Summary
ここでは、ゼブラフィッシュの卵巣卵胞で濾胞細胞と卵母細胞を分離するための簡単な方法を提示し、ゼブラフィッシュにおける卵巣の発達の調査を容易にする。
Abstract
ゼブラフィッシュは、脊椎動物の卵巣の発達を研究するのに理想的なモデルとなっています。卵胞は卵巣の基本単位であり、卵母細胞および周囲の濾胞細胞からなる。卵胞細胞の一次培養、遺伝子発現の解析、卵母細胞成熟、体外受精など様々な研究目的で、卵胞細胞と卵母細胞の両方を分離することが重要です。従来の方法は、両方のコンパートメントを分離するために鉗子を使用し、これは面倒で時間がかかり、卵母細胞に高いダメージを与えます。ここでは、引っ張られたガラスキャピラリーを用いて、両方の区画を分離する簡単な方法を確立しました。立体顕微鏡では、卵母細胞と濾胞細胞は、引っ張られた細かいガラス毛細管でピペット処理することによって容易に分離することができる(直径は卵胞の直径に依存する)。従来の方法と比較して、この新しい方法は卵母細胞と濾胞細胞の両方を分離する効率が高く、卵母細胞への損傷が少ない。さらに重要なことは、この方法は、早期の卵胞に適用することができる前の早期発生期段階で。このように、この簡単な方法は、ゼブラフィッシュの濾胞細胞および卵母細胞を分離するために使用することができる。
Introduction
ゼブラフィッシュは脊椎動物の発達と生理学の研究のための主要なモデル生物です。ゼブラフィッシュは、卵巣の発達1、2、3の分子メカニズムを研究するための良いモデルとして役立ちます。卵巣の発達の多くの特徴は、魚から哺乳類1、2への進化の間に多く保存されている。他の脊椎動物と同様に、ゼブラフィッシュの成人は非同期卵巣を有し、全発育期4の卵巣卵胞を含む。卵胞は卵巣の基本的な生殖要素である。卵胞は卵胞細胞と呼ばれる体細胞の1つまたは複数の層で囲まれている卵母細胞から成っている。卵胞の発達は卵母細胞と濾胞細胞5の間の双方向通信に依存する。卵胞細胞の一次培養、遺伝子発現解析、卵母細胞成熟、体外受精などの異なる研究目的で、卵胞細胞と卵子を卵巣卵胞から分離することが重要です。
従来の分離方法には、鉗子と酵素消化6、7、8、9、10による機械的分離が含まれる。しかし、鉗子による機械的分離は時間がかかり、面倒です。また、分離中に卵母細胞に高い損傷を引き起こす。酵素消化法は操作が簡単で短時間を要しますが、処理時間と酵素濃度を検証する必要があり、単離された卵母細胞の完全性と生存率は理想的ではありません。そこで、引っ張られたガラスの毛管管を用いて、異なる発達段階で両方の区画を分離する簡単な方法を確立しました。
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Protocol
魚の実験で行われる手順はすべて、ノースウェストノーマル大学動物実験倫理委員会の規則に従っています。
1. 準備
- 動物
- 体長4~6cmの成虫の雌ゼブラフィッシュを使用してください。
注:私たちは地元の市場からゼブラフィッシュを使用しました。 - ゼブラフィッシュは、約28°Cで14時間光と10時間の暗いサイクルで循環水系に保管してください。
- 新しく孵化した塩水エビで1日2回魚を養います。
- 体長4~6cmの成虫の雌ゼブラフィッシュを使用してください。
- 引っ張られたガラスの毛管
- 15cmのガラスキャピラリーを使用し、それを加熱するためにアルコールバーナーに頭を置きます。ガラスキャピラリーの一方の端を手で持ち、もう一方の端を鉗子で保持します。
- 5~10秒加熱すると、アルコールバーナーの火の上のガラスが赤く柔らかくなります。ガラスキャピラリーの頭を鉗子で伸ばして、必要な直径でキャピラリーの開口部を作ります。
