Summary
Aqui, apresentamos um método simples para separar células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish, o que facilitará investigações do desenvolvimento ovariano em zebrafish.
Abstract
O zebrafish tornou-se um modelo ideal para estudar o desenvolvimento ovariano de vertebrados. O folículo é a unidade básica do ovário, que consiste em oócitos e células foliculares circundantes. É vital separar células foliculares e oócitos para vários fins de pesquisa, como para a cultura primária das células foliculares, análise da expressão genética, maturação de oócitos e fertilização in vitro, etc. O método convencional usa fórceps para separar ambos os compartimentos, o que é trabalhoso, demorado e tem alto dano ao oócito. Aqui, estabelecemos um método simples para separar ambos os compartimentos usando um capilar de vidro puxado. Sob um estereótipo, oócitos e células foliculares podem ser facilmente separados por tubulação em um capilar de vidro fino puxado (o diâmetro depende do diâmetro do folículo). Comparado com o método convencional, este novo método tem alta eficiência na separação de oócitos e células foliculares e tem baixo dano aos oócitos. Mais importante, este método pode ser aplicado a folículos em estágio inicial, inclusive na fase pré-vitellogênese. Assim, este método simples pode ser usado para separar células foliculares e oócitos de zebrafish.
Introduction
O zebrafish é um dos principais organismos modelo para o estudo do desenvolvimento de vertebrados e fisiologia. O zebrafish pode servir como um bom modelo para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento ovariano1,2,3. Muitas características do desenvolvimento ovariano são muito conservadas durante a evolução de peixes para mamíferos1,2. Semelhante aos outros vertebrados, os adultos de zebrafish têm ovários assíncronsos, contendo folículos ovarianos de todos os estágios de desenvolvimento4. O folículo é o elemento reprodutivo fundamental do ovário. O folículo consiste no oócito que é cercado por uma ou várias camadas de células somáticas chamadas células foliculares. O desenvolvimento de folículos depende da comunicação bidirecional entre oócitos e células foliculares5. É vital separar células foliculares e oócitos dos folículos ovarianos para diferentes propósitos de pesquisa, como cultura primária de células foliculares, análise de expressão genética, maturação de oócitos e fertilização in vitro.
Os métodos tradicionais de separação incluem separação mecânica por fórceps e digestão enzimática6,7,8,9,10. No entanto, a separação mecânica por fórceps é demorada e trabalhosa. Também causará o alto dano ao oócito durante a separação. Embora o método de digestão da enzima seja simples de operar e exija um curto espaço de tempo, o tempo de tratamento e a concentração enzimática devem ser validados, e a taxa de integridade e sobrevivência dos oócitos isolados não são ideais. Por isso, estabelecemos um método simples para separar ambos os compartimentos em diferentes estágios de desenvolvimento usando tubos capilares de vidro puxados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos realizados em experimentos com peixes estão de acordo com as normas do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Normal do Noroeste.
1. Preparativos
- Animais
- Use zebrafish fêmea adulta com um comprimento corporal de 4-6 cm.
NOTA: Usamos zebrafish de um mercado local. - Mantenha o zebrafish em um sistema de água circulado com uma luz de 14 horas e ciclo escuro de 10h a cerca de 28 °C.
- Alimente os peixes duas vezes por dia com camarão de salmoura recém-eclodido.
- Use zebrafish fêmea adulta com um comprimento corporal de 4-6 cm.
- Capilar de vidro puxado
- Use um capilar de vidro de 15 cm e coloque sua cabeça em um queimador de álcool para aquecê-lo. Segure uma extremidade de vidro capilar à mão e segure a outra extremidade com fórceps.
- Após o aquecimento de 5 a 10 segundos, o vidro no fogo do queimador de álcool fica vermelho e macio. Estique a cabeça do capilar de vidro com fórceps para fazer a abertura capilar com diâmetro necessário.
