Summary
Здесь мы представляем простой метод разделения фолликулярной клетки и яйцеклетки в фолликулах яичников зебры, что облегчит исследования развития яичников у зебры.
Abstract
Зебрафиш стала идеальной моделью для изучения развития яичников позвоночных. Фолликул является основной единицей яичника, который состоит из яйцеклеток и окружающих фолликулярных клеток. Очень важно отделить фолликулярные клетки и яйцеклетки для различных исследовательских целей, таких как первичная культура фолликулярной клетки, анализ экспрессии генов, созревание яйцеклеток и экстракорпоральное оплодотворение и т.д. Обычный метод использует типсы, чтобы отделить оба отсека, что является трудоемким, трудоемким и имеет высокий урон яйцеклетки. Здесь мы создали простой метод, чтобы отделить оба отсека с помощью вытащил стеклянный капилляр. Под стереомикроскопом, яйцеклетки и фолликулярные клетки могут быть легко разделены трубопроводов в вытащил тонкой стеклянной капиллярной (диаметр зависит от диаметра фолликула). По сравнению с обычным методом, этот новый метод имеет высокую эффективность в разделении обоих яйцеклеток и фолликулярной клетки и имеет низкий ущерб яйцеклеток. Что еще более важно, этот метод может быть применен к фолликулам на ранних стадиях, в том числе на стадии превителлогенеза. Таким образом, этот простой метод может быть использован для отдельных фолликулярных клеток и яйцеклеток зебры.
Introduction
Зебрафиш является основным моделью организма для изучения развития позвоночных и физиологии. Зебрафиш может служить хорошей моделью для изучения молекулярных механизмов развития яичников1,2,3. Многие особенности развития яичников значительно сохранены в процессе эволюции от рыбы кмлекопитающим 1,2. Как и у других позвоночных, у взрослых зебры асинхронные яичники, содержащие фолликулы яичников всех стадий развития4. Фолликул является основным репродуктивным элементом яичника. Фолликул состоит из яйцеклетки, которая окружена одним или несколькими слоями соматических клеток, называемых фолликулярными клетками. Развитие фолликулов зависит от двунаправленной связи между яйцеклетками и фолликулярными клетками5. Очень важно отделить фолликулярные клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников для различных исследовательских целей, таких как фолликулярная клеточная первичная культура, анализ экспрессии генов, созревание яйцеклеток и экстракорпоральное оплодотворение.
Традиционные методы разделения включают механическое разделение типсами и энзиматическое пищеварение6,7,8,9,10. Тем не менее, механическое разделение типсами является трудоемким и трудоемким. Это также приведет к высокому повреждению яйцеклетки во время разделения. Хотя метод переваривания ферментов прост в эксплуатации и требует короткого времени, время лечения и концентрация ферментов должны быть проверены, и целостность и выживаемость изолированных яйцеклеток не являются идеальными. Таким образом, мы создали простой метод, чтобы отделить оба отсека на разных стадиях развития с помощью вытащил стеклянные капиллярные трубки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, выполняемые в рыбных экспериментах, соответствуют правилам Комитета по этике экспериментов на животных Северо-Западного нормального университета.
1. Подготовка
- животные
- Используйте взрослую самку зебры с длиной тела 4-6 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали зебру с местного рынка. - Держите зебру в циркулированную систему водоснабжения с 14 ч света и 10 ч темного цикла около 28 градусов по Цельсию.
- Кормите рыбу два раза в день недавно вылупившихся рассолом креветок.
- Используйте взрослую самку зебры с длиной тела 4-6 см.
- Вытащил стеклянный капилляр
- Используйте 15-сантиметровый стеклянный капилляр и поместите его голову в горелку для алкоголя, чтобы нагреть его. Держите один конец стеклянной капиллярной руки и держите другой конец типсами.
