Summary
Her presenterer vi en enkel metode for å skille follikulære celler og oocytter i sebrafisk eggstokksekkene, noe som vil lette undersøkelser av eggstokkutvikling i sebrafisk.
Abstract
Sebrafisk har blitt en ideell modell for å studere eggstokkutviklingen av vertebrater. Follikkelen er den grunnleggende enheten av eggstokken, som består av oocytter og omkringliggende follikulære celler. Det er viktig å skille både follikulære celler og oocytter for ulike forskningsformål som for primærkultur av follikulære celler, analyse av genuttrykk, oocyttmodning og in vitro befruktning, etc. Den konvensjonelle metoden bruker tang for å skille begge rommene, som er arbeidskrevende, tidkrevende og har høy skade på oocytten. Her har vi etablert en enkel metode for å skille begge rommene ved hjelp av en trukket glasskapillær. Under et stereomikroskop kan oocytter og follikulære celler lett skilles ved pipettering i en trukket fin glasskapillær (diameteren avhenger av follikkeldiameteren). Sammenlignet med den konvensjonelle metoden har denne nye metoden høy effektivitet i å skille både oocytter og follikulære celler og har lav skade på oocyttene. Enda viktigere er at denne metoden kan brukes på tidlige follikler, inkludert på pre-vitellogenesis stadium. Dermed kan denne enkle metoden brukes til å skille follikulære celler og oocytter av sebrafisk.
Introduction
Sebrafisk er en stor modellorganisme for studiet av virveldyrutvikling og fysiologi. Sebrafisken kan tjene som en god modell for å studere molekylære mekanismer for eggstokkutvikling1,2,3. Mange trekk ved ovarieutvikling er mye bevart under evolusjon fra fisk til pattedyr1,2. I likhet med de andre vertebratene har sebrafisk voksne asynkrone eggstokkene, som inneholder eggstokksekkene i alle utviklingsstadier4. Follikkelen er det grunnleggende reproduktive elementet i eggstokken. Follikkelen består av oocytten som er omgitt av ett eller flere lag med somatiske celler kalt follikulære celler. Utviklingen av follikler avhenger av toveis kommunikasjon mellom oocytter og follikulære celler5. Det er viktig å skille follikulære celler og oocytter fra eggstokksekkene til ulike forskningsformål som follikulær celle primærkultur, genuttrykksanalyse, oocyttmodning og in vitro befruktning.
Tradisjonelle separasjonsmetoder inkluderer mekanisk separasjon av tang og enzymatisk fordøyelse6,7,8,9,10. Imidlertid er den mekaniske separasjonen av tang tidkrevende og arbeidskrevende. Det vil også forårsake den høye skaden på oocytten under separasjon. Selv om enzym fordøyelsesmetoden er enkel å betjene og krever kort tid, bør behandlingstiden og enzymkonsentrasjonen valideres, og integriteten og overlevelsesgraden til de isolerte oocyttene er ikke ideelle. Derfor har vi etablert en enkel metode for å skille begge rommene på forskjellige utviklingsstadier ved hjelp av trukket glass kapillærrør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene som utføres i fiskeforsøk er i samsvar med regelverket i Animal Experimentation Ethics Committee ved Northwest Normal University.
1. Forberedelser
- Dyr
- Bruk voksen kvinnelig sebrafisk med en kroppslengde på 4-6 cm.
MERK: Vi brukte sebrafisk fra et lokalt marked. - Oppbevar sebrafisken i et sirkulert vannsystem med 14 timers lys og 10 timers mørk syklus ved ca. 28 °C.
- Fôr fisk to ganger daglig med nyutviklede saltlake reker.
- Bruk voksen kvinnelig sebrafisk med en kroppslengde på 4-6 cm.
- Trukket glass kapillær
- Bruk en 15 cm glasskapillær og legg hodet i en alkoholbrenner for å varme den opp. Hold den ene enden av glasskapillæren for hånd og hold den andre enden med tang.
- Etter oppvarming 5-10 sekunder blir glasset på brannen av alkoholbrenner rødt og mykt. Strekk hodet på glasskapillæren med tang for å gjøre kapillæråpningen med ønsket diameter.
