Summary
Qui presentiamo un metodo semplice per separare le cellule follicolari e gli ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish, che faciliterà le indagini sullo sviluppo ovarico nel pesce zebra.
Abstract
Zebrafish è diventato un modello ideale per studiare lo sviluppo ovarico dei vertebrati. Il follicolo è l'unità di base dell'ovaio, che consiste di ovociti e cellule follicolari circostanti. È fondamentale separare sia le cellule follicolari che gli ovociti per vari scopi di ricerca come per la coltura primaria di cellule follicolari, l'analisi dell'espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro, ecc. Il metodo convenzionale utilizza le forcep per separare entrambi i compartimenti, il che è laborioso, richiede molto tempo e ha alti danni all'ovocita. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti utilizzando un capillare in vetro tirato. Sotto uno stereomicroscopio, gli ovociti e le cellule follicolari possono essere facilmente separati mediante pipettazione in un capillare di vetro fine tirato (il diametro dipende dal diametro del follicolo). Rispetto al metodo convenzionale, questo nuovo metodo ha un'alta efficienza nella separazione sia degli ovociti che delle cellule follicolari e ha bassi danni agli ovociti. Ancora più importante, questo metodo può essere applicato ai follicoli in fase iniziale anche nella fase pre-vitellogenesi. Pertanto, questo semplice metodo può essere utilizzato per separare le cellule follicolari e gli ovociti del pesce zebra.
Introduction
Zebrafish è un importante organismo modello per lo studio dello sviluppo e della fisiologia dei vertebrati. Il pesce zebra può servire come un buon modello per lo studio dei meccanismi molecolari dello sviluppoovarico 1,2,3. Molte caratteristiche dello sviluppo ovarico sono molto conservate durante l'evoluzione dai pesci ai mammiferi1,2. Simile agli altri vertebrati, gli adulti zebrafish hanno ovaie asincrone, contenenti follicoli ovarico di tutte le fasi di sviluppo4. Il follicolo è l'elemento riproduttivo fondamentale dell'ovaio. Il follicolo è costituito dall'ovocitio che è circondato da uno o più strati di cellule somatiche chiamate cellule follicolari. Lo sviluppo dei follicoli dipende dalla comunicazione bidirezionale tra ovociti e cellule follicolari5. È fondamentale separare le cellule follicolari e gli ovociti dai follicoli ovarici per diversi scopi di ricerca come la coltura primaria delle cellule follicolari, l'analisi dell'espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro.
I metodi di separazione tradizionali includono la separazione meccanica mediante forcep e digestioneenzimatica 6,7,8,9,10. Tuttavia, la separazione meccanica per forcep è dispendiosa in termini di tempo e laboriosa. Causerà anche l'alto danno all'ovocita durante la separazione. Sebbene il metodo di digestione enzimatica sia semplice da usare e richieda un breve periodo di tempo, il tempo di trattamento e la concentrazione enzimatica devono essere convalidati e il tasso di integrità e sopravvivenza degli ovociti isolati non è l'ideale. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti in diversi stadi di sviluppo utilizzando tubi capillari in vetro tirato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure eseguite negli esperimenti sui pesci sono conformi alle normative del Comitato Etico per la Sperimentazione Animale della Northwest Normal University.
1. Preparativi
- animali
- Usa il pesce zebra femmina adulto con una lunghezza del corpo di 4-6 cm.
NOTA: Abbiamo usato il pesce zebra di un mercato locale. - Mantenere il pesce zebra in un sistema idrico circolato con una luce di 14 ore e un ciclo buio di 10 ore a circa 28 °C.
- Nutrire il pesce due volte al giorno con gamberetti salamoia appena nati.
- Usa il pesce zebra femmina adulto con una lunghezza del corpo di 4-6 cm.
- Capillare in vetro tirato
- Utilizzare un capillare di vetro di 15 cm e posizionare la testa in un bruciatore di alcol per riscaldarlo. Tenere un'estremità del vetro capillare a mano e tenere l'altra estremità con le forcep.
- Dopo aver riscaldato 5-10 secondi, il vetro sul fuoco del bruciatore di alcol diventa rosso e morbido. Allungare la testa del capillare di vetro con le forcep per rendere l'apertura capillare con il diametro richiesto.