- После нагрева через 5-10 секунд стекло при возгорании спиртовой горелки становится красным и мягким. Растянуть голову стеклянной капиллярной с типсами, чтобы капиллярное отверстие с требуемым диаметром.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр зависит от диаметров фолликула: превителлогенный (PV; около 0,30 мм в диаметре), ранний вителлогенный (EV; около 0,40 мм в диаметре), мидвителлогенный (MV; около 0,50 мм в диаметре), поздний вителлогенный (LV; около 0,60 мм в диаметре) и полностью выращенный, но незрелый (FG; около 0,65 мм в диаметре). - Растянуть отверстие стеклянной капиллярной до соответствующего диаметра, который немного меньше размера разделенных фолликулов. Стеклянные капилляры с отверстием гораздо больше, чем размер фолликулов яичников не может выполнять разделение, но гораздо меньше из них будет разорвать фолликулов во время разделения. Практика растяжения стеклянной капиллярной несколько раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время нагрева зависит от размера стеклянной капиллярной. Не напрямую растягивайте стеклянную капиллярную часть на огонь спиртовой горелки. Он разбеет стеклянную капиллярную. - Вырезать стеклянный капилляр с резаком ампулы и разорвать стеклянный капилляр с типсами, чтобы получить плавный разрез.
ПРИМЕЧАНИЕ: Резкое или сломанное отверстие стеклянного капилляра повредит фолликулы. - Используя пластиковую трубку диаметром 30 см, вставьте наконечник пипетки 1 мл с фильтром на одном конце, вставьте вытянутую стеклянную капиллярную пленку в конце пипетки и соедините наконечник пипетки 200 йл на другом конце.
2. Разделение яйцеклеток зебры и фолликулярной клетки на разных стадиях
- Рассечение яичников зебры
- Заполните ведро со льдом до 4/5 полный со льдом суспензии и добавить достаточное количество рыбной воды, чтобы суспензии льда плавать. Подождите 2-5 минут, проверьте температуру воды, и убедитесь, что температура между 2-4 градусов по Цельсию.
- Обезботь взрослых самок, поместив рыбу в ледяную воду, по крайней мере 2-5 минут, пока рыба остановить жаберное движение. Обезглавить рыбу, разодровив спинной мозг с помощью острых ножниц для обеспечения смерти.
- Поместите рыбу на вскрытии пластины с типсами.
- Используйте рассечение ножницами, чтобы сократить следующим образом. Рассекаете от клоаки до жабры вдоль средней линии живота. Вырезать из задней части клоака. Отрежьте от переднего кончика к спинной стороне. Аккуратно удалите кожу и мышцы с одной стороны тела. Разоблачить внутренние органы и вытащить весь яичник с типсами.
- Немедленно аккуратно поместите яичники в 100-мм культурную тарелку, содержащую 60% L-15 (L-15) среды Лейбовица.
- Изоляция фолликулов яичников
ПРИМЕЧАНИЕ: Постановочная система, которую мы приняли, основана на первоначальном определении Selman et al.4.- Вручную изолировать фолликулы различных стадий, используя пару тонких типсов, как описаноранее 8.
- Сгруппив фолликулы яичников на следующие этапы: П.В., EV, MV, LV и FG этапов.
- Отделение фолликулярной клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников
- Положите фолликулы яичников на разных стадиях в чистую чашку Петри, содержащую 60% L-15 среды.
- Используя вытащил стеклянный капилляр из шага 1.2, сосать фолликулы в стеклянный капилляр 2-3 см и выдуть их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда открытие диаметр стеклянных капилляров является целесообразным, фолликул может быть отделен от яйцеклетки путем вдыхания один раз.- Если фолликулярный слой клеток крепится к яйцеклетке твердо, повторите 2-3 раза, чтобы выполнить полное разделение. Избегайте многочисленных попыток заставить фолликул через меньший капилляр, который повредит фолликул.
ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе вдыхания и выдувания фолликулярный слой отпадает и отделяется от яйцеклетки, и, наконец, фолликулярные клетки и огорные ооциты отделяются(рисунок 1).
- Если фолликулярный слой клеток крепится к яйцеклетке твердо, повторите 2-3 раза, чтобы выполнить полное разделение. Избегайте многочисленных попыток заставить фолликул через меньший капилляр, который повредит фолликул.
- Бассейн оголглые, но нетронутые яйцеклетки и собирать выживших оголдовавших яйцеклеток для дальнейших анализов.
