative Results
이 방법은 제브라피시에서 난소 여포 발달의 다른 단계에서 여포 세포와 난모세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 도 1은 모세관 유리 튜브를 사용하여 난소 여포로부터 얼룩말 피낭 및 여포 세포의 분리를나타낸다(도 1). 여포 세포가 그대로 여포로부터 분리되었는지 여부를 조사하기 위해, 태양광 단계에서 FG 단계로의 여포의 상이한 단계에서 분비및 분리된 난투는 30분 동안 37°C에서 DAPI(50 μg/mL)로 염색하였다. 여포 세포의 핵은 DAPI에 의해 얼룩질 수 있다. DAPI의 파란색 신호는 그대로 여포에서 관찰되었지만 난소세포(그림 2)는제거되지 않았습니다. 이것은 여포의 난모세포 및 여포 세포가 이 방법에 의해 깨끗하게 분리될 수 있다는 것을 나타냅니다. 명확한 분리를 더 확인하기 위해, 그대로 여포와 분리 된 난모세포는 조직학적 섹션으로 절단되었다. DAPI 염색 결과 여포 세포가 디누드 난우세포(도3)에서명확하게 제거된 것으로 나타났다. 이 모든 결과는 이 방법이 제브라피시의 다른 단계 여포에 있는 여포 세포 및 난모세포를 분리하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 건의합니다.
이 방법은 제브라피시의 난모세포 성숙을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 난모세포 성숙 시 난모세포와 여포 세포 간의 양방향 통신을 연구하려면, 탈모세포는 다양한 분해된 변미를 다양한 연구용으로 얻어야 한다. 당겨진 유리 모세관을 사용하여, 전체 성장 단계 제브라피시 여포에서 분리 된 탈모세포는 4 시간 배양 후 치료없이 자발적인 난모세포 성숙을 겪는 것으로 나타났으며, 일반적으로 적어도 30 % 분리 된 난소세포가 생존하고 이들 생존 난소세포의 성숙율은 최대 80%(그림 4)가될 수 있습니다. 이러한 성숙한 난모세포는 여포 세포가 완전히 제거되었다는 것을 시사하는 물에 배치 한 후 전체 초리온 확장을 겪을 수 있습니다(도 4). 따라서, 이 방법은 제브라피시의 난모세포 성숙을 연구하기 위한 탈모세포를 얻기 위하여 이용될 수 있다.
이 방법은 제브라피시의 IVF에 사용할 수 있습니다. 체외 성숙 (IVM) 방법은 잘 제브라피시에 설립되었습니다. 이러한 방법을 이용하여, 완전히 자란 단계 여포는11,12,13,15,16으로성숙하게 유도될 수 있다. 체외 수정 (IVF)을 더 수행하려면 성숙한 여포의 여포 층은 여전히 수동으로 제거해야합니다. 여기서, 제브라피쉬의 IVM은 DHP의 치료에 의해 유도되었다. 성숙한 여포의 여포 층은 모세관 유리 튜브에 의해 제거되었습니다. 이러한 탈포 화 난모세포는 수정되어 부화 단계(그림 5)로개발 될 수 있습니다. 결과는 이 방법이 제브라피시에 있는 IVF를 위해 사용될 수 있다는 것을 건의합니다. 일반적으로 건강한 배아의 약 10%는 성숙한 난모세포에서 얻을 수 있습니다.