NOTA: O diâmetro depende dos diâmetros do folículo: previtellogênico (PV; cerca de 0,30 mm de diâmetro), vitellogenic precoce (EV; cerca de 0,40 mm de diâmetro), midvitellogenic (MV; cerca de 0,50 mm de diâmetro), vitellogenic tardio (LV; cerca de 0,60 mm de diâmetro) e adulto completo, mas imaturo (FG; cerca de 0,65 mm de diâmetro). - Estique a abertura do capilar de vidro até o diâmetro apropriado, que é ligeiramente menor do tamanho de folículos separados. O capilar de vidro com uma abertura muito maior do que o tamanho dos folículos ovarianos não pode realizar a separação, mas os muito menores quebrariam os folículos durante a separação. Pratique o alongamento do capilar de vidro várias vezes.
NOTA: O tempo de aquecimento depende do tamanho do capilar de vidro. Não estique diretamente o capilar de vidro no fogo do queimador de álcool. Vai quebrar o capilar de vidro. - Corte o capilar de vidro com um cortador de ampola e quebre o capilar de vidro com fórceps para obter uma incisão lisa.
NOTA: Uma abertura afiada ou quebrada do capilar de vidro danificaria os folículos. - Usando um tubo de plástico de 30 cm, insira uma ponta de pipeta de 1 mL com um elemento filtro em uma extremidade, insira o capilar de vidro puxado na extremidade da pipeta e conecte uma ponta de pipeta de 200 μL em outra extremidade.
2. Separação de oócitos de zebrafish e células foliculares em diferentes estágios
- Dissecção do ovário de zebrafish
- Encha um balde de gelo até 4/5 cheio com gelo de chorume e adicione água suficiente para deixar o gelo de chorume flutuar. Espere de 2 a 5 minutos, verifique a temperatura da água e certifique-se de que a temperatura está entre 2-4 °C.
- Anestesia as fêmeas adultas colocando peixes na água gelada por pelo menos 2-5 minutos, até que os peixes parem o movimento da brânquia. Decapite o peixe cortando a medula espinhal usando uma tesoura afiada para garantir a morte.
- Coloque o peixe na placa de dissecação com fórceps.
- Use a tesoura dissecando para cortar da seguinte forma. Disseca da cloaca até as brânquias ao longo da linha média do abdômen. Corte da parte de trás da cloaca. Corte da ponta anterior para o lado dorsal. Remova suavemente a pele e os músculos de um lado do corpo. Exponha os órgãos internos e tire todo o ovário com fórceps.
- Imediatamente, coloque os ovários suavemente em um prato de cultura de 100 mm contendo 60% do meio L-15 (L-15) de Leibovitz de 60%.
- Isolamento dos folículos ovarianos
NOTA: O sistema de encenação que adotamos baseia-se na definição original de Selman et al.4.- Isolar manualmente folículos de diferentes estágios usando um par de fórceps finos como descrito anteriormente8.
- Agrupar os folículos ovarianos nas seguintes etapas: estágios PV, EV, MV, LV e FG.
- Separação de células foliculares e oócito dos folículos ovarianos
- Coloque os folículos ovarianos em diferentes estágios em uma placa de Petri limpa contendo 60% de meio L-15.
- Usando o capilar de vidro puxado do passo 1.2, chupe os folículos no capilar de vidro de 2-3 cm e exploda-os.
NOTA: Quando o diâmetro de abertura dos capilares de vidro é apropriado, o folículo pode ser separado do oócito por inalação uma vez.- Se a camada de célula folicular estiver presa firmemente ao oócito, repita 2-3 vezes para realizar uma separação completa. Evite múltiplas tentativas de forçar um folículo através de um capilar menor, o que danificaria o folículo.
NOTA: No processo de inalação e sopro, a camada folicular cai e se separa do oócito, e, finalmente, células foliculares e oócitos desnudados são separados(Figura 1).
- Se a camada de célula folicular estiver presa firmemente ao oócito, repita 2-3 vezes para realizar uma separação completa. Evite múltiplas tentativas de forçar um folículo através de um capilar menor, o que danificaria o folículo.