- Чтобы выяснить, были ли фолликулярные клетки отделены от нетронутых фолликулов, окрашивать нетронутые фолликулы и отделять яйцеклетки 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).
- Исправить образцы в 4% буферных параформальдегид при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч. Вымойте несколько раз PBS.
- Пятно от DAPI на RT в течение 30 мин. Промывают несколько раз с PBS. Просмотр и фотографирование с помощью флуоресцентной микроскопа (например, Leica DFC7000 T).
- Чтобы подтвердить завершенное разделение, зафиксировать нетронутые фолликулы и разделенные яйцеклетки в 4% буферизированных параформальдегида на ночь при 4 градусов по Цельсию, и вставлять intissue замораживания среды (например, Leica) при -25 градусов по Цельсию.
- Вырезать фиксированные ткани на микротоме, и установить на стеклянные горки.
- Вымойте секции в PBS и визуализировать ядра клеток с DAPI. Просмотр и фотографирование на флуоресцентный микроскоп.
3. Созревание in vitro (IVM) и экстракорпоральное оплодотворение (IVF)
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура IVM ЭКО последовала, как описано ранее с незначительной модификацией 11,12,13.
- Приготовьте свежую среду созревания (среды DHP) перед вскрытием яичников у взрослой самки зебры. Для приготовления свежей среды созревания добавьте 9 мл L-15 среды Лейбовица, рН 9,0, до 15 мл конических трубок. Добавьте 10 л 17'-20'-дигидрокси-4 прегнен-3-один (DHP) (5 мг/мл), 490 л dH2O и 500 л 10% бычьего альбумин сыворотки (BSA).
- Подготовь решение Хэнка и решение E3 заранее. Подготовь решение Хэнкса, как описано Baars et al.14. Подготовка E3 средний: 5 мм NaCl, 0,17 мм ККл, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мММгСО 4, и 1-5% метиленовый синий.
- Выполните вскрытие яичников зебры и изоляции фолликулов яичников, как в шагах шаг 2.
- Соберите полноценные выращенные сценические фолликулы и используйте в качестве незрелых яйцеклеток. Для каждой взрослой самки зебры, по крайней мере 150-200 полных выращенных фолликулов стадии могут быть изолированы. Выберите нетронутые и здоровые фолликулы для IVM.
- Инкубировать полную стадию фолликулов в среде DHP в 12-хорошо пластин, периодически проверяя, чтобы убедиться, что яйцеклетки остаются нетронутыми. Удалите любые лизные яйцеклетки с пипеткой Pasteur.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время созревания яйцеклеток, яйцеклетки станут постепенно полупрозрачными. Большинство яйцеклеток становятся полупрозрачными после лечения DHP в течение 2 ч. Это можно наблюдать под рассеченным микроскопом с передаваемой световой оптикой. - Удалите внешние фолликулярные клетки из каждого созреваемого яйцеклетки, как описано в шаге 2.3.
- Перенесите оголглые яйцеклетки в чашку Петри с несколькими каплями среды культуры и приступайте к оплодотворению.
- Подготовь свежий раствор спермы с помощью яитесов, расчлененных по крайней мере у трех самцов в 500 МКЛ раствора Хэнкса. Положите раствор спермы на лед, где он может сохранить свою потенцию оплодотворения на срок до 2-3 ч.
- Добавьте 100 мкл раствора спермы в оголглые и созреваемые яйцеклетки на чашке Петри. Аккуратно добавьте раствор спермы среди яйцеклеток, и закружить сперму и яйца вместе с помощью наконечника пипетки.
- Немедленно добавьте 1 мл среднего раствора E3, чтобы активировать яйца и снова аккуратно закружить яйца и сперму с помощью наконечника пипетки.
- Примерно через 1 минуту после оплодотворения (mpf), затопить пластину со средним раствором E3. Полное расширение хориона можно наблюдать в пределах 10-15 mpf.
- Между 35-45 mpf, выберите эмбрионы, которые проходят симметричное расщепление в 2-клеточной стадии, и которые поэтому оплодотворены. Удалите эмбрионы, которые не подвергаются расщеплению клеток.