注:直径は卵胞径に依存します:簡潔性(PV;直径約0.30mm)、初期のビテロゲン(EV;直径約0.40mm)、中胞原性(MV;直径約0.50mm)、後期強原性(LV;直径約0.60mm)、完全に成長したが未熟な直径(FGは約0.65mm)。 - ガラスキャピラリーの開口部を適切な直径まで伸ばし、分離した卵胞のサイズがわずかに小さくなります。卵巣卵胞の大きさよりもはるかに大きな開口部を持つガラス毛細管は分離を行うことはできませんが、はるかに小さいものは分離中に卵胞を壊します。ガラスキャピラリーの延伸を何度か練習します。
注:加熱時間は、ガラスキャピラリーのサイズに依存します。アルコールバーナーの火の上にガラスの毛細血管を直接伸ばさないでください。それはガラスの毛細管を壊すでしょう。 - アンプルカッターでガラスキャピラリーを切り、ガラスキャピラリーを鉗子で割って滑らかな切開を得る。
注:ガラスの毛細管の鋭い開口部または壊れた開口部は、卵胞を損傷します。 - 30 cmのプラスチックチューブを使用して、一方の端にフィルター要素を持つ1 mLピペットチップを挿入し、ピペットの端に引っ張られたガラスの毛細管を挿入し、別の端に200 μLピペットチップを接続します。
2. ゼブラフィッシュ卵母細胞と濾胞細胞の異なる段階での分離
- ゼブラフィッシュ卵巣の解剖
- スラリーアイスで4/5いっぱいにアイスバケツを満たし、スラリーアイスを浮かべるように十分な魚の水を追加します。2~5分待ち、水温を確認し、温度が2~4°Cであることを確認します。
- 魚がギルの動きを止めるまで、少なくとも2〜5分間氷水に魚を入れることによって、成虫の雌を麻酔します。死を確実にするために鋭いはさみを使用して脊髄を切断することによって魚の首を切る。
- 魚を鉗子で解剖プレートに置きます。
- はさみを解剖して次のように切ります。クロアカから腹部の正中線に沿ったエラに解剖する。クロアカの後ろから切ります。前先端から後側に切ります。体の片側の皮膚と筋肉をそっと取り除きます。内臓を露出させ、鉗子で卵巣全体を取り出す。
- すぐに、60%ライボヴィッツのL-15(L-15)培地を含む100mm培養皿に卵巣をそっと入れます。
- 卵巣卵胞の分離
注:我々が採用したステージングシステムは、Selmanらの元の定義に基づいています4.- 前に説明した細かい鉗子のペアを使用して、異なる段階の卵胞を手動で分離する 8.
- 卵巣卵胞を次の段階にグループ化: PV、 EV、 MV、 LV および FG ステージ。
- 卵巣卵胞からの濾胞細胞と卵母細胞の分離
- 卵巣卵胞を異なる段階で、60%L-15培地を含むきれいなペトリ皿に入れます。
- ステップ1.2から引っ張られたガラスの毛管を使用して、ガラス毛管2〜3cmに卵胞を吸い込み、それらを吹き飛ばします。
注:ガラス毛細血管の開口部径が適切な場合、卵胞は一度吸入することによって卵母細胞から分離することができます。- 卵胞細胞層が卵母細胞にしっかりと取り付けられている場合は、2〜3回繰り返して完全な分離を行います。小さな毛細血管を通して卵胞を強制する複数の試みを避け、卵胞を損傷させる。
注:吸入と吹き出しの過程で、濾胞層が脱落して卵母細胞から分離し、最後に卵胞細胞と裸卵母細胞が分離されます(図1)。
- 卵胞細胞層が卵母細胞にしっかりと取り付けられている場合は、2〜3回繰り返して完全な分離を行います。小さな毛細血管を通して卵胞を強制する複数の試みを避け、卵胞を損傷させる。
- 裸だが無傷の卵母細胞をプールし、さらなるアッセイのために生き残った裸の卵母細胞を収集する。
- 濾胞細胞が無傷の卵胞から分離されたかどうかを調べるには、無傷の卵胞を染色し、4',6-ダイアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)で卵母細胞を分離した。
- 室温(RT)で4%緩衝パラホルムアルデヒドでサンプルを1時間固定します。PBSで数回洗浄します。
- RTで30分間DAPIで汚す。PBSで数回洗浄した。蛍光顕微鏡(例えば、ライカDFC7000 T)での表示および写真。