NOTA: Il diametro dipende dai diametri del follicolo: previtellogenico (PV; circa 0,30 mm di diametro), vitellogenico precoce (EV; circa 0,40 mm di diametro), midvitellogenico (MV; circa 0,50 mm di diametro), vitellogenico tardivo (LV; circa 0,60 mm di diametro) e pieno ma immaturo (FG; circa 0,65 mm di diametro). - Allungare l'apertura del capillare di vetro al diametro appropriato, che è leggermente più piccolo delle dimensioni dei follicoli separati. Il capillare di vetro con un'apertura molto più grande delle dimensioni dei follicoli ovarico non può eseguire la separazione, ma quelli molto più piccoli romperebbero i follicoli durante la separazione. Praticare più volte lo stiramento del capillare di vetro.
NOTA: Il tempo di riscaldamento dipende dalle dimensioni del capillare di vetro. Non allungare direttamente il capillare di vetro sul fuoco del bruciatore di alcol. Romperà il capillare di vetro. - Tagliare il capillare in vetro con una fresa ad ampolla e rompere il capillare di vetro con le forcep per ottenere un'incisione liscia.
NOTA: Un'apertura affilata o rotta del capillare di vetro danneggerebbe i follicoli. - Utilizzando un tubo di plastica da 30 cm, inserire una punta della pipetta da 1 ml con un elemento filtrante ad un'estremità, inserire il capillare di vetro tirato all'estremità della pipetta e collegare una punta della pipetta da 200 μL su un'altra estremità.
2. Separazione degli ovociti zebrafish e delle cellule follicolari in diverse fasi
- Dissezione dell'ovaio zebrafish
- Riempire un secchio di ghiaccio a 4/5 pieno di ghiaccio liquame e aggiungere acqua di pesce sufficiente per far galleggiare il ghiaccio liquame. Attendere 2-5 minuti, controllare la temperatura dell'acqua e assicurarsi che la temperatura sia compresa tra 2-4 °C.
- Anestetizza le femmine adulte posizionando i pesci nell'acqua ghiacciata per almeno 2-5 minuti, fino a quando i pesci non interrompo il movimento delle branchie. Decapitare il pesce tagliando il midollo spinale usando forbici affilate per garantire la morte.
- Posizionare il pesce sulla piastra di sezionazione con le forcep.
- Utilizzare le forbici sezionanti per tagliare come segue. Sezionare dalla cloaca alle branchie lungo la linea mediana dell'addome. Tagliato dal retro della cloaca. Tagliare dalla punta anteriore al lato dorsale. Rimuovere delicatamente la pelle e i muscoli su un lato del corpo. Esporre gli organi interni ed esegnare l'intera ovaia con le forcep.
- Immediatamente, posizionare delicatamente le ovaie in un piatto di coltura da 100 mm contenente il mezzo L-15 (L-15) di Leibovitz al 60%.
- Isolamento dei follicoli ovarico
NOTA: Il sistema di staging che abbiamo adottato si basa sulla definizione originale di Selman etal.- Isolare manualmente follicoli di stadi diversi utilizzando una coppia di forcep fini come descritto in precedenza8.
- Raggruppare i follicoli ovarico nelle seguenti fasi: stadi PV, EV, MV, LV e FG.
- Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici
- Mettere i follicoli ovarico in diverse fasi in una piastra di Petri pulita contenente il 60% di mezzo L-15.
- Utilizzando il capillare di vetro tirato dal passo 1.2, succhiare i follicoli nel capillare di vetro di 2-3 cm e soffiarli fuori.
NOTA: Quando il diametro di apertura dei capillari di vetro è appropriato, il follicolo può essere separato dall'ovocita per inalazione una volta.- Se lo strato cellulare follicolare è attaccato saldamente all'ovocita, ripetere 2-3 volte per eseguire una separazione completa. Evitare molteplici tentativi di forzare un follicolo attraverso un capillare più piccolo, che danneggerebbe il follicolo.
NOTA: Nel processo di inalazione e soffiatura, lo strato follicolare cade e si separa dall'ovociti e, infine, le cellule follicolari e gli ovociti denudati sono separati(Figura 1).
- Se lo strato cellulare follicolare è attaccato saldamente all'ovocita, ripetere 2-3 volte per eseguire una separazione completa. Evitare molteplici tentativi di forzare un follicolo attraverso un capillare più piccolo, che danneggerebbe il follicolo.