- Junte os oócitos desnudos, mas intactos, e colete os oócitos desnudados sobreviventes para mais ensaios.
- Para investigar se as células foliculares foram separadas dos folículos intactos, manchar os folículos intactos e osócitos separados com 4',6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI).
- Fixar as amostras em paraformaldeído tampão de 4% à temperatura ambiente (TR) por 1 h. Lave várias vezes pela PBS.
- Mancha por DAPI em RT por 30 min. Lavado várias vezes com PBS. Ver e fotografar com um microscópio de fluorescência (por exemplo, Leica DFC7000 T).
- Para confirmar a separação completa, fixar os folículos intactos e oócitos separados em paraformaldeído tamponado de 4% durante a noite a 4 °C, e incorporar meio de congelamento de intissue (por exemplo, Leica) a -25 °C.
- Corte os tecidos fixos em um microtómeo e monte em lâminas de vidro.
- Lave as seções em PBS e visualize os núcleos celulares com DAPI. Ver e fotografar em um microscópio de fluorescência.
3. Maturação in vitro (IVM) e fertilização in vitro (FIV)
NOTA: O procedimento de IVM de FIV foi seguido como descrito anteriormente com pequena modificação 11,12,13.
- Prepare o meio de maturação fresco (+meio DHP) antes da dissecção do ovário da fêmea de zebrafish adulto. Para preparar o meio de maturação fresco, adicione 9 mL do meio L-15 de Leibovitz, pH 9.0, a tubos cônicos de 15 mL. Adicione 10 μL de 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/mL), 490 μL de dH2O, e 500 μL de 10% de albumina de soro bovino (BSA).
- Prepare a solução de Hank e a solução E3 com antecedência. Prepare a solução de Hanks, conforme descrito por Baars et al.14. Prepare E3 médio: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4e 1-5% Azul de Metileno.
- Realizar dissecção do ovário de zebrafish e isolamento de folículos ovarianos como nas etapas passo 2.
- Colete folículos de estágio adulto completo e use como oócitos imaturos. Para cada zebrafish fêmea adulta, pelo menos 150-200 folículos de estágio adulto podem ser isolados. Selecione os folículos intactos e saudáveis para IVM.
- Incubar os folículos de estágio completo em média +DHP em placas de 12 poços, verificando periodicamente para garantir que os oócitos permaneçam intactos. Remova os oócitos de lise com uma pipeta Pasteur.
NOTA: Durante a maturação do oócito, os oócitos se tornarão progressivamente translúcidos. A maioria dos oócitos tornam-se translúcidos após o tratamento de DHP por 2 h. Isso pode ser observado sob um microscópio dissecando com óptica de luz transmitida. - Remova as células foliculares mais externas de cada oócito amadurecido, conforme descrito na etapa 2.3.
- Transfira os oócitos desnudos para uma placa de Petri com algumas gotas de cultura média e prossiga para fertilização.
- Prepare a solução de esperma fresco usando testículos dissecados de pelo menos três machos em 500 μL da solução de Hanks. Coloque a solução de esperma no gelo, onde pode manter sua potência de fertilização por até 2-3 h.
- Adicione 100 μL de solução de esperma para oócitos desnudados e maduros em uma placa de Petri. Adicione suavemente a solução de esperma entre os óvulos, e gire o esperma e os óvulos juntos usando uma ponta de pipeta.
- Adicione imediatamente 1 mL de solução média E3 para ativar os óvulos e novamente redemoinho suavemente de óvulos e esperma usando uma ponta de pipeta.
- Após cerca de 1 minuto após a fertilização (mpf), alagam a placa com solução média E3. A expansão completa do acorde pode ser observada dentro de 10-15 mpf.
- Entre 35-45 mpf, selecione os embriões que estão submetidos ao decote simétrico no estágio de 2 células e, portanto, fertilizados. Remova embriões que não estão submetidos ao decote celular.