- 完全な分離を確認するには、4%緩衝パラホルムアルデヒドを4%緩衝したパラホルムアルデヒドで4%緩衝液に完全な卵胞と分離し、インティッシュ凍結培地(例えば、ライカ)を-25°Cで埋め込む。
- ミクロトームで固定組織を切り、ガラススライドに取り付けます。
- PBSのセクションを洗浄し、DAPIで細胞核を可視化します。蛍光顕微鏡で見て写真を撮る。
3. 体外成熟(IVM)と体外受精(IVF)
注: IVF の IVM の手順は、マイナーな変更11、12、13で前述のように従いました。
- 成体ゼブラフィッシュメスからの卵巣解離の前に、新鮮な成熟培地(+DHP培地)を準備します。新鮮な成熟培地を調製するには、ライボヴィッツのL-15培地pH 9.0の9mLを15 mL円錐形チューブに加えます。17α-20β-ジヒドロキシ-4プレグネン-3-ワン(DHP)(5mg/mL)、dH2Oの490 μL、10%ウシ血清アルブミン(BSA)の500 μLを加えます。
- ハンクのソリューションとE3ソリューションを事前に準備してください。Baarsら14で述べたようにハンクスのソリューションを準備します。E3培地を準備する:5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl 2、0.33 mM MgSO4、および1-5%メチレンブルー。
- ステップ2のようにゼブラフィッシュ卵巣の解剖および卵巣卵胞の単離を行う。
- 完全に成長した段階の卵胞を収集し、未熟な卵母細胞として使用します。各成体雌ゼブラフィッシュについて、少なくとも150〜200完全に成長したステージ卵胞を単離することができる。IVM の無傷で健康な卵胞を選択します。
- 完全成長したステージ卵胞を+DHP培地に12ウェルプレートでインキュベートし、卵母細胞がそのまま残っていることを定期的に確認します。パスツールピペットでライジング卵母細胞を取り除く。
注:卵母細胞の成熟の間、卵母細胞は徐々に半透明になります。卵母細胞の大部分は、2時間のDHPの治療後に半透明になる。これは透過した光学系の解剖顕微鏡の下で観察することができる。 - ステップ2.3で説明したように、各成熟卵母細胞から最も外側の濾胞細胞を除去する。
- 数滴の培養培地でペトリ皿にヌード卵母細胞を移し、受精に進みます。
- ハンクスの溶液の500 μLで少なくとも3人の男性から解剖された精巣を使用して、新鮮な精子溶液を準備します。精子溶液を氷の上に置き、受精の効力を最大2〜3時間保つことができます。
- ペトリ皿に脱裸&成熟卵母細胞に精子溶液の100 μLを追加します。卵の間に精子溶液をそっと加え、ピペットチップを使って精子と卵を一緒に渦巻く。
- すぐに卵子を活性化するためにE3培地溶液の1 mLを追加し、再びピペット先端を使用して卵と精子を穏やかに渦巻きます。
- 約1分の受精後(mpf)後、プレートをE3培地溶液であふれさせます。完全な絨毛の拡大は10-15 mpfの内で観察することができる。
- 35〜45 mpfの間で、2細胞段階に対称的な切断を受けている、したがって受精している胚を選択する。細胞切断を受けていない胚を除去する。
- 28°Cのペトリ皿で胚を発生させ、10cmプレートあたり80個の胚の制限を持ちます。胚の発生を見て、写真を撮る。
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Representative Results
この方法は、ゼブラフィッシュの卵巣卵胞の発達の異なる段階で濾胞細胞と卵母細胞を分離するために使用することができます。 図1 は、毛細管ガラス管を用いた卵巣卵胞からのゼブラフィッシュ卵母細胞および濾胞細胞の分離を示す(図1)。濾胞細胞が無傷の卵胞から分離されたかどうかを調べるには、PV段階からFG段階までの異なる段階の卵胞から卵胞を、30分間37°CでDAPI(50μg/mL)で染色した。濾胞細胞の核は、DAPIによって染色することができる。DAPIの青色信号は、無傷の卵胞では観察されなかったが、裸卵細胞は認められなかった(図2)。これは、卵胞の卵母細胞および濾胞細胞がこの方法によってきれいに分離できることを示す。さらに明確な分離を確認するために、無傷の卵胞と分離された卵母細胞を組織学的セクションに切断した。DAPI染色結果は、濾胞細胞が裸卵細胞中で明確に除去されたことを示した(図3)。これらの結果はすべて、この方法がゼブラフィッシュの異なるステージ卵胞で濾胞細胞と卵母細胞を分離するために使用できることを示唆している。