- Mettere in comune gli ovociti denudati ma intatti e raccogliere gli ovociti denudati sopravvissuti per ulteriori saggi.
- Per verificare se le cellule follicolari sono state separate da follicoli intatti, macchiare i follicoli intatti e separare gli ovociti con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
- Fissare i campioni in paraformaldeide tamponata al 4% a temperatura ambiente (RT) per 1 h. Lavare più volte da PBS.
- Macchia da DAPI a RT per 30 min. Lavato più volte con PBS. Visualizza e fotografa con un microscopio a fluorescenza (ad esempio, Leica DFC7000 T).
- Per confermare la separazione completata, fissare i follicoli intatti e gli ovociti separati in paraformaldeide tamponata al 4% durante la notte a 4 °C e incorporare il mezzo di congelamento dell'intissue (ad esempio, Leica) a -25 °C.
- Tagliare i tessuti fissi su un microtomo e montare su scivoli di vetro.
- Lavare le sezioni in PBS e visualizzare i nuclei cellulari con DAPI. Visualizza e fotografa su un microscopio a fluorescenza.
3. Maturazione in vitro (IVM) e fecondazione in vitro (FIV)
NOTA: La procedura di IVM di fecondazione in vitro è stata seguita come descritto in precedenza con modifica minore 11,12,13.
- Preparare il mezzo di maturazione fresco (+DHP medium) prima della dissezione dell'ovaio dalla femmina adulta di zebrafish. Per preparare il mezzo di maturazione fresco, aggiungere 9 ml del mezzo L-15 di Leibovitz, pH 9,0, a tubi conici da 15 ml. Aggiungere 10 μL di 17α-20β-diidrossi-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/mL), 490 μL di dH2O e 500 μL di albumina sierica bovina al 10% (BSA).
- Preparare in anticipo la soluzione Hank e la soluzione E3. Preparare la soluzione di Hanks come descritto da Baars etal. Preparare mezzo E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4e 1-5% Methylene Blu.
- Eseguire la dissezione dell'ovaio di zebrafish e l'isolamento dei follicoli ovarico come nei passaggi 2.
- Raccogli follicoli da stadio adulti e usalo come ovociti immaturi. Per ogni femmina adulta di zebrafish, almeno 150-200 follicoli a stadio adulto possono essere isolati. Selezionare i follicoli integri e sani per IVM.
- Incubare i follicoli da stadio adulti in mezzo +DHP in piastre da 12 po ', controllando periodicamente per garantire che gli ovociti rimangano intatti. Rimuovere eventuali ovociti di lysing con una pipetta Pasteur.
NOTA: Durante la maturazione degli ovociti, gli ovociti diventeranno progressivamente traslucidi. La maggior parte degli ovociti diventa traslucida dopo il trattamento del DHP per 2 ore. Questo può essere osservato al microscopio sezionato con ottica a luce trasmessa. - Rimuovere le cellule follicolari più ose da ogni ovociti maturato come descritto nel passaggio 2.3.
- Trasferire gli ovociti denudati in una piastra di Petri con alcune gocce di mezzo di coltura e procedere alla fecondazione.
- Preparare la soluzione di sperma fresco utilizzando teste sezionate da almeno tre maschi in 500 μL della soluzione di Hanks. Metti la soluzione di sperma sul ghiaccio, dove può mantenere la sua potenza di fecondazione fino a 2-3 ore.
- Aggiungere 100 μL di soluzione spermatica agli ovociti denudati e maturati su una piastra di Petri. Aggiungere delicatamente la soluzione di spermatozoi tra le uova e ruotare lo sperma e le uova insieme usando una punta di pipetta.
- Aggiungere immediatamente 1 mL di soluzione media E3 per attivare le uova e di nuovo ruotare delicatamente uova e spermatozoi utilizzando una punta di pipetta.
- Dopo circa 1 minuto di post-fecondazione (mpf), inondare la piastra con soluzione media E3. L'espansione completa del corrione può essere osservata entro 10-15 mpf.
- Tra 35-45 mpf, selezionare gli embrioni che sono sottoposti a scissione simmetrica nello stadio a 2 cellule e che vengono quindi fecondati. Rimuovere gli embrioni che non sono sottoposti a scissione cellulare.