- Permita que os embriões se desenvolvam na placa de Petri a 28 °C, com um limite de 80 embriões por placa de 10 cm. Veja e fotografe o desenvolvimento do embrião.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este método pode ser usado para separar células foliculares e oócitos em diferentes estágios do desenvolvimento do folículo ovariano em zebrafish. A Figura 1 mostra a separação de oócitos de zebrafish e células foliculares dos folículos ovarianos usando um tubo de vidro capilar(Figura 1). Para investigar se as células foliculares foram separadas dos folículos intactos, os folículos intactos e osócitos separados de diferentes estágios dos folículos do estágio PV para o estágio FG foram manchados com DAPI (50 μg/mL) a 37 °C por 30 minutos. O núcleo das células foliculares pode ser manchado pelo DAPI. O sinal azul do DAPI foi observado em folículos intactos, mas não oócitos desnudados(Figura 2). Isso indica que os oócitos e as células foliculares do folículo podem ser separados limpamente por este método. Para confirmar ainda mais a separação clara, os folículos intactos e os oócitos separados foram cortados nas seções histológicas. Os resultados da coloração do DAPI mostraram que as células foliculares foram claramente removidas em oócitos desnudados(Figura 3). Todos esses resultados sugerem que este método pode ser usado para separar células foliculares e oócitos em diferentes folículos de estágio de zebrafish.
Este método pode ser usado para estudar a maturação oócida de zebrafish. Para estudar a comunicação bidirecional entre oócitos e células foliculares durante a maturação do oócito, os oócitos desnudados devem ser obtidos para vários ensaios. Usando um capilar de vidro puxado, os oócitos desnudados separados dos folículos de zebrafish em estágio adulto foram encontrados para submeter-se à maturação espontânea do oócito sem qualquer tratamento após 4 horas de incubação, geralmente pelo menos 30% dos oócitos separados sobreviveram e a taxa de maturidade desses oócitos sobreviventes poderia ser de até 80%(Figura 4). Esses oócitos maduros poderiam passar pela expansão completa do chorão após a colocação na água, sugerindo que as células foliculares foram completamente removidas(Figura 4). Assim, este método pode ser utilizado para obter os oócitos desnudados para o estudo da maturação do oócito dos zebrafish.
Este método pode ser usado para FIV em zebrafish. Métodos de maturação in vitro (IVM) foram bem estabelecidos em zebrafish. Utilizando esses métodos, os folículos de estágio totalmente cultivados podem ser induzidos ao estágio amadurecido11,12,13,15,16. Para realizar ainda mais a fertilização in vitro (FIV), a camada folicular de folículos maduros ainda precisa ser removida manualmente. Aqui, o IVM de zebrafish foi induzido pelo tratamento de DHP. A camada folicular de folículos maduros foi removida por um tubo de vidro capilar. Estes oócitos desfolliculados poderiam ser fertilizados e desenvolvidos na fase de eclosão(Figura 5). O resultado sugere que este método pode ser usado para FIV em zebrafish. Normalmente cerca de 10% dos embriões saudáveis podem ser obtidos a partir dos oócitos maduros.