- Разрешить эмбрионы развиваться в чашке Петри при 28 градусов по Цельсию, с ограничением 80 эмбрионов на 10 см пластины. Просмотр и фотографирование развития эмбриона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод может быть использован для отдельных фолликулярных клеток и яйцеклеток на разных стадиях развития фолликула яичников у зебры. На рисунке 1 показано отделение яйцеклеток зебры и фолликулярной клетки от фолликулов яичников с помощью капиллярной стеклянной трубки(рисунок 1). Чтобы исследовать, были ли фолликулярные клетки отделены от нетронутых фолликулов, нетронутые фолликулы и отделенные яйцеклетки от различных стадий фолликулов от стадии. до стадии ФГ были окрашены ДАПИ (50 мкг/мл) при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Ядро фолликулярных клеток может быть окрашено DAPI. Синий сигнал DAPI наблюдался в нетронутых фолликулах, но не оголглых ооцитах(рисунок 2). Это указывает на то, что яйцеклетки и фолликулярные клетки фолликула могут быть разделены чисто этим методом. Чтобы еще больше подтвердить четкое разделение, нетронутые фолликулы и разделенные яйцеклетки были разрезаны на гистологические секции. Результаты окрашивания DAPI показали, что фолликулярные клетки были четко удалены в оголглых яйцеклетках(рисунок 3). Все эти результаты свидетельствуют о том, что этот метод может быть использован для отдельных фолликулярных клеток и яйцеклеток в различных стадии фолликулов зебры.
Этот метод может быть использован для изучения созревания яйцеклеток зебры. Для изучения двунаправленной связи между яйцеклетками и фолликулярными клетками во время созревания яйцеклеток, оголенные яйцеклетки должны быть получены для различных анализов. Используя вытащил стекла капилляров, оголенные яйцеклетки отделены от полной выросли стадии зебры фолликулы были найдены пройти спонтанное созревание яйцеклеток без какого-либо лечения после 4 часов инкубации, как правило, по крайней мере 30% разделенных яйцеклеток выжил и скорость зрелости этих выживших яйцеклеток может быть до 80% (Рисунок 4). Эти созревают яйцеклетки могут пройти полное расширение хориона после размещения в воде, предполагая, что фолликулярные клетки были полностью удалены (Рисунок 4). Таким образом, этот метод может быть использован для получения оголенных яйцеклеток для изучения созревания яйцеклеток зебры.
Этот метод может быть использован для ЭКО у зебры. В пробирке созревания (IVM) методы были хорошо установлены в зебры. Используя эти методы, полностью выращенные сценические фолликулы могут быть выведеныв зрелую стадию 11,12,13,15,16. Для дальнейшего проведения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) фолликулярный слой созревных фолликулов все еще нуждается в ручном удалении. Здесь, IVM зебры была вызвана лечением DHP. Фолликулярный слой созревных фолликулов был удален капиллярной стеклянной трубкой. Эти дефолликулированные яйцеклетки могут быть оплодотворены и превратились в стадию вылупления(рисунок 5). Результат показывает, что этот метод может быть использован для ЭКО у зебры. Обычно около 10% здоровых эмбрионов могут быть получены из созревных яйцеклеток.