- Consentire agli embrioni di svilupparsi nella piastra di Petri a 28 °C, con un limite di 80 embrioni per piastra di 10 cm. Visualizza e fotografa lo sviluppo dell'embrione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo metodo può essere utilizzato per separare cellule follicolari e ovociti in diverse fasi dello sviluppo del follicolo ovarico nel pesce zebra. La figura 1 mostra la separazione degli ovociti zebrafish e delle cellule follicolari dai follicoli ovarici utilizzando un tubo di vetro capillare (Figura 1). Per verificare se le cellule follicolari fossero separate da follicoli intatti, i follicoli intatti e gli ovociti separati da diversi stadi dei follicoli dallo stadio fotovoltaico allo stadio FG sono stati macchiati con DAPI (50 μg/mL) a 37 °C per 30 minuti. Il nucleo delle cellule follicolari può essere macchiato da DAPI. Il segnale blu del DAPI è stato osservato nei follicoli intatti ma non negli ovociti denudati (Figura 2). Ciò indica che gli ovociti e le cellule follicolari del follicolo possono essere separati in modo pulito con questo metodo. Per confermare ulteriormente la netta separazione, i follicoli intatti e gli ovociti separati sono stati tagliati nelle sezioni istologiche. I risultati della colorazione DAPI hanno mostrato che le cellule follicolari sono state chiaramente rimosse negli ovociti denudati (Figura 3). Tutti questi risultati suggeriscono che questo metodo può essere utilizzato per separare cellule follicolari e ovociti in diversi follicoli dello stadio di zebrafish.
Questo metodo può essere utilizzato per studiare la maturazione degli ovocite del pesce zebra. Per studiare la comunicazione bidirezionale tra ovociti e cellule follicolari durante la maturazione degli ovociti, gli ovociti denudati devono essere ottenuti per vari saggi. Utilizzando un capillare di vetro tirato, gli ovociti denudati separati dai follicoli zebrafish a stadio adulto sono stati trovati sottoposti alla maturazione spontanea degli ovociti senza alcun trattamento dopo 4 ore di incubazione, di solito almeno il 30% di ovociti separati è sopravvissuto e il tasso di maturità di questi ovociti sopravvissuti potrebbe essere fino all'80%(Figura 4). Questi ovociti maturi potrebbero subire la piena espansione del colino dopo il posizionamento nell'acqua, suggerendo che le cellule follicolari siano state completamente rimosse (Figura 4). Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per ottenere gli ovociti denudati per studiare la maturazione degli ovociti del pesce zebra.
Questo metodo può essere utilizzato per la fecondazione in vitro in zebrafish. I metodi di maturazione in vitro (IVM) sono stati ben consolidati nel pesce zebra. Utilizzando questi metodi, i follicoli dello stadio completamente cresciuti possono essere indotti nello stadiomaturo 11,12,13,15,16. Per eseguire ulteriormente la fecondazione in vitro (FIV), lo strato follicolare dei follicoli maturi deve ancora essere rimosso manualmente. Qui, l'IVM di zebrafish è stato indotto dal trattamento del DHP. Lo strato follicolare dei follicoli maturi è stato rimosso da un tubo di vetro capillare. Questi ovociti defollicolati potrebbero essere fecondati e sviluppati nella fase di schiusa (figura 5). Il risultato suggerisce che questo metodo può essere utilizzato per la fecondazione in vitro nel pesce zebra. Di solito circa il 10% degli embrioni sani può essere ottenuto dagli ovociti maturi.