この方法は、ゼブラフィッシュの卵母細胞成熟を研究するために使用することができます。卵母細胞の成熟の間に卵母細胞と濾胞細胞の間の双方向コミュニケーションを研究するためには、種々のアッセイのために脱裸卵母細胞を得なければならない。引っ張られたガラス毛細血管を使用して、完全に成長したステージゼブラフィッシュの卵胞から分離された裸卵母細胞は、4時間のインキュベーション後に何の治療もせずに自発的な卵母細胞成熟を受けることが判明し、通常、少なくとも30%分離した卵母細胞は生存し、これらの生き残った卵母細胞の成熟率は最大80%である可能性がある(図4)。これらの成熟卵母細胞は、水中に配置した後に完全な絨毛膜拡張を受けることができ、濾胞細胞が完全に除去されたことを示唆している(図4)。したがって、この方法は、ゼブラフィッシュの卵母細胞成熟を研究するための裸卵母細胞を得るために使用することができる。
この方法は、ゼブラフィッシュのIVFに使用することができます。インビトロ成熟(IVM)方法は、ゼブラフィッシュで十分に確立されています。これらの方法を使用して、完全に成長した段階の卵胞は成熟した段階11、12、13、15、16に誘導することができる。さらに体外受精(IVF)を行うためには、成熟した卵胞の濾胞層を手動で除去する必要があります。ここで、ゼブラフィッシュのIVMはDHPの処理によって誘導された。成熟した卵胞の濾胞層を毛細血管ガラスチューブによって除去した。これらの脱毛卵子は受精し、孵化段階に発展することができる(図5)。結果は、この方法はゼブラフィッシュのIVFに使用できることを示唆しています。通常、健康な胚の約10%は成熟した卵母細胞から得ることができる。
図 1.プルドガラス毛細管を用いたゼブラフィッシュ卵巣卵胞からの濾胞細胞および卵母細胞の分離 1) FG段階での無傷の卵胞の形態。2)引っ張られたガラスの毛細血管に無傷の卵胞を吸入する。3)卵胞細胞は、引っ張られたガラスの毛細血管から卵胞が吹き出されると卵母細胞から切り離される。4) 濾胞細胞と卵母細胞の分離に成功した。スケールバー:200 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.無傷の卵胞と裸卵母細胞の形態は、DAPI染色後に卵胞の異なる段階から分離した。 無傷の卵胞と分離卵母細胞をPV段階からFG段階までの卵胞の異なる段階からDAPIによって染色した。DAPIの青色の信号は、無傷の卵胞で観察されたが、裸卵母細胞ではなかった。スケールバー:200 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.DAPI染色後の無傷の卵胞および単離卵母細胞の組織学的セクション。 濾胞細胞の細胞核をDAPI染色で可視化した。青色の信号が観測できます。濾胞細胞は、裸卵母細胞で明確に除去された。スケールバー:100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.プルガラス毛細血管を使用して完全に成長したステージの卵胞から分離されたヌード卵母細胞の成熟および完全な絨毛の拡大。(A)完全に成長した段階の卵胞における無傷の卵胞の形態。(B) 完全成長期卵胞から分離された裸卵母細胞は、4時間の培養後に何の治療もしなくても自発的な卵母細胞成熟を受けることができる。(C)成熟卵母細胞は、水で活性化した後に完全な絨毛膜拡張を受けることができる。