MERK: Diameteren avhenger av follikkeldiametrene: previtellogene (PV; ca. 0,30 mm i diameter), tidlig vitellogene (EV; ca. 0,40 mm i diameter), midvitellogene (MV; ca. 0,50 mm i diameter), sen vitellogene (LV; ca. 0,60 mm i diameter) og fullvoksen, men umoden (FG; ca. 0,65 mm i diameter). - Strekk åpningen av glass kapillær til riktig diameter, som er litt mindre størrelsen på separerte follikler. Glasskapillæren med en åpning mye større enn størrelsen på eggstokksekkene kan ikke utføre separasjon, men de mye mindre ville bryte folliklene under separasjon. Øv på strekkingen av glasskapillæren flere ganger.
MERK: Oppvarmingstiden avhenger av størrelsen på glasskapillæren. Ikke strekk glasskapillæren direkte på brannen av alkoholbrenner. Det vil bryte glasskapillæren. - Klipp glasskapillæren med en ampullekutter og bryt glasskapillæren med tang for å oppnå et jevnt snitt.
MERK: En skarp eller ødelagt åpning av glasskapillæren vil skade folliklene. - Bruk et 30 cm plastrør, sett inn en 1 ml pipettespiss med et filterelement i den ene enden, sett inn den trukket glasskapillæren på enden av pipetten, og koble til en 200 μL pipettespiss i en annen ende.
2. Separasjon av sebrafisk oocytter og follikulære celler på ulike stadier
- Disseksjon av sebrafisk eggstokken
- Fyll en isbøtte til 4/5 full med slurry is og tilsett tilstrekkelig fiskevann for å la slurry is flyte. Vent 2-5 minutter, kontroller vanntemperaturen, og sørg for at temperaturen er mellom 2-4 °C.
- Bedøv voksne kvinner ved å plassere fisk i isvannet i minst 2-5 minutter, til fisken stopper gjellebevegelsen. Decapitate fisken ved å kutte ryggmargen ved hjelp av en skarp saks for å sikre døden.
- Plasser fisken på dissekeringsplaten med tang.
- Bruk dissekering saks for å kutte som følger. Disseker fra cloaca til gjellene langs midtlinjen av magen. Klipp fra baksiden av cloaca. Klipp fra den fremre spissen til dorsalsiden. Fjern forsiktig huden og musklene på den ene siden av kroppen. Utsett de indre organene og ta ut hele eggstokken med tang.
- Legg straks eggstokkene forsiktig inn i en 100 mm kulturrett som inneholder 60% Leibovitz L-15 (L-15) medium.
- Isolering av eggstokksekkene
MERK: Iscenesettelsessystemet som vi har vedtatt er basert på den opprinnelige definisjonen av Selman et al.4.- Isoler follikler av forskjellige stadier manuelt ved hjelp av et par fine tang som beskrevet tidligere8.
- Grupper eggstokksekkene i følgende stadier: PV-, EV-, MV-, LV- og FG-stadier.
- Separasjon av follikulære celler og oocytt fra eggstokksekkene
- Legg eggstokksekkene på forskjellige stadier i en ren Petri-tallerken som inneholder 60% L-15 medium.
- Bruk den trukket glasskapillæren fra trinn 1.2, suge folliklene inn i glasskapillæren 2-3 cm og blåse dem ut.
MERK: Når glasskapillærens åpningsdiameter er passende, kan follikkelen skilles fra oocytten ved innånding en gang.- Hvis follikulært cellelag er festet til oocytten fast, gjenta 2-3 ganger for å oppnå en fullstendig separasjon. Unngå flere forsøk på å tvinge en follikkel gjennom en mindre kapillær, noe som vil skade follikkelen.
MERK: I prosessen med innånding og utblåsning faller follikulærlaget av og skiller seg fra oocytten, og til slutt separeres follikulære celler og denuderte oocytter (Figur 1).