Figura 1. Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici di zebrafish usando un capillare di vetro tirato. 1) La morfologia del follicolo intatto allo stadio FG. 2) Inalazione del follicolo intatto nel capillare di vetro tirato. 3) La cellula follicolare viene staccata dall'ovocito quando il follicolo viene soffiato fuori dal capillare di vetro tirato. 4) Separazione riuscita delle cellule follicolari e degli ovociti. Barre di scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La morfologia dei follicoli intatti e degli ovociti denudati si separava da diversi stadi dei follicoli dopo la colorazione DAPI. I follicoli intatti e gli ovociti separati da diversi stadi di follicoli dallo stadio fotovoltaico allo stadio FG sono stati macchiati da DAPI. I segnali blu del DAPI sono stati osservati nei follicoli intatti ma non negli ovocite denudati. Barre di scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Sezioni istologiche di follicoli intatti e ovociti isolati dopo la colorazione DAPI. I nuclei cellulari delle cellule follicolari sono stati visualizzati con colorazione DAPI. Il segnale blu può essere osservato. Le cellule follicolari sono state chiaramente rimosse negli ovociti denudati. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. La maturazione e l'espansione completa del coro degli ovociti denudati separati dai follicoli dello stadio adulto usando un capillare di vetro tirato. (A) La morfologia dei follicoli intatti nei follicoli allo stadio adulto. (B) Gli ovociti denudati separati dai follicoli allo stadio adulto possono subire una maturazione spontanea degli ovociti senza alcun trattamento dopo 4 ore di incubazione. (C) Gli ovociti maturi possono subire una piena espansione del coro dopo l'attivazione da parte dell'acqua. Barra di scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. La morfologia dei primi embrioni ottenuta da IVM e IVF. L'IVM è stato indotto dal trattamento di DHP (5 μg/mL) per 2 h. Dopo l'IVM, le cellule follicolari sono state rimosse dagli ovociti maturi da un capillare di vetro tirato. Gli ovociti maturi sono stati fecondati dalla fecondazione in vitro. Lo sviluppo degli embrioni in diverse fasi è stato visto e fotografato. Barre di scala: (A-I) 200 μm, (J) 1 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descriviamo qui un nuovo metodo per la semplice e rapida separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici di zebrafish. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto al metodo convenzionale. Il principale di questi è la facilità di separazione notevolmente aumentata con alta efficienza ed efficacia, in quanto è necessaria una sola manipolazione esterna. Questo punto aumenta l'applicabilità ai ricercatori che non sono bravi nell'anatomia microscopica. Secondo la nostra esperienza, si possono separare con successo le cellule follicolari e gli ovociti da un follicolo da stadio completamente cresciuto entro 5-10 s utilizzando il capillare di vetro. Tuttavia, sono necessari almeno 30-60 s per eseguire questa separazione utilizzando le forcep. Ancora più importante, di solito almeno il 20% degli ovociti denudati separati dal capillare di vetro può subire una maturazione spontanea degli ovociti. Al contrario, non oltre l'1% degli ovociti denudati può subire una maturazione spontanea degli ovociti usando le forcette. Pertanto, l'efficienza e l'efficacia del nuovo metodo utilizzando il capillare in vetro s è migliore del metodo precedentemente stabilito utilizzando le forcep. In secondo luogo, questo metodo può essere usato per separare la cellula follicolare e l'ovocita dei follicoli ovarici nelle prime fasi di sviluppo come gli stadi PV, EV e MV. Tale separazione non può essere eseguita nei follicoli in fase iniziale utilizzando le metodologie attuali.
Ci sono anche alcune limitazioni che usano questo metodo. Ad esempio, il diametro appropriato dell'apertura capillare del vetro è fondamentale per la separazione di cellule follicolari e ovociti in questo metodo. Un'apertura molto più grande o più piccola delle dimensioni dei follicoli ovarico porterebbe al fallimento della separazione. Pertanto, il diametro di apertura del capillare di vetro dovrebbe essere regolato in base alle dimensioni dei follicoli ovarico, che ha bisogno di qualche pratica.
La separazione delle cellule follicolari e degli ovociti ha diverse applicazioni nello studio dello sviluppo ovarico. Le cellule follicolari e gli ovociti in diversi stadi dei follicoli ovarici ottenuti con questo metodo possono essere utilizzati per analizzare l'espressione genica. Le cellule follicolari separate possono essere utilizzate per la coltura cellulare primaria. Gli ovociti denudati separati sono utili per studiare il crosstalk tra cellule follicolari e ovociti e forniscono un buon modello per studiare la maturazione degli ovociti. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per rimuovere le cellule follicolari in alcuni saggi come la maturazione degli ovociti in vitro o la fecondazione in vitro. La disponibilità di un metodo che aumenti notevolmente la facilità e la velocità di separazione dovrebbe facilitare un più ampio sfruttamento dei follicoli ovarico di zebrafish nell'obiettivo a lungo termine di comprendere la complessità dello sviluppo ovarico. Inoltre, la struttura dei follicoli ovarici è simile tra diverse specie ittiche; pertanto, è interessante verificare se questo metodo può essere applicato anche in altri pesci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 e 31560334], progetto di visiting scholar sostenuto dal China Scholarship Council e dal fondo del Laboratorio chiave statale di ecologia e biotecnologia d'acqua dolce [2020FB05].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
