Summary
在这里，我们提出了一个简单的方法来分离斑马鱼卵泡中的卵泡细胞和卵母细胞，这将促进斑马鱼卵巢发育的调查。
Abstract
斑马鱼已成为研究脊椎动物卵巢发育的理想模型。卵泡是卵巢的基本单位，由卵母细胞和周围的卵泡细胞组成。为了各种研究目的，如卵泡细胞的初级培养、基因表达分析、卵母细胞成熟和体外受精等，将卵泡细胞和卵母细胞分开至关重要。传统方法使用钳子将两个隔间分开，这既费力又费时，对卵母细胞有很高的损伤。在这里，我们建立了一个简单的方法，使用拉玻璃毛细丝分离两个隔间。在立体显微镜下，卵母细胞和卵泡细胞可以通过在拉细玻璃毛细管中管道轻松分离（直径取决于毛囊直径）。与传统方法相比，这种新方法在分离卵母细胞和卵泡细胞方面效率高，对卵母细胞的损伤较低。更重要的是，这种方法可以应用于早期卵泡，包括在存活前阶段。因此，这种简单的方法可以用来分离斑马鱼的卵泡细胞和卵母细胞。
Introduction
斑马鱼是脊椎动物发育和生理学研究的主要模型生物体。斑马鱼可以作为研究卵巢发育1、2、3分子机制的良好模型。在从鱼类到哺乳动物的进化过程中，卵巢发育的许多特征都受到很大的保护。与其他脊椎动物类似，斑马鱼成人有异步卵巢，包含所有发育阶段4的卵巢卵泡。卵泡是卵巢的基本生殖元素。卵泡由卵母细胞组成，由一层或几层称为卵泡细胞的体细胞包围。卵泡的发育取决于卵母细胞和卵泡细胞之间的双向交流。为了不同的研究目的，如卵泡细胞原培养、基因表达分析、卵母细胞成熟和体外受精，将卵泡细胞和卵母细胞分离至关重要。
传统的分离方法包括机械分离的钳子和酶消化6，7，8，9，10。然而，用钳子进行机械分离既费时又费力。在分离过程中，它还会对卵母细胞造成高损伤。虽然酶消化方法操作简单，需要较短的时间，但应验证治疗时间和酶浓度，分离卵母细胞的完整性和存活率不理想。因此，我们建立了一个简单的方法，使用拉玻璃毛细管在不同的发育阶段分离两个隔间。
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Protocol
鱼类实验的所有程序均符合西北师范大学动物实验伦理委员会的规定。
1. 准备
- 动物
- 使用体长为4-6厘米的成年雌性斑马鱼。
注：我们使用当地市场的斑马鱼。 - 将斑马鱼保持在循环水系统中，在大约 28 °C 时具有 14 h 光和 10 h 黑暗循环。
- 每天用新孵化的盐水虾喂鱼两次。
- 使用体长为4-6厘米的成年雌性斑马鱼。
- 拉玻璃毛细
- 使用15厘米的玻璃毛细，并将其头部放在酒精燃烧器中加热。用手握住玻璃毛细的一端，用钳子握住另一端。
- 加热5-10秒后，酒精燃烧器上的玻璃变得红色和柔软。用钳子拉伸玻璃毛细的头部，使毛细细毛线以所需的直径打开。
注：直径取决于毛囊直径：预生（光伏： 直径约0.30毫米）、早期生化（EV;直径约0.40毫米）、中生代（MV;直径约0.50毫米）、晚维他性（LV;直径约0.60毫米）和完全生长但不成熟（FG;直径约0.65毫米）。 - 将玻璃毛细细丝的开口拉伸到适当的直径，直径略小于分离的毛囊大小。开口比卵巢大小大得多的玻璃毛细管不能进行分离，但较小的毛细管在分离过程中会折断毛囊。练习几次玻璃毛细的伸展。
注意：加热时间取决于玻璃毛细细纸的大小。不要直接伸展酒精燃烧器火上的玻璃毛细细骨。它会打破玻璃毛细细。 - 用放大器切割玻璃毛细管，用钳子打破玻璃毛细管，获得光滑的切口。