그림 1. 당겨진 유리 모세관을 사용하여 제피피 난소 여포에서 여포 세포와 난모세포의 분리. 1) FG 단계에서 온전한 여포의 형태. 2) 당겨진 유리 모세관에 그대로 여포를 흡입. 3) 여포세포는 당겨진 유리 모세관에서 여포가 날아갈 때 난모세포로부터 분리된다. 4) 여포 세포와 난모세포의 성공적인 분리. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 손상되지 않은 여포와 누드 난소의 형태는 DAPI 염색 후 여포의 다른 단계에서 분리. PV 단계에서 FG 단계로 여포의 다른 단계에서 온전한 여포와 분리 된 난모세포는 DAPI에 의해 염색되었다. DAPI의 파란색 신호는 그대로 여포에서 관찰되었지만 난모세포는 제거되지 않았습니다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. DAPI 염색 후 그대로 여포및 분리된 난모세포의 조직학적 섹션. 여포 세포의 세포 핵은 DAPI 염색으로 시각화되었다. 파란색 신호를 관찰할 수 있습니다. 여포 세포는 누드 난모세포에서 명확하게 제거되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 풀 카른 유리 모세관을 사용하여 전체 성장 단계 여포에서 분리 된 누드 난우세포의 성숙과 전체 초리온 확장. (A)전체 성장 단계 여포에서 그대로 여포의 형태. (B)전체 성장 단계 여포에서 분리 된 탈누드 난모세포는 4 시간 배양 후 치료없이 자발적인 난모세포 성숙을 겪을 수 있습니다. (C)성숙한 난모세포는 물에 의해 활성화 된 후 전체 초리온 확장을 겪을 수 있습니다. 스케일 바: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. IVM과 IVF에 의해 얻은 초기 태아의 형태. IVM은 2h에 대한 DHP(5 μg/mL)의 처리에 의해 유도되었다. IVM 후, 여포 세포는 뽑아진 유리 모세관에 의해 성숙한 난모세포에서 제거되었다. 성숙한 난모세포는 IVF에 의해 기름지게 했습니다. 다른 단계에서 배아의 발달을 보고 촬영했습니다. 스케일 바:(A-I)200 μm,(J)1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 여기에 제브라피시 난소 여포에서 여포 세포와 난모세포의 간단하고 신속한 분리를위한 새로운 방법을 설명합니다. 이 방법은 종래의 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 이들 중 1 차는 단일 및 외부 조작이 필요하므로 고효율 및 효과로 분리의 용이성을 크게 증가시다. 이 점은 현미경 해부학에 좋지 않은 연구원에 대한 적용성을 증가시킵니다. 우리의 경험에 따르면, 하나는 성공적으로 유리 모세관을 사용하여 5-10 s 내에서 완전히 성장 된 단계 여포에서 여포 세포와 난모세포를 분리 할 수 있습니다. 그러나, 적어도 30-60 s는 집게를 사용하여 이 분리를 하기 위하여 필요합니다. 더 중요한 것은, 일반적으로 유리 모세관에 의해 분리된 탈모세포의 적어도 20%는 자발적인 난소 세포 성숙을 겪을 수 있다. 대조적으로, 디누드 난초의 1%를 초과하지 않는 것은 집게를 사용하여 자발적인 난모세포 성숙을 겪을 수 있습니다. 따라서, 유리 모세관을 이용한 새로운 방법의 효율성과 효과는 이전에 확립된 방법보다 더 낫다. 둘째, 이 방법은 PV, EV 및 MV 단계와 같은 초기 발달 단계에서 난소 여포의 여포 세포 및 난모를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 분리는 현재 방법론을 사용하여 초기 단계 여포에서 수행 할 수 없습니다.
이 방법을 사용하는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 예를 들어, 유리 모세관 개구의 적절한 직경은 이 방법으로 여포 세포 및 난모세포의 분리에 매우 중요합니다. 난소 여포의 크기보다 훨씬 크거나 작은 개방은 분리의 실패로 이어질 것입니다. 따라서, 유리 모세관의 개구름은 난소 여포의 크기에 따라 조정되어야 하며, 이는 몇 가지 연습이 필요하다.
여포 세포와 난모세포의 분리는 난소 발달을 공부하는 데 여러 가지 응용 프로그램이 있습니다. 이 방법에 의해 얻어진 난소 여포의 상이한 단계에서 여포 세포 및 난모세포는 유전자 발현을 분석하기 위하여 이용될 수 있다. 분리된 여포 세포는 1차 세포 배양에 사용될 수 있다. 분리된 탈누드 난우피는 여포 세포와 난모세포 사이의 교차토크를 조사하는 데 유용하며, 난소성 성숙도를 연구하기 위한 좋은 모델을 공급한다. 또한, 이러한 방법은 체외 내피세포 성숙 또는 체외 수정과 같은 일부 소세포에서 여포 세포를 제거하는 데 사용될 수 있다. 분리의 용이성과 속도를 크게 증가시키는 방법의 가용성은 난소 발달의 복잡성을 이해하는 장기적인 목표에 제브라피시 난소 여포의 광범위한 착취를 촉진해야합니다. 또한 난소 여포의 구조는 다른 어종들 사이에서 유사합니다. 따라서 이 방법이 다른 물고기에도 적용될 수 있는지 여부를 테스트하는 것은 흥미롭습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구 작업은 중국 국립 자연과학 재단[32060170, 31601205 및 31560334]에 의해 지원되었으며, 중국 장학위원회가 지원하는 장학금 프로젝트와 담수 생태 및 생명공학 국가 핵심 연구소 기금 [2020FB05]에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
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