スケールバー:500 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.IVMおよびIVFによって得られた初期胚の形態 IVMはDHP(5μg/mL)を2時間処理することによって誘導された。IVM後、濾胞細胞を、引っ張られたガラス毛細血管によって成熟した卵母細胞から除去した。成熟した卵母細胞はIVFによって受精した。異なる段階での胚の発達を見て撮影した。スケールバー: (A-I)200 μm,(J)1 mm.ここをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。
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Discussion
ここでは、ゼブラフィッシュ卵巣卵胞から濾胞細胞と卵母細胞を簡単かつ迅速に分離するための新しい方法を説明する。この方法は、従来法に比していくつかの利点を有する。これらの中でも、単一の外部操作のみが必要となるため、高効率と有効性で大幅に増加した分離の容易さがあります。この点は、顕微鏡解剖学が苦手な研究者に対する適用性を高める。私たちの経験によると、ガラス毛細血管を使用して5〜10s以内に完全に成長したステージの卵胞から濾胞細胞と卵母細胞を正常に分離することができます。ただし、この分離には鉗子を使用して少なくとも30〜60 sが必要です。さらに重要なことは、通常、ガラス毛細血管によって分離された裸卵母細胞の少なくとも20%が自発的な卵母細胞成熟を受けることができる。対照的に、裸卵母細胞の1%を超えないと、鉗子を使用して自発的な卵母細胞成熟を受け得る。したがって、ガラスキャピラリーを用いた新しい方法の効率と有効性は、鉗子を用いる以前に確立された方法よりも優れている。第二に、この方法は、PV、EV、およびMV段階などの初期発達段階で卵巣卵胞の濾胞細胞および卵胞を分離するために使用することができる。このような分離は、現在の方法論を使用して初期段階の卵胞では行うことができません。
この方法を使用する制限もいくつかあります。例えば、ガラス毛管開口部の適切な直径は、この方法で濾胞細胞と卵母細胞の分離に不可欠です。卵巣卵胞の大きさよりもはるかに大きいか小さい開口部は、分離の失敗につながるだろう。したがって、ガラス毛細血管の開口径は、いくつかの練習を必要とする卵巣卵胞の大きさに応じて調整されるべきである。
濾胞細胞と卵母細胞の分離は、卵巣の発達を研究する上でいくつかの用途を有する。この方法で得られた卵巣卵胞の異なる段階における濾胞細胞および卵母細胞は、遺伝子発現を解析するために使用することができる。分離した濾胞細胞は、一次細胞培養に使用することができる。分離された卵母細胞は、濾胞細胞と卵母細胞のクロストークを調べ、卵母細胞成熟を研究するための良いモデルを提供するのに有用である。さらに、この方法は、体外卵母細胞成熟または体外受精などのいくつかのアッセイで濾胞細胞を除去するために使用することができる。分離の容易さと速度を大幅に増加させる方法の可用性は、卵巣の発達の複雑さを理解するという長期的な目標においてゼブラフィッシュ卵巣卵胞のより広範な搾取を促進するべきである。さらに、卵巣卵胞の構造は、異なる魚種の間で類似しています。したがって、この方法が他の魚にも適用できるかどうかをテストすることは興味深いです。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は中国国立自然科学財団[32060170、31601205および31560334]、中国奨学金協議会と淡水生態学とバイオテクノロジーの国家主要研究所の基金によって支援された客員研究員プロジェクト[2020FB05]によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
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