注意：玻璃毛细的尖锐或破碎的开口会损坏毛囊。 - 使用 30 厘米的塑料管，在一端插入带有滤芯元素的 1 毫升移液器尖端，在移液器末端插入拉动的玻璃毛细管，并在另一端连接 200 μL 移液器尖端。
2. 在不同阶段分离斑马鱼卵母细胞和卵泡细胞
- 斑马鱼卵巢解剖
- 将冰桶装满泥浆冰，加入足够的鱼水，让泥浆冰漂浮。等待 2-5 分钟，检查水温，并确保温度在 2-4 °C 之间。
- 麻醉成年雌性，将鱼放入冰水中至少2-5分钟，直到鱼停止刺运动。用锋利的剪刀切断脊髓以确保死亡，从而斩首鱼。
- 用钳子将鱼放在解剖板上。
- 使用解剖剪刀切割如下。从氯卡解剖到腹部中线的刺。从氯卡后面切下来。从前尖切到后侧。轻轻去除身体一侧的皮肤和肌肉。暴露内部器官，用钳子取出整个卵巢。
- 立即将卵巢轻轻放入含有 60% 莱博维茨 L-15 （L-15） 介质的 100 mm 培养皿中。
- 卵巢卵泡的隔离
注：我们采用的暂存系统基于塞尔曼等人的原始定义。- 手动分离不同阶段的毛囊使用一对细钳子，如前所述8。
- 将卵巢卵泡分组到以下阶段：光伏、EV、MV、LV 和 FG 阶段。
- 卵泡细胞和卵母细胞从卵巢卵泡中分离
- 将不同阶段的卵巢卵泡放入含有 60% L-15 介质的清洁培养皿中。
- 使用从步骤 1.2 拉玻璃毛细，将毛囊吸入玻璃毛细细丝 2-3 厘米，并将其吹出。
注意：当玻璃毛细细纸的开口直径合适时，毛囊可以通过吸入一次从卵母细胞中分离出来。- 如果卵泡细胞层牢固地附着在卵母细胞上，则重复 2-3 次以完成完全分离。避免多次尝试通过较小的毛细毛迫使毛囊，这将损害毛囊。
注：在吸入和吹出的过程中，卵泡层脱落并脱离卵母细胞，最后分离卵泡细胞和凹陷的卵母细胞（图1）。
- 如果卵泡细胞层牢固地附着在卵母细胞上，则重复 2-3 次以完成完全分离。避免多次尝试通过较小的毛细毛迫使毛囊，这将损害毛囊。
- 将凹陷但完好无损的卵母细胞集中，收集幸存的凹陷卵母细胞，以进行进一步的检测。
- 要调查卵泡细胞是否从完整的卵泡中分离出来，用4'，6-二恶英-2-苯林多（DAPI）染色完好的卵泡和分离的卵母细胞。
- 在室温 （RT） 下将样品固定在 4% 缓冲的副甲醛中 1 小时。通过PBS清洗几次。
- 在 Rt 被达皮弄脏 30 分钟。用PBS洗了好几次。用荧光显微镜（例如莱卡 DFC7000 T）查看和拍照。
- 要确认已完成的分离，请在 4 °C 的 4% 缓冲副甲醛中固定完好的卵泡和分离的卵母细胞，并在 -25 °C 处嵌入 intise-冰点介质（如 Leica）。
- 切开微原子上的固定组织，并安装在玻璃滑梯上。
- 用 PBS 清洗部分，然后使用 DAPI 可视化细胞核。在荧光显微镜上查看和拍照。
3. 体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）
注：试管婴儿试管婴儿的程序遵循如前所述，稍作修改11，12，13。
- 准备新鲜的成熟介质（+DHP介质）之前，卵巢解剖从成年斑马鱼雌性。为了准备新鲜的成熟介质，将莱博维茨的L-15介质（pH 9.0）的9毫升添加到15毫升圆锥管中。添加 10 μL 的 17°-20+-二羟基-4 前腺-3-1 （DHP） （5 毫克/毫升）， 490 μL 的 dH2O， 和 500 μL 的 10% 牛血清白蛋白 （BSA）.