Figura 1. Separação de células foliculares e oócitos de folículos ovarianos de zebrafish usando um capilar de vidro puxado. 1) A morfologia do folículo intacto na fase FG. 2)Inalação do folículo intacto no capilar de vidro puxado. 3)A célula folicular é separada do oócito quando o folículo é soprado para fora do capilar de vidro puxado. 4) Separação bem sucedida de células foliculares e oócito. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A morfologia de folículos intactos e oócitos desnudados separados de diferentes estágios dos folículos após a coloração da DAPI. Os folículos intactos e oócitos separados de diferentes estágios dos folículos do estágio PV para o estágio FG foram manchados pelo DAPI. Os sinais azuis do DAPI foram observados em folículos intactos, mas não desnudados oócitos. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Seções histológicas de folículos intactos e oócitos isolados após a coloração da DAPI. Núcleos celulares de células foliculares foram visualizados com coloração da DAPI. O sinal azul pode ser observado. As células foliculares foram claramente removidas em oócitos desnudados. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A maturação e a expansão completa do acorde de oócitos desnudados separados dos folículos de estágio completo usando um capilar de vidro puxado. Amorfologia de folículos intactos em folículos de estágio adulto. (B) Os oócitos desnudos separados dos folículos de estágio adulto podem sofrer maturação espontânea de oócito sem qualquer tratamento após 4 horas de incubação. (C) Os oócitos amadurecidos podem sofrer uma expansão completa do chorão após a ativação por água. Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. A morfologia dos embriões precoces obtidos por IVM e FIV. O IVM foi induzido pelo tratamento de DHP (5 μg/mL) por 2 h. Após o IVM, as células foliculares foram removidas dos oócitos amadurecidos por um capilar de vidro puxado. Os oócitos amadurecidos foram fertilizados por FIV. O desenvolvimento de embriões em diferentes estágios foi visto e fotografado. Barras de escala:(A-I) 200 μm, (J) 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descrevemos aqui um novo método para a simples e rápida separação de células foliculares e oócitos dos folículos ovarianos de zebrafish. Este método tem várias vantagens em relação ao método convencional. Entre elas, a maior facilidade de separação com alta eficiência e eficácia, pois apenas uma única manipulação externa é necessária. Este ponto aumenta a aplicabilidade para pesquisadores que não são bons em anatomia microscópica. De acordo com nossa experiência, pode-se separar com sucesso células foliculares e oócitos de um folículo de estágio totalmente crescido dentro de 5-10 s usando o capilar de vidro. No entanto, pelo menos 30-60 s é necessário para fazer essa separação usando fórceps. Mais importante, geralmente pelo menos 20% dos oócitos desnudos separados pelo capilar de vidro podem sofrer maturação espontânea de oócito. Em contraste, não mais de 1% dos oócitos desnudos podem sofrer maturação espontânea de oócito usando fórceps. Assim, a eficiência e eficácia do novo método utilizando o capilar de vidro s é melhor do que o método previamente estabelecido usando fórceps. Em segundo lugar, este método pode ser usado para separar células foliculares e oocitos de folículos ovarianos em estágios iniciais de desenvolvimento, como os estágios PV, EV e MV. Tal separação não pode ser realizada em folículos em estágio inicial usando metodologias atuais.
Há também algumas limitações usando este método. Por exemplo, o diâmetro apropriado da abertura capilar de vidro é crucial para a separação de células foliculares e oócitos neste método. Uma abertura muito maior ou menor do que o tamanho dos folículos ovarianos levaria ao fracasso da separação. Assim, o diâmetro de abertura do capilar de vidro deve ser ajustado dependendo do tamanho dos folículos ovarianos, o que precisa de alguma prática.
A separação de células foliculares e oócitos tem várias aplicações no estudo do desenvolvimento ovariano. Células foliculares e oócitos em diferentes estágios dos folículos ovarianos obtidos por este método podem ser usados para analisar a expressão genética. Células foliculares separadas podem ser usadas para a cultura celular primária. Oócitos desnudados separados são úteis para investigar o crosstalk entre células foliculares e oócitos, e fornecem um bom modelo para estudar a maturação do oócito. Além disso, este método pode ser usado para remover as células foliculares em alguns ensaios como a maturação in vitro oócito ou fertilização in vitro. A disponibilidade de um método que aumente muito a facilidade e a velocidade de separação deve facilitar a exploração mais ampla dos folículos ovarianos de zebrafish no objetivo de longo prazo de entender os meandros do desenvolvimento ovariano. Além disso, a estrutura dos folículos ovarianos é semelhante entre diferentes espécies de peixes; assim, é interessante testar se esse método também pode ser aplicado em outros peixes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho de pesquisa foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China [32060170, 31601205 e 31560334], visitando projeto acadêmico apoiado pelo China Scholarship Council e pelo Fundo Estadual de Ecologia e Biotecnologia de Água Doce [2020FB05].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C.
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