Рисунок 1. Отделение фолликулярной клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников зебры с помощью вытащил стеклянный капилляр. 1) Морфология нетронутого фолликула на стадии ФГ. 2) Вдыхание нетронутого фолликула в вытянутый стеклянный капилляр. 3) фолликулярная клетка отделяется от яйцеклетки, когда фолликул выдувается из вытащил стекла капилляров. 4) Успешное разделение фолликулярной клетки и яйцеклетки. Шкала баров: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Морфология нетронутых фолликулов и оголовых яйцеклеток отделена от различных стадий фолликулов после окрашивания DAPI. Нетронутые фолликулы и отделенные яйцеклетки от различных стадий фолликулов от стадии. до стадии ФГ были окрашены DAPI. Синие сигналы DAPI наблюдались в нетронутых фолликулах, но не оголглых яйцеклетках. Шкала баров: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Гистологические участки нетронутых фолликулов и изолированных яйцеклеток после окрашивания DAPI. Ядра клеток фолликулярной клетки визуализировались с помощью окрашивания DAPI. Синий сигнал можно наблюдать. Фолликулярные клетки были четко удалены в оголглых яйцеклетках. Шкала баров: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Созревание и полное расширение хориона оголенных яйцеклеток отделены от полностью выращенных сценических фолликулов с помощью вытянутого стеклянного капилляра. (A)Морфология нетронутых фолликулов на полностью выращенных стадии фолликулов. (B) Оголенные яйцеклетки, отделенные от полностью выращенных сценических фолликулов, могут подвергаться спонтанному созреванию яйцеклеток без какого-либо лечения после 4-часовой инкубации. (C)Созревая яйцеклетка может пройти полное расширение хориона после активации водой. Шкала бар: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. Морфология ранних эмбрионов, полученных с помощью IVM и ЭКО. IVM был вызван лечением DHP (5 мкг/мл) в течение 2 ч. После IVM фолликулярные клетки были удалены из созреваемых яйцеклеток вытянутым стеклянным капилляром. Созревают яйцеклетки были оплодотворены с помощью ЭКО. Было просмотрено и сфотографировано развитие эмбрионов на разных стадиях. Шкала баров: (A-I) 200 мкм, ( J ) 1мм.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем здесь новый метод для простого и быстрого отделения фолликулярной клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников зебры. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с обычным методом. Главным из них является значительно возросшей легкостью разделения с высокой эффективностью и эффективностью, так как требуется только одно и внешнее манипулирование. Этот момент увеличивает применимость к исследователям, которые не хороши в микроскопической анатомии. Согласно нашему опыту, можно успешно отделить фолликулярные клетки и яйцеклетки от полностью выращенного сценического фолликула в пределах 5-10 с использованием стеклянной капиллярной. Тем не менее, по крайней мере 30-60 с необходимо сделать это разделение с помощью типсов. Что еще более важно, как правило, по крайней мере 20% оголенных яйцеклеток, разделенных стеклянной капиллярной может пройти спонтанное созревание яйцеклеток. В отличие от этого, не более 1% оголенных яйцеклеток может пройти спонтанное созревание яйцеклеток с помощью хлипов. Таким образом, эффективность и эффективность нового метода с использованием стеклянного капилляра лучше, чем ранее установленный метод с использованием хлипса. Во-вторых, этот метод может быть использован для отдельных фолликулярной клетки и яйцеклетки фолликулов яичников на ранних стадиях развития, таких как., EV, и MV этапов. Такое разделение не может быть выполнено на ранних стадиях фолликулов с использованием текущих методологий.
Есть также несколько ограничений с помощью этого метода. Например, соответствующий диаметр стеклянного капиллярного отверстия имеет решающее значение для разделения фолликулярной клетки и яйцеклетки в этом методе. Открытие гораздо больше или меньше, чем размер фолликулов яичников приведет к отказу разделения. Таким образом, диаметр отверстия стеклянных капилляров следует регулировать в зависимости от размера фолликулов яичников, что требует некоторой практики.
Разделение фолликулярных клеток и яйцеклеток имеет несколько применений в изучении развития яичников. Фолликулярные клетки и яйцеклетки на разных стадиях фолликулов яичников, полученные этим методом, могут быть использованы для анализа экспрессии генов. Разделенные фолликулярные клетки могут быть использованы для первичной клеточной культуры. Разлученные яйцеклетки полезны для изучения перекрестного стебля между фолликулярными клетками и ооцитами, а также являются хорошей моделью для изучения созревания яйцеклеток. Кроме того, этот метод может быть использован для удаления фолликулярной клетки в некоторых анализах, таких как созревание желудочковых яйцеклеток или экстракорпоральное оплодотворение. Наличие метода, который значительно увеличивает легкость и скорость разделения должны способствовать более широкой эксплуатации фолликулов яичников зебры в долгосрочной цели понимания тонкостей развития яичников. Кроме того, структура фолликулов яичников аналогична среди различных видов рыб; таким образом, интересно проверить, может ли этот метод также применяться в других рыб.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта исследовательская работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32060170, 31601205 и 31560334), посетив научный проект при поддержке Китайского стипендиального совета и фонда Государственной ключевой лаборатории пресноводной экологии и биотехнологии (2020FB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C.
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