- 提前准备汉克的解决方案和E3解决方案。准备汉克斯的解决方案，如巴尔斯等人描述的14。准备E3介质：5毫克，0.17毫克，0.33毫克卡2，0.33毫米MGSO4，和1-5%甲基蓝。
- 执行斑马鱼卵巢解剖和卵巢卵泡的隔离，如步骤 2。
- 收集完全生长的阶段卵泡，并用作不成熟的卵母细胞。对于每只成年雌性斑马鱼，至少可以分离150-200个完全生长的阶段性毛囊。选择完整和健康的卵泡为IVM。
- 在 +DHP 介质中在 12 井板中孵化完全生长的阶段性毛囊，定期检查以确保卵母细胞完好无损。用巴斯德移液器取出任何解滑卵母细胞。
注意：在卵母细胞成熟期间，卵母细胞将逐渐半透明。大多数卵母细胞在治疗DHP2小时后变成半透明。这可以在带有传输光光学的解剖显微镜下观察到。 - 从步骤 2.3 中描述的每个成熟卵母细胞中去除最外侧的卵泡细胞。
- 将凹陷的卵母细胞转移到培养皿中，用几滴培养基进行施肥。
- 使用汉克斯溶液 500 μL 中至少三个男性解剖的睾丸准备新的精子溶液。将精子溶液放在冰上，在那里它可以保持其受精能力长达2-3小时。
- 在培养皿中加入100μL的精子溶液，以去毛刺和成熟的卵母细胞。轻轻地在卵子之间加入精子溶液，然后用移液器尖将精子和卵子旋转在一起。
- 立即添加 1 mL 的 E3 中等溶液以激活卵子，并再次使用移液器尖端轻轻旋转卵子和精子。
- 施肥后约 1 分钟 （mpf） 后，用 E3 介质溶液充斥板。在 10-15 mpf 内可以观察到全胆碱扩张。
- 在 35 - 45 毫克之间，选择正在经历对称的胚胎进入 2 细胞阶段，因此受精。去除未经历细胞裂口的胚胎。
- 允许胚胎在28°C的培养皿中发育，每10厘米板80个胚胎的限制。查看和拍摄胚胎发育。
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Representative Results
这种方法可用于分离斑马鱼卵巢卵泡发育不同阶段的卵泡细胞和卵母细胞。 图1 显示斑马鱼卵母细胞和卵泡细胞与卵巢卵泡使用毛细管分离（图1）。为了调查卵泡细胞是否从完整的卵泡中分离出来，从光伏阶段到FG阶段的卵泡不同阶段的完整卵泡和分离的卵母细胞在37°C处染上DAPI（50微克/毫升），持续30分钟。卵泡细胞的细胞核可以通过DAPI染色。DAPI的蓝色信号在完好无损的卵泡中观察到，但没有发现卵母细胞（图2）。这表明卵泡的卵母细胞和卵泡细胞可以通过这种方法干净地分离。为了进一步确认明确的分离，完整的卵泡和分离的卵母细胞被切入组虫学部分。DAPI染色结果显示，卵泡细胞在凹陷的卵母细胞中明显被移除（图3）。所有这些结果表明，这种方法可用于分离斑马鱼不同阶段毛囊中的卵泡细胞和卵母细胞。
这种方法可用于研究斑马鱼的卵母细胞成熟。要研究卵母细胞和卵泡细胞在卵母细胞成熟期间的双向通信，必须获得不同检测的凹陷卵母细胞。使用拉玻璃毛细管，从完全生长阶段斑马鱼卵泡分离的凹陷卵母细胞被发现在4小时孵化后未经任何治疗就进行自发卵母细胞成熟，通常至少30%分离的卵母细胞存活下来，这些幸存卵母细胞的成熟率可能高达80%（图4）。这些成熟的卵母细胞在放入水中后可能会经历完全的胆汁扩张，这表明卵泡细胞被完全切除（图4）。因此，这种方法可以用来获得斑马鱼的卵母细胞，用于研究斑马鱼的卵母细胞成熟。
这种方法可用于斑马鱼的试管婴儿。体外成熟（IVM）方法在斑马鱼中已经确立。使用这些方法，完全生长的阶段毛囊可以诱导到成熟的阶段11，12，13，15，16。为了进一步进行体外受精（IVF），成熟卵泡的卵泡层仍需要手动去除。在这里，斑马鱼的IVM是由DHP的治疗引起的。成熟卵泡的卵泡层被毛细管去除。这些去污的卵母细胞可以受精并发育成孵化阶段（图5）。结果表明，这种方法可用于斑马鱼的试管婴儿。通常大约10%的健康胚胎可以从成熟的卵母细胞中获得。