- Hvis follikulært cellelag er festet til oocytten fast, gjenta 2-3 ganger for å oppnå en fullstendig separasjon. Unngå flere forsøk på å tvinge en follikkel gjennom en mindre kapillær, noe som vil skade follikkelen.
- Samle de benektede, men intakte oocyttene og samle de overlevende denuded oocytes for ytterligere analyser.
- For å undersøke om follikulære celler ble skilt fra intakte follikler, flekk de intakte folliklene og separerte oocytter med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
- Fest prøvene i 4% bufret paraformaldehyd ved romtemperatur (RT) i 1 time. Vask flere ganger med PBS.
- Flekk ved DAPI ved RT i 30 min. Vasket flere ganger med PBS. Vis og fotografi med et fluorescensmikroskop (f.eks. Leica DFC7000 T).
- For å bekrefte den fullførte separasjonen, fest de intakte folliklene og separerte oocytter i 4% bufret paraformaldehyd over natten ved 4 °C, og legg inn intissuefrysende medium (f.eks. Leica) ved -25 °C.
- Klipp det faste vevet på en mikrotom, og monter på glasssklier.
- Vask seksjonene i PBS og visualiser cellekjernene med DAPI. Se og fotografi på et fluorescensmikroskop.
3. In vitro modning (IVM) og in vitro befruktning (IVF)
MERK: Prosedyren for IVM av IVF ble fulgt som beskrevet tidligere med mindre modifikasjon 11,12,13.
- Forbered fersk modningsmedium (+DHP medium) før eggløsning fra voksen sebrafisk kvinne. For å forberede det friske modningsmediet, tilsett 9 ml Leibovitz L-15 medium, pH 9,0, til 15 ml koniske rør. Tilsett 10 μL 17α-20β-dihydroksy-4 pregnen-3-en (DHP) (5 mg/ml), 490 μL dH2O og 500 μL av 10% bovint serumalbumin (BSA).
- Forbered Hanks løsning og E3-løsning på forhånd. Forbered Hanks løsning som beskrevet av Baars et al.14. Forbered E3 medium: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4og 1-5% metylenblå.
- Utfør disseksjon av sebrafisk eggstokk og isolasjon av eggstokksekkene som i trinn 2.
- Samle fullvoksne scenesekkene og bruk som umodne oocytter. For hver voksen kvinnelig sebrafisk kan minst 150-200 fullvoksne scenesekkene isoleres. Velg de intakte og sunne folliklene for IVM.
- Inkuber de fullvoksne scenesekkene i +DHP-medium i 12-brønnsplater, kontroller regelmessig for å sikre at oocyttene forblir intakte. Fjern eventuelle lysing oocytter med en Pasteur pipette.
MERK: Under oocyttmodningen vil oocyttene bli gradvis gjennomskinnelige. Et flertall av oocyttene blir gjennomskinnelige etter behandling av DHP i 2 timer. Dette kan observeres under et dissekerende mikroskop med overført lysoptikk. - Fjern de ytterste follikulære cellene fra hver modnet oocytt som beskrevet i trinn 2.3.
- Overfør de denuderte oocyttene til en Petri-tallerken med noen dråper kulturmedium og fortsett til befruktning.
- Forbered den ferske sædløsningen ved hjelp av testikler dissekert fra minst tre hanner i 500 μL av Hanks løsning. Sett sædoppløsningen på is, hvor den kan holde sin styrke av befruktning i opptil 2-3 timer.
- Tilsett 100 μL sædoppløsning til denuded & modne oocytter på en Petri-tallerken. Tilsett forsiktig sædoppløsningen blant eggene, og virvle sæden og eggene sammen ved hjelp av en pipettespiss.
- Tilsett umiddelbart 1 ml E3 medium løsning for å aktivere eggene og igjen forsiktig virvle egg og sæd ved hjelp av en pipettespiss.
- Etter ca. 1 minutt etter befruktning (mpf), oversvømme platen med E3 middels løsning. Full korutvidelse kan observeres innen 10-15 mpf.
- Mellom 35-45 mpf, velg embryoene som gjennomgår symmetrisk spalting inn i 2-cellersstadiet, og som derfor befruktes. Fjern embryoer som ikke gjennomgår cellespalting.