图1。使用拉玻璃毛细管将卵泡细胞和卵母细胞从斑马鱼卵巢中分离出来。 1） FG 阶段完整卵泡的形态。2）将完好的毛囊吸入拉玻璃毛细细丝中。3）当卵泡从拉玻璃毛细管中吹出时，卵泡细胞与卵母细胞分离。4） 成功分离卵泡细胞和卵母细胞。缩放条： 200μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图2。DAPI染色后，完整卵泡和凹陷卵母细胞的形态与不同阶段的卵泡分离。 完整的卵泡和分离的卵母细胞从不同阶段的卵泡从光伏阶段到FG阶段被DAPI染色。DAPI的蓝色信号在完整的卵泡中观察到，但没有发现卵母细胞。缩放条： 200μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图3。DAPI染色后，完整的卵泡和孤立的卵母细胞的神学部分。 卵泡细胞的细胞核通过DAPI染色可视化。可以观察到蓝色信号。卵泡细胞在凹陷的卵母细胞中被明显去除。比例栏： 100μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图4。使用拉玻璃毛细管，从完全生长的阶段毛囊中分离出的凹陷卵母细胞的成熟和全胆汁扩张。 （A） 完整卵泡在完全生长阶段卵泡的形态。（B） 与完全生长的阶段卵泡分离的凹陷卵母细胞在4小时孵化后可进行自发卵母细胞成熟，无需任何治疗。（C） 成熟的卵母细胞在被水激活后可以进行完全的胆汁膨胀。比例栏： 500μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图5。试管婴儿和试管婴儿获得的早期胚胎形态。 IVM 是由DHP（5μg/mL）治疗引起的，治疗时间为2小时。IVM后，卵泡细胞被拉玻璃毛细管从成熟的卵母细胞中去除。成熟的卵母细胞由试管婴儿受精。对不同阶段胚胎的发育进行了观察和拍摄。缩放栏：（A-I） 200μm ， （J） 1 mm.请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们在这里描述了一种从斑马鱼卵泡中简单而快速地分离卵泡细胞和卵母细胞的新方法。这种方法比传统方法有几个优点。其中最主要的是大大提高了分离的便利性，效率高，效率高，因为只需要一个单一的和外部的操作。这一点增加了不擅长微观解剖学的研究人员的适用性。根据我们的经验，一个人可以成功地分离卵泡细胞和卵母细胞从完全生长的阶段卵泡在5-10s使用玻璃毛细管。但是，使用钳子进行这种分离至少需要 30-60s。更重要的是，通常至少20%的被玻璃毛细隔开的卵母细胞可以经历自发的卵母细胞成熟。相比之下，超过1%的凹陷卵母细胞可以使用钳子进行自发卵母细胞成熟。因此，使用玻璃毛细细金的新方法的效率和效力优于先前确定的使用钳子的方法。其次，这种方法可用于在早期发育阶段（如光伏、EV 和 MV 阶段）分离卵巢卵泡的卵泡细胞和卵泡。这种分离不能在早期卵泡使用目前的方法进行。
使用此方法也存在一些限制。例如，玻璃毛细管开口的适当直径对于分离这种方法中的卵泡细胞和卵母细胞至关重要。开口大于或小于卵巢卵泡的大小将导致分离失败。因此，应根据卵巢卵泡的大小调整玻璃毛细毛的开口直径，这需要一些练习。
卵泡细胞和卵母细胞的分离在研究卵巢发育方面有几个应用。这种方法获得的卵巢卵泡不同阶段的卵泡细胞和卵母细胞可用于分析基因表达。分离的卵泡细胞可用于初级细胞培养。分离的卵母细胞有助于研究卵泡细胞和卵母细胞之间的相声，为研究卵母细胞成熟提供了良好的模型。此外，此方法可用于去除某些检测中的卵泡细胞，如体外卵母细胞成熟或体外受精。在了解卵巢发育错综复杂的长期目标中，提供一种大大提高分离方便和速度的方法应有助于更广泛地开发斑马鱼卵巢卵泡。此外，卵巢卵泡的结构在不同的鱼种中是相似的：因此，测试这种方法是否也可以应用于其他鱼类是很有趣的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究工作由中国国家自然科学基金委员会（32060170、31601205和31560334）支持，访问学者项目由中国奖学金委员会和国家淡水生态与生物技术重点实验室[2020FB05]资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C.
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