- La embryoer utvikle seg i Petri-parabolen ved 28 °C, med en grense på 80 embryoer per 10 cm plate. Se og fotografere embryoutviklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden kan brukes til å skille follikulære celler og oocytter på ulike stadier av ovarial follikkelutvikling i sebrafisk. Figur 1 viser separasjon av sebrafiskoocytter og follikulære celler fra eggstokksekkene ved hjelp av et kapillærglassrør (figur 1). For å undersøke om follikulære celler ble skilt fra intakte follikler, ble de intakte folliklene og separerte oocytter fra ulike stadier av follikler fra PV-stadiet til FG-scenen farget med DAPI (50 μg/ml) ved 37 °C i 30 minutter. Kjernen i follikulære celler kan farges av DAPI. Det blå signalet til DAPI ble observert i intakte follikler, men ikke denuded oocytter (Figur 2). Dette indikerer at oocyttene og follikulære cellene i follikkelen kan skilles rent ved denne metoden. For ytterligere å bekrefte den klare separasjonen ble de intakte folliklene og separerte oocytter kuttet inn i de histologiske delene. DAPI-fargeresultater viste at follikulære celler ble tydelig fjernet i denuderte oocytter (figur 3). Alle disse resultatene tyder på at denne metoden kan brukes til å skille follikulære celler og oocytter i forskjellige stadiumsekkene av sebrafisk.
Denne metoden kan brukes til å studere oocyttmodning av sebrafisk. For å studere den toveis kommunikasjonen mellom oocytter og follikulære celler under oocyttmodningen, må de denuderte oocyttene oppnås for ulike analyser. Ved hjelp av en trukket glasskapillær ble de denuderte oocyttene skilt fra fullvoksne sebrafiskfoskler funnet å gjennomgå den spontane oocyttmodningen uten behandling etter 4 timers inkubasjon, vanligvis overlevde minst 30% separerte oocytter og modenheten til disse overlevde oocytter kunne være opptil 80% (Figur 4). Disse modne oocyttene kunne gjennomgå hele korets ekspansjon etter plassering i vannet, noe som tyder på at follikulære celler ble fullstendig fjernet (Figur 4). Dermed kan denne metoden brukes til å skaffe de denuded oocytter for å studere oocyttmodning av sebrafisk.
Denne metoden kan brukes til IVF i sebrafisk. In vitro modningsmetoder (IVM) er godt etablert i sebrafisk. Ved hjelp av disse metodene kan de fullvoksne scenesekkene induseres i modnet stadium11,12,13,15,16. For å utføre in vitro befruktning (IVF) må det follikulære laget av modne follikler fortsatt fjernes manuelt. Her ble IVM av sebrafisk indusert ved behandling av DHP. Det follikulære laget av modne follikler ble fjernet av et kapillærglassrør. Disse avfolliculated oocytter kan befruktes og utvikles til klekkestadiet (Figur 5). Resultatet antyder at denne metoden kan brukes til IVF i sebrafisk. Vanligvis kan rundt 10% av sunne embryoer fås fra modne oocytter.
Figur 1. Separasjon av follikulære celler og oocytter fra sebrafisk eggstokksekkene ved hjelp av en trukket glasskapillær. 1) Morfologien til den intakte follikkelen på FG-scenen. 2) Innånding av den intakte follikkelen i den trukket glasskapillæren. 3) Follikulærcellen løsnes fra oocytten når follikkelen blåses ut av den trukket glasskapillæren. 4) Vellykket separasjon av follikulære celler og oocytt. Skalastenger: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Morfologien til intakte follikler og denuderte oocytter skilt fra forskjellige stadier av follikler etter DAPI-farging. De intakte folliklene og separerte oocytter fra ulike stadier av follikler fra PV-stadium til FG-stadium ble farget av DAPI. De blå signalene fra DAPI ble observert i intakte follikler, men ikke benektet oocytt. Skalastenger: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Histologiske deler av intakte follikler og isolerte oocytter etter DAPI-farging. Cellekjerner av follikulære celler ble visualisert med DAPI-farging. Det blå signalet kan observeres. Follikulære celler ble tydelig fjernet i denuderte oocytter. Skalastenger: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Modning og full chorion utvidelse av denuded oocytter skilt fra fullvoksne scene follikler ved hjelp av en trukket glass kapillær. (A) Morfologien til intakte follikler på fullvoksne trinnsekkene. (B) De denuderte oocyttene atskilt fra fullvoksne trinnsekkene kan gjennomgå spontan oocyttmodning uten behandling etter 4 timers inkubasjon. (C) De modne oocyttene kan gjennomgå full chorion ekspansjon etter aktivering med vann. Skalalinje: 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Morfologien til tidlige embryoer oppnådd ved IVM og IVF. IVM ble indusert ved behandling av DHP (5 μg/ml) i 2 timer. Etter IVM ble follikulære celler fjernet fra de modne oocyttene av en trukket glasskapillær. De modne oocyttene ble befruktet av IVF. Utviklingen av embryoer på ulike stadier ble sett og fotografert. Skalastenger: (A-I) 200 μm, (J) 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en ny metode for enkel og rask separasjon av follikulære celler og oocytter fra sebrafisk eggstokksekkene. Denne metoden har flere fordeler i forhold til den konvensjonelle metoden. Primært blant disse er den sterkt økte separasjonen med høy effektivitet og effektivitet, da bare en enkelt og ekstern manipulering er nødvendig. Dette punktet øker anvendbarheten til forskere som ikke er flinke til mikroskopisk anatomi. Vår erfaring er at man med hell kan skille follikulære celler og oocytter fra en fullvoksen scenesekk innen 5-10 s ved hjelp av glasskapillæren. Imidlertid er det nødvendig med minst 30-60 s for å gjøre denne separasjonen ved hjelp av tang. Enda viktigere, vanligvis kan minst 20% av de denuderte oocyttene skilt av glasskapillæren gjennomgå spontan oocyttmodning. I motsetning kan ikke utover 1% av de denuderte oocyttene gjennomgå spontan oocyttmodning ved hjelp av tang. Dermed er effektiviteten og effektiviteten til den nye metoden ved hjelp av glasskapillær bedre enn den tidligere etablerte metoden ved hjelp av tang. For det andre kan denne metoden brukes til å skille follikulært celld og oocytterted av eggstokksekkene i tidlige utviklingsstadier som PV-, EV- og MV-stadier. Slik separasjon kan ikke utføres ved tidlige follikler ved hjelp av gjeldende metoder.
Det er også noen begrensninger ved hjelp av denne metoden. For eksempel er riktig diameter av glass kapillæråpning avgjørende for separasjon av follikulære celler og oocytter i denne metoden. En åpning mye større eller mindre enn størrelsen på eggstokksekkene ville føre til svikt i separasjon. Dermed bør åpningsdiameteren til glasskapillær justeres avhengig av størrelsen på eggstokksekkene, noe som trenger litt øvelse.
Separasjon av follikulære celler og oocytter har flere anvendelser i å studere eggstokkutvikling. Follikulære celler og oocytter på ulike stadier av eggstokksekkene oppnådd ved denne metoden kan brukes til å analysere genuttrykk. Follikulære celler separert kan brukes til primærcellekultur. Denuded oocytter separert er nyttige for å undersøke krysstale mellom follikulære celler og oocytter, og gi en god modell for å studere oocyttmodning. I tillegg kan denne metoden brukes til å fjerne follikulære celler i noen analyser som in vitro oocyttmodning eller in vitro befruktning. Tilgjengeligheten av en metode som i stor grad øker lettheten og hastigheten på separasjon, bør lette bredere utnyttelse av sebrafisk eggstokksekkene i det langsiktige målet om å forstå vanskelighetene ved eggstokkutvikling. I tillegg er strukturen av eggstokksekkene lik blant forskjellige fiskearter; Dermed er det interessant å teste om denne metoden også kan brukes i andre fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette forskningsarbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 og 31560334], gjesteforskerprosjekt støttet av China Scholarship Council og fondet til State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C.